1.本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种靶向肠道菌群的黄嘌呤氧化酶抑制剂及其应用。
背景技术：2.黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，xo)参与机体内核酸的分解代谢，是嘌呤代谢中一个关键的限速酶，分布于肝脏、肠道和肾脏等。在体内嘌呤代谢的过程中黄嘌呤氧化酶可以将次黄嘌呤氧化为黄嘌呤，也可以将黄嘌呤氧化为尿酸。尿酸的产生和排泄失衡不仅会影响机体正常生理活动也会导致血液中尿酸水平升高引起高尿酸血症，长期的高尿酸血症会引起痛风并伴发多种疾病。因此，有关降低黄嘌呤氧化酶活性，进而减少痛风和高尿酸血症患者体内尿酸生成的研究越来越多。
3.黄嘌呤氧化酶具有复杂的结构，一些与嘌呤、嘧啶结构相似的物质可与底物竞争性抑制酶的活性。临床中治疗高尿酸血症及痛风的主要药物之一别嘌呤醇，该药物可抑制黄嘌呤氧化酶活性，从而减少尿酸生成。但该药物不但会引起发热，还会引发过敏、腹泻、贫血等不良反应。因此，研究安全高效的黄嘌呤氧化酶抑制剂具有十分重要的意义。
4.近年来有关天然药用植物中有效成分的研究越来越多，有研究报道发现，一些药用植物中提取出的黄酮类、多酚类和三萜类等化合物对黄嘌呤氧化酶具体不同程度的抑制作用，且天然产物来源的活性物质性小，安全性高，引起了广泛关注。但这类天然产物或食物来源的药物口服后会经消化道进入肠道。随着研究的不断深入，有报道发现在肠道中药物与微生物会发生相互作用，药物能改变肠道菌群的组成，肠道菌群能通过代谢药物，改变其药理作用，进而调节机体的健康和疾病。
5.7，8-二羟基黄酮(7，8-dihydroxyflavone，7，8-dhf)是一种天然黄酮类化合物，主要存在于柑橘、谷物、茶叶以及植物中，具有神经保护、抗氧化、抗炎、心血管调节等重要作用，并具有较高的安全性，有研究证明在人肠道细胞模型中进行其细胞毒性评价，7，8-二羟基黄酮在1～100μmol/l浓度范围内没有明显的细胞毒性。目前，7,8-dhf多被广泛应用于各类bdnf/trk b信号相关疾病及其肥胖等代谢症状的防治。
6.现有的技术报道黄嘌呤氧化酶抑制剂一般大都为体外研究药物单独对黄嘌呤氧化酶活性的抑制作用，而有关药物在体内与肠道菌群互作后的生物学功效的研究仍然较少，因此寻找一种能调节肠道菌群，与菌群互作后具有影响黄嘌呤氧化酶活性的药物就具有非常重要的意义。
技术实现要素：7.针对现有技术中的不足，本发明提供了一种靶向肠道菌群的黄嘌呤氧化酶抑制剂及其应用。
8.本发明的首要目的在于提供7，8-二羟基黄酮在制备靶向肠道菌群的黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用。
9.作为本发明一种优选的技术方案，所述7，8-二羟基黄酮通过调节肠道菌群，抑制黄嘌呤氧化酶活性。
10.作为本发明一种优选的技术方案，所述肠道菌群包括拟杆菌属、乳杆菌属。
11.本发明的第二个目的在于提供上述靶向肠道菌群的黄嘌呤氧化酶抑制剂用于制备预防和治疗高尿酸及相关疾病的药物中的用途。
12.作为本发明一种优选的技术方案，所述药物以肠道菌群作为药物靶点，抑制黄嘌呤氧化酶活性。
13.作为本发明一种优选的技术方案，所述药物包括预防或治疗有效量的抑制剂和医学上可接受的载体。
14.作为本发明一种优选的技术方案，所述相关疾病包括痛风、高血压、脑血栓、冠心病、肾结石、糖尿病。
15.作为本发明一种优选的技术方案，所述药物形式包括口服片剂、口服硬胶囊、口服软胶囊、口服滴剂、口服颗粒剂。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
17.本发明提供了7，8-二羟基黄酮在制备靶向肠道菌群的黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用，7，8-二羟基黄酮本身对黄嘌呤氧化酶活性无抑制作用，而是通过调节肠道菌群，与肠道菌群互作后具有抑制黄嘌呤氧化酶活性的作用，7，8-二羟基黄酮属于天然生物活性物质，安全高效，无毒副作用，可以用于减少痛风和高尿酸血症患者体内尿酸的生成，调节机体的健康和相关疾病，对有关药物在体内与肠道菌群互作后的生物学功效的研究有重要意义。
附图说明
18.图1为本发明实施例1中7，8-二羟基黄酮与肠道菌群共孵育后上清液对xo的相对抑制率柱状图。
19.图2为本发明实施例2中7，8-二羟基黄酮单独对xo的相对抑制率柱状图。
