ABCB5抑制剂在制备多耐药性类风湿性关节炎治疗药物中的应用

abcb5抑制剂在制备多耐药性类风湿性关节炎治疗药物中的应用
技术领域
1.本发明属于靶向性治疗药物开发领域，具体涉及abcb5抑制剂在制备多耐药性类风湿性关节炎治疗药物中的应用。


背景技术：

2.类风湿性关节炎(ra)是一种常见的自身免疫性疾病，全球范围内约有3000万患者。ra是一种慢性疾病，会造成关节骨骼损伤，致残率达到30％-50％，且病情缠绵，难以治愈。患病后会导致劳动力逐渐丧失，社会参与度下降，而且患者还需面临长期的医疗费用支出，对患者的生活质量带来了极大的挑战。因此，精准的早期诊断(并迅速开始治疗)和设计合理的治疗策略(仔细控制炎症，减少或防止疾病损害) 对于改善ra患者的病情和生活水平都有极大的帮助。
3.非甾体抗炎药(nsaids)、类固醇和改善症状抗风湿病药物(dmards)是三种主要的ra干预手段。然而这些药物都存在着一定的缺陷性，如dmards的使用会伴随一些不良的副作用。而且耐药性的产生也是目前阻碍ra成功治疗的主要原因之一。据统计，约有25％的ra患者存在多重耐药性，从而不得不停止dmards等药物的使用。其中，dmards代表药物mtx因其物美价廉。美国风湿病学会(acr) 和欧洲抗风湿病联盟(eular)推荐使用低剂量的mtx用于新诊断为ra的患者的治疗。但是，ra患者对 mtx治疗无反应/耐药的发生。率估计范围为30％至50％。药物的外排是导致mtx耐药的原因之一，同时，mtx的药物外排，与abc转运蛋白家族的abcb5相关。
4.因此，如能开发出一种可以针对性克服类风湿性关节炎的多耐药性的新药将对ra的成功治疗具有极为重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出abcb5抑制剂在制备多耐药性类风湿性关节炎治疗药物中的应用。在本发明中，发明人发现了一种青藤碱衍生物，并首次发现该衍生物与青藤碱同样具有抑制abcb5介导mtx耐药反应的功能，并通过试验发现，该衍生物能够显著改善多耐药性类风湿性关节炎，且治疗活性高于青藤碱。
6.本发明的第一个方面，提供一种青藤碱衍生物，1.所述青藤碱衍生物为青藤碱的4位羟基发生取代或亲核酰基取代反应形成的化合物，所述青藤碱衍生物的结构式为：
[0007][0008]
或
[0009][0010]
其中，所述式i中，r基团选自氢、取代或未取代的苯胺基、含氮烷烃、咪唑；
[0011]
或
[0012]
不含有r基团，且a位与b位的c连接形成环，得到如下所述结构：
[0013][0014]
所述式ii中，r基团选自氢、含腈烷烃。
[0015]
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述式i中，r基团选自如下所示结构：
[0016][0017][0018]
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述式ii中，r基团选自含腈c
1-8
烷烃。
[0019]
在本发明的一些实施方式中，所述式ii中，r基团选自含腈c
2-5
烷烃。
[0020]
在本发明的一些实施方式中，所述式ii中，r基团选自如下所示结构：
[0021][0022]
在本发明的一些实施方式中，所述青藤碱衍生物具体为：
[0023]
[0024]
[0025]
[0026][0027]
在本发明实施例中，发明人通过将青藤碱、胺基化合物在特定环境下反应制得上述青藤碱衍生物，并发现该青藤碱衍生物相比青藤碱而言，具有更强的类风湿性关节炎mtx耐药逆转效果，能够更加显著的治疗多耐药性类风湿性关节炎相关疾病，对于多耐药性类风湿性关节炎治疗或预防等相关药物的开发提供了极好的理论依据。
[0028]
本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的青藤碱衍生物的制备方法，包括如下步骤：
[0029]
(1)将青藤碱、胺基化合物在三乙胺和三光气或n,n
′‑
羰基二咪唑条件下混合即得；或
[0030]
(2)将青藤碱、含溴的腈基化合物在碱性条件下混合即得。
[0031]
在本发明的一些实施方式中，(1)中所示步骤的反应方程式可参考说明书附图图9a、图9b。(2) 中所示步骤的反应方程式可参考说明书附图图9c。
[0032]
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述胺基化合物选自苯胺、4-硝基苯胺、4
‑ꢀ
叔丁基苯胺、4-甲磺酰基苯胺、4-氯苯胺、苄胺、正戊胺、正己胺、正庚
胺。
[0033]
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述含溴的腈基化合物选自溴乙腈、4-溴丁腈、5-溴戊腈。
[0034]
在本发明的一些实施方式中，化合物2～10的制备方法参考说明书附图图9a中的反应方程进行，将三光气、青藤碱和三乙胺混合，搅拌，再加入胺基化合物，即得。
[0035]
在本发明的一些实施方式中，所述胺基化合物选自苯胺、4-硝基苯胺、4-叔丁基苯胺、4-甲磺酰基苯胺、4-氯苯胺、苄胺、正戊胺、正己胺、正庚胺。
[0036]
在本发明的一些实施方式中，化合物11和12的制备方法参考说明书附图图9b中的反应方程进行，将青藤碱、n,n
′‑
羰基二咪唑和三乙胺混合，搅拌，即得。
[0037]
在本发明的一些实施方式中，化合物13～15的制备方法参考说明书附图图9c中的反应方程进行，将青藤碱、含溴的腈基化合物在碱性和二甲基甲酰胺条件下混合即得。
[0038]
在本发明的一些实施方式中，碱性条件使用ph调节剂构建。所述ph调节剂为碱性ph调节剂，包括氢氧化物、碱性盐和碱性有机物。所述碱性盐包括碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸一氢钠、磷酸钠。所述碱性有机物包括醇钠。
[0039]
在本发明的一些实施方式中，上述反应是在特定溶剂体系中完成。
[0040]
在本发明的一些实施方式中，所述溶剂为二氯甲烷或二甲基甲酰胺。
[0041]
在本发明的一些实施方式中，所述青藤碱与胺基化合物的摩尔比为1：0.1～20。
[0042]
在本发明的一些实施方式中，所述青藤碱与胺基化合物的摩尔比为1：1～10。
[0043]
在本发明的一些实施方式中，所述青藤碱与含溴的腈基化合物的摩尔比为1：0.5～2。
[0044]
当然，本领域技术人员也可以根据本发明中提供的青藤碱衍生物结构式，采用其他方式进行合成，包括但不限于上述制备方法。
[0045]
在本发明的一些实施方式中，所述青藤碱衍生物的制备方法还包括萃取与纯化。
[0046]
在本发明的一些实施方式中，反应产物用乙酸乙酯萃取，合并有机相后干燥，过滤，浓缩，经柱层析分离纯化。
[0047]
在本发明的一些实施方式中，所述层析柱中的溶剂为二氯甲烷和甲醇，混合体积比为91～92:8～9。
[0048]
当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，采用其他方式进行化合物的萃取和纯化，包括但不限于上述方法。
[0049]
本发明的第三个方面，提供abcb5抑制剂在制备多耐药性类风湿性关节炎治疗药物中的应用。
[0050]
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述abcb5抑制剂包括青藤碱、本发明第一个方面所述的青藤碱衍生物中的至少一种。
[0051]
在本发明的一些实施方式中，所述青藤碱衍生物为青藤碱的4位羟基发生取代或亲核酰基取代反应形成的化合物。
[0052]
在本发明的一些实施方式中，所述青藤碱衍生物的结构式为：
[0053][0054]
或
[0055][0056]
其中，所述式i中，r基团选自氢、取代或未取代的苯胺基、含氮烷烃、咪唑；
[0057]
或
[0058]
不含有r基团，且a位与b位的c连接形成环，得到如下所述结构：
[0059][0060]
所述式ii中，r基团选自氢、含腈烷烃。
[0061]
在本发明实施例中，发明人通过细胞层面以及动物试验分别验证了上述abcb5抑制剂对于多耐药性类风湿性关节炎的治疗作用，并首次发现了青藤碱和青藤碱衍生物均具有能够逆转多耐药性类风湿性关节炎的耐药性的功效，尤其是，在实验中发现了经过对青藤碱构型改进的青藤碱衍生物显示出了比青藤碱更加优异的治疗效果，从而为多耐药性类风湿性关节炎的治疗提供了有利的药理依据和潜在的成药开发参考。
[0062]
在本发明的一些实施方式中，所述多耐药性类风湿性关节炎为耐甲氨蝶呤类风湿性关节炎。
[0063]
发明人发现，类风湿性关节炎mtx耐药主要是基于abcb5转运蛋白介导的mtx的外排，从而引起 mtx的耐药反应。然而目前并没有有效的药物可以实现逆转类风湿性关节炎mtx耐药，而本发明首次提出使用青藤碱和青藤碱衍生物能够有效抑制abcb5，从而有效克服mtx的外排，进而抑制了类风湿性关节炎mtx耐药。
[0064]
本发明的第四个方面，提供abcb5抑制剂联合甲氨蝶呤在制备多耐药性类风湿性关节炎治疗药物中的应用。
[0065]
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述abcb5抑制剂包括青藤碱、本发明第一个方面所述的青藤碱衍生物中的至少一种。
[0066]
在本发明的一些实施方式中，所述青藤碱衍生物为青藤碱的4位羟基发生取代或亲核酰基取代反应形成的化合物。
[0067]
在本发明的一些实施方式中，所述青藤碱衍生物的结构式为：
[0068][0069]
或
[0070][0071]
其中，所述式i中，r基团选自氢、取代或未取代的苯胺基、含氮烷烃、咪唑；
