一种僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性pcr鉴别方法及其应用
技术领域
1.本发明涉及中药鉴别技术领域，尤其涉及一种僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性pcr鉴别方法及其应用。
背景技术：2.中国药典2020年版规定僵蚕来源为蚕蛾科昆虫家蚕bombyx mori linnaeus4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌beauveria bassiana(bals.)vuillant而致死的干燥体。其多于春、秋季生产，将感染白僵菌病死的家蚕干燥，得到僵蚕。僵蚕作为常用中药动物药，使用量较大，现市场上出现较多伪品或掺伪品，如绿僵菌感染致死的家蚕、用石灰水染白或白僵菌孢子粉包裹的死蚕、黑死蚕等，它们性状接近，形态相似，依靠传统的鉴别方法难度较大，准确性低，尤其是经过麸炒制成的炮制品、水提取制成标准汤剂，进一步加工成配方颗粒后，在失去药材性状后，更难进行有效的鉴别。为保证僵蚕的药材质量和疗效，急需一种能准确、快速地鉴别僵蚕正品与其伪品的方法。
3.目前，中国专利cn106048020a公开了一种动物药材僵蚕的基因身份证，其基于coi和its序列的dna条形码技术，可鉴定家蚕，且基于its序列构建邻接(nj)树以能区分白僵菌与其他致病菌株。由于该方法基于coi和its通用引物，pcr产物测序后需对测序结果进行处理和比对，操作步骤繁琐、耗时较长，无法对僵蚕的真伪进行快速检测。另外，中国专利cn107164471a公开了一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法，其基于白僵菌和多个虫草科物种线粒体全基因，设计白僵菌的特异性引物，通过pcr反应实现对僵蚕中白僵菌真伪的鉴别。但以上方法仅限于僵蚕药材，适用范围较小。目前用于鉴定僵蚕的特异性引物、试剂盒及鉴别方法，其范围主要为药材，而关于僵蚕及其炮制品炒僵蚕的水提取物、配方颗粒的特异性鉴别研究较少。因此，为保障中药配方颗粒用药安全与临床疗效，需要建立准确度高，专属性好的鉴别方法。
技术实现要素：4.本发明所要解决的技术问题在于，提供一种用于僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性pcr鉴别的引物，其可有效鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒的真伪。
5.本发明还要解决的技术问题在于，提供所述僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性pcr鉴别的引物的应用。
6.本发明还要解决的技术问题在于，提供一种试剂盒，其能够快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒的真伪。
7.本发明还要解决的技术问题在于，提供一种快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法，其准确度好、专属性高。
8.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提
物制品和配方颗粒特异性pcr鉴别的引物，其包括第一引物对和第二引物对；
9.其中，所述第一引物对的上游引物的序列如seq id no：1所示，其下游引物的序列如seq id no：2所示；
10.所述第二引物对的上游引物的序列如seq id no：3所示，其下游引物的序列如seq id no：4所示。
11.所述第一引物对和第二引物对，其具体序列如下表所示：
[0012][0013]
为了解决上述技术问题，本发明提供了所述僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性pcr鉴别的引物在(1)、(2)或(3)中的应用：
[0014]
(1)鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的应用；
[0015]
(2)制备用于鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒的试剂盒；
[0016]
(3)构建快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法中的应用。
[0017]
在一种实施方式中，鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的应用为同时鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒是否来源于家蚕和白僵菌。如果僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒同时源于家蚕和白僵菌，则所述僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒为真品；否则为伪劣品。
[0018]