20.图3为本发明实施例3中7，8-二羟基黄酮处理后肠道菌群平均相对丰度柱状图，其中，图3a是门水平微生物丰度分析(phylum)；图3b是科水平微生物丰度分析(family)；图3c是属水平微生物丰度分析(genus)；control：空白对照组；7，8-dhf：7，8-二羟基黄酮组。
21.图4为本发明实施例3中7，8-二羟基黄酮处理后肠道菌群中差异物种lefse分析图。
22.图5为本发明实施例3中7，8-二羟基黄酮处理组肠道菌属相对丰度的变化图，t检验：*：p《0.05；**：p《0.01；***：p《0.001。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.本发明实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、
试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
25.实施例1、7，8-二羟基黄酮与肠道菌群共孵育后上清对黄嘌呤氧化酶活性的抑制效果具体实验步骤如下：
26.1、制备粪便微生物悬液
27.1.1实验材料：
28.(1)7，8-二羟基黄酮，纯度≥98.0％，上海麦克林生化科技有限公司；别嘌呤醇，纯度98.0％，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；l-半胱氨酸盐酸盐，纯度99.0％，上海麦克林生化科技有限公司。
29.(2)实验用培养基：在灭菌超纯水中加入蛋白胨水(2.0g/l)、酵母提取物(2.0g/l)、l-半胱氨酸盐酸盐(0.5g/l)、nacl(1.0g/l)、k2hpo4(0.4g/l)、kh2po4(0.4g/l)、mgso4·
7h2o(0.1g/l)、cacl2·
2h2o(0.1g/l)、nahco3(4.0g/l)、氯化血红素(5mg/l)、维生素k1(10μl/l)、胆酸(0.25g/l)、鹅去氧胆酸(0.25g/l)、吐温80(2ml/l)，其中不溶于水的物质均使用相应的溶剂完全溶解后再加入培养基中，超声完全溶解，使用ph计用稀盐酸调节ph值至6.5
±
0.2(25℃)，用0.22μm滤头进行过滤除菌，4℃避光保存备用。
30.(3)实验动物：无特定病原体(specific pathogen free,spf)级6～12周龄c57bl/6雌性鼠，购自南方医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证号scxk(粤)2016-0041。
31.1.2实验准备：
32.(1)样品采集后的预处理均在厌氧工作站(10％h2，10％co2和80％n2，37℃)中进行，实验中所需的所有材料及试剂等均提前放入厌氧工作站中进行预还原处理
33.(2)配制含有0.1％l-半胱氨酸盐酸盐的磷酸盐缓冲液：称取l-半胱氨酸盐酸盐0.01g，溶于10ml磷酸盐缓冲液中，充分溶解，用0.22μm滤头过滤至灭菌的离心管中，现用现配。
34.(3)吸取250μl含有0.1％l-半胱氨酸盐酸盐pbs溶液加入无菌2ml离心管中。
35.(4)药物的配制：准确称取7，8-二羟基黄酮和别嘌呤醇各10mg，分别加入dmso溶解配制成浓度为10mm的储备液，用0.22μm滤头过滤至灭菌的离心管中，于-20℃避光保存。实验前从冰箱取出并平衡至室温，吸取部分备用。
36.1.3、样品的采集及预处理：
37.(1)将小鼠转移至洁净开放式鼠盒中，快速收集新鲜小鼠粪便0.1g放入含有250μl0.1％l-半胱氨酸盐酸盐pbs溶液的无菌2ml离心管中。
38.(2)迅速转移至厌氧工作站，打开管盖，进行气体交换，充分涡旋混匀至接近均质状态。
39.(3)加入750μl培养基，以最大转速涡旋15s；室温，1,000rpm，离心30s。
40.(4)将离心得到的上清(约750μl)转移至洁净无菌的2ml离心管a中。
41.(5)剩余沉淀中加入750μl培养基，以最大转速涡旋15s；室温，1,000rpm，离心30s。
42.(6)将离心得到的上清(约750μl)转移至步骤“4”中的2ml离心管a中。
43.(7)剩余沉淀中加入750μl培养基，以最大转速涡旋15s；室温，1,000rpm，离心30s。
44.(8)将离心得到的上清(约750μl)转移至洁净无菌的2ml离心管b中。