[0072]
或
[0073]
不含有r基团，且a位与b位的c连接形成环，得到如下所述结构：
[0074][0075]
所述式ii中，r基团选自氢、含腈烷烃。
[0076]
在本发明实施例中，发明人通过细胞层面以及动物试验分别验证了上述abcb5抑制剂对于多耐药性类风湿性关节炎的治疗作用，并首次发现了青藤碱和青藤碱衍生物均具有能够逆转多耐药性类风湿性关节炎的耐药性的功效，尤其是，在实验中发现了经过对青藤碱构型改进的青藤碱衍生物显示出了比青藤碱更加优异的治疗效果，从而为多耐药性类风湿性关节炎的治疗提供了有利的药理依据和潜在的成药开发参考。
[0077]
在本发明的一些实施方式中，所述多耐药性类风湿性关节炎为耐甲氨蝶呤类风湿性关节炎。
[0078]
发明人发现，类风湿性关节炎mtx耐药主要是基于abcb5转运蛋白介导的mtx的外排，从而引起 mtx的耐药反应。然而目前并没有有效的药物可以实现逆转类风湿性关节炎mtx耐药，而本发明首次提出使用青藤碱和青藤碱衍生物能够有效抑制abcb5，从而有效克服mtx的外排。因此，将青藤碱和青藤碱衍生物作为abcb5抑制剂，同时联合甲氨蝶呤应用与多耐药性类风湿性关节炎的治疗中，能有效逆转 mtx的耐药反应，回复mtx的抗炎效果。
[0079]
本发明的第五个方面，提供一种用于治疗多耐药性类风湿性关节炎的药物，所述药物中含有青藤碱、本发明第一个方面所述青藤碱衍生物中的至少一种。
[0080]
在本发明的一些实施方式中，所述青藤碱衍生物为青藤碱的4位羟基发生取代或亲核酰基取代反应形成的化合物。所述青藤碱衍生物的结构式为：
[0081][0082]
或
[0083][0084]
其中，所述式i中，r基团选自氢、取代或未取代的苯胺基、含氮烷烃、咪唑；
[0085]
或
[0086]
不含有r基团，且a位与b位的c连接形成环，得到如下所述结构：
[0087][0088]
所述式ii中，r基团选自氢、含腈烷烃。
[0089]
在本发明的一些实施方式中，所述药物中还含有药学上可接受的辅料。
[0090]
在本发明的一些实施方式中，所述辅料包括溶剂、润湿剂、乳化剂、增稠剂、赋形剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、润滑剂或稀释剂中的至少一种。
[0091]
当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理加入其他辅料，以实现特定辅料所带来的技术效果，其包括但不限于上述溶剂、润湿剂、乳化剂、增稠剂、赋形剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、润滑剂或稀释剂。
[0092]
在本发明的一些实施方式中，所述药物的剂型包括散剂、针剂、溶液剂、片剂或胶囊中的至少一种。
[0093]
当然，本领域技术人员可以根据实际使用需求，合理选择其他剂型，以实现在特定位置或特定目的性的药物释放或治疗效果，其包括但不限于上述散剂、针剂、溶液剂、片剂或胶囊。
[0094]
在本发明的一些实施方式中，所述药物中含有治疗有效量的青藤碱、青藤碱衍生物，或两者的组合。
[0095]
在本发明的一些实施方式中，所述青藤碱的治疗有效量大于或等于100mg/kg/day。
[0096]
在本发明的一些实施方式中，所述青藤碱衍生物的治疗有效量大于等于30mg/kg/
day。
[0097]
在本发明实施例中，发明人通过试验验证，发现上述青藤碱衍生物在30mg/kg/day的使用量下即可以实现较好的类风湿性关节炎mtx耐药逆转效果，甚至在某些方面，其相比100mg/kg/day的青藤碱具有更强的治疗功效。
[0098]
本发明的有益效果是：
[0099]
1.本发明中首次开发出了一种青藤碱衍生物，并发现该青藤碱衍生物具有极好的多耐药性类风湿性关节炎治疗效果，且对于试验动物并无明显的副作用，安全性较高。
[0100]
2.本发明提供了一种青藤碱衍生物的制备方法，该制备方法操作简单，反应条件温和，不会引入过多的杂质，且相对产量较高，有效产率可达80％。
[0101]
3.本发明首次发现了青藤碱和青藤碱衍生物能够抑制基于abcb5转运蛋白介导的mtx的外排，从而极好的逆转了多耐药性类风湿性关节炎的耐药性，而且在配合mtx使用后，在细胞以及动物模型层面上均显示出了极强的抑制活性和治疗效果，从而对于多耐药性类风湿性关节炎的治疗药物和治疗方案的开发与拓展起到了极为重要的意义，并真正意义上的拓宽了多耐药性类风湿性关节炎药物的开发与研究方向。
附图说明
[0102]
图1为abcb5高表达的rafls耐药细胞系的构建和流式细胞术检测rafls耐药细胞药物外排功能的强弱情况，其中，(a)为免疫印记法分析瞬时转染的rafls细胞中abcb1或abcb5表达的蛋白条带；(b)为罗丹明123(rho123)或mtx-fitc在abcb1和abcb5过表达的rafls中的外排作用流式细胞术图；(c)为rho123或mtx-fitc在abcb1和abcb5过表达的rafls中的外排效果的条形图，条形图中显示的数据用转染空载体的对照标准化。
[0103]
图2为青藤碱抑制高表达abcb5的ra-fls对rho123外排作用流式细胞术图(a)和青藤碱抑制高表达abcb5的ra-fls对rho123外排作用流式条形图(b)，维拉帕米为阳性对照；其中，(b)中条形图中显示的数据用未转染空载体的对照标准化。
[0104]
图3为mtt法验证青藤碱逆转高表达abcb5的ra-fls(a)和jurkat细胞(b)对甲氨蝶呤的耐药反应。
[0105]
图4为构建关节腔注射abcb5腺病毒介导的耐药aia大鼠模型的示意图。
[0106]
图5为免疫组化dab染色法研究abcb5腺病毒介导的耐药aia大鼠滑膜中abcb5的表达水平，其中，(a)为关节腔滑膜dab染色图，(b)为免疫组化染色评分统计学分析结果柱状图。
[0107]
图6为青藤碱联合甲氨蝶呤对耐药aia大鼠足肿胀的影响：(a)sd大鼠足部照片(b)sd大鼠足体积的变化情况。
[0108]
图7为microct分析耐药aia大鼠骨破坏程度：(a)sd大鼠足部微电脑断层扫描复原图片，黄色箭头指示显著骨破坏位点，(b)sd大鼠足部骨破坏评分统计学分析结果柱状图，(c)sd大鼠足部骨破坏程度评价表。
[0109]
图8为rt-pcr检测sd大鼠血液样本中炎症相关细胞因子表达情况，其中，结果使用健康组作为对照标准化。
[0110]
图9为本发明实施例中的青藤碱衍生物的反应方程式，其中，(a)为化合物2～10的反应方程式，(b) 为化合物11～12的反应方程式，(c)为化合物13～15的反应方程式。
[0111]
图10为不同浓度青藤碱对abcb5外排mtx-fitc功能的影响的对比图。
[0112]
图11为不同浓度青藤碱对abcb5及其突变体外排mtx-fitc功能的影响的对比图，其中，(a)、 (b)和(c)依次为100、50和20μm的青藤碱。
[0113]
图12为青藤碱衍生物(化合物2～8)对abcb5及其突变体外排mtx-fitc功能的影响的对比图。
[0114]
图13为青藤碱衍生物(化合物9～15)对abcb5及其突变体外排mtx-fitc功能的影响的对比图。
[0115]
图14为为含有{cag-loxp-stop-loxp-ratabcb5 cds-sv40 late pa}的基因载体质粒图谱(a)和构建目标图示(b)；。
[0116]
图15为本发明实施例中的cre-ert2基因载体的质粒图谱。
[0117]
图16为青藤碱及其衍生物联合甲氨蝶呤对耐药型类风湿性关节炎转基因大鼠足肿胀的改善作用对比，其中，(a)为sd大鼠足部肿胀照片；(b)为sd大鼠足体积变化情况统计学分析结果折线图。
[0118]
图17为qpcr检测大鼠血液样本的abcb5 mrna表达水平情况。
[0119]
图18为青藤碱及其衍生物联合甲氨蝶呤对耐药型类风湿性关节炎转基因大鼠的microct检测结果，其中，(a)为微电脑断层扫描足部骨结构复原图片，(b)为骨破坏评分统计学分析结果柱状图，(c) 为评分对照表。
[0120]
图19为青藤碱及其衍生物联合甲氨蝶呤治疗耐药型类风湿性关节炎转基因动物实验的红细胞血沉速率分析结果柱状图。
[0121]
图20为青藤碱及其衍生物联合甲氨蝶呤治疗耐药型类风湿性关节炎转基因动物实验中大鼠cd4+细胞内foxp3荧光染色流式细胞图。
[0122]
图21为青藤碱及其衍生物联合甲氨蝶呤治疗耐药型类风湿性关节炎转基因动物实验中大鼠cd4+细胞内il-17a荧光染色流式细胞图。
[0123]
图22为青藤碱及其衍生物联合甲氨蝶呤治疗耐药型类风湿性关节炎转基因动物实验中大鼠cd4+细胞内foxp3和il-17a流式检测荧光信号统计分析柱状图，其中，(a)为foxp3
+
t细胞占总cd4
+
细胞的百分比柱状图；(b)为il-17a
+
t细胞占总cd4
+
细胞的百分比柱状图；(c)为cd4
+
细胞中的foxp3 与il-17比值，反应二者平衡情况。
[0124]
图23为青藤碱及其衍生物(化合物2，c2)联合甲氨蝶呤治疗耐药型类风湿性关节炎转基因动物实验中大鼠血清样本中多种炎症因子含量增长倍比热图。
具体实施方式
[0125]
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
[0126]
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
[0127]
实施例1 利用高表达abcb5的rafls耐药细胞构建abcb5外排功能研究细胞平台
[0128]