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第一引物对和第二引物对；
[0019]
其中，所述第一引物对的上游引物的序列如seq id no：1所示，其下游引物的序列如seq id no：2所示；
[0020]
所述第二引物对的上游引物的序列如seq id no：3所示，其下游引物的序列如seq id no：4所示。
[0021]
在一种实施方式中，所述试剂盒中还包括dna阳性对照、pcr反应体系、电泳鉴定体系。
[0022]
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法，包括以下步骤：
[0023]
s1、提取待测样品的基因组dna；
[0024]
s2、以所述基因组dna为模板，采用如权利要求1所述的引物进行pcr扩增，得到扩增产物；
[0025]
s3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，以判断待测样品的真伪。
[0026]
在一种实施方式中，步骤s1中，采用如下方法提取待测样品的基因组dna：
[0027]
取待测样品，加入ctab沉淀液沉淀提取1～3次；取沉淀物加入ctab提取液、蛋白酶
k、β-巯基乙醇提取，然后加入氯仿-异戊醇萃取1～3次；取萃取后上清液，加入异丙醇或异丙醇-乙酸钠沉淀提取，沉淀物经洗涤、孵育后用水溶解，即得待测样品的基因组dna。
[0028]
在一种实施方式中，步骤s2中包括：
[0029]
以所述基因组dna为模板，采用所述第一引物对进行第一pcr扩增，得到第一扩增产物；
[0030]
以所述基因组dna为模板，采用所述第二引物对进行第二pcr扩增，得到第二扩增产物。
[0031]
在一种实施方式中，步骤s2中，所述pcr扩增的程序为：将扩增体系在94～96℃的温度下预变性4～6min，然后在预设程序下循环29～40次，最后在71～75℃延伸4～6min；
[0032]
其中，所述预设程序为：先在94～96℃的温度下变性20～40s，随后在50～70℃的温度下退火20～40s，再在65～80℃的温度下延伸20～40s。
[0033]
在一种实施方式中，所述第一pcr扩增的反应体系为：2
×
m5 supper fasttaq pcr mastermix 12.5μl，所述第一引物对的上游引物0.3μl，所述第一引物对的下游引物0.3μl，dna模板2μl，灭菌双蒸水补足至25μl；
[0034]
所述第二pcr扩增的反应体系为：2
×
m5 supper fasttaq pcr mastermix 12.5μl，所述第二引物对的上游引物0.3μl，所述第二引物对的下游引物0.3μl，dna模板1μl，灭菌双蒸水补足至25μl。
[0035]
在一种实施方式中，步骤s3中包括：
[0036]
将所述第一扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若所述第一扩增产物在152bp处产生条带，则待测样品中含有家蚕；
[0037]
将所述第二扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若所述第二扩增产物在260bp处产生条带，则待测样品中含白僵菌；
[0038]
所述待测样品中同时含有家蚕和白僵菌时，所述待测样品为真品；否则待测样品为伪劣品。
[0039]
实施本发明，具有如下有益效果：
[0040]
1，本发明提供的引物，可进行位点特异性pcr反应，能够有效鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒中是否含有家蚕和白僵菌，从而辨别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒的真伪。本发明以僵蚕及炒僵蚕水提取物、配方颗粒为研究对象，分别基于家蚕、面包虫、玉米虫、金龟子幼虫的co i基因、白僵菌和绿僵菌的its基因设计了家蚕及白僵菌特异性引物，通过优化扩增体系和程序，实现了同时鉴定僵蚕饮片、水提物和配方颗粒中家蚕和白僵菌的特异性pcr方法，以保障中药配方颗粒用药安全与临床疗效，提供了准确度高、专属性好的鉴别方法。
[0041]
2，本发明提供的鉴别方法，其准确度好、专属性高，能够快速准确地辨别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒的真伪，且可解决标准汤剂、中药配方颗粒在失去形态后难以鉴别的难题。
附图说明
[0042]
图1是家蚕的引物筛选电泳图；其中，m为dna分子量标准，1为僵蚕对照药材，2为僵蚕饮片，3和4为僵蚕标准汤剂(冻干粉)，5和6为僵蚕配方颗粒，7为金龟子幼虫药材，8为玉
米虫药材，9为面包虫药材，10为空白(ddh2o)；
[0043]
图2是白僵菌的引物筛选电泳图，其中，m为dna分子量标准，1为僵蚕对照药材，2为僵蚕饮片，3和4为僵蚕标准汤剂(冻干粉)，5和6为僵蚕配方颗粒，7为蚕蛹药材，8为死蚕药材，9为空白(ddh2o)；
[0044]
图3是实施例2中僵蚕中家蚕特异性pcr法样品适用性结果；其中，m为dna分子量标准，1为僵蚕对照药材，2～18为僵蚕饮片，19～35为僵蚕标准汤剂(冻干粉)，36～53为僵蚕配方颗粒，54为金龟子幼虫药材，55为玉米虫药材，56为面包虫药材，n为空白(ddh2o)。
