一株抗pedv s蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及一株抗pedv s蛋白的单克隆抗体及其应用，属于病毒学和免疫学检测领域。
背景技术：2.猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)是一种严重危害养猪业的病原，属于套式病毒目(nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)、α-冠状病毒属(alphacoronavirus)。pedv感染后主要引起猪水样腹泻、呕吐和脱水。pedv对各年龄阶段的猪均有影响，尤其引起7日龄以内哺乳仔猪高发病率及高死亡率，病死率高达100％，造成养猪业巨大的经济损失。目前防控pedv最主要的方式是疫苗免疫，免疫形式包括主动免疫和被动免疫。因新生仔猪免疫系统不健全，母猪乳汁中母源抗体，特别是iga抗体，是其抵抗pedv感染免疫保护力的重要来源。因此，检测母猪乳汁中pedv iga抗体水平对哺乳母猪pedv疫苗免疫效果评价、仔猪pedv免疫力及pedv流行病学研究具有重要的指导意义。
3.酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，elisa)是一种具有高灵敏度和高特异性检测母猪乳汁中pedv iga抗体的方法。目前已报道的母猪乳汁pedv iga抗体elisa检测方法包被抗原以病毒重组蛋白或纯化的病毒居多。然而，病毒重组蛋白不能完全反映出完整病毒的免疫活性，使用常规纯化方法容易造成病毒结构破坏，从而降低检测敏感性。虽然近期有报道利用pedv抗体包被完整病毒作为包被抗原的elisa检测方法，但是这些抗体识别pedv抗原不明确，特异性有待进一步验证，具有一定局限性。作为一种冠状病毒，pedv纤突糖蛋白(spike glycoprotein，s)包含众多抗原表位和中和表位，发挥极其重要的免疫学功能。因此，基于s蛋白特异性单克隆抗体捕获pedv抗原作为包被抗原检测母猪乳汁中pedv iga抗体的elisa方法具有明确的识别抗原和高特异性，但是目前国内外未见有相关研究。
技术实现要素：4.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一株特异性识别pedv流行毒株ch/hubei/2016s蛋白的单克隆抗体pedv mab-s，并基于该抗体研发检测母猪乳汁中pedv iga抗体的elisa方法。
5.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
6.一株抗pedv s蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株mab-s，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c202289。
7.一株抗pedv s蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体是由所述的杂交瘤细胞株mab-s分泌的。
8.所述单克隆抗体特异性识别pedv流行毒株ch/hubei/2016s蛋白s1区域重组蛋白的第21位至第793位氨基酸，但不包括其中的第505位至第629位氨基酸。
9.所述单克隆抗体特异性识别pedv流行毒株ch/hubei/2016及其s蛋白。
10.一种利用所述的单克隆抗体建立的检测母猪乳汁中pedv iga抗体的elisa方法，包括如下步骤：
11.(1)使用elisa包被液将单克隆抗体稀释至终浓度为0.5μg/ml，按100μl/孔加入elisa反应板，4℃包被12h后，pbst缓冲液洗涤5次；
12.(2)加入含5％(wt)bsa的pbs缓冲液，37℃封闭1.5h后，pbst缓冲液洗涤5次；
13.(3)将灭活的pedv毒株ch/hubei/2016病毒液稀释至终浓度为0.5mg/ml，100μl/孔加入elisa反应板，37℃捕获1h后，pbst缓冲液洗涤5次；
14.(4)加入稀释度为1︰40的待测母猪乳汁样品，37℃孵育30min后，pbst缓冲液洗涤5次；
15.(5)加入1︰20000稀释的hrp标记的羊抗猪iga抗体，37℃孵育30min后，pbst缓冲液洗涤5次；
16.(6)加入tmb单组份显色液于室温避光反应5min，加入elisa终止液终止反应，通过自动酶标分析仪读取各检测孔od
450
值。
