作为对抗牙周炎或牙龈炎的活性物质的胶原蛋白水解物
1.本发明涉及在牙周炎或牙龈炎的治疗和/或预防中用作活性物质的胶原蛋白水解物。
2.牙周炎是所谓的牙周组织的炎症，即颌骨中容纳牙齿的整个组织都受到这种疾病的影响。通俗地说，尽管在医学上不正确，但这种疾病通常也被称为牙周病(periodontosis)。
3.相反，牙龈炎仅仅是牙龈或牙龈线的炎症。然而牙龈炎通常是牙周炎的前兆，并且如果不及时治疗可能会发展成后者。因此，在本说明书的范围内，在提到牙周炎的治疗或预防的情况下，这也总是包括牙龈炎的治疗或预防，除非所考虑的上下文指明不是如此。
4.在发达国家，牙周炎和牙龈炎属于最常发生的疾病。在德国，它目前影响约2千3百万人。
5.牙周炎可以是急性的，但通常采取慢性过程。由于它在初始阶段通常是无痛的，因此通常发现得太晚，经常在40至50岁的患者中。典型症状是发红、肿胀、牙龈出血和牙龈萎缩。后者导致暴露的牙颈的疼痛敏感性增加。在进一步发展的阶段中，牙周炎可能导致牙齿松动并最终导致牙齿脱落。
6.然而，除了对牙周组织或牙齿的负面和部分严重影响之外，牙周炎也可能具有全身影响。一方面，发炎的牙周组织有利于病原体浸润到血流中，另一方面，受影响的组织会产生促炎信使物质。因此，慢性牙周炎在某些情况下导致心血管疾病、呼吸系统疾病、心脏病发作和中风风险的显著提高。
7.牙周炎的病因疗法在此之前尚不为人所知。然而，疾病的进展可以通过定期机械去除龈上和龈下菌斑来限制，尽管在晚期阶段也可能需要对牙龈进行手术切口。在某些情况下，抗生素的给药是另外的权宜之计。整体来看，这种牙周炎治疗的时间长，费用高。
8.针对这一背景，本发明的目的是提出一种用于牙周炎或牙龈炎的治疗和/或预防的活性物质。
9.为了实现这个目的，根据本发明提出了使用胶原蛋白水解物作为适合的活性物质。在一项双盲安慰剂对照临床研究的基础上可以清楚地证实胶原蛋白水解物在牙周炎治疗中的功效，所述研究的结果在下文中进一步详细呈现。
10.胶原蛋白水解物的生理效应在相当长的时间里已为人所知，特别是与骨质疏松症相关联或在关节疾病中。胶原蛋白水解物对皮肤健康的正面效应也已被描述，例如在国际专利申请wo 2012/065782 a2中。然而，胶原蛋白水解物在治疗牙周炎中的高功效是令人吃惊的。
11.作为也被用作食品的动物起始材料的副产物的胶原蛋白水解物从健康的观点来看是完全无害的产品，没有已知的有害副作用。它不需要法律批准即可用作药物，并且可以特别地以膳食补充剂的形式销售和使用。胶原蛋白水解物作为膳食补充剂、作为非处方(otc)药或作为处方药(特别是与其他活性物质组合)的用途，包括在本发明的范围之内。与这种分类无关，胶原蛋白水解物是一种活性治疗物质。
12.理想情况下，胶原蛋白水解物口服给药。已知胶原蛋白水解物的肽即使具有高达
10,000da的相对高的分子量，也至少以一定程度在肠内吸收。
13.胶原蛋白水解物的具体剂型可以包括粉剂、溶液、片剂或胶囊。
14.进一步优选的剂型是口香糖、特别是基于压缩组合物的口香糖、吮吸含片或在口中保留相对较长时间的类似产品，以及可饮用的漱口水。这种给药类型除了全身作用之外，还允许胶原蛋白水解物对牙龈产生强烈的局部效应。
15.所述给药的胶原蛋白水解物的每日剂量，特别是在口服给药的情况下，有利地为约1至约20g，优选为约2至约15g，更优选为约3至约10g。在临床研究中，使用5g胶原蛋白水解物的每日剂量可以表现出功效。
16.本发明的优选实施方式涉及牙周炎或牙龈炎的治疗，即向患有相应疾病、特别是慢性牙周炎的患者给药胶原蛋白水解物。在这种情况下，特别是在晚期疾病的情况下，所述给药有利地与用于牙周炎的其他疗法相组合进行。这种其他疗法特别是包括机械去除龈上和龈下菌斑(生物膜和牙垢)。尽管根据本发明的胶原蛋白水解物的给药不能替代牙菌斑的去除，但它可以积极影响疾病的进展并且可以显著减少由牙周炎造成的损伤。在某些情况下，最终还需要采取手术措施的重型疾病可以通过给药胶原蛋白水解物来预防。
17.本发明的另一个实施方式涉及牙周炎或牙龈炎的预防。就此而言，向存在这些疾病的一种或多种风险因子的患者给药胶原蛋白水解物是特别有利的。这些牙周炎的风险因子具体来说包括免疫系统减弱、吸烟、激素变化(例如更年期)和某些遗传障碍(例如唐氏综合征)。现有的牙龈炎通常可以被认为是牙周炎的风险因子，因此通过给药胶原蛋白水解物治疗牙龈炎同时也构成了牙周炎的预防。