[0045]
图4为实施例2中僵蚕中白僵菌特异性pcr法样品适用性结果；其中，m为dna分子量标准，1为僵蚕对照药材，2～18为僵蚕饮片，19～35为僵蚕标准汤剂(冻干粉)，36～53为僵蚕配方颗粒，54为蚕蛹药材，55为死蚕药材，n为空白(ddh2o)。
[0046]
图5为实施例2中炒僵蚕中家蚕特异性pcr法样品适用性结果；其中，m为dna分子量标准，1为炒僵蚕对照药材，2～18为炒僵蚕饮片，19～35为炒僵蚕标准汤剂(冻干粉)，36～53为炒僵蚕配方颗粒，54为金龟子幼虫药材，55为玉米虫药材，56为面包虫药材，n为空白(ddh2o)。
[0047]
图6为实施例2中炒僵蚕中白僵菌特异性pcr法样品适用性结果；其中，m为dna分子量标准，1为炒僵蚕对照药材，2～18为炒僵蚕饮片，19～35为炒僵蚕标准汤剂(冻干粉)，36～53为炒僵蚕配方颗粒，54为蚕蛹药材，55为死蚕药材，n为空白(ddh2o)。
[0048]
图7为实施例3中不同退火温度的考察结果；其中，m为dna分子量标准，1.僵蚕对照药材，2.僵蚕药材，3.僵蚕标汤，4.僵蚕标汤，5.僵蚕颗粒，6.僵蚕颗粒，7.金龟子幼虫药材，8.玉米虫药材，9.面包虫药材，10.n为空白(ddh2o)。
[0049]
图8为实施例3中不同酶的考察结果；其中，m为dna分子量标准，1.僵蚕对照药材，2.僵蚕药材，3.僵蚕标汤，4.僵蚕标汤，5.僵蚕颗粒，6.僵蚕颗粒，7.金龟子幼虫药材，8.玉米虫药材，9.面包虫药材，10.n为空白(ddh2o)。
[0050]
图9为实施例3中不同引物量的考察结果；其中，m为dna分子量标准，1.僵蚕对照药材，2.僵蚕药材，3.僵蚕标汤，4.僵蚕标汤，5.僵蚕颗粒，6.僵蚕颗粒，7.金龟子幼虫药材，8.玉米虫药材，9.面包虫药材，10.n为空白(ddh2o)。
[0051]
图10为实施例3中不同循环次数的考察结果；其中，m为dna分子量标准，1.僵蚕对照药材，2.僵蚕药材，3.僵蚕标汤，4.僵蚕标汤，5.僵蚕颗粒，6.僵蚕颗粒，7.金龟子幼虫药材，8.玉米虫药材，9.面包虫药材，10.n为空白(ddh2o)。
[0052]
图11为实施例4中不同退火温度的考察结果；其中，m为dna分子量标准，1.僵蚕对照药材，2.僵蚕药材，3.僵蚕标准汤剂，4.僵蚕标准汤剂，5.僵蚕配方颗粒，6.僵蚕配方颗粒，7.蚕蛹，8.死蚕，n为空白(ddh2o)。
[0053]
图12为实施例4中不同酶的考察结果；其中，m为dna分子量标准，1.僵蚕对照药材，2.僵蚕药材，3.僵蚕标准汤剂，4.僵蚕标准汤剂，5.僵蚕配方颗粒，6.僵蚕配方颗粒，7.蚕蛹，8.死蚕，n为空白(ddh2o)。
[0054]
图13为实施例4中不同引物量的考察结果；其中，其中，m为dna分子量标准，1.僵蚕对照药材，2.僵蚕药材，3.僵蚕标准汤剂，4.僵蚕标准汤剂，5.僵蚕配方颗粒，6.僵蚕配方颗粒，7.蚕蛹，8.死蚕，n为空白(ddh2o)。
[0055]
图14为实施例4中不同循环次数的考察结果；其中，其中，m为dna分子量标准，1.僵
蚕对照药材，2.僵蚕药材，3.僵蚕标准汤剂，4.僵蚕标准汤剂，5.僵蚕配方颗粒，6.僵蚕配方颗粒，7.蚕蛹，8.死蚕，n为空白(ddh2o)。
具体实施方式
[0056]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施方式对本发明作进一步地详细描述。
[0057]
本发明提供了一种用于僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性pcr鉴别的引物，其包括第一引物对和第二引物对；
[0058]
其中，所述第一引物对的上游引物的序列如seq id no：1所示，其下游引物的序列如seq id no：2所示；
[0059]
所述第二引物对的上游引物的序列如seq id no：3所示，其下游引物的序列如seq id no：4所示。
[0060]
所述第一引物对和第二引物对，其具体序列如表1所示：
[0061]
表1为第一引物对和第二引物对的信息表
[0062][0063]
相应地，本发明还提供了所述僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性pcr鉴别的引物在(1)、(2)或(3)中的应用：
[0064]
(1)鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的应用；
[0065]
(2)制备用于鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒的试剂盒；
[0066]
(3)构建快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法中的应用。
[0067]
