1.本发明属于纳米医学技术领域，具体涉及双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统及其制备方法与应用。
背景技术：2.乳腺癌(bc)是乳腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下，发生增殖失控的现象，是女性中最常见的癌症，占全球女性确诊癌症的四分之一。其中，三阴性乳腺癌由于缺乏激素受体和人表皮生长因子受体-2的表达而缺乏有效的靶向治疗不能从内分泌治疗和抗her2治疗(靶向治疗)中获益。传统的化学疗法虽然可以提高癌症的存活率，但化学治疗剂是非选择性的，除了癌细胞之外还损害正常的细胞和组织，引起严重的不良副作用。临床实践中发现，三阴性乳腺癌术后复发转移的风险大大增加，患者的5年生存率仍然很低。单一模式治疗方法并不能完全消除肿瘤，最终导致治疗失败。
3.现有技术已有采用化学动力学疗法进行肿瘤治疗的报道，相比传统的化学治疗，对正常细胞和组织的损害作用显著降低。化学动力学治疗是一种基于芬顿反应或者类芬顿反应的癌症治疗方法，他主要是利用肿瘤组织的弱酸性和高浓度过氧化氢，通过过氧化物酶活性将过氧化氢转化为高细胞毒性的羟基自由基，从而杀死癌细胞。化学动力学无需引入抗癌药物和外界刺激，副作用小，操作简单。目前技术常采用金属及金属氧化物作为过氧化物纳米酶材料。氧化铁纳米颗粒作为一种具有芬顿反应活性的磁性纳米材料，是目前研究最多的金属氧化物纳米酶。氧化铁纳米颗粒已经被广泛应用于生物分离、环境保护、疾病的诊断与治疗等领域，例如磁共振成像(mri)、药物递送、肿瘤治疗等。较小尺寸的氧化铁纳米颗粒能够快速进入细胞，增加细胞内活性氧(ros)的产生并诱导细胞凋亡。但是肿瘤微环境内乏氧状态、低水平的过氧化氢以及过表达的谷胱甘肽严重影响了化学动力学治疗效果。过表达的谷胱甘肽会消耗羟基自由基，从而抑制化学动力学治疗效果。因此，单纯的化学动力学治疗效果并不理想。
4.现有技术中，二氧化锰作为一种金属氧化物，也被证明具有多种酶活性，包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶。其酶催化活性受到反应ph、温度、纳米颗粒的尺寸和浓度、表面修饰等因素的影响。同时，二氧化锰具有类芬顿效应，具有治疗ros诱导的相关疾病的巨大潜力。二氧化锰在肿瘤酸性环境中能够产生o2，缓解肿瘤内缺氧环境；另外，二氧化锰还可以消耗谷胱甘肽。在肿瘤偏酸的环境中，二氧化锰降解，产生二价锰离子，能够增强t1成像。虽然，现有技术中二氧化锰已被用于解决肿瘤微环境乏氧的状态，但是将氧化铁与二氧化锰联合使用调节肿瘤微环境的机制并不明确。
5.现有技术中，免疫疗法已被用于解决乳腺癌的复发和转移。肿瘤的免疫治疗旨在激活人体内自身免疫系统，进而消灭癌细胞和肿瘤组织。与手术、化疗不同的是，免疫治疗针对的靶标是人体自身的免疫系统。根据治疗作用的制剂可分为分子治疗、细胞治疗和免疫调节剂治疗。研究表明，pd-1/pd-l1作为免疫检查点抑制剂靶点在肿瘤微环境中表达增
高，该信号通路的激活能抑制t细胞的活化增殖及细胞因子如il-10、inf-γ的分泌，肿瘤细胞通过上调pd-l1分子的表达来激活pd-1/pd-l1的抑制通路，抑制t细胞的活化，形成适合肿瘤细胞生长的微环境。目前，常使用pd-1抗体进行pd-1/pd-l1通路的抑制，pd-1可以与pd-l1结合也可以和pd-l2结合，而pd-l2更多是在正常组织中表达，这样会给正常组织细胞带来更多的潜在免疫损伤。为了解决这个问题，现有技术使用pd-l1抗体来阻断pd-l1与pd-1通路。pd-l1抗体只阻断pd-1/pd-l1通路，并不会影响pd-1/pd-l2通路，避免了对正常组织细胞的副作用，重新激发t细胞的识别杀生肿瘤细胞的能力，从而抑制肿瘤生长。但是随着pd-l1抗体的广泛应用，其缺点也不断凸显，如昂贵的生产成本、循环半衰期长，组织和肿瘤渗透性差，口服生物利用度低以及免疫源性不良反应严重均限制了抗体的使用，剂量过大容易引起不良的反应，且抗体治疗作用有限，限制了免疫治疗的效果。
6.为了解决上述问题，现有技术采用小分子抑制剂代替抗体，阻断pd-1/pd-l1通路，提高t细胞免疫治疗效果。bms-202是一种pd-1/pd-l1通路小分子抑制剂。bms-202可直接与pd-l1结合，诱导pd-l在与pd-1结合的活性位点形成二聚体，进而有效的阻止pd-1/pd-l1形成复合物。从而使得t细胞不被抑制活化，产生杀伤肿瘤的作用。但是，小分子pd-l1抑制剂bms-202是疏水性分子，直接应用于体内可能导致毒性及不良的药代动力学性质。