参考ncbi ay230001.1合成abcb5序列(委托nanjing genscript biotech inc.进行合成操作)。在合成的abcb5序列5'端添加bamh i，在3'端添加ecor i限制性酶切位点。通
过bamh i和ecor i限制酶克隆pcdna 3.1-mrfp-abcb5质粒。通过bamh i和ecor i双酶切和测序验证单克隆。使用脂质体 (3000,invitrogen)转染试剂将abcb5重组质粒转入类风湿关节炎关节成纤维样滑膜细胞 (rafls)并接种在6孔板中，每孔rafls细胞为106个。汇合后，将5μg/ml的rho123(sigma-aldrich,r8004) 或0.5μm的mtx-fitc(invitrogen,m1198mp)添加到每个孔中，在37℃下孵育1h。使用预冷的pbs 洗涤细胞5次以停止rho123的积累。然后将细胞重悬于400μlpbs中进行流式细胞术分析。使用流式细胞仪在488nm激发波长和525nm发射波长下测量细胞内荧光。数据采集和分析均使用cell quest(bdbiosciences,sanjose,ca,usa)进行，所有试验至少进行三个独立实验。结果显示为荧光强度的平均值。
[0129]
同时，对部分转染了abcb1(作为参考，转染方法同abcb5)或abcb5重组质粒的rafls细胞使用ripa裂解液(cst,9806)处理。然后使用bio-rad蛋白质测定法(bio-radlaboratories,inc.,hercules,ca,usa)测定蛋白质浓度。
[0130]
以abcb1作为对照，检测步骤同abcb5。其中，abcb1的序列参考ncbi m14758.1。
[0131]
结果如图1所示。
[0132]
蛋白印迹法western blot结果表明，abcb1与abcb5成功在细胞内高表达。使用rho 123检测abcb5 高表达耐药细胞系药物外排转运功能正常，结果发现rho123被有效地从abcb5过表达的rafls中排出，说明abcb5转染成功后，可正常转运底物。而荧光素连接的mtx则是用于流式细胞术分析测试药物外排活性的。由于mtx是abcb5的底物，在没有abcb5瞬时表达的情况下，mtx-fitc会在细胞内积累。而基于构建的abcb5高表达耐药细胞系，由于细胞中的abcb5的过表达显着降低了rafls中mtx-fitc 的吸收累积，从而可以说明细胞内高表达的abcb5能够导致药物mtx外排。
[0133]
实施例2 利用罗丹明123(rho123)在abcb5高表达的rafls细胞中的外排作用筛选abcb5抑制剂
[0134]
基于上述实施例中的方法，使用脂质体转染试剂将abcb5重组质粒转入rafls细胞中。
[0135]
具体步骤为：在6孔板中每孔接种103个重组rafls细胞，过夜培养后。使用脂质体转染试剂将abcb5 重组质粒转入rafls细胞中，随后将细胞暴露于不同的测试药物(分别为终浓度为10μm维拉帕米 (verapamil)或100μm青藤碱(sinomenine))中，然后在37℃、含有5％co2的环境下孵育24小时。按终浓度5.0μg/ml的量加入rho123，37℃孵育1小时。使用预冷的pbs洗涤细胞5次停止rho123的积累。然后将细胞重悬于400μlpbs中进行流式细胞术分析。使用流式细胞仪在488nm激发波长和525nm发射波长下测量细胞内荧光。以转染后暴露在维拉帕米的重组rafls作为阳性对照，以转染后未经处理的的重组rafls细胞为空白阴性对照，使用转染空载体的对照组平均值进行标准化处理。
[0136]
结果如图2所示。由于abcb5所介导的mtx外排现象在ra的治疗中是一个非常大的阻力，其会使病人对mtx表现出耐药性。正常情况下，rho123在进入细胞后会形成信号累积。而abcb5高表达后，在没有药物干预的情况下rho123会被大量外排，因而荧光信号降低。相比之下，使用100μm青藤碱处理细胞后，会显著抑制外排现象，结合阳性对照维拉帕米，说明青藤碱能够有效抑制abcb5对于mtx产生的外排。
[0137]
实施例3 青藤碱逆转高表达abcb5的rafls耐药细胞对mtx耐药反应
[0138]
根据实施例2中的方法，使用脂质体转染试剂将abcb5重组质粒转入rafls和jurkat细胞中。在 96孔板中每孔接种4
×
103个abcb5转然后的rafls细胞或jurkat细胞，过夜培养后，加入100μl不同浓度(终浓度为100、50和10μm)的青藤碱，随后将细胞暴露于不同浓度(0.039-100μmol/l，dmso稀释)的mtx中72小时(对于jurkat细胞，在接种的同时即给与相应浓度的青藤碱和不同浓度的mtx)。孵育结束时将10μl 5.0mg/ml的mtt添加到每个孔中，并在37℃下孵育4小时，然后添加100μl的增溶缓冲液(含有10％十二烷基硫酸钠的0.01mol/lhcl中)，孵育过夜。第二天测定每个孔的570nm出吸光度(a570nm)。对照组为未经mtx处理的rafls细胞或jurkat细胞，空白组为无细胞接种孔。
[0139]
根据吸光度计算细胞活力，计算公式为：
[0140][0141]
式中，a处理表示mtx处理后的rafls/jurkat细胞孔的a570nm值；a对照表示未经mtx处理的 rafls/jurkat细胞孔的a570nm值；a空白表示无细胞孔的a570nm值。
[0142]
结果如图3所示。过表达abcb5增加了mtx的需求剂量。而使用100μm青藤碱干预后，mtx对rafls的细胞毒性得到恢复。并且青藤碱的该活性表现出剂量依赖性，表现为低浓度的青藤碱对mtx使用剂量的恢复作用减弱。
[0143]
综上所述，发明人发现了青藤碱可以作为一种潜在的abcb5抑制剂，以剂量依赖性的方式在体外试验中表现出极好的mtx耐药逆转活性。
[0144]
实施例4 青藤碱对于mtx耐药性关节炎大鼠模型的治疗作用
[0145]
(1)腺病毒介导的abcb5高表达关节炎大鼠模型的构建：
[0146]
在本实施例中，所用试验大鼠为5周龄雄性sprague dawley(sd)大鼠，购买自广东省医学实验动物中心，体重80-120g。饲养环境为：配备有温度控制和自动通风系统的房间中，房间内12小时的光/暗循环，并且可以随意取食和饮水。本实施例是由中国澳门特别行政区卫生局动物伦理委员会批准的，根据澳门科技大学《动物护理与用户委员会指南》进行。
[0147]
一般关节炎模型：使用完全弗氏佐剂(cfa，cas：9007-81-2)诱发大鼠关节炎，具体步骤为：向大鼠尾根皮内注射100μlcfa，第一次发炎会在cfa注射后约第9天出现。对大鼠足体积每三天进行一次测量和记录。
[0148]
高表达abcb5关节炎模型：使用完全弗氏佐剂(cfa，cas：9007-81-2)诱发大鼠关节炎，abcb5腺病毒(pav[exp]-cmv》{rabcb5[xm_006225905.2](ns)}：t2a:egfp)，载体构建和病毒包装由赛业生物科技有限公司完成，产品id：avp-vb180424-1073gvh，其中，载体上插入的abcb5基因ncbi号为 xm_006225905.2。具体步骤为：向大鼠尾根皮内注射100μlcfa，然后在当天内使用微量注射器将100μl 上述abcb5腺病毒注射入大鼠关节腔内。
[0149]
共取48只雄性大鼠，按照表1随机分为8个实验组，每组6只。
[0150]
表1
[0151][0152][0153]
疗程结束时(cfa注射后第30天)将大鼠处死，收集大鼠血液及部分脏器，右后脚拍照冻存，左后爪被截肢并固定在4％的多聚甲醛(pfa)内。
[0154]
使用微电脑断层扫描(microct)分析大鼠足部骨破坏情况，具体步骤为：对左后爪使用体内微型ct 扫描仪((skyscan 1176,bruker，比利时)在al 1mm滤片的条件下进行扫描。其中，扫描参数为：35微米分辨率，62kv，385μa，98ms曝光时间，角速度0.70。扫描结束后利用nrecon软件重建图像、ctvox软件用于打开重建的数据文件，并生成可观察的3维图片，ctan软件对扫描数据进行分析。
[0155]
microct评分基于microct检查的五项疾病相关指标(骨矿物质密度、骨体积分数、皮质矿物密度、小梁数目和总孔隙率)进行，microct评分的计算公式为：
[0156][0157]
或
[0158][0159]
microct得分为以上方法处理后五项疾病相关指标数值之和的平均值。
[0160]
同时，使用实时荧光定量pcr分析大鼠血液炎症相关细胞因子的表达情况，其中，炎症相关细胞因子具体为il-1β、il-6、tnf-α和il-2。
[0161]
具体操作为：取300-400μl收集得到的大鼠血液，使用十倍体积的红细胞裂解液
(碧云天，c3702) 冰上裂解10分钟，4℃条件下500g离心5min，弃去红色上清。如果发现红细胞裂解不完全，可以重复裂解。裂解完毕后使用pbs洗涤细胞。去除红细胞后，使用favorpreptm blood/ciltured cell total rna minikit(favorgen，fabrk001-2)，按照说明书操作提取总rna。取1μg提取得到的总rna经.反转录得到cdna。以反转录得到的cdna作为模板，使用perfectstart
tm green qpcr supermix(transgen，aq601) 和设计的特异性引物进行rt-pcr扩增。将基因表达水平标准化为actin(对照)，并使用2-δδct
方法进行分析。对每个引物分析了3个独立实验，每组3个重复。所有数据均采用非配对t检验进行统计分析。
[0162]
其中，各靶标基因的特异性引物序列如表2所示。
[0163]
表2
[0164][0165][0166]