在一种实施方式中，鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的应用为同时鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒是否来源于家蚕和白僵菌。如果僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒同时源于家蚕和白僵菌，则所述僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒为真品；否则为伪劣品。
[0068]
具体地，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第一引物对和第二引物对；
[0069]
其中，所述第一引物对的上游引物的序列如seq id no：1所示，其下游引物的序列如seq id no：2所示；
[0070]
所述第二引物对的上游引物的序列如seq id no：3所示，其下游引物的序列如seq id no：4所示。
[0071]
在一种实施方式中，所述试剂盒中还包括dna阳性对照、pcr反应体系、电泳鉴定体系。
[0072]
进一步地，本发明提供了一种快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和
配方颗粒真伪的鉴定方法，包括以下步骤：
[0073]
s1、提取待测样品的基因组dna；
[0074]
在一种实施方式中，步骤s1中，采用如下方法提取待测样品的基因组dna：
[0075]
取待测样品，加入ctab沉淀液沉淀提取1～3次；取沉淀物加入ctab提取液、蛋白酶k、β-巯基乙醇提取，然后加入氯仿-异戊醇萃取1～3次；取萃取后上清液，加入异丙醇或异丙醇-乙酸钠沉淀提取，沉淀物经洗涤、孵育后用水溶解，即得待测样品的基因组dna。
[0076]
优选地，步骤s1中，采用如下方法提取待测样品的基因组dna：
[0077]
取待测样品，加入ctab沉淀液沉淀提取2次；取沉淀物加入ctab提取液、蛋白酶k、β-巯基乙醇提取，然后加入氯仿-异戊醇萃取3次；取萃取后上清液，加入异丙醇或异丙醇-乙酸钠沉淀提取，沉淀物经洗涤、孵育后用水溶解，即得待测样品的基因组dna。
[0078]
进一步地，对提取出的基因组dna的浓度进行测定。在一种实施方式中，取基因组dna样品，采用biospec-nano微量紫外分光光度计测定dna浓度，同时记录od260/od230，od260/od280，并调整浓度到100～400ng/μl。
[0079]
s2、以所述基因组dna为模板，采用如权利要求1所述的引物进行pcr扩增，得到扩增产物；
[0080]
在一种实施方式中，所述pcr扩增的程序为：将扩增体系在94～96℃的温度下预变性4～6min，然后在预设程序下循环29～40次，最后在71～75℃延伸4～6min；
[0081]
其中，所述预设程序为：先在95℃的温度下变性30s，随后在60℃的温度下退火30s，再在72℃的温度下延伸30s。
[0082]
优选地，所述pcr扩增的程序为：将扩增体系在95℃的温度下预变性5min，然后在预设程序下循环33次，最后在72℃延伸5min；
[0083]
其中，所述预设程序为：先在95℃的温度下变性30s，随后在60℃的温度下退火30s，再在72℃的温度下延伸30s。
[0084]
在一种实施方式中，步骤s2中包括：
[0085]
以所述基因组dna为模板，采用所述第一引物对进行第一pcr扩增，得到第一扩增产物；
[0086]
以所述基因组dna为模板，采用所述第二引物对进行第二pcr扩增，得到第二扩增产物。
[0087]
在一种实施方式中，所述第一pcr扩增的反应体系为：2
×
m5 supper fasttaq pcr mastermix 12.5μl，所述第一引物对的上游引物0.3μl，所述第一引物对的下游引物0.3μl，dna模板2μl，灭菌双蒸水补足至25μl；
[0088]
所述第二pcr扩增的反应体系为：2
×
m5 supper fasttaq pcr mastermix 12.5μl，所述第二引物对的上游引物0.3μl，所述第二引物对的下游引物0.3μl，dna模板1μl，灭菌双蒸水补足至25μl。
[0089]
s3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，以判断待测样品的真伪。
[0090]
在一种实施方式中，向扩增产物反应体系中加入5μl 6
×
loading buffer，混匀，取混合产物6～8μl点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于150v电压的条件下电泳25min，经gelred显色，最后于凝胶成像仪观察记录结果。
[0091]
在一种实施方式中，步骤s3中包括：
[0092]
将所述第一扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若所述第一扩增产物在152bp处产生条带，则待测样品中含有家蚕；
[0093]
将所述第二扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若所述第二扩增产物在260bp处产生条带，则待测样品中含白僵菌；
[0094]
所述待测样品中同时含有家蚕和白僵菌时，所述待测样品为真品；否则待测样品为伪劣品。
[0095]
下面以具体实施例对本发明进行说明。