17.所述的单克隆抗体在建立母猪pedv疫苗免疫效果评价方法中的应用。
18.所述的单克隆抗体在检测母猪乳汁中pedv iga抗体的elisa方法中的应用。
19.所述的单克隆抗体在建立哺乳仔猪pedv免疫力效果评价方法中的应用。
20.所述的单克隆抗体在pedv感染机制和流行病学研究中的应用。
21.本发明的有益效果：
22.1、本发明综合利用病毒学和免疫学等技术，制备了一株特异性识别pedv流行毒株ch/hubei/2016s蛋白的单克隆抗体pedv mab-s，可特异性识别pedv流行毒株ch/hubei/2016s蛋白及pedv流行毒株ch/hubei/2016。
23.2、基于本发明制备的单克隆抗体pedv mab-s捕获灭活pedv ch/hubei/2016抗原作为elisa包被抗原，研发一种检测母猪乳汁中pedv iga抗体的elisa方法。
24.3、本发明制备的单克隆抗体pedv mab-s可应用于pedv s蛋白及pedv检测，可应用于pedv感染机制研究。基于该抗体研发的捕获灭活病毒抗原及母猪乳汁中pedv iga抗体的elisa检测方法可应用于母猪pedv疫苗免疫效果评价、哺乳仔猪pedv免疫力及pedv流行病学研究。
附图说明
25.图1是实施例1中单克隆抗体pedv mab-s的ipma鉴定结果图。
26.图2是实施例1中单克隆抗体pedv mab-s的wb鉴定结果图。
27.图中，m：蛋白marker。
28.图3是实施例1中单克隆抗体pedv mab-s的ifa鉴定结果图。
29.图4是实施例2中单克隆抗体pedv mab-s经15％sds-page鉴定纯化后的结果图。
30.图中，m：蛋白marker。
具体实施方式
31.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。如无特别说明，实施例中所涉及的仪器设备均为常规仪器设备；涉及试剂均为市售常规试剂；涉及试验方法
均为常规方法。
32.实施例1.单克隆抗体pedv mab-s制备与鉴定
33.1.1单克隆抗体pedv mab-s制备
34.以实验室保存的pedv流行毒株ch/hubei/2016(genbank编号ky496315.1)作为免疫原，免疫4只购自河南省实验动物中心的6～8周龄无特定病原体(specific pathogen free，spf)balb/c纯系雌性小鼠：首次免疫时按50μg pedv/200μl(美国sigma公司弗氏完全佐剂：pbs稀释病毒液体积比1:1，终体积200μl)
·
只小鼠进行背部皮下注射免疫；间隔3周后，按50μg pedv/200μl(美国sigma公司弗氏不完全佐剂：pbs稀释病毒液体积比1:1，终体积200μl)
·
只小鼠进行背部皮下注射第二次免疫；间隔3周后，按第二次免疫方法进行第三次免疫；间隔3周后，按第三次免疫方法进行第四次免疫；间隔1周后，按50μg pedv/200μl(不添加佐剂的pbs稀释病毒液，终体积200μl)
·
只小鼠进行腹腔注射加强免疫。
35.将加强免疫后第3～5天内的小鼠颈椎脱臼处死，以体积分数75％酒精进行体表消毒；将免疫后小鼠脾细胞悬液与小鼠骨髓瘤sp2/0细胞进行融合；以ipma检测方法对融合后的杂交瘤细胞上清进行筛选鉴定；将阳性杂交瘤细胞转移至24孔细胞培养板(美国corning公司)中；将稳定分泌抗体的阳性杂交瘤细胞通过有限稀释法进行2～3次亚克隆，获得特异性好、稳定性强的阳性杂交瘤细胞株。
36.本发明获得一株单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株mab-s；该杂交瘤细胞株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉大学，保藏时间为2022年4月12日，保藏编号为cctcc no：c202289。
37.由该杂交瘤细胞株mab-s分泌得到单克隆抗体pedv mab-s。
38.1.2 ipma鉴定单克隆抗体pedv mab-s
39.将猪小肠上皮ipec-j2细胞铺设96孔细胞培养板(美国corning公司)，待细胞密度达到80％～90％时，接种pedv毒株ch/hubei/2016；在病毒感染14h细胞出现明显病变时，弃掉细胞培养上清液，加入预冷的甲醇置于-20℃固定10min，pbst洗涤3～5次；然后按100μl/孔加入质量分数5％的脱脂乳于37℃封闭1.5h，pbst洗涤3～5次；将单克隆抗体pedv mab-s杂交瘤细胞上清加入细胞培养板孔中于37℃孵育30min，pbst洗涤3～5次，同时以本实验室保存未免疫小鼠阴性血清作为阴性对照；按100μl/孔加入1︰500稀释的hrp标记羊抗鼠二抗(美国abbkine公司)于37℃孵育30min，pbst洗涤3～5次；最终每孔加入50μl 3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole，aec)显色液(北京索莱宝科技有限公司)室温反应5～10min，置于倒置显微镜(德国leica公司)下观察分析细胞染色情况。