18.根据本发明，作为活性物质的胶原蛋白水解物通常具有500至15,000da、优选地1,000至8,000da、更优选地1,500至5,000da、最优选地1,800至2,200da的平均分子量。在这些陈述中总是意味着重均分子量，其具体来说可以通过凝胶渗透色谱来确定。
19.所述胶原蛋白水解物优选地通过含胶原蛋白起始材料的酶水解来生产。具体来说，将微生物或植物来源的内肽酶或外肽酶用于这种水解。在所需分子量范围内的胶原蛋白水解物可以通过适合地选择肽酶或水解条件来生产。
20.所述含胶原蛋白起始材料通常选自脊椎动物、优选为哺乳动物或鸟类的皮或骨骼，特别是牛或猪的皮(分别为牛剖层皮或猪皮)。可选地，所述含胶原蛋白起始材料可以选自鱼类、特别是冷水鱼或热带鱼的皮、骨骼和/或鳞。
21.所述胶原蛋白水解物可以从这些起始材料在一步法中生产，或利用中间阶段明胶来生产；在后一种情况下，可以使用a型和b型明胶两者。
22.所述胶原蛋白水解物优选地通过至少两种具有不同特异性的内切蛋白酶，特别是至少两种不同的金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶，即在特定氨基酸之前或之后切割胶原蛋白分子的氨基酸序列的蛋白酶的连续作用来生产。方便地，所述金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶是来自于微生物枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)、米曲霉(aspergillus oryzae)和蜂蜜曲霉(aspergillus melleus)的酶。
23.由于选择了适合的内切蛋白酶，因此不仅可以获得所述胶原蛋白水解物的特定的分子量分布，而且也影响了所述水解物中包含的肽的末端处的氨基酸类型。就此而言，优选情况下例如所述胶原蛋白水解物的至少50％的n-端氨基酸是疏水氨基酸，特别是丙氨酸、
亮氨酸和异亮氨酸。
24.除了酶水解之外，在本发明的范围之内所述胶原蛋白水解物可以通过重组基因表达来生产。利用特别是来自于牛或猪的天然胶原蛋白序列及其在遗传修饰细胞(例如酵母、细菌或植物细胞，特别是烟草)中的表达，可以生产与所述相应的含胶原蛋白原材料的水解产物基本上一致的产物。在这种情况下有可能获得更窄或精确指定的分子量分布。
25.本发明还涉及一种用于治疗和/或预防牙周炎或牙龈炎的治疗方法，所述方法包括向患者给药胶原蛋白水解物。这种方法的有利和优选实施方式已与根据本发明的胶原蛋白水解物相结合进行了描述。
26.胶原蛋白水解物在治疗牙周炎中的功效，将在下文描述的临床研究的基础上和对牙龈成纤维细胞进行的细胞试验的基础上更详细地解释。
27.1.临床研究
28.1.1研究设计
29.所述双盲、安慰剂对照的临床研究在w
ü
rzburg大学医院牙周病科，对43名由于现有的牙周炎而到那里接受常规治疗(每年2至4次去除龈下菌斑)的患者进行。所有研究参与者都具有至少三颗牙龈指数为1或2(参见下文)的牙齿，牙龈袋的探诊深度为至少3毫米。参与者的年龄在35至70岁之间，bmi在24至30之间。
30.参与者被随机分为23名患者的治疗组和20名患者的安慰剂组，参与者和医务人员均不被告知个体参与者的划分。
31.治疗组的参与者在90
±
14天的整个研究期间接受5g胶原蛋白水解物的每日剂量。使用通过牛胶原蛋白的酶水解产生并具有约2,000da的平均分子量的胶原蛋白水解物，其由申请人gelita ag在名称verisol b下销售。verisol b的生产基本上对应于wo 2012/065782a2中描述的生产方法。
32.安慰剂组中的参与者代替所述胶原蛋白水解物接受相应的每日剂量的安慰剂，其与所述胶原蛋白水解物在包装、质地和口味方面无法区分。
33.在研究开始时(v1，第0天)，为所有研究参与者提供全面检查并确定了表征牙周炎状态的一系列参数和指标。患者然后经历专业牙齿清洁过程，机械去除龈上和龈下菌斑。
34.利用第二次检查(v2，在60
±
14天后)和研究期结束时的第三次检查(v3，在90
±
14天后)再次确定相同的参数和指标。并非所有最初的43名研究参与者都可以进行所有检查；两组中的每一组接受检查的参与者人数在下文的评估中说明。
35.治疗组与安慰剂组之间所确定的参数和指标的变化的比较，使得可以确定胶原蛋白水解物在牙周炎治疗中的功效。
36.1.2探诊出血
37.对于探诊出血(bop)测试来说，将牙周探针引入到牙龈袋中。在这里发生的任何出血都是急性炎症的明确迹象。
38.所述探诊出血测试在检查v1、v2和v3时进行，在每种情况下使用牙周探针pcp-11；发生出血的所有牙龈袋的百分率在这里被检测为每位患者的bop[％]。结果示出在下面的表1中。