7.为了克服药物利用率低的问题，目前现有的技术是靶向治疗。其指在治疗的过程中有目的的针对某一个特定的目标或者部位，可以达到减少药物用量，精准达到病变区域的目的，减少毒副作用。目前，与靶向治疗有关的已知药物有一氧化氮合成酶抑制剂。表皮生长因子受体及其抑制剂等。但是，靶向治疗也面临着一些问题，比如单药使用疗效低，易产生耐药性，价格昂贵等问题，限制了其广泛使用。现有技术表明，表面增加靶向因子有助于药物精准运送至肿瘤细胞部分。amd3100是一种公认的、特异性比较高的、已被fda批准用于造血干细胞的细胞因子受体拮抗剂，具有成本低廉、免疫原性较低等优点，可以抑制趋化因子受体4(cxcr4)与趋化因子配体12(cxcl12)的结合。但是，amd3100抑制肿瘤细胞的生长转移的特点在治疗三阴性乳腺癌方面作用仍不明确。
8.目前，三阴性乳腺癌的治疗效果不佳，患者预后不良。既往的化疗方法存在治疗效果不理想、易发生耐药性、患者在手术后会出现复发与转移等问题。现有技术虽然已有运用纳米技术治疗三阴性乳腺癌的报道，但是双靶向至肿瘤细胞并对肿瘤微环境有响应性仍不明确。此外，化学动力学治疗、免疫治疗，磁共振成像结合起来，达到诊疗一体化的多功能纳米递送系统构建尚不明确。
技术实现要素：9.发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一种双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统，可靶向至肿瘤细胞且在特定肿瘤微环境下释放药物，降低对正常细胞的毒副作用，并且显著提高三阴性乳腺癌的治疗效果，有效抑制三阴性乳腺癌转移至肺部等其他组织，同时增强t细胞对三阴性乳腺癌细胞免疫应答作用。
10.技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统，所述多功能纳米递送系统是以高分子聚合物为载体包封磁性纳米颗粒及免疫抑制剂为内核，表面负载二氧化锰并进一步修饰透明质酸以及趋化因子受体4抑制剂。
11.其中，所述高分子聚合物包括但不仅限于聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-聚乙烯亚胺嵌段聚合物或聚乳酸-羟基乙酸-聚乙烯亚胺嵌段共聚合物中的一种或几种；高分子聚合物具有较好的两亲性，利于长循环，表面易于修饰，可以达到特定的治疗目标。
12.其中，作为优选地，所述高分子共聚物为聚乳酸-羟基乙酸-聚乙烯亚胺嵌段共聚合物。
13.其中，作为优选地，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物平均分子量5000～10000，最优为5000。
14.其中，作为优选地，聚乙烯亚胺平均分子量为600～10000，最优为800。
15.其中，所述磁性纳米颗粒包括但不仅限于四氧化三铁纳米颗粒；所述免疫抑制剂包括但不仅限于pd-l1小分子抑制剂。
16.本发明内容还包括所述的一种双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统的制备方法，包括以下步骤：
17.1)制备包裹磁性纳米颗粒及免疫抑制剂的高分子聚合物纳米颗粒：将高分子聚合物、磁性纳米颗粒及免疫抑制剂溶于有机试剂中，并加入到乳化剂水溶液中，在冰浴条件下超声破碎得到初乳液转移到三颈瓶中，机械搅拌并超声震荡以挥发有机试剂，超滤洗涤去除多余的乳化剂及其他杂质，收集包裹磁性纳米颗粒与免疫抑制剂的高分子聚合物纳米颗粒；
18.2)原位合成法制备负载二氧化锰并包裹磁性纳米颗粒与免疫抑制剂的高分子聚合物纳米颗粒(以下简称为“负载二氧化锰的磁性纳米颗粒”)：将包裹磁性纳米颗粒与免疫抑制剂的高分子聚合物纳米颗粒溶于水，用氢氧化钠调节ph至碱性得到水溶液，然后将高锰酸钾缓慢滴加至水溶液中，在室温下继续搅拌，将高锰酸钾还原为二氧化锰颗粒，最后磁分离以去除单独的二氧化锰即得到负载二氧化锰的磁性纳米颗粒。
19.3)制备透明质酸修饰的负载二氧化锰的磁性纳米颗粒：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于水，混合于透明质酸水溶液中，置于恒温摇床中对透明质酸的羧基进行活化，随后缓慢滴加入高分子聚合物磁性纳米颗粒水溶液中，并在摇床中下震荡反应，之后超滤去除多余的透明质酸，纯水洗涤，最终获得透明质酸修饰的负载二氧化锰的磁性纳米颗粒；
20.4)在透明质酸修饰的二氧化锰负载的磁性纳米颗粒表面修饰趋化因子受体4抑制剂：在将透明质酸修饰的负载二氧化锰的磁性纳米颗粒溶于水中，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐对透明质酸表面羧基进行活化，之后缓慢加入趋化因子受体4抑制剂，置于摇床中振荡反应；反应结束后，超滤去除游离趋化因子受体4抑制剂，纯水洗涤收集趋化因子受体4抑制剂偶联透明质酸修饰的负载二氧化锰并包裹磁性纳米颗粒与免疫抑制剂的高分子聚合物纳米颗粒，即为所述双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统。
21.其中，所述的pd-l1小分子抑制剂可直接与pd-l1结合，占据了pd-l1的活性位点，形成二聚体，抑制pd-l1与pd-1结合，能够有效的阻止t细胞沉默，增强t细胞杀伤作用。