40.经ipma鉴定，如图1所示：制备的单克隆抗体pedv mab-s对感染有pedv毒株ch/hubei/2016的ipec-j2细胞有清晰细胞质染色，而未免疫小鼠阴性血清不能染色，表明单克隆抗体pedv mab-s可特异识别pedv ch/hubei/2016毒株。
41.1.3 elisa鉴定单克隆抗体pedv mab-s
42.以elisa包被液(北京索莱宝科技有限公司)将实验室保存的pedv s蛋白s1区域(第21位至第793位氨基酸)重组蛋白、pedv s1区域截短片段(第505位至第629位氨基酸)重组蛋白稀释为2μg/ml，然后按100μl/孔分别加至elisa反应板(无锡耐思生命科技股份有限公司)孔中，4℃包被过夜，pbst洗涤3～5次；使用5％脱脂乳于37℃封闭2h，pbst洗涤3～5次；按100μl/孔加入单克隆抗体pedv mab-s杂交瘤细胞上清，37℃孵育30min，pbst洗涤3～
scientific)进一步纯化，以15％sds-page分析纯化结果。
54.如图4所示，纯化后单克隆抗体pedv mab-s重链的分子质量约50kda，轻链的分子质量约25kda，获得了纯度较高的单克隆抗体pedv mab-s。
55.2.2单克隆抗体pedv mab-s包被浓度和灭活pedv毒株ch/hubei/2016捕获浓度确定
56.取生长状态良好的单层vero细胞，将细胞培养液弃掉，pbs洗涤三次；加入含终浓度6μg/ml胰蛋白酶(美国sigma公司)的pedv毒株ch/hubei/2016，37℃孵育2h；孵育后，加入含胰蛋白酶的dmem培养基(北京索莱宝科技有限公司)置于5％co2、37℃的恒温培养箱内培养；观察细胞状态，待细胞病变达到80％以上后收取病毒；将细胞培养物反复冻融3次后收取病毒液；4℃、5000rpm离心20min除杂。使用甲醛灭活病毒液，最终将灭活的pedv毒株ch/hubei/2016病毒液置于-80℃保存备用。
57.采用方阵滴定法对单克隆抗体pedv mab-s包被浓度和灭活pedv毒株ch/hubei/2016捕获浓度进行确定。采用elisa检测方法测定母猪pedv iga抗体阳性和阴性乳汁样品的od
450
值，具体方法如下：
58.使用elisa包被液将单克隆抗体pedv mab-s分别稀释至终浓度为8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml；按100μl/孔加入elisa反应板，4℃过夜包被，pbst洗涤5次；加入5％脱脂乳，37℃封闭2h，pbst洗涤5次；将灭活的pedv毒株ch/hubei/2016病毒液按4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml的比例进行稀释，100μl/孔加入elisa反应板，37℃捕获1h，pbst洗涤5次；分别加入1:20稀释的本实验室保存的母猪pedv iga抗体阳性和阴性乳汁样品，37℃孵育1h，pbst洗涤5次；加入1︰20000稀释的hrp标记的羊抗猪iga抗体(英国abcam公司)，37℃孵育30min，pbst洗涤5次；加入tmb单组份显色液于室温避光反应5min，加入elisa终止液终止反应，通过自动酶标分析仪读取各检测孔od
450
值。以阳性样品od
450
值接近1，p/n值(阳性样品与阴性样品od
450
值之比)最大为判定标准来确定单克隆抗体pedv mab-s包被浓度和pedv毒株ch/hubei/2016病毒液捕获浓度。
59.如表1，方阵滴定结果显示，当单克隆抗体pedv mab-s包被浓度为0.5μg/ml，灭活pedv毒株ch/hubei/2016病毒液捕获浓度为0.5mg/ml，阳性样品od
450
值最接近1且p/n值最大。因此，确定本发明单克隆抗体pedv mab-s最佳包被浓度为0.5μg/ml，最佳灭活pedv毒株ch/hubei/2016病毒液捕获浓度0.5mg/ml。
60.表1不同包被浓度和捕获浓度下的od
450
值