[0039]
表1：探诊出血(bop)
[0040][0041]
这些结果显示，在研究期间所有患者中出血牙龈袋的百分率降低，但与安慰剂组中的参与者相比，对于治疗组中的参与者来说明显更是如此。
[0042]
1.3菌斑控制记录
[0043]
为了根据o’leary等1972确定菌斑控制记录(pcr)，将菌斑染色并用光学方法记录它沿着整个牙龈线(即在牙齿的所有侧面上)的范围。所述参数从菌斑阳性表面的数量相对于评估表面的总数的百分数形成。
[0044]
检查v1、v2和v3中pcr[％]的结果示出在下面的表2中。
[0045]
表2：菌斑控制记录(pcr)
[0046][0047]
结果显示，在研究期间所有患者中的pcr降低，但与安慰剂组中的参与者相比，治疗组中的参与者更是如此。
[0048]
1.4牙龈指数
[0049]
根据1967的牙龈指数(gi)(根据lobene等1986修改)，按照下述纲要，通过目测评估颊侧上的牙龈的急性炎症状态来给出：
[0050]
0级：无炎症
[0051]
1级：牙龈的某个区域，但不是整个牙龈线或牙龈乳头颜色改变
[0052]
2级：涉及整个牙龈线或牙龈乳头的颜色变化
[0053]
3级：与2级相同，但明显发红
[0054]
对于每位患者来说，牙龈指数gi被提供为所有牙齿的指数的平均值。牙龈指数的检查结果示出在下面的表3中。
[0055]
表3：牙龈指数(gi)
[0056][0057]
结果显示，在研究期间所有患者中的牙龈指数降低，即牙龈炎症的急性程度降低。然而，与安慰剂组中的参与者相比，对于治疗组中的参与者来说这种降低明显更大。
[0058]
1.5 pisa评分
[0059]
pisa评分表示以mm2为单位的牙周炎症区域的范围(牙周发炎表面积)。pisa评分可以从上述参数计算出来；结果示出在下面的表4中。
[0060]
表4：pisa评分
[0061][0062][0063]
结果显示在研究期间所有患者的pisa评分显著降低，但是对于这个参数来说，也
是治疗组中参与者的变化远远比安慰剂组中的参与者更加显著。
[0064]
1.6概述
[0065]
所述临床研究在探诊出血、菌斑控制记录、牙龈指数和pisa评分的基础上显示，与安慰剂组中相比，通过5g胶原蛋白水解物的每日给药实现了牙周炎明显更大的改善。这个结果在3个月的相对短的时间段内实现，并且两个组都接受相同的常规治疗(龈上和龈下菌斑去除)。
[0066]
因此，结果清楚地证实了胶原蛋白水解物在牙周炎或牙龈炎的治疗和/或预防中作为活性物质的功效。
[0067]
2.对牙龈成纤维细胞的细胞测试
[0068]
牙龈由牙龈成纤维细胞(牙龈细胞)和由这些细胞形成并含有不同类型的胶原蛋白和蛋白聚糖的细胞外基质组成。在牙周炎或牙龈炎的情况下，这些基质蛋白的生物合成与降解之间的平衡通常也被破坏。因此，刺激基质蛋白被成纤维细胞的合成可以对抗牙周炎或牙龈炎。
[0069]
在下文描述的细胞测试中，在体外研究了具有不同平均分子量的胶原蛋白水解物对人类牙龈成纤维细胞中基质蛋白i型胶原蛋白、双糖链蛋白聚糖和饰胶蛋白聚糖的合成的刺激作用。这通过利用实时pcr和半定量评估(基于不含胶原蛋白水解物的对照)确定相应的mrna的表达来实现。
[0070]
从手术取出的牙龈组织通过酶消化分离人类牙龈成纤维细胞，并将其在增补有10％胎牛血清、20u/ml青链霉素和50μg/ml帕曲星的ham f12培养基中培养。在达到80％合生后，将培养基用增补有0.5mg/ml胶原蛋白水解物的新鲜培养基更换。
[0071]
所述细胞测试使用三种不同的胶原蛋白水解物进行：(1)平均分子量为约2,000da的牛胶原蛋白水解物，其也被用于上述临床研究中，(2)平均分子量为约3,000da的猪胶原蛋白水解物，和(3)平均分子量为约6,000da的牛胶原蛋白水解物。
[0072]
在将所述成纤维细胞在特定胶原蛋白水解物存在下(或者在对照的情况下无胶原蛋白水解物)温育24h后，收获细胞并裂解，然后提取并沉淀总rna。
[0073]
i型胶原蛋白、双糖链蛋白聚糖和饰胶蛋白聚糖的mrna的量的半定量评估结果在图中示出。
[0074]
具体来说，所述图显示了：
[0075]
图1：约2,000da的牛胶原蛋白水解物对基质蛋白合成的刺激；
[0076]
图2：约3,000da的猪胶原蛋白水解物对基质蛋白合成的刺激；和
[0077]
图3：约6,000da的牛胶原蛋白水解物对基质蛋白合成的刺激。