[0096]
实施例1
[0097]
用于僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性pcr鉴别的引物的设计和筛选
[0098]
(1)引物设计
[0099]
在genebank数据库中搜索下载家蚕的cytochrome oxidase i(co i)、白僵菌以及绿僵菌its序列，由于ncbi上缺乏家蚕伪品玉米虫、面包虫和金龟子幼虫的序列信息，家蚕引物基于家蚕的序列信息进行设计，利用bioedit软件分别对家蚕、白僵菌和绿僵菌的序列进行同源比对，校对后分析家蚕和白僵菌特异性snp位点，将包含snp位点的碱基序列导入到primer premier 5软件中，进行引物设计，经初步筛选确定了表2所示的5对引物，由上海生工有限公司合成。
[0100]
表2引物信息表
[0101][0102]
(2)引物筛选
[0103]
建立家蚕和白僵菌pcr扩增体系和程序，如表3所示：
[0104]
表3家蚕和白僵菌pcr反应体系(25μl)
[0105][0106]
pcr扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共33个循环；最后72℃延伸5min。
[0107]
以实施例2所得的基因组dna和表2所示的引物进行pcr扩增，待pcr扩增反应结束后，取混合产物6～8μl点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于150v电压的条件下电泳30min，经gelred显色，于凝胶成像仪观察结果，结果见图1和图2。
[0108]
由图1和图2可知，引物组jiac03.f/jiac03.r、bjj03.f/bjj03.r其空白对照未出现反应条带，说明pcr反应过程无污染，结果可靠，pcr扩增得到的目的条带长度分别为152bp和260bp。引物组jiac03.f/jiac03.r、bjj03.f/bjj03.r能够对家蚕和白僵菌进行扩增，而未能对其伪品进行扩增，说明了该2组引物分别能够特异性检测家蚕和白僵菌，则可作为快速鉴别家蚕和白僵菌的特异性引物。
[0109]
实施例2
[0110]
一种快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法及其适用性检测
[0111]
s1、提取待测样品的基因组dna；
[0112]
按照表4所示的样品列表，以17批僵蚕饮片、17批僵蚕冻干粉、18批僵蚕配方颗粒、17批炒僵蚕饮片、17批炒僵蚕冻干粉、18批炒僵蚕配方颗粒、1批金龟子幼虫药材、1批玉米虫药材、1批蚕蛹药材、1批死蚕药材和1批面包虫药材为待测样品，提取基因组dna。其中，炒僵蚕是由僵蚕清洗后放入热锅中炒制而得。另外冻干粉属于标准汤剂中的一种。
[0113]
表4样品列表
[0114][0115]
采用如下方法提取僵蚕药材、僵蚕饮片、炒僵蚕饮片、金龟子幼虫药材、玉米虫药材、蚕蛹药材、死蚕药材和面包虫药材样品的基因组dna：
[0116]
取样品0.05g，研磨成粉末，置2ml离心管中，加入1.2ml 65℃预热的ctab沉淀液，混匀，65℃水浴加热60min，冷却至室温后，以12000r/min离心5min，弃上清液，再加入ctab沉淀液1.0ml，混匀，65℃水浴加热30min后同法操作。
[0117]
向该离心管中依次加入900μl ctab提取液、10μl蛋白酶k、10μlβ-巯基乙醇，混匀，65℃水浴加热120min。取出离心管，待冷却至室温后加入等体积的氯仿-异戊醇(24﹕1)，涡旋混匀，以12000r/min，4℃离心10min，取上清液于新的2ml离心管中，重复操作2次。
[0118]
取上清液于1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，于-20℃静置60min。取出离心管以12000r/min离心5min，弃上清液，沉淀分别用75％乙醇洗涤3次及无水乙醇洗涤1次，以12000r/min离心5min，弃上清液，沉淀于37℃孵育30min，待乙醇挥发后，加灭菌水30μl使溶解，置4℃保存或置零下20℃长期保存。
[0119]
采用如下方法提取僵蚕及炒僵蚕冻干粉、僵蚕及炒僵蚕配方颗粒样品的基因组dna：
[0120]
取样品0.1g，研磨成粉末，置2ml离心管中，加入1.2ml 65℃预热的ctab沉淀液，混匀，65℃水浴加热60min，冷却至室温后，以12000r/min离心5min，弃上清液，再加入ctab沉淀液1.0ml，混匀，65℃水浴加热30min后同法操作。
[0121]
向该离心管中依次加入900μl ctab提取液、10μl蛋白酶k、10μlβ-巯基乙醇，混匀，65℃水浴加热120min。取出离心管，待冷却至室温后加入等体积的氯仿-异戊醇(24﹕1)，涡旋混匀，以12000r/min，4℃离心10min，取上清液于新的2ml离心管中，重复操作2次。
[0122]
取上清液于1.5ml离心管中，加入等体积异丙醇，于-20℃静置60min。取出离心管以12000r/min离心5min，弃上清液，沉淀分别用75％乙醇洗涤3次及无水乙醇洗涤1次，以12000r/min离心5min，弃上清液，沉淀于37℃孵育30min，待乙醇挥发后，加灭菌水30μl使溶