61.62.2.3单克隆抗体pedv mab-s最佳包被条件确定
63.参照上述“2.2”部分的elisa检测方法，以确定的单克隆抗体pedv mab-s最佳包被浓度(0.5μg/ml)包被elisa反应板(100μl/孔)，将包被条件分别设置为4℃12h，4℃16h，4℃20h。100μl/孔加入最佳捕获浓度(0.5mg/ml)的灭活pedv毒株ch/hubei/2016病毒液，37℃捕获1h。其他反应条件同“2.2”部分，进行elisa检测。以p/n值最大为判定标准确定单克隆抗体pedv mab-s包被条件。
64.如表2，确定本发明单克隆抗体pedv mab-s最佳包被条件为4℃包被12h。
65.表2不同包被条件下的od
450
值
66.包被条件阳性阴性p/n4℃12h1.5650.1788.7924℃16h1.7220.2138.0854℃20h1.8280.2776.599
67.2.4最佳封闭液及封闭条件确定
68.参照“2.2”的elisa检测方法，用最佳单克隆抗体pedv mab-s包被浓度(0.5μg/ml)和包被条件(4℃包被12h)包被elisa反应板。以含5％(wt％)脱脂乳的pbst、含5％(wt％)bsa的pbs作为封闭液分别进行封闭，在37℃条件下封闭60、90、120min。按100μl/孔加入最佳捕获浓度(0.5mg/ml)的灭活pedv毒株ch/hubei/2016病毒液，37℃孵育1h；其他反应条件同“2.2”，进行elisa检测。以p/n值最大为判定标准。
69.如表3，最佳封闭液为含5％bsa的pbs缓冲液，最佳封闭条件为37℃封闭1.5h。
70.表3不同封闭液及封闭条件下的od
450
值
[0071][0072]
实施例3.基于单克隆抗体pedv mab-s及捕获病毒抗原方法检测母猪乳汁中pedv iga抗体elisa方法的建立
[0073]
3.1最佳母猪乳汁样品稀释度及孵育条件确定
[0074]
参照“实施例2的2.2”的elisa检测方法，分别将本实验室保存的母猪pedv iga抗体阳性和阴性乳汁样品均按1︰20、1︰40、1︰80、1︰160、1︰320、1︰640、1︰1280的比例进行稀释，加入elisa反应板，置于37℃孵育1h。单克隆抗体pedv mab-s包被浓度、包被时间，灭活pedv毒株ch/hubei/2016捕获浓度、封闭液及封闭条件同“实施例2的2.2-2.4”确定的最佳条件，其他反应条件同“实施例2的2.2”进行elisa检测。以p/n值最大为判定标准确定最佳母猪乳汁样品稀释度。
[0075]
如表4，当母猪乳汁样品稀释度为1︰40时p/n值最大，确定本发明母猪乳汁样品稀释度为1︰40。
[0076]
进一步，母猪pedv iga抗体阳性和阴性乳汁样品按照上述最佳稀释度(1︰40)加入，37℃分别孵育30、60、90、120min，其他反应条件同上，进行elisa检测。以p/n值最大为判定标准。
[0077]
如表5，确定本发明最佳孵育条件为37℃孵育30min。
[0078]
表4不同母猪乳汁样品稀释度下的od
450
值
[0079][0080]
表5不同母猪乳汁样品孵育条件下的od450值
[0081][0082]
3.2最佳酶标二抗稀释度及孵育时间确定
[0083]
参照“实施例2的2.2”的elisa检测方法，将hrp标记羊抗猪iga抗体分别以1︰20000、1︰40000、1︰80000比例进行稀释，100μl/孔加入elisa反应板，37℃孵育45min；单克隆抗体pedv mab-s包被浓度、包被时间，灭活pedv毒株ch/hubei/2016捕获浓度，封闭液及封闭条件同“实施例2的2.2-2.4”确定的最佳条件，母猪乳汁样品稀释度及孵育条件同“实施例3的3.1”确定的最佳条件，其他反应条件同“实施例2的2.2”，进行elisa检测。以p/n值最大为判定标准确定最佳酶标二抗稀释度。
[0084]
如表6，确定本发明最佳酶标抗体稀释度为1︰20000。
[0085]
进一步，按最佳稀释度(1︰20000)加入hrp标记羊抗猪iga抗体，37℃分别孵育30、45、60min；其他反应条件同上，进行elisa检测。以p/n值最大为标准确定最佳孵育条件。
[0086]
如表7，确定本发明最佳孵育条件为37℃孵育30min。
[0087]
表6不同酶标二抗稀释度下的od
450
值
[0088]
稀释倍数1︰200001︰400001︰800001︰160000阳性1.4190.7810.3740.213阴性0.1840.1240.0820.066p/n7.7126.2984.5613.227