[0078]
因此，所有三种研究的胶原蛋白水解物在体外均导致由人牙龈成纤维细胞进行的由i型胶原蛋白、双糖链蛋白聚糖和饰胶蛋白聚糖构成的细胞外基质蛋白的合成的显著刺激。对于平均分子量为约2,000da的胶原蛋白水解物来说这种效应最强，特别是对于刺激i型胶原蛋白和饰胶蛋白聚糖的合成来说。
[0079]
这个结果证实了胶原蛋白水解物在牙周炎或牙龈炎的治疗和/或预防中的功效。在这里，至少一种作用机制是通过在胶原蛋白水解物的作用下加强基质蛋白合成来强化牙龈的细胞外基质。
技术特征：1.一种胶原蛋白水解物，其在牙周炎或牙龈炎的治疗和/或预防中用作活性物质。2.根据权利要求1所述的用途的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物是膳食补充剂或药物。3.根据前述权利要求所述的用途的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物被口服给药。4.根据权利要求3所述的用途的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物以粉剂、溶液、片剂或胶囊的形式给药。5.根据前述权利要求所述的用途的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物以约1至约20g的每日剂量，优选地以约2至约15g的每日剂量，更优选地以约3至约10g的每日剂量给药。6.根据前述权利要求所述的用途的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物被给药到患有牙周炎或牙龈炎、特别是慢性牙周炎的患者。7.根据权利要求6所述的用途的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物与用于牙周炎或牙龈炎的其他疗法、特别是龈上和龈下菌斑的机械去除相结合给药。8.根据权利要求1至5所述的用途的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物被给药到存在牙周炎或牙龈炎的一种或多种风险因子的患者。9.根据前述权利要求所述的用途的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物具有500至15,000da、优选地1,000至8,000da、更优选地1,500至5,000da、最优选地1,800至2,200da的平均分子量。10.根据前述权利要求所述的用途的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物通过含胶原蛋白起始材料的酶水解来生产。11.根据权利要求10所述的用途的胶原蛋白水解物，其中所述含胶原蛋白起始材料选自脊椎动物、优选为哺乳动物、鸟类或鱼类的皮或骨骼，特别是选自牛或猪的皮。12.根据权利要求10或11所述的用途的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物通过至少两种具有不同特异性的内切蛋白酶、特别是至少两种不同金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶的连续作用来生产。13.根据权利要求12所述的用途的胶原蛋白水解物，其中所述金属蛋白酶和/或丝氨酸蛋白酶选自来自于微生物枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)、米曲霉(aspergillus oryzae)和蜂蜜曲霉(aspergillus melleus)的酶。14.根据权利要求12或13所述的用途的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物的至少50％的n-端氨基酸是疏水氨基酸，特别是丙氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。15.根据权利要求1至9所述的用途的胶原蛋白水解物，其中所述胶原蛋白水解物通过重组基因表达来生产。
技术总结本发明涉及在牙周炎或牙龈炎的治疗和/或预防中用作活性物质的胶原蛋白水解物。预防中用作活性物质的胶原蛋白水解物。预防中用作活性物质的胶原蛋白水解物。
技术研发人员：斯特凡
受保护的技术使用者：嘉利达股份有限公司
技术研发日：2020.12.17
技术公布日：2022/11/1