同时，发明人还对大鼠关节腔滑膜上的abcb5蛋白进行免疫组化分析(dab染色)，具体步骤为：将pfa固定的大鼠左后腿关节进行脱钙，石蜡包埋，切片，制备得到大鼠关节腔滑膜石蜡切片。然后用二甲苯通过不同浓度的乙醇和水进行脱蜡28分钟，脱蜡后使用target retrieval solution 50
×
low ph(dakoenvison flex，lot 20080033)在97℃条件下进行抗原修复20分钟。然后使用envision flex+visualizationsystems(dako k8002)进行abcb5抗体孵育及dab染色(具体操作参见说明书)，将处理后的切片置于40
×
显微镜下进行拍照。对照片中阳性区域进行免疫组化评分，具体评分方法如下：阳性反应被定义为在图片中显示出棕色信号。染色指数(数值范围0-12)则通过将染色强度的分数与阳性区域的分数相乘来确定。其中，染色强度的分数判定标准为：染色阴性，0分；染色强度弱，1分；染色强度中等，2分；染色强度强，3分。阳性区域的分数则根据阳性细胞占比情况来判断，具体标准为：阳性细胞占比小于5％， 0分；5％至25％，1分；26％至50％，2分；51％至75％，3分；大于75％，4分。
[0167]
计算示例：一个含有75％肿瘤细胞的标本，染色强度中等，评分为3
×
2＝6，而另外25％为阴性细胞，且染色强度较弱，评分为1
×
1＝1，最终得分为6+1＝7。
[0168]
统计分析中，0-7分被认为是低表达，8-12分被认为是高表达。
[0169]
结果如图4-8所示。
[0170]
图4为大鼠模型构建的示意图。
[0171]
图5为关节腔滑膜组织dab染色免疫组化结果，根据dab染色的免疫组化照片(棕色
为阳性信号)显示，在腺病毒介导的高表达abcb5关节炎大鼠模型中，healthy ctrl、aia模型组、mtx和sin治疗组在只注射腺病毒空载体的情况下基本无阳性信号出现，显示为蓝色背景。而abcb5组、abcb5+mtx组、 abcb5+sin组及abcb5+mtx+sin组经abcb5高表达腺病毒感染后，均出现阳性反应，表明腺病毒成功介导abcb5转运蛋白在关节腔滑膜组织高表达。同时根据免疫组化照片阳性信号的染色指数评价结果，也印证了abcb5转运蛋白在abcb5组、abcb5+mtx组、abcb5+sin组及abcb5+mtx+sin组的滑膜中高表达。
[0172]
通过动物取材前对大鼠右后爪进行拍照，可以发现aia模型组大鼠足出现肿胀，表明造模成功。在接受2mg/kg/weekmtx或100mg/kg/day治疗后，大鼠足部肿胀有所减轻。但两种抗关节炎药药物的作用效果在高表达abcb5的情况下被显著削弱，在abcb5+mtx组、abcb5+sin组中，大鼠足部依然出现严重肿胀。但mtx联合sin对高表达abcb5关节炎大鼠表现出良好的治疗效果，联合用药组足部未出现明显肿胀。同时基于体积测量仪器，实现了大鼠足部肿胀情况的量化。通过对足体积进行连续记录，形成足体积变化曲线(图6)，发现在abcb5转运蛋白存在的情况下，mtx及sin单独使用时，对足体积的改善作用被显著削弱，而当两种药物联合使用时显著降低了关节炎大鼠的足肿胀情况，说明mtx及sin 联合用药能够显著改善耐药性ra的发展病况。
[0173]
而对大鼠模型的左后爪经micro ct扫描重建后，利用软件对足部骨组织进行拍照，可以直观的观察到不同实验组大鼠足部的实际骨破坏情况(图7)。可以发现，健康组大鼠足部骨质紧密，结构完整。aia 造模后，一般关节炎大鼠足部出现骨破坏(黄色箭头指示骨破坏位置)。对此，mtx或sin单独使用减轻了足部骨破坏，但abcb5的介入显著加重了骨破坏的位点和严重程度。而在这种情况下，mtx或sin 单独使用所带来的改善效果因abcb5的过表达而完全失效，不能再产生减轻足部骨破坏的效果。在联合用药组中，在abcb5过表达的情况，大鼠模型的足部骨结构基本保持完整，骨破坏位点较少。同时借助micro ct分析软件对骨破坏情况进行量化，通过对5个量化的骨参数进行化归一处理后取平均值即为 microct评分(图7b)，发现abcb5高表达后，单一药物的治疗无法缓解大鼠的骨破坏，而mtx与sin 的联合使用对足部骨表现良好的保护作用，表现为骨评分与健康组接近。对比骨破坏评级表(图7c)，可以发现abcb5高表达情况下的mtx或sin单独治疗组，评级为严重骨破坏，联合用药组则为轻微骨破坏，说明仅在联合用药时，才能有效改善abcb5高表达带来的耐药性ra对骨的破坏程度。
[0174]
而图8则显示了大鼠模型中相关炎症因子il-1β、il-2、il-6、tnf-α的表达情况，反映了大鼠炎症的严重程度。通过实时荧光定量pcr结果，发现四个炎症因子与大鼠炎症反应表现出正相关。aia造模后， 4个炎症因子表达升高，mtx治疗降低了相关炎症因子表达，但在abcb5的介入条件下，mtx的治疗效果显著降低。但反观联合用药组中，4个炎症因子表达均被显著抑制。说明仅在联合用药时，才能有效改善abcb5高表达带来的耐药性ra带来的炎症反应。
[0175]
综上所述，通过本实施例构建得到的abcb5高表达耐药性关节炎大鼠模型，可以发现abcb5转运蛋白的高表达可导致关节炎大鼠模型的mtx耐药反应，并主要表现为mtx对足肿胀、骨破坏、炎症因子表达的抑制作用降低，失去治疗活性。而利用青藤碱的联合用药，显著逆转了mtx的耐药反应，提供了青藤碱在治疗类风湿关节炎中的一种新用途，即作为abcb5转运蛋白的抑制剂应用于耐药型类风湿性的临床治疗。
[0176]
实施例5 青藤碱衍生物的合成
[0177]
1.化合物2的合成：
[0178]
将苯胺与青藤碱(购于成都瑞芬思生物科技有限公司，式1所示结构的化合物)的4位羟基进行连接，得到以下青藤碱衍生物(式2所示结构的化合物)：
[0179][0180]
具体制备方法为：
[0181]
反应方程式如图9a所示。将2.0g三光气溶于134ml无水二氯甲烷中，在冰浴下缓慢滴加1.5g青藤碱(式1所示化合物)和3.8ml三乙胺溶液(溶于无水二氯甲烷，浓度为0.4m)，搅拌，反应1小时。加入0.65ml苯胺，提升至室温继续反应。使用tlc监控直至反应完成。反应混合物用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，经柱层析(二氯甲烷:甲醇＝92:8)分离纯化，得到化合物2(即青藤碱衍生物)，产率为80％。
[0182]
对化合物2进行表征，具体结果为：
[0183]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ7.52(d,j＝7.8hz,2h),7.31(t,j＝8.0hz,2h),7.07(t,j＝7.4hz,1h),6.92 (d,j＝8.4hz,1h),6.79(d,j＝8.5hz,1h),5.50(s,1h),3.94(d,j＝15.5hz,1h),3.73(s,3h),3.48(s,3h), 3.36
–
3.33(m,1h),3.22
–
3.19(m,1h),3.07(d,j＝18.5hz,1h),2.87(dd,j＝20.4,5.3hz,1h),2.68(dd,j＝ 12.2,3.1hz,1h),2.56(d,j＝15.1hz,1h),2.52(s,3h),2.31
–
2.27(m,1h),2.03
–
1.98(m,1h),1.81(d,j＝ 12.6hz,1h)ppm；
[0184]
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ192.2,152.8,151.7,150.2,139.6,137.6,129.3,129.1,125.9,123.9,122.0, 118.8,112.0,110.1,57.9,56.2,56.2,55.3,55.1,53.5,48.8,47.5,41.3,41.2,39.6,24.6ppm；hrms-esi(m/z) calcd for c
26h29
n2o5[m+h]
+
:449.2071；found 449.2084.。
[0185]
2.化合物3的合成：
[0186]
化合物3的结构式如式3所示。
[0187][0188]
具体制备方法为：
[0189]
反应方程式如图9a所示，制备方法步骤同化合物2，区别在于：青藤碱(204.7mg)与三光气(262.3 mg)、三乙胺(0.37ml)及4-硝基苯胺(132.4mg)反应得化合物3，产率为41％。
[0190]
对化合物3进行表征，具体结果为：
[0191]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ9.58(s,1h),8.02(d,j＝8.9hz,2h),7.58(d,j＝9.1hz,2h),6.91(d,j＝8.5 hz,1h),6.63(d,j＝8.4hz,1h),5.62(d,j＝1.4hz,1h),3.94
–
3.88(m,1h),3.58(s,3h),3.56(s,3h),3.23
–ꢀ
3.20(m,1h),3.09(d,j＝18.4hz,1h),3.05(s,1h),2.74(dd,j＝18.2,5.5hz,1h),2.62(d,j＝15.7hz,1h), 2.54(dd,j＝12.2,3.1hz,1h),2.45(s,3h),2.20
–
2.13(m,1h),1.93(td,j＝12.5,4.7hz,1h),1.73(d,j＝12.4 hz,1h)ppm；
[0192]
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ195.0,152.5,150.7,150.2,144.5,142.8,138.6,130.1,129.8,125.7,124.9, 117.9,116.7,110.6,56.2,55.7,55.0,50.8,46.5,46.4,42.8,41.4,37.3,24.1ppm；hrms-esi(m/z)calcd forc