[0089]
表7不同酶标二抗孵育时间下的od
450
值
[0090]
孵育时间30min45min60min阳性1.2951.5111.642阴性0.1630.1990.208p/n7.9457.5937.894
[0091]
3.3最佳显色条件确定
[0092]
参照“实施例2的2.2”的elisa检测方法，将tmb单组份显色液加至elisa反应板，设置显色时间为3min、5min、10min，终止反应后读取od
450
值，单克隆抗体pedv mab-s包被浓度、包被时间，灭活pedv毒株ch/hubei/2016捕获浓度，封闭液及封闭条件同“实施例2的2.2-2.4”确定的最佳条件，母猪乳汁样品稀释度及孵育条件同“实施例3的3.1”确定的最佳条件，酶标二抗稀释度及孵育时间同“实施例3的3.2”确定的最佳条件，其他条件同“实施例
2的2.2”，进行elisa检测。以p/n值最大为判定标准。
[0093]
如表8显示，确定tmb最佳显色条件为室温避光反应5min。
[0094]
表8不同显色条件下的od
450
值
[0095]
反应时间3min5min10min阳性1.0581.4361.975阴性0.1230.1580.234p/n8.6029.0898.440
[0096]
3.4临界值确定
[0097]
根据实施例2及实施例3对各处理步骤的最佳条件的确定，得到基于单克隆抗体pedv mab-s检测母猪乳汁中pedv iga抗体的elisa方法：
[0098]
(1)使用elisa包被液将单克隆抗体pedv mab-s稀释至终浓度为0.5μg/ml，按100μl/孔加入elisa反应板，4℃包被12h，pbst洗涤5次；
[0099]
(2)加入含5％bsa的pbs，37℃封闭1.5h，pbst洗涤5次；
[0100]
(3)将灭活的pedv毒株ch/hubei/2016病毒液稀释至终浓度为0.5mg/ml，100μl/孔加入elisa反应板，37℃捕获1h，pbst洗涤5次；
[0101]
(4)加入稀释度为1︰40的待测母猪乳汁样品，37℃孵育30min，pbst洗涤5次；
[0102]
(5)加入1︰20000稀释的hrp标记的羊抗猪iga抗体，37℃孵育30min，pbst洗涤5次；
[0103]
(6)加入tmb单组份显色液于室温避光反应5min，加入elisa终止液终止反应，通过自动酶标分析仪读取各检测孔od
450
值。
[0104]
利用上述方法，对本实验室保存的20份母猪pedv iga抗体阴性乳汁样品进行elisa检测。计算阴性样品od
450
平均值和标准差，根据统计学分析方法确定临界值。
[0105]
如表9，用本发明建立的elisa方法对20份母猪pedv iga抗体阴性乳汁样本进行检测，获得od
450
值，计算其平均值为0.189，标准差为0.051。根据统计学原理，用平均值+3
×
标准差的方法确定检测方法最终的临界值为0.342。根据临界值，当待测样品od
450
≥0.342判定为阳性，待测样品od
450
《0.342判定为阴性。
[0106]
表9母猪pedv iga抗体阴性乳汁样品的od450值
[0107][0108]
3.5重复性试验
[0109]
取本实验室保存的5份母猪pedv iga抗体阳性乳汁样品(表10中样品1～样品5)和1份母猪pedv iga抗体阴性乳汁样品(表10中阴性样品)，按照本发明建立的elisa方法进行重复性试验。每份样品作6组重复，最终按统计学方法计算各组样品的平均值、标准差和变异系数。
[0110]
如表10，各组变异系数在4.00％～8.10％之间(《10％)，重复性较好。
[0111]
表10重复性试验
[0112]
编号样品1样品2样品3样品4样品5阴性样品10.7621.0291.271.4811.2450.1820.7181.1321.1351.4091.1760.173
30.7521.2291.2271.4651.1190.16240.7791.1971.0781.4231.0720.16850.7911.0351.2131.3351.0590.17360.7141.031.061.4421.0650.179平均值0.7531.1091.1641.4261.1230.173标准差0.0310.090.0860.0520.0750.007变异系数4.10％8.10％7.40％3.60％6.68％4.00％
[0113]
3.6敏感性试验
[0114]