45.(9)剩余沉淀中加入750μl培养基，以最大转速涡旋15s；室温，1,000rpm，离心30s。
46.(10)将离心得到的上清(约750μl)转移至步骤“8”中的2ml离心管b中(此时应有2
个含有约1.5ml上清液的2ml离心管)。
47.(11)将含有约1.5ml上清液的2ml离心管a，室温，4,000
×
g离心5min。
48.(12)将离心后的上清液小心移出弃去，将含有约1.5ml上清液的2ml离心管b中液体转移至离心管a；室温，4,000
×
g离心5min。
49.(13)将离心后的上清液小心移出弃去，用1ml培养基重悬，得到小鼠粪便微生物悬液。
50.2、7，8-二羟基黄酮与肠道菌群共孵育
51.(1)将按照处理后的小鼠粪便微生物悬液按照最终接种浓度为40％(w/v)立即接种至优化后的mipro培养基中，涡旋充分混匀。
52.(2)药物处理组：吸取500μl浓度为40％(w/v)的小鼠粪便微生物悬液至96深孔板中；每孔加入浓度为1mm的7，8-二羟基黄酮工作液100μl以及400μl培养基。
53.(3)阳性对照组：吸取500μl浓度为40％(w/v)的小鼠粪便微生物悬液至96深孔板中；每孔加入浓度为1mm的别嘌呤醇工作液100μl以及400μl培养基。
54.(4)空白对照组：以不加药仅含有dmso处理的小鼠粪便悬液作为空白对照，实验条件下dmso的最终浓度为1％。
55.(5)静置在37℃、厌氧条件下共孵育48h。
56.3、7，8-二羟基黄酮与肠道菌群共孵育后上清对黄嘌呤氧化酶活性抑制实验
57.3.1实验材料：
58.黄嘌呤氧化酶(xo)，效价8.6u/mg，上海源叶生物有限公司；黄嘌呤(xanthine)，纯度≥98.0％，美国mce公司；磷酸盐缓冲液(pbs)，ph 7.4，thermo fisher公司。
59.3.2实验准备：
60.(1)主要试剂配制
61.黄嘌呤氧化酶溶液：精密称取黄嘌呤氧化酶2mg，放入2ml离心管中，加入1ml磷酸盐缓冲液，充分溶解，用磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度，现用现配。
62.黄嘌呤储存液：精密称取黄嘌呤0.0152g，放入15ml离心管中，加入少量1mol/l氢氧化钠溶液，超声至完全溶解后用磷酸盐缓冲液定容至10ml，超声溶解，则配制为10mm的黄嘌呤储存液，用0.22μm滤头过滤至灭菌的离心管中，于-20℃避光保存。实验前从冰箱取出黄嘌呤储存液并平衡至室温，配制黄嘌呤工作液，用磷酸盐缓冲液稀释至所需浓度，现用现配。
63.3.3黄嘌呤氧化酶活性抑制实验
64.(1)将各处理组样品孵育48h后快速取出并转移至洁净无菌的2ml离心管中，在室温下，5,000rpm离心10min，吸取样品上清进行检测，剩余样品于-80℃保存。
65.(2)取样品上清100μl加入96孔板中，再加入50μl黄嘌呤氧化酶(0.04u/ml)，吹打混匀后，于37℃静置60min；加入50μl黄嘌呤(400μmol/l)启动反应，吹打混匀注意不要有气泡。
66.(3)使用多功能酶标仪检测20min内290nm处吸光值随时间的变化，每120s检测一次。实验结果经过三个生物学重复后进行统计分析。以反应时间为横坐标，吸光值为纵坐标作图并计算出曲线斜率，即样品组反应速率为as；空白对照组反应速率为ac；相对抑制率计算方法如下：
[0067][0068]
结果分析
[0069]
7，8-二羟基黄酮与肠道菌群共孵育后上清液对xo的相对抑制率计算结果如图1所示，阳性对照组别嘌呤醇与肠道菌群共孵育后的上清液对黄嘌呤氧化酶的相对抑制率为(60.15％
±
0.66)％。7，8-二羟基黄酮与肠道菌群共孵育后的上清液对黄嘌呤氧化酶的相对抑制率为(50.57％
±
1.15)％。
[0070]
实施例2、7，8-二羟基黄酮单独对黄嘌呤氧化酶活性的抑制效果
[0071]
1相关实验材料及准备工作同实施例1中步骤3.1和3.2所述。
[0072]
2黄嘌呤氧化酶活性的抑制实验
[0073]
(1)实验中阳性对照组为别嘌呤醇，空白对照组为含有1％dmso的培养基，取7,8-二羟基黄酮、别嘌呤醇(100μm)100μl加入96孔板中，再加入50μl黄嘌呤氧化酶(0.04u/ml)，吹打混匀后，于37℃静置60min；加入50μl黄嘌呤(400μmol/l)启动反应，吹打混匀注意不要有气泡。
[0074]