26h27
n3o7[m+h]
+
:494.1922；found494.1919.。
[0193]
3.化合物4的合成：
[0194]
化合物4的结构式如式4所示。
[0195][0196]
具体制备方法为：
[0197]
反应方程式如图9a所示，制备方法步骤同化合物2，区别在于：青藤碱(132.6mg)与三光气(174.9 mg)、三乙胺(0.25ml)及4-叔丁基苯胺(100μl)反应得化合物4，产率为57％。
[0198]
对化合物4进行表征，具体结果为：
[0199]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.17(s,1h),7.46
–
7.40(m,2h),7.32(d,j＝8.6hz,2h),6.91(d,j＝8.4hz, 1h),6.76(d,j＝8.5hz,1h),5.50(d,j＝1.2hz,1h),3.94(d,j＝15.7hz,1h),3.71(s,3h),3.48(d,j＝5.3hz, 3h),3.29
–
3.24(m,1h),3.11(s,1h),3.07(d,j＝18.5hz,1h),2.79(dd,j＝18.3,5.4hz,1h),2.60(dd,j＝ 12.3,2.9hz,1h),2.55(d,j＝15.7hz,1h),2.48(s,3h),2.22(td,j＝12.3,3.0hz,1h),1.92(td,j＝12.6,4.5hz, 1h),1.81(d,j＝12.4hz,1h),1.30(s,9h)ppm；
[0200]
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ193.7,152.5,151.0,150.9,146.4,139.4,135.4,130.3,129.2,125.8,125.3, 118.2,115.3,111.0,56.5,56.0,54.9,50.2,46.8,45.8,42.5,40.9,36.8,34.3,31.4,24.3ppm；hrms-esi(m/z) calcd for c
30h36
n2o5[m+h]
+
:505.2697；found 505.2699.。
[0201]
4.化合物5的合成：
[0202]
化合物5的结构式如式5所示。
[0203][0204]
具体制备方法为：
[0205]
反应方程式如图9a所示，制备方法步骤同化合物2，区别在于：青藤碱(123.7mg)与三光气(155.3 mg)、三乙胺(0.22ml)及4-甲磺酰基苯胺(104.1mg)反应得化合物5，产率为52％。
[0206]
对化合物5进行表征，具体结果为：
[0207]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ9.64(s,1h),7.77(d,j＝8.6hz,2h),7.67(d,j＝8.8hz,2h),6.93(d,j＝8.5 hz,1h),6.71(d,j＝8.5hz,1h),5.58(s,1h),3.94
–
3.89(m,1h),3.64(s,3h),3.53(s,3h),3.32
–
3.27(m, 1h),3.19
–
3.15(m,1h),3.10(d,j＝18.4hz,1h),3.00(s,3h),2.81(dd,j＝18.3,5.3hz,1h),2.63(d,j＝15.6 hz,2h),2.50(s,3h),2.23(t,j＝11.0hz,1h),1.99(td,j＝12.5,4.2hz,1h),1.74(d,j＝12.5hz,1h)ppm；
[0208]
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ194.7,152.5,150.9,150.5,143.5,138.7,134.2,129.9,129.1,128.6,125.7, 118.4,116.0,110.9,56.5,55.9,55.1,50.5,46.6,45.9,44.8,42.5,41.2,36.9,24.2ppm；hrms-esi(m/z)calcdfor c
27h30
n2o7s[m+h]
+
:527.1847；found 527.1836.。
[0209]
5.化合物6的合成：
[0210]
化合物6的结构式如式6所示。
[0211][0212]
具体制备方法为：
[0213]
反应方程式如图9a所示，制备方法步骤同化合物2，区别在于：青藤碱(122.3mg)与三光气(158.2 mg)、三乙胺(0.22ml)及4-氯苯胺(77.4mg)反应得化合物6，产率为10％。
[0214]
对化合物6进行表征，具体结果为：
[0215]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.28(s,1h),7.46(d,j＝8.7hz,2h),7.30
–
7.26(m,2h),6.93(d,j＝8.4hz, 1h),6.77(d,j＝8.4hz,1h),5.54(s,1h),3.91(d,j＝15.6hz,1h),3.74(s,3h),3.51(s,3h),3.20(s,1h),3.08 (d,j＝18.3hz,1h),3.02(s,1h),2.73(dd,j＝18.2,5.3hz,1h),2.55(t,j＝11.8hz,2h),2.45(s,3h),2.17(td, j＝12.3,2.8hz,1h),1.89(td,j＝12.5,4.5hz,1h),1.76(d,j＝12.5hz,1h)ppm；
[0216]
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ194.1,152.4,150.9,150.6,139.1,136.7,130.4,129.7,129.0,128.4,125.5, 119.7,115.9,111.0,56.4,56.1,54.9,50.5,46.6,46.3,42.8,41.1,37.2,24.2ppm；hrms-esi(m/z)calcd forc
26h27
cln2o5[m+h]
+
:483.1681；found 483.1675.。
[0217]
6.化合物7的合成：
[0218]
化合物7的结构式如式7所示。
[0219]
[0220]
具体制备方法为：
[0221]
反应方程式如图9a所示，制备方法步骤同化合物2，区别在于：青藤碱(183.3mg)与三光气(246.0 mg)、三乙胺(0.46ml)及苄胺(96μl)反应得化合物7，产率为51％。
[0222]
对化合物7进行表征，具体结果为：
[0223]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ7.37
–
7.32(m,4h),7.29
–
7.26(m,1h),6.88(d,j＝8.4hz,1h),6.75(d, j＝8.4hz,1h),6.21(t,j＝6.0hz,1h),5.49(s,1h),4.52(dd,j＝15.1,6.8hz,1h),4.35(dd,j＝15.1,5.5hz, 1h),3.89(d,j＝15.8hz,1h),3.71(s,3h),3.47(s,3h),3.32
–
3.29(m,1h),3.11(s,1h),3.08
–
3.02(m,1h), 2.80(dd,j＝18.2,5.2hz,1h),2.59(d,j＝11.3hz,1h),2.50(d,j＝15.9hz,1h),2.48(s,3h),2.20(td,j＝12.3, 2.7hz,1h),1.95
–
1.89(m,1h),1.81(d,j＝12.6hz,1h)ppm；
[0224]
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ193.0,154.3,152.4,150.9,139.9,138.5,130.2,129.0,128.6,127.5,127.4, 125.1,114.8,111.0,56.6,56.0,54.9,50.0,46.9,45.5,45.2,42.4,40.6,36.6,24.3ppm；hrms-esi(m/z)calcdfor c
27h30
n2o5[m+h]
+
:463.2228；found 463.2224.。
[0225]
7.化合物8的合成：
[0226]
化合物8的结构式如式8所示。
[0227][0228]
具体制备方法为：
[0229]
反应方程式如图9a所示，制备方法步骤同化合物2，区别在于：青藤碱(106.2mg)与三光气(143.1 mg)、三乙胺(0.27ml)及正戊胺(60μl)反应得化合物8，产率为31％。
[0230]
对化合物8进行表征，具体结果为：
[0231]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ6.91(d,j＝8.4hz,1h),6.79(d,j＝8.5hz,1h),5.61(t,j＝5.8hz,1h), 5.50(t,j＝4.7hz,1h),3.89(d,j＝15.8hz,1h),3.75(s,3h),3.64(d,j＝13.5hz,1h),3.49(s,3h),3.30
–
3.17 (m,2h),3.08
–
2.99(m,2h),2.87(d,j＝10.5hz,1h),2.65(s,3h),2.58(dd,j＝15.7,7.8hz,1h),2.39(dt,j＝ 26.7,13.4hz,1h),2.18
–