将实验室保存的母猪pedv iga抗体阳性和阴性乳汁样品进行倍比稀释，按照本发明建立的elisa方法进行检测。如表11，对于本发明建立的elisa方法，当阳性乳汁样品稀释至1︰1280仍可检测出阳性，敏感性较高。
[0115]
表11敏感性试验
[0116][0117]
3.7 elisa对比试验
[0118]
利用本发明建立的elisa检测方法和商品化pedv iga抗体elisa检测试剂盒(哈尔滨元亨生物药业有限公司)同时对本实验室保存的92份临床母猪乳汁样品进行检测，分析两种检测方法检测结果的符合率。
[0119]
如表12，本发明建立的elisa检测方法检测出59份阳性样品、33份阴性样品(纵列)，商品化试剂盒检测出56份阳性样品、36份阴性样品(横行)，显示二者检测结果符合率较高。
[0120]
表12本发明建立的elisa方法和商品化elisa检测试剂盒对比
[0121]
技术特征：1.一株抗pedv s蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株mab-s，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：c202289。2.一株抗pedv s蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体是由权利要求1所述的杂交瘤细胞株mab-s分泌的。3.如利用权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别pedv流行毒株ch/hubei/2016s蛋白s1区域重组蛋白的第21位至第793位氨基酸，但不包括其中的第505位至第629位氨基酸。4.如利用权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别pedv流行毒株ch/hubei/2016及其s蛋白。5.一种利用权利要求2所述的单克隆抗体建立的检测母猪乳汁中pedviga抗体的elisa方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)使用elisa包被液将单克隆抗体稀释至终浓度为0.5μg/ml，按100μl/孔加入elisa反应板，4℃包被12h后，pbst缓冲液洗涤5次；(2)加入含5％(wt)bsa的pbs缓冲液，37℃封闭1.5h后，pbst缓冲液洗涤5次；(3)将灭活的pedv毒株ch/hubei/2016病毒液稀释至终浓度为0.5mg/ml，100μl/孔加入elisa反应板，37℃捕获1h后，pbst缓冲液洗涤5次；(4)加入稀释度为1︰40的待测母猪乳汁样品，37℃孵育30min后，pbst缓冲液洗涤5次；(5)加入1︰20000稀释的hrp标记的羊抗猪iga抗体，37℃孵育30min后，pbst缓冲液洗涤5次；(6)加入tmb单组份显色液于室温避光反应5min，加入elisa终止液终止反应，通过自动酶标分析仪读取各检测孔od
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值。6.如权利要求2所述的单克隆抗体在建立母猪pedv疫苗免疫效果评价方法中的应用。7.如权利要求2所述的单克隆抗体在检测母猪乳汁中pedviga抗体的elisa方法中的应用。8.如权利要求2所述的单克隆抗体在建立哺乳仔猪pedv免疫力效果评价方法中的应用。9.如权利要求2所述的单克隆抗体在pedv感染机制和流行病学研究中的应用。
技术总结本发明涉及一株抗PEDV S蛋白的单克隆抗体及其应用，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞株MAb-S，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202289。由杂交瘤细胞株MAb-S分泌的单克隆抗体特异性识别PEDV流行毒株CH/hubei/2016及其S蛋白。本发明制备的单克隆抗体PEDV MAb-S可应用于PEDV S蛋白及PEDV检测，可应用于PEDV感染机制研究。基于该抗体研发的捕获灭活病毒抗原及母猪乳汁中PEDV IgA抗体的ELISA检测方法可应用于母猪PEDV疫苗免疫效果评价、哺乳仔猪PEDV免疫力及PEDV流行病学研究。及PEDV流行病学研究。及PEDV流行病学研究。
技术研发人员：李睿 乔松林 温颖 卢清侠 邢广旭 陈鑫鑫 郭振华 赵东 李学伍 张改平
受保护的技术使用者：河南省农业科学院
技术研发日：2022.07.15
技术公布日：2022/11/1