22.其中，所述的pd-l1小分子抑制剂包括但不限于bms-202，bms-37中的一种或组合，最优为bms-202。
23.其中，所述有机试剂为三氯甲烷或二氯甲烷。
24.其中，步骤1)中，所述的乳化剂包括但不限于聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇中的一种或两种组合。
25.其中，作为优选地，乳化剂为聚乙烯醇。
26.其中，作为优选地，聚乙烯醇分子量为20000～40000，最优为31000。
27.其中，步骤1)中所述的超声破碎时间为5～8min，超声间隔时间为2～3s，超声功率为180～300w；机械搅拌时间为3～5h，搅拌速度为400～600rpm。
28.其中，步骤2)中，所述的条件ph为8～10，所用氢氧化钠为1～2m，所述高锰酸钾注入速度为3～5ml/h；机械搅拌速度为400～500rpm，搅拌时间为30～60min。
29.其中，步骤3)中，所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)对透明质酸(ha)的羧基进行活化时edc的浓度为1～5mg/ml，恒温摇床温度为25～30℃，摇床转速为120～150rpm，活化时间为0.5～2h，偶联时间为4～6h。
30.其中，步骤4)中，所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐对透明质酸进行活化时其浓度为1～5mg/ml，反应体系ph为7.4～9.0，室温孵育48～72h。
31.其中，所述的bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha纳米颗粒的制备，其中，所述的靶向乳腺癌的配体包括但不限于透明质酸，纤维连接蛋白，pl-108中的一种或几种组合。
32.其中，作为优选地，所述靶向乳腺癌的配体为透明质酸。
33.其中，所述的cxcr4小分子抑制剂包括但不限于amd3100、e5、mavorixafor、balixafortide的一种或几种组合。
34.其中，作为优选地，所述cxcr4小分子抑制剂为amd3100。
35.其中，作为优选地，所述的bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒的纯化方法为超滤，超滤离心所用的超滤管分子量为30～100kda，离心速度为4000～5000rpm，离心时间为3～5min，离心次数为3～5次。
36.其中，所述的bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒具有核壳结构，水动力尺寸在50～200nm之间，表面电位为-12
±
3mv。
37.本发明内容还包括所述的一种双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统在制备乳腺癌药物中的用途。
38.其中，所述药物通过抑制乳腺癌转移至肺部或其他组织并同时增强t细胞对乳腺癌细胞免疫应答作用。
39.作为优选地，所述包裹磁性纳米颗粒及免疫抑制剂的高分子聚合物纳米颗粒为bms/fe3o4@plga-pei；
40.作为优选地，所述负载二氧化锰的磁性纳米颗粒为bms/fe3o4@plga-pei@mno2；
41.作为优选地，所述透明质酸(ha)修饰的负载二氧化锰的磁性纳米颗粒为bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha；
42.作为优选地，本发明的双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统为bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒。
43.本发明还提供了利用上述一种双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统及其在细胞、动物及磁共振方向的应用。
44.本发明首先采用溶剂蒸发法制备了包裹磁性纳米颗粒(fe3o4)及pd-l1免疫小分子抑制剂(bms-202)的高分子聚合物磁性纳米颗粒；其次，通过原位合成法在高分子聚合物磁
性纳米颗粒表面还原形成mno2；再次，透明质酸和cxcr4小分子抑制剂(amd3100)通过化学键及吸附作用与高分子磁性纳米颗粒表面连接，制备出双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统。