2.11(m,1h),1.89(d,j＝12.7hz,1h),1.60
–
1.54(m,2h),1.46(t,j＝7.3hz,1h), 1.38
–
1.32(m,4h),0.92(t,j＝7.0hz,3h)ppm；
[0232]
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ192.3,154.0,152.6,151.4,140.0,129.5,127.2,125.3,
113.2,111.5,57.3, 56.9,55.0,49.3,47.3,42.2,41.8,41.3,40.0,35.5,29.5,28.7,22.3,14.1,11.2ppm；hrms-esi(m/z)calcd forc
25h34
n2o5[m+h]
+
:443.2541；found443.2537.。
[0233]
8.化合物9的合成：
[0234]
化合物9的结构式如式9所示。
[0235][0236]
具体制备方法为：
[0237]
反应方程式如图9a所示，制备方法步骤同化合物2，区别在于：青藤碱(83.1mg)与三光气(109.9 mg)、三乙胺(0.15ml)及正己胺(52μl)反应得化合物9，产率为35％。
[0238]
对化合物9进行表征，具体结果为：
[0239]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ6.87(d,j＝8.4hz,1h),6.74(d,j＝8.4hz,1h),5.71(t,j＝5.7hz,1h), 5.50(d,j＝1.7hz,1h),3.89(d,j＝15.7hz,1h),3.74(s,3h),3.48(s,3h),3.30
–
3.20(m,2h),3.20
–
3.17(m, 1h),3.05(d,j＝18.2hz,1h),3.01(s,1h),2.72(dd,j＝18.1,5.4hz,1h),2.55
–
2.48(m,2h),2.44(s,3h), 2.16(td,j＝12.2,3.4hz,1h),1.89
–
1.83(m,1h),1.79(d,j＝12.2hz,1h),1.59
–
1.53(m,2h),1.38(dd,j＝ 14.3,7.5hz,2h),1.35
–
1.27(m,4h),0.90(t,j＝6.9hz,3h)ppm；
[0240]
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ193.5,154.1,152.4,150.9,139.9,130.4,129.6,124.9,115.5,111.0,56.4, 56.1,54.9,50.3,46.7,46.2,42.7,41.3,40.9,37.0,31.5,29.9,26.3,24.2,22.6,14.1ppm；hrms-esi(m/z)calcdfor c
26h36
n2o5[m+h]
+
:457.2697；found457.2694.。
[0241]
9.化合物10的合成：
[0242]
化合物10的结构式如式10所示。
[0243][0244]
具体制备方法为：
[0245]
反应方程式如图9a所示，制备方法步骤同化合物2，区别在于：青藤碱(167.5mg)与三光气(226.3 mg)、三乙胺(0.42ml)及正庚胺(120μl)反应得化合物10，产率为34％。
[0246]
对化合物10进行表征，具体结果为：
[0247]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ6.90(d,j＝8.4hz,1h),6.77(d,j＝8.4hz,1h),5.59(s,1h),5.48(t,j＝4.3 hz,1h),3.89(d,j＝15.8hz,1h),3.75(s,3h),3.49(s,4h),3.32(s,1h),3.24(ddq,j＝33.3,13.3,6.8hz,2h), 3.07(d,j＝18.7hz,1h),2.93(dd,j＝18.5,5.0hz,1h),2.77(d,j＝10.7hz,1h),2.59(s,3h),2.56(d,j＝15.8 hz,1h),2.33(dd,j＝12.3,10.1hz,1h),2.07(dd,j＝12.6,9.1hz,1h),1.86(d,j＝12.9hz,1h),1.60
–
1.53 (m,2h),1.39
–
1.25(m,8h),0.89(t,j＝6.9hz,3h)ppm；
[0248]
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ192.7,154.0,152.6,151.3,140.0,129.8,127.8,125.2,113.8,111.3,57.1, 56.1,55.0,49.6,47.2,44.7,42.1,41.3,40.3,36.0,31.8,29.9,28.9,26.6,24.4,22.6,14.1ppm；hrms-esi(m/z) calcd for c
27h38
n2o5[m+h]
+
:471.2854；found 471.2858.。
[0249]
10.化合物11和12的合成：
[0250]
化合物11的结构式如式11所示。化合物12的结构式如式12所示。
[0251][0252]
反应方程式如图9b所示，将30.7mg青藤碱(式1所示化合物)溶于0.42ml无水二氯
甲烷中，加入 67.4mg n,n
′‑
羰基二咪唑和34μl三乙胺，搅拌，反应1小时。使用tlc监控直至反应完成。反应混合物用去离子水、乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，经柱层析(二氯甲烷:甲醇＝91:9)分离纯化，得到化合物11(如式11所示)和化合物12(如式12所示)，化合物11产率为29％，化合物12为30％。
[0253]
对化合物11进行表征，具体结果为：
[0254]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ7.68(s,1h),7.10(d,j＝0.7hz,2h),6.63(d,j＝8.3hz,1h),6.54(d,j＝8.2 hz,1h),5.47(d,j＝2.1hz,1h),4.35(d,j＝15.7hz,1h),3.80(s,3h),3.49(s,3h),3.19(t,j＝4.1hz,1h), 3.03
–
2.98(m,2h),2.71(dd,j＝18.4,5.3hz,1h),2.55(ddd,j＝12.0,4.3,1.7hz,1h),2.45(t,j＝4.7hz,1h), 2.44(s,3h),2.08(td,j＝12.1,3.7hz,1h),1.94
–
1.91(m,1h),1.89(dd,j＝12.3,4.6hz,1h)ppm；
[0255]
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ194.2,152.4,145.0,144.7,135.1,130.2,122.5,118.3,115.1,109.0,56.7, 56.1,54.8,49.1,47.1,45.8,42.7,40.5,35.9,24.3ppm；hrms-esi(m/z)calcd for c
23h25
n3o5[m+h]
+
: 424.1867；found424.1884.。
[0256]
对化合物12进行表征，具体结果为：
[0257]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ6.84(d,j＝8.4hz,1h),6.78(d,j＝8.4hz,1h),5.52(d,j＝2.0hz,1h), 3.82(s,3h),3.76(s,1h),3.50(s,3h),3.31
–
3.27(m,1h),3.17(s,1h),3.11(d,j＝18.4hz,1h),2.64
–
2.55(m, 2h),2.46(s,3h),2.18(td,j＝12.3,3.3hz,1h),2.02(td,j＝12.4,4.7hz,1h),1.59(d,j＝12.3hz,1h)ppm；
[0258]
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ185.5,162.7,151.2,146.0,139.8,127.1,123.4,121.0,114.7,112.5,59.4, 57.1,56.3,55.2,46.4,42.8,40.7,38.0,35.1,22.5ppm；hrms-esi(m/z)calcd for c
20h21
no5[m+h]
+
:356.1492； found356.1516.。
[0259]
11.化合物13的合成：
[0260]
化合物13的结构式如式13所示。
[0261][0262]
反应方程式如图9c所示，将116.5mg青藤碱(式1所示化合物)溶于1.3ml二甲基甲酰胺，加入 275μl氢氧化钾(2m)和21μl溴乙腈，搅拌，反应2小时。反应混合物用乙酸乙酯稀释后，加入去离子水，用乙酸乙酯萃取3次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩，经柱层析(二氯甲烷:甲醇＝92:8) 分离纯化，得到化合物13(如式13所示)，产率为72％。
[0263]
对化合物13进行表征，具体结果为：
[0264]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ6.86
–
6.79(m,1h),6.73(d,j＝8.4hz,1h),5.50(d,j＝1.9hz,1h),4.99