fasttaq、ex taq、mightyamp、speedstar时，对pcr扩增的影响。结果如图8所示，当使用中保真的2
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m5 supper fasttaq聚合酶和ex taq聚合酶、高度保真的speedstar聚合酶以及mightyamp聚合酶进行试验时，4种dna聚合酶均获得僵蚕dna样品的扩增条带，且条带亮度适中，但speedstar聚合酶获得伪品玉米虫的扩增条带，为保证结果准确性，故选用2
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m5 supper fasttaq聚合酶作为dna聚合酶。
[0141]
(3)不同引物量考察
[0142]
以实施例2为基础，通过单因素考察加入引物量分别为0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl时，对pcr扩增的影响。结果如图9所示，当引物量分别为0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl时，随着加入引物量的增加，条带亮度逐渐增加，以0.3μl时，空白对照无假阳性出现，条带亮度适中，为保证条带亮度及节约引物试剂成本，故选择引物量为0.3μl。
[0143]
(4)不同循环数考察
[0144]
以实施例2为基础，通过单因素分别考察循环数为29、31、33、35个时，对pcr扩增的影响。结果如图10所示，随着循环数的增加，pcr条带亮度逐渐增加，且均空白对照无假阳性出现，当循环数为33个时，条带亮度适中，且均空白对照无假阳性出现，为避免出现非特异性扩增，故选循环数为33个。
[0145]
实施例4
[0146]
僵蚕菌体方法学考察
[0147]
(1)退火温度考察
[0148]
以实施例2为基础，通过单因素分别考察退火温度分别为56℃、58℃、60℃、62℃时，对pcr扩增的影响。结果如图11所示，当退火温度分别为60℃、62℃时，pcr扩增条带差异较小且空白对照均无假阳性出现，而退火温度分别为56℃、58℃时，伪品出现非特异性扩增，为保证方法特异性鉴别，故选择退火温度为60℃～62℃。
[0149]
(2)不同酶考察
[0150]
以实施例2为基础，通过单因素分别考察dna聚合酶分别为2
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m5 supper fasttaq、ex taq、mightyamp、speedstar时，对pcr扩增的影响。结果如图12所示，使用2
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m5 supper fasttaq pcr mastermix聚合酶和speedstar hs dna聚合酶时，僵蚕菌体dna样品均可获得目标条带，且伪品均无目标条带，其中使用speedstar hs dna聚合酶时，伪品出现非特异性扩增；使用其他2种聚合酶，正品及伪品均获得目标条带或存在明显的非特异性扩增，为保证方法特异性鉴别准确性，故选择dna聚合酶为2
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m5 supper fasttaq pcr mastermix聚合酶。
[0151]
(3)不同引物量考察
[0152]
以实施例2为基础，通过单因素考察加入引物量分别为0.2、0.3、0.4μl时，对pcr扩增的影响。结果如图13所示，当引物用量为0.3μl及0.4μl时，pcr扩增条带均较亮，为保证条带亮度及节约引物试剂成本，故选择引物量为0.3μl。
[0153]
(4)不同循环数考察
[0154]
以实施例2为基础，通过单因素分别考察循环数为29、31、33、35个时，对pcr扩增的影响。结果如图14所示，不同循环次数的pcr扩增条带差异较小且空白对照均无假阳性出现，为保证条带亮度，故选择循环次数为33次。
[0155]
以上所述是发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来
说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
[0156]
[0157]
技术特征：1.一种用于僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性pcr鉴别的引物，其特征在于，包括第一引物对和第二引物对；其中，所述第一引物对的上游引物的序列如seq id no：1所示，其下游引物的序列如seq id no：2所示；所述第二引物对的上游引物的序列如seq id no：3所示，其下游引物的序列如seq id no：4所示。2.如权利要求1所述的引物在(1)、(2)或(3)中的应用：(1)鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的应用；(2)制备用于鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒的试剂盒；(3)构建快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法中的应用。