45.反应机理：本发明的纳米递送系统通过透明质酸(ha)和amd3100主动靶向并集中在肿瘤部位；在酸性/还原的肿瘤微环境中消耗谷胱甘肽，生成二价锰离子，产生氧气，缓解肿瘤缺氧环境，同时产生活性氧，增强化学动力学治疗效果；另外，该纳米递送系统通过pd-l1小分子抑制剂(bms-202)阻断pd-l1与pd-1结合，从而激活t细胞，触发t免疫作用；amd3100不仅具有靶向作用，还阻断了cxcr4/cxcl12生物轴，有效抑制乳腺癌的转移；此外，四氧化三铁以及二价锰离子可以同步增强磁共振介导的肿瘤跟踪诊断，实现纳米诊疗一体化。
46.有益效果：与现有技术相比，本发明材料安全易得且制备方法简单，制备的纳米递送系统具有较好的双靶向能力、肿瘤微环境敏感释药能力，能够增强三阴性乳腺癌化学动力学治疗效果并抑制三阴性乳腺癌的转移，提高免疫治疗的效果。本发明的双靶向的多功能纳米递送系统用于克服肿瘤缺氧耐受性问题，增强化学动力学治疗、免疫治疗，同时可提供磁共振成像(mri)监测，本发明整合了每种治疗方式的治疗潜力，多模式协同治疗发挥了显着的协同效应(即“1+1＞2”)，强于单一治疗方式，可为肿瘤治疗提供一种有价值的诊疗技术。
附图说明
47.图1为fe3o4、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒的电镜图。
48.图2为bms/fe3o4@plga-pei、bms/fe3o4@plga-pei@mno2、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米微球的粒径分布图。
49.图3为bms/fe3o4@plga-pei、bms/fe3o4@plga-pei@mno2、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒的zeta电位图。
50.图4为bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒不同ph环境下mn
2+
释放对比图。
51.图5为bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒不同ph环境下药物释放对比图。
52.图6为bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒不同ph环境下氧气产生对比图。
53.图7为bms/fe3o4@plga-pei、bms/fe3o4@plga-pei@mno2、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒电子自旋共振图。
54.图8为bms/fe3o4@plga-pei、bms/fe3o4@plga-pei@mno2、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@amd3100、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100细胞摄取图。
55.图9为bms/fe3o4@plga-pei、bms/fe3o4@plga-pei@mno2、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@amd3100、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100对细胞的毒性研究。
56.图10为不同纳米颗粒肿瘤细胞迁移能力研究。
57.图11为bms/fe3o4@plga-pei、bms/fe3o4@plga-pei@mno2、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@amd3100、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100的治疗效果。图中，(1)生理盐水；(2)bms/fe3o4@pp；(3)bms/fe3o4@pp@mno2；(4)bms/fe3o4@pp@mno2@amd3100；(5)bms/fe3o4@pp@mno2@ha；(6)bms/fe3o4@pp@mno2@ha@amd3100。
58.图12为不同纳米颗粒(bms/fe3o4@plga-pei、bms/fe3o4@plga-pei@mno2、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@amd3100、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100)体内磁共振成像。
59.图13双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统合成示意图。
具体实施方式
60.为了更好地理解本发明，下面用实施例进一步阐明本发明，但本发明的内容不仅仅局限于下面实例。
61.实施例1 bms/fe3o4@plga-pei纳米颗粒的制备
62.将5mg fe3o