–
4.90(m,1h),4.72(d,j＝15.8hz,1h),3.86(d,j＝15.5hz,1h),3.83(s,3h),3.48(s,3h),3.16(t,j＝4.2hz, 1h),3.01(dd,j＝9.7,8.2hz,2h),2.70(dd,j＝18.4,5.3hz,1h),2.62(d,j＝15.5hz,1h),2.54
–
2.50(m,1h), 2.41(s,3h),2.01
–
1.96(m,1h),1.96
–
1.90(m,1h),1.84(d,j＝12.3hz,1h)ppm；
[0265]
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ194.2,152.5,150.5,146.1,130.3,129.7,124.2,116.5,115.4,111.2,57.5, 56.2,55.6,54.9,50.5,46.8,46.3,42.7,41.3,36.9,24.4ppm；hrms-esi(m/z)calcd for c
21h24
n2o4[m+h]
+
: 369.1809；found 369.1794.。
[0266]
12.化合物14的合成：
[0267]
化合物14的结构式如式14所示。
[0268][0269]
反应方程式如图9c所示，制备方法步骤同化合物13，区别在于：青藤碱为115.9mg、氢氧化钾(2m) 275μl，溴乙腈替换为30μl4-溴丁腈，反应得化合物14，产率为50％。
[0270]
对化合物14进行表征，具体结果为：
[0271]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ6.75(d,j＝8.4hz,1h),6.70(d,j＝8.4hz,1h),5.51(d,j＝2.1hz,1h), 4.23
–
4.13(m,2h),3.98(d,j＝15.9hz,1h),3.79(s,3h),3.49(s,3h),3.15(t,j＝4.1hz,1h),3.00(d,j＝18.2 hz,1h),2.98
–
2.96(m,1h),2.75
–
2.61(m,3h),2.54
–
2.48(m,2h),2.42(s,3h),2.16(qd,j＝7.2,1.0hz, 2h),1.99(td,j＝12.1,3.2hz,1h),1.90(td,j＝12.4,4.4hz,1h),1.83
–
1.79(m,1h)ppm；
[0272]
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ193.8,152.5,151.2,147.0,130.1,130.0,123.0,120.0,115.6,111.0,69.0, 56.4,55.4,54.8,50.3,46.9,46.2,42.7,41.0,37.5,26.7,24.6,14.0ppm；hrms-esi(m/z)calcd for c
23h28
n2o
4 [m+h]
+
:397.2122；found 397.2111.。
[0273]
13.化合物15的合成：
[0274]
化合物15的结构式如式15所示。
[0275][0276]
反应方程式如图9c所示，制备方法步骤同化合物13，区别在于：青藤碱为97.7mg、氢氧化钾(2m) 为275μl，溴乙腈替换为35μl 5-溴戊腈，反应得化合物15，产率为70％。
[0277]
对化合物15进行表征，具体结果为：
[0278]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ6.74(d,j＝8.5hz,1h),6.70(d,j＝8.4hz,1h),5.49(d,j＝1.8hz,1h), 4.16
–
4.11(m,1h),4.11
–
4.07(m,1h),4.07
–
4.03(m,1h),3.78(s,3h),3.49(s,3h),3.18(s,1h),3.02
–
2.97 (m,2h),2.75(dd,j＝18.4,5.2hz,1h),2.55
–
2.49(m,4h),2.43(s,3h),2.02
–
1.96(m,3h),1.96
–
1.89(m, 3h),1.83(d,j＝12.4hz,1h)ppm；
[0279]
13
c nmr(150mhz,cdcl3)δ193.8,152.6,151.4,147.5,130.0,122.9,119.9,115.4,111.2,70.4,56.5,55.6, 54.8,50.1,47.0,46.0,42.6,40.9,37.3,29.1,24.6,22.3,16.9ppm；hrms-esi(m/z)calcd for c
24h30
n2o
4 [m+h]
+
:411.2278；found 441.2281.。
[0280]
实施例6 青藤碱衍生物在293t细胞中抑制abcb5及其突变体对mtx的外排作用
[0281]
为了进一步说明青藤碱的衍生物同样具有能够青藤碱所具有的mtx耐药性关节炎治疗作用，发明人取上述实施例中制备得到的青藤碱衍生物进行试验验证。
[0282]
具体步骤为：
[0283]
(1)abcb5的定点突变：
[0284]
以上述实施例中的abcb5哺乳动物表达质粒作为模板，利用pfuultra ii fusion hs dna polymerase (aligent)和dntp，并通过下述引物(表3)，使用生物系统热循环仪对abcb5进行定点突变。在pcr 后进行凝胶纯化及dpni消化，消化产物中单克隆呈粉红色，并经测序验证。
[0285]
表3
[0286]
sv40latepa}敲入rosa26位点的abcb5转基因sd大鼠，大鼠rosa26基因位于大鼠4号染色体上，选择内含子1-2(具体序列情况为ccttcttccctcgtgatctgc
‑‑‑
tttctggaagataggcgg，
‑‑‑
表示插入位置)作为靶位点。grna靶向序列如下：
[0295]
grna1(匹配基因的反义链):gactccagttgcagatcacgagg(seqidno:19)；
[0296]
grna2(匹配基因的正义链):aagataggcgggagtcttctggg(seqidno:20)。
[0297]
具体为：将大鼠rosa26基因的grna、含有{cag-loxp-stop-loxp-ratabcb5cds-sv40latepa}的基因载体(质粒图谱如图14a所示)和cas9mrna共同注射到大鼠受精卵中以产生靶向敲入的f0祖代(如图14b)。f0祖代与野生型大鼠杂交产生f1代，通过对f1代进行pcr鉴定和序列分析，可实现对f0祖代种系传递的鉴定，借此筛选出可稳定遗传的f0代和合格的f1代大鼠(f1代大鼠基因型为杂合子)，后续再经过一些列繁育获得纯合子的abcb5转基因鼠。同时，构建cre重组酶工具鼠，首先需要进行cre-ert2哺乳动物基因表达载体(如图15)的构建和纯化，并利用显微注射将表达载体导入受精卵中，筛选阳性f0幼崽。将abcb5纯合子转基因鼠与cre工具鼠杂交并经繁育筛选出双基因阳性的幼崽。繁育大量的双基因阳性转基因sd大鼠，待幼崽约两周龄时按照75mg/kg/day的剂量，腹腔注射给予他莫昔芬，连续诱导5天。
[0298]
设置普通sd大鼠对照组。诱导结束后继续适应性饲养试验大鼠至少3周。使用完全弗氏佐剂(cfa，cas：9007-81-2)诱发在大鼠体重约120-150g时大鼠关节炎。
[0299]
试验共取40只大鼠，普通sd大鼠15只，abcb5转基因sd大鼠25只，按照表4随机分为8个实验组，每组5只。
[0300]
表4
[0301][0302]
[0303]
实验共进行30天，每隔3天对大鼠进行一次足体和体重测量。实验最后一天处死大鼠并获取相关组织样本。
[0304]
通过足体测量(图16)可以发现甲氨蝶呤(mtx)在普通的aia关节炎大鼠中能够有效抑制关节肿胀，但当abcb5高表达时，其治疗作用被抵消，大鼠足肿胀无明显改善，表现出mtx耐药性的产生。而在高剂量的青藤碱(100mg/kg/day)联合甲氨蝶呤的使用中，发现两者组合可逆转mtx的耐药反应，使得大鼠足肿胀显著减轻。然而，在联合使用低剂量青藤碱(30mg/kg/day)时却无此种作用，表现为联合用药治疗效果的显著减弱。上述实施例中制备得到的青藤碱衍生物(化合物2)同样具有抑制abcb5 转运蛋白的作用，但不同于青藤碱，青藤碱衍生物能够在较低剂量的情况下(30mg/kg/day)联合甲氨蝶呤仍然能够显著抑制大鼠足肿胀的增长，从而显示出更佳的应用前景。
[0305]
从各组大鼠中取400μl抗凝血，使用红细胞裂解液(碧云天c3702)处理样本，然后使用favorpreptmblood/ciltured cell total rna mini kit提取总rna，经反转录pcr获得cdna后使用perfectstarttm greenqpcr supermix(transgen，aq601)以及下述表5引物在viia 7 real-time pcr系统中对血液中abcb5 的表达进行检测。
[0306]
表5
[0307]
引物核苷酸序列(5'-3')abcb5 r f1tcgtggggcagacctgattg(seq id no:21)abcb5 r r1gggggacttggcgctattca(seq id no:22)
[0308]
结果如图17所示。
[0309]
通过qpcr检测发现经他莫昔芬诱导后，abcb5+aia、abcb5+aia+mtx、abcb5+aia+mtx+sin100、abcb5+aia+mtx+sin30、abcb5+aia+mtx+compound2组中的abcb5 成功高表达，说明cd4+细胞特异性表达abcb5的sd大鼠动物模型构建成功。