(2)使用多功能酶标仪检测20min内290nm处吸光值随时间的变化，每120s检测一次。实验结果经过三个生物学重复后进行统计分析。以反应时间为横坐标，吸光值为纵坐标作图并计算出曲线斜率，即样品组反应速率为as；空白对照组反应速率为ac；相对抑制率计算方法如下：
[0075][0076]
结果分析
[0077]
7，8-二羟基黄酮单独对xo的相对抑制率计算结果如图2所示，阳性对照组别嘌呤醇单独对黄嘌呤氧化酶的相对抑制率为(74.75％
±
4.63)％。7,8-二羟基黄酮单独对黄嘌呤氧化酶无明显抑制作用，其相对抑制率为(1.40％
±
1.80)％。
[0078]
实施例3、7，8-二羟基黄酮对肠道菌群的调节效果
[0079]
1实验材料
[0080]
qiaamp powerfecal pro dna kit，凯杰生物科技有限公司；sybr qpcr master mix，南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
[0081]
2宏基因组测序
[0082]
(1)文库构建及上机测序
[0083]
使用dna提取试剂盒提取样本dna并检测合格后，使用超声破碎仪随机打断后进行文库构建。构建完成后，用qubit 2.0进行初步定量，稀释文库，随后检测文库的插入片段，并对文库的有效浓度进行定量。库检合格后，按照有效浓度及目标下机数据量的需求使用illumina pe150(2x150)平台测序。
[0084]
(2)数据预处理
[0085]
对测序获得的原始数据(raw data)，进行预处理，包括质控和去宿主序列获取用于后续分析的有效序列(clean data)。
[0086]
(3)物种及功能注释与评估
[0087]
使用kraken2软件对有效序列进行物种注释分类，用bracken软件对样本中物种的
实际丰度进行估计。使用humann2软件将质控和去宿主之后的序列与uniref 90进行比对，根据uniref 90id和各功能数据库的对应关系，得到各个功能数据库的注释信息和相对丰度表。
[0088]
(4)数据处理
[0089]
采用lefse(linear discriminant analysis effect size,lefse)分析方法进行差异显著性分析，并根据线性判别分析(lda)对数据进行分类和评估差异显著物种的影响力(即lda score)，lda阈值默认为2～4，绘制lda柱状图。
[0090]
结果分析
[0091]
药物处理后在菌群微生物丰度变化结果如图3所示：
[0092]
图3a展示了7，8-二羟基黄酮处理后菌群在门分类水平上物种丰度的变化情况。从图中可以看出菌群主要分属于变形菌门(proteobacteria)、厚壁菌门(firmicutes)、拟杆菌门(bacteroidetes)以及放线菌门(actinobacteria)。与空白对照组相比，7，8-二羟基黄酮处理后引起菌群中厚壁菌门的丰度升高以及拟杆菌门丰度降低。
[0093]
图3b展示了7，8-二羟基黄酮处理后菌群在科分类水平上物种丰度的变化情况。从各组在科水平下的菌群相对丰度可知，肠杆菌科(enterobacteriaceae)在各组的检出率相似。与空白对照组相比，7，8-二羟基黄酮处理组菌群中乳杆菌科(lactobacillaceae)平均相对丰度增加，拟杆菌科(bacteroidaceae)平均相对丰度降低。
[0094]
图3c展示了7，8-二羟基黄酮处理后菌群在属分类水平上物种丰度的变化情况。从各组在属水平下的菌群相对丰度可知，肠杆菌科的埃希菌属(escherichia)在各组的占比较为接近。而药物处理组的乳杆菌科的三个菌属(lactobacillus、limosilactobacillus以及ligilactobacillus)的平均相对丰度均高于空白对照组。
[0095]
药物处理后在菌群微生物物种差异分析结果：
[0096]
由图4可知，与空白对照组相比，经过7，8-二羟基黄酮处理后菌群中乳杆菌科lactobacillus菌属以及ligilactobacillus菌属的丰度显著升高；拟杆菌目(bacteroidales)的细菌丰度显著下降。
[0097]
3通过实时荧光定量pcr检测菌群中调节菌属在药物处理后相对丰度的变化：
[0098]
(1)药物与菌群培养后的沉淀物于-80℃储存的样品取出自然解冻。
[0099]
(2)按照qiaamp
○
r powerfecal
○
r pro dna kit粪便基因组提取试剂盒的说明书，提取样品dna。