4 nps和0.5mg bms-202添加到含有100mg plga-pei的4ml氯仿中。超声处理2分钟后，将混合物分散在10ml的1％(w/v)聚乙烯醇(pva)溶液中，冰浴条件下超声破碎(时间为5min，超声间隔时间为3s，功率为180w)。将初乳液转移至三颈瓶中，超声搅拌约3h以挥发三氯甲烷。4500rpm超滤洗涤3次去除多余的plga-pei、pva等杂质，最后得到bms/fe3o4@plga-pei纳米颗粒。
63.上述方法中采用的fe3o
4 nps、bms-202购自美国(usa)medchemexpress公司。plga-pei购自西安瑞禧公司。
64.实施例2 bms/fe3o4@plga-pei@mno2纳米颗粒的制备
65.用naoh(1.0m)将bms/fe3o4@plga-pei纳米颗粒水溶液的ph值调节至9，然后将质量为fe3o
4 nps一倍的kmno4(2mg/ml)用注射器以3ml/h的速率缓慢滴入bms/fe3o4@plga-pei的水溶液中。在室温下搅拌30min后，将所制备的纳米颗粒磁分离以去除游离的mno2即得到bms/fe3o4@plga-pei@mno2纳米颗粒。
66.实施例3 bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha纳米颗粒的制备
67.称取10mg的透明质酸，在超声震荡条件下溶解于1ml水中，并将0.15ml，1mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)加入到透明质酸水溶液中，室温下摇床震荡0.5h。孵育结束后，将混合液缓慢加入到bms/fe3o4@plga-pei@mno2(含有5mg fe)纳米颗粒中，置于摇床中反应4h。反应结束后，用分子量为100kd的超滤管4500rpm超滤离心5min去除多余的透明质酸，并用纯水洗涤3次得到bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha纳米颗粒。
68.实施例4 bms/fe3o4@plga-pei@mno2@amd3100纳米颗粒的制备
69.称取10mg的amd3100超声震荡条件下溶解于0.5ml无水乙醇中。将上述溶解好的amd3100缓慢加入到bms/fe3o4@plga-pei@mno2(含有5mg fe)水溶液，室温摇床震荡48h，反应结束后，产物用分子量为100kd的超滤管4500rpm超滤离心5min去除多余的amd3100，并用纯水洗涤3次。
70.上述方法中使用的amd3100购自美国(usa)medchemexpress公司。
71.实施例5 bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒的制备
72.取bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha(含有5mg fe)溶液与150μl，1mg/ml的1-(3-二甲
氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)溶液混合，室温孵育0.5h。孵育结束后，将amd3100缓慢滴加到上述溶液中，摇床150rpm反应48h，反应结束后，将产物转移入50ml分子量为100kda的超滤管离心超滤(离心速度为4500rpm，离心时间为5min)，纯水反复洗涤3次以去除游离的amd3100等杂质，最终获得bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒。置于4℃冰箱保存备用。
73.实施例6 bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒形貌及粒径
74.取少量实施例5制备的bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒，平铺在铜网上，在透射电镜下观察纳米颗粒的形貌和粒径。如图1所示，可以观察到bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒呈球形，粒径分布在50～200nm之间，稳定性较好，eds能谱结果显示其主要含有c、o、fe、mn元素，预期的基本元素均含有；从bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒图中可以显著的看到二氧化锰纳米颗粒。
75.如图2和3所示，采用马尔文粒度仪分别测定bms/fe3o4@plga-pei、bms/fe3o4@plga-pei@mno2、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100的水动力尺寸和zeta电位。未接二氧化锰的纳米颗粒的平均粒径约为90nm，原位合成二氧化锰后bms/fe3o4@plga-pei@mno2纳米颗粒的平均尺寸约为110nm，证明二氧化锰原位合成。bms/fe3o4@plga-pei纳米颗粒的zeta电位约为30