[0310]
使用微电脑断层扫描(microct)分析大鼠足部骨破坏情况，使用体内微型ct扫描仪(skyscan 1176, bruker，比利时)在al 0.5mm滤片的条件下进行扫描。其中，扫描参数为：35微米分辨率，62kv，385μa， 98ms曝光时间，角速度0.70。扫描结束后利用nrecon软件重建图像、ctvox软件用于打开重建的数据文件，并生成可观察的3维图片，ctan软件对扫描数据进行分析。
[0311]
microct评分基于microct检查的五项疾病相关指标(骨矿物质密度(bmd)、组织骨密度(tmd)、骨体积分数(bv/tv)、小梁数目(tb.n)和总孔隙率(totalporosity))进行，microct评分的计算公式为：
[0312][0313]
或
[0314][0315]
microct得分为以上处理后五项疾病相关指标之和的平均值。
[0316]
microct检测结果如图18所示。
[0317]
图18a为微电脑断层扫描分析图片，可以发现30mg/kg/day青藤碱衍生物联合甲氨
蝶呤即可显著改善关节炎大鼠骨破坏。而青藤碱在100mg/kg/day剂量剂量联合用药时也表现出优秀的治疗活性，但该活性在低剂量时消失，大鼠足部骨骼出现多处损伤(图中箭头指示骨破坏位点)。图18b为microct评分柱状图，从图中可以反映出不同组大鼠足部骨参数指标的优劣，其中，低剂量的青藤碱衍生物联合甲氨蝶呤治疗耐药型关节炎大鼠，可使其足部骨质逆转为轻微骨破坏，效果优于同剂量的青藤碱。
[0318]
同时，对实验大鼠进行血沉速率检测，具体步骤为：使用血沉管采集实验大鼠静脉血标本，采集完成后，进行180度颠倒6-8次，使管中的抗凝剂与血充分混匀。将装有标本的血沉管垂直固定在专用血沉架上，记录好起始时间和对应编号，在室温保持20℃左右静置状态下，3小时后读取红细胞沉降的毫米数，红细胞血沉毫米数(mm)/时间(h)＝血沉速率(mm/h)。
[0319]
在本领域中，许多病理情况，如急性炎症、活动性结核、风湿病活动期、组织严重破坏、贫血、恶性肿瘤等都会导致红细胞血沉速率病理性增快，血沉的快慢可辅助观察病情的变化。图19中的血沉结果表明，对于abcb5基因过表达导致的类风湿性关节炎的介入导致了mtx的治疗失败，使血沉速率明显加快。而高剂量的青藤碱和低剂量的青藤碱衍生物(化合物2)联合甲氨蝶呤的使用均可逆转abcb5介导的耐药反应，使血沉速率处于较低水平，从而改善模型大鼠的相关病症。
[0320]
同时，领取各组大鼠400μl新鲜抗凝血，使用红细胞裂解液(碧云天c3702)处理样品。进行活细胞计数后，取适量的细胞使用apc/cy7-cd45、fitc-cd3、percp/cy5-cd4、apc-cd8(biolegend)和cellstaining buffer(biolegend cat.no.420201)，根据细胞表面流式细胞仪染色方案进行表面染色。使用 true-nuclear
tm
transcription factor buffer set(cat.no.424401)固定破膜后再利用pe-foxp3(biolegend)荧光抗体进行胞内染色，并在流式细胞仪上采集样本。取适量细胞(1-2
×
106cell/ml)使用cellactivationcocktail with brefeldina(biolegend cat.no.423302)进行刺激诱导6h，然后加入荧光抗体，4℃避光染色 45分钟。再使用cyto-fast
tm
fix/perm buffer set(biolegend cat.no.426803)对细胞破膜处理20分钟。用细胞染色缓冲液稀释后的pe/cy7-il-17a(biolegend)荧光抗体进行胞内染色30分钟，使用流式细胞仪分析细胞荧光信号。
[0321]
结果如图20、图21和图22所示。
[0322]
treg是一种介导免疫耐受的t细胞，而th17细胞则可以介导一系列的炎症反应，二者的作用与分化过程是互相对抗的。在正常条件下，二者处于平衡，从而利于维持机体的免疫稳态。但在炎症反应、自身免疫性疾病和移植排斥反应中，由于受到某些炎症因子的影响，原始t淋巴细胞的分化格局改变，分化向着产生更多的th17细胞发展，从而破坏treg/th17之间的平衡，从而引起一系列炎症反应，对机体造成损害。图20和21为实验大鼠cd4+细胞内foxp3、il-17a荧光染色流式细胞图，图22则为荧光信号统计分析柱状图(其中，图22c为foxp3、il-17a荧光信号比值，用于反映样本中treg/th17平衡的倾向性)。从图中可以发现，在关节炎大鼠模型中，foxp3呈现下降趋势，il-17a则表现为上升，炎症大鼠血液中treg 细胞所占比减少，th17细胞占比增多，平衡向th17细胞倾斜。而有效的治疗措施则能够逆转此现象，如 30mg/kg/day低剂量的青藤碱衍生联合mtx的给药、mtx单独用药以及低剂量青藤碱联合用药均显示出一定的治疗效果，但在这些试验组中，30mg/kg/day低剂量的青藤碱衍生联合mtx的给药能够更好的维持treg/th17的平衡，抑制th17细胞的增多。
[0323]
取新鲜非抗凝血，至少静置30分钟。1000
×
g，10分钟离心获取血清样本。然后使用rat inflammationcustom panel 10-plex(biolegend)，按照操作说明书进行操作，流式检测收集信号数据。最后在 biolegend.com指定数据分析网站进行数据处理。每项指标数据使用对应健康对照组指标均值进行标准化，并扣除基础倍比1即为细胞因子含量增长倍比。结果显示为各指标增长倍比平均值。
[0324]
结果如图23所示。
[0325]
在图23中，血清内各细胞因子含量平均增长倍比超过3倍显示为红色，增长超过25倍为蓝色。与健康对照组相比在aia造模后血清内多种炎症因子的含量显著升高。mtx介入后情况得到改善。cd4
+
细胞高表达abcb5组mtx的抗炎效果受到抑制。在使用100mg/kg/day的青藤碱作为abcb5抑制剂加入治疗中时，可逆转mtx抗炎效果的抑制现象，然而30mg/kg/day低剂量的青藤碱则不表现出该作用。相反的是，青藤碱衍生物(化合物2)能够在较低剂量的情况下抑制abcb5转运蛋白，血液中的炎症细胞因子的增长受到抑制。
[0326]
综上所述，相比于青藤碱，上述实施例中制备得到的青藤碱衍生物(化合物2)能够联合甲氨蝶呤在治疗cd4+细胞高表达abcb5的耐药型类风湿性关节炎大鼠中发挥出极好的治疗效果，其有效的抑制了 abcb5外排转运功能，逆转了mtx耐药反应，从而说明该青藤碱衍生物可以作为abcb5抑制剂在制备抗耐药型类风湿性关节炎制剂中的应用中展示出优秀的应用前景和成药潜力。
[0327]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种青藤碱衍生物，其特征在于，所述青藤碱衍生物为青藤碱的4位羟基发生取代或亲核酰基取代反应形成的化合物，所述青藤碱衍生物的结构式为：其中，所述式i中，r基团选自氢、取代或未取代的苯胺基、含氮烷烃、咪唑；或不含有r基团，且a位与b位的c连接形成环，得到如下所述结构：所述式ii中，r基团选自氢、含腈烷烃。2.根据权利要求2所述的青藤碱衍生物，其特征在于，所述式i中，r基团选自如下所示结构：
3.根据权利要求2所述的青藤碱衍生物，其特征在于，所述式ii中，r基团选自含腈c
1-8
烷烃；所述含腈c
1-8
烷烃优选如下所示结构：4.权利要求1～3任一项所述的青藤碱衍生物的制备方法，包括如下步骤：将青藤碱、胺基化合物在三乙胺和三光气或n,n
′‑
羰基二咪唑条件下混合即得；或将青藤碱、含溴的腈基化合物在碱性条件下混合即得。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述胺基化合物选自苯胺、4-硝基苯胺、4-叔丁基苯胺、4-甲磺酰基苯胺、4-氯苯胺、苄胺、正戊胺、正己胺、正庚胺。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述含溴的腈基化合物选自溴乙腈、4-溴丁腈、5-溴戊腈。7.abcb5抑制剂在制备多耐药性类风湿性关节炎治疗药物中的应用。
8.abcb5抑制剂联合甲氨蝶呤在制备多耐药性类风湿性关节炎治疗药物中的应用。9.根据权利要求7或8所述的abcb5抑制剂，其特征在于，所述abcb5抑制剂包括青藤碱、权利要求1～3任一项所述的青藤碱衍生物中的至少一种。10.根据权利要求7或8所述的abcb5抑制剂，其特征在于，所述多耐药性类风湿性关节炎为耐甲氨蝶呤类风湿性关节炎。11.一种用于治疗多耐药性类风湿性关节炎的药物，其特征在于，所述药物中含有青藤碱、权利要求1～3任一项所述的青藤碱衍生物中的至少一种。12.根据权利要求11所述的药物，其特征在于，所述药物中还含有药学上可接受的辅料，所述辅料包括溶剂、润湿剂、乳化剂、增稠剂、赋形剂、悬浮剂、崩解剂、填充剂、润滑剂或稀释剂中的至少一种。

技术总结
本发明公开了ABCB5抑制剂在制备多耐药性类风湿性关节炎治疗药物中的应用，其中，所述的ABCB5抑制剂包括包括青藤碱、青藤碱衍生物中的至少一种。在本发明中，发明人发现了一种新的青藤碱衍生物，并发现该衍生物和青藤碱均可以用于逆转多耐药性类风湿性关节炎的耐药性，联合甲氨蝶呤后具有较高的多耐药性类风湿性关节炎治疗效果，且还发现该青藤碱衍生物的治疗效果相比青藤碱更佳，具有极好的成药潜力和应用价值。和应用价值。


技术研发人员：权利要求书3页说明书34页序列表4页附图22页
受保护的技术使用者：澳门科技大学
技术研发日：2022.06.09
技术公布日：2022/11/1