3.根据权利要求2所述的鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的应用，其特征在于，所述应用为鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒是否来源于家蚕和白僵菌。4.一种试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的引物。5.一种快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、提取待测样品的基因组dna；s2、以所述基因组dna为模板，采用如权利要求1所述的引物进行pcr扩增，得到扩增产物；s3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，以判断待测样品的真伪。6.如权利要求5所述的快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法，其特征在于，步骤s1中，采用如下方法提取待测样品的基因组dna：取待测样品，加入ctab沉淀液沉淀提取1～3次；取沉淀物加入ctab提取液、蛋白酶k、β-巯基乙醇提取，然后加入氯仿-异戊醇萃取1～3次；取萃取后上清液，加入异丙醇或异丙醇-乙酸钠沉淀提取，沉淀物经洗涤、孵育后用水溶解，即得待测样品的基因组dna。7.如权利要求5所述的快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法，其特征在于，步骤s2中包括：以所述基因组dna为模板，采用所述第一引物对进行第一pcr扩增，得到第一扩增产物；以所述基因组dna为模板，采用所述第二引物对进行第二pcr扩增，得到第二扩增产物。8.如权利要求5所述的快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法，其特征在于，步骤s2中，所述pcr扩增的程序为：将扩增体系在94～96℃的温度下预变性4～6min，然后在预设程序下循环29～40次，最后在71～75℃延伸4～6min；其中，所述预设程序为：先在94～96℃的温度下变性20～40s，随后在50～70℃的温度下退火20～40s，再在65～80℃的温度下延伸20～40s。9.如权利要求7所述的快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法，其特征在于，所述第一pcr扩增的反应体系为：2
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m5 supper fasttaq pcr mastermix 12.5μl，所述第一引物对的上游引物0.3μl，所述第一引物对的下游引物0.3μl，dna模板2μl，灭菌双蒸水补足至25μl；
所述第二pcr扩增的反应体系为：2
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m5 supper fasttaq pcr mastermix 12.5μl，所述第二引物对的上游引物0.3μl，所述第二引物对的下游引物0.3μl，dna模板1μl，灭菌双蒸水补足至25μl。10.如权利要求7所述的快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法，其特征在于，步骤s3中包括：将所述第一扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若所述第一扩增产物在152bp处产生条带，则待测样品中含有家蚕；将所述第二扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，若所述第二扩增产物在260bp处产生条带，则待测样品中含白僵菌；所述待测样品中同时含有家蚕和白僵菌时，所述待测样品为真品；否则待测样品为伪劣品。
技术总结本发明公开了一种用于僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性PCR鉴别的引物，其包括第一引物对和第二引物对；其中，所述第一引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示；所述第二引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：4所示。本发明还公开了上述引物的应用，基于该引物的试剂盒以及基于该引物的鉴别方法。实施本发明，可有效鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒的真伪。提物制品和配方颗粒的真伪。提物制品和配方颗粒的真伪。
技术研发人员：胡绮萍 钟春琳 谭斯尹 黄上书 刘潇晗 罗宇琴 魏梅 陈向东
受保护的技术使用者：广东一方制药有限公司
技术研发日：2022.06.21
技术公布日：2022/11/1