±
5mv，原位生成二氧化锰之后的电位约为-15
±
5mv，说明成功合成二氧化锰，修饰透明质酸后电位约为-20
±
5mv，说明透明质酸已修饰在表面，另外，偶联amd3100后，电位约为-12
±
5mv，说明amd3100成功偶联在纳米颗粒表面。
76.实施例7 bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒在不同ph环境下mn
2+
的释放
77.取三份bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒，每份5ml(含有2mg铁元素)置于10kda的透析袋中，并分别分散在pbs(ph＝7.4，6.5，5.5)缓冲液中，置于37℃的摇床上震荡。在指定时间内(0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、24小时、48小时、72小时)取出1ml缓冲液，并补充1ml的新鲜pbs缓冲液。取出的缓冲液用电感耦合等离子体发射光谱仪(icp-oes)测量其mn
2+
浓度。如图4所示，在中性条件下，mn
2+
几乎没有释放，在酸性条件下，mn
2+
释放速率越来越快，且酸性越强，mn
2+
释放速率越快，mn
2+
浓度越高。
78.实施例8 bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒的在不同ph环境下bms-202小分子抑制剂的释放
79.通过透析测量bms-202的体外释放行为。将2mg bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒转移到透析膜(mw截流量＝3kda)中，并分别置于ph 7.4、6.5和5.5的40ml pbs中，并在37℃振荡器(150rpm)。接下来，在指定的时间(0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、24小时、48小时、72小时)收集1ml样品，并用1ml的新鲜缓冲液替换。bms-202的释放是通过紫外-可见分光光度法测量的。
80.如图5所示，bms-202缓慢地从bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒中释放，中性条件下72h后bms-202累积释放仅达到40％，而酸性条件下，bms-202累积释放分别能达到90％，98％，说明bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒具有明显的药物释放性能，并且ph5.5＞ph6.5＞ph7.4。
81.实施例9不同浓度bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒的在不同ph环
境下氧气产生速率
82.将不同浓度的bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100(fe离子浓度为10μg/ml，20μg/ml，30μg/ml)纳米粒子和1ml 30％h2o2分散到不同ph值(ph＝7.4、6.5、5.5)的pbs溶液中。通过使用溶解氧电极随时间测量氧气浓度来检测o2生成速率。
83.如图6所示，同一ph条件下，纳米颗粒浓度越高，产生氧气速率越快，产生氧气越多，同一浓度条件下，氧气产生速率ph 5.5＞ph 6.5＞ph 7.4。
84.实施例10电子自旋共振(esr)检测纳米颗粒
·
oh的形成
85.使用bruker emx esr光谱仪检测纳米颗粒形成的
·
oh。在h2o2条件下，以5，5-二甲基-1-吡咯啉-n-氧化物(dmpo)作为捕获剂来捕获dmpo/
·
oh加合物。分别配制样品溶液包含1
×
10-3
m h2o2、0.05m dmpo、2
×
10-3
mg/ml的bms/fe3o4@plga-pei、bms/fe3o4@plga-pei@mno2或bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒置于玻璃毛细管中并密封，1min后记录光谱特征线。
86.如图7所示，当bms/fe3o4@plga-pei纳米颗粒存在时，esr特征信号较低。相比而言，加入bms/fe3o4@plga-pei@mno2、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒之后，esr特征信号明显增强。此外，bms/fe3o4@plga-pei@mno2的esr信号强度强于bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100信号强度。由此可见，二氧化锰可以在酸性条件下产生
·
oh。
87.实施例11不同纳米颗粒在乳腺癌细胞内的摄取情况