[0100]
(3)通过琼脂糖凝胶电泳检测dna提取质量，并使用nano drop微量紫外分光光度计检测dna浓度和纯度，保存于-20℃冰箱备用。
[0101]
(4)采用sybr荧光染料法进行qpcr实验，将质检合格后的样本总dna，用无菌超纯水稀释至10ng/μl作为qpcr待测dna模板，检测拟杆菌属(bacteroides)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、乳杆菌属(lactobacillus)、普雷沃菌属(prevotella)；嗜黏蛋白阿克曼菌(akkermansia)、肠球菌属(enterococcus)、以及肠杆菌科(enterobacteriaceae)，所有检测模板的不同引物均设置3个技术重复，且每个引物组都包含一个非模板阴性对照。
[0102]
(5)采用2-δδct法分析各菌属目的基因的相对差异倍数即相对丰度。δδct＝(实验组目的基因ct值-实验组内参基因ct值)-(对照组目的基因ct值-对照组内参基因ct值)，实验组与对照组目的基因相对表达的差异倍数计算公式为：
[0103]
fold change＝2-δδct
[0104]
结果分析
[0105]
实时荧光定量pcr检测结果如图5所示，7，8-二羟基黄酮处理后菌群中拟杆菌属(p＝0.004)相对丰度显著下降，乳杆菌属相对丰度显著上升(p＝0.004)，对双歧杆菌属、普雷沃菌属、嗜黏蛋白阿克曼菌、肠球菌属和肠杆菌科的影响差异不显著(p》0.05)。
[0106]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为了清楚地说明本发明技术方案的所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
技术特征：1.7，8-二羟基黄酮在制备靶向肠道菌群的黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用。2.根据权利要求1所述的7，8-二羟基黄酮在制备靶向肠道菌群的黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用，其特征在于，所述7，8-二羟基黄酮通过调节肠道菌群，抑制黄嘌呤氧化酶活性。3.根据权利要求2所述的7，8-二羟基黄酮在制备靶向肠道菌群的黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用，其特征在于，所述肠道菌群包括拟杆菌属、乳杆菌属。4.权利要求1-3任意一项中所述的靶向肠道菌群的黄嘌呤氧化酶抑制剂用于制备预防和治疗高尿酸及相关疾病的药物中的用途。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物以肠道菌群作为药物靶点，抑制黄嘌呤氧化酶活性。6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物包括预防或治疗有效量的抑制剂和医学上可接受的载体。7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述相关疾病包括痛风、高血压、脑血栓、冠心病、肾结石、糖尿病。8.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物形式包括口服片剂、口服硬胶囊、口服软胶囊、口服滴剂、口服颗粒剂。
技术总结本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种靶向肠道菌群的黄嘌呤氧化酶抑制剂及其应用。本发明提供了7，8-二羟基黄酮在制备靶向肠道菌群的黄嘌呤氧化酶抑制剂中的应用，7，8-二羟基黄酮本身对黄嘌呤氧化酶活性无明显的抑制作用，但其在肠道内可以与微生物发生相互作用，通过改变肠道菌群的组成，肠道菌群通过代谢药物，改变其药理作用，进而抑制黄嘌呤氧化酶活性，减少痛风和高尿酸血症患者体内尿酸生成，从而达到调节机体健康和防治疾病的目的。从而达到调节机体健康和防治疾病的目的。从而达到调节机体健康和防治疾病的目的。
技术研发人员：孙坚 韦然 李龚 仁昊 夏丽娟 万磊 刘雅红 廖晓萍
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2022.07.08
技术公布日：2022/11/1