88.4t1细胞系获自中国上海生物化学与细胞生物学研究所，属于三阴性乳腺癌细胞系。
89.异硫氰酸荧光素(fitc)购自上海源叶生物科技有限公司。
90.0.25％胰蛋白酶消化液购自江苏凯基生物技术股份有限公司
91.取对数生长期4t1细胞按照5
×
105个细胞/孔的密度接种到6孔板中，16小时后，加入相同铁浓度(5μg/ml)的与5mg fitc孵育一段时间后的bms/fe3o4@plga-pei、bms/fe3o4@plga-pei@mno2、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@amd3100、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒，4个小时后，pbs清洗细胞，然后0.25％胰蛋白酶消化洗涤收集细胞，采用流式细胞术进行绿色荧光检测。
92.如图8所示，修饰有透明质酸和amd3100的双靶向的纳米颗粒可以大量的被乳腺癌细胞摄取，这有利于纳米颗粒发挥治疗作用。
93.实施例12 cck8法测定细胞相对存活率
94.cck8试剂盒采购自江苏凯基生物技术股份有限公司。
95.采用cck-8细胞活性试剂盒检测不同纳米颗粒对乳腺癌细胞活性的影响。将4t1乳腺癌细胞以1
×
104个/孔的密度接种于96孔板中，待达到一定生长密度后，分别加入0ug/ml、5ug/ml、12.5ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml不同铁浓度的bms/fe3o4@plga-pei、bms/fe3o4@plga-pei@mno2、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@amd3100、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒，在37℃，5％co2的恒温培养箱中孵育48小时后，每孔加入10μl cck-8，继续于恒温培养箱中孵育2h，在酶标仪上450nm波长处测其吸光度(od)，每孔重复6次，按照下面公式计算细胞存活率(％)：
96.细胞存活率＝(样品od-空白od/对照od-空白od)
×
100％
97.样品od：加入样品的细胞液的吸光度
98.对照od：加入pbs的细胞液的吸光度
99.空白od：空白培养基的吸光度
100.如图9所示，随着纳米纳米颗粒浓度的增加，细胞存活率明显下降，且杀伤效果bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100＞bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha＞bms/fe3o4@plga-pei@mno2@amd3100＞bms/fe3o4@plga-pei@mno2＞bms/fe3o4@plga-pei。
101.实施例13肿瘤细胞迁移能力的测试
102.ms-5细胞采购自江苏凯基生物技术股份有限公司
103.胎牛血清(fbs)购自美国thermo fisher scientific公司，品牌为gbico。
104.结晶紫试剂盒采购自江苏凯基生物技术股份有限公司
105.将单层ms-5细胞(5
×
105个/孔)接种到24孔板室中并孵育过夜。将用bms/fe3o4@plga-pei、bms/fe3o4@plga-pei@mno2、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@amd3100、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒(10μg/ml)预处理的4t1细胞(2
×
104个/孔)接种在上室中，并浸入含有10％fbs培养基的24孔板中。孵育24小时后，插入物底面的4t1细胞用结晶紫染色。将染色的细胞溶解在33％(v/v)乙酸中，在570nm处测量吸光度。
106.如图10所示，存在或者不存在amd3100小分子抑制剂的条件下，肿瘤细胞迁移程度不同。在amd3100存在条件下迁移程度明显受到抑制，小于未偶联amd3100的纳米颗粒，而即便在都偶联amd3100的条件下，双靶向的纳米颗粒迁移程度受到抑制更强，迁移能力下降。
107.实施例14乳腺癌小鼠的治疗效果
108.乳腺癌小鼠模型构建成功后，将小鼠随机分为6组(n＝5)。分别尾静脉注射生理盐水、bms/fe3o4@plga-pei、bms/fe3o4@plga-pei@mno2、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@amd3100、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100，注射剂量以铁浓度计，注射浓度为5mg fe/kg。每隔两天治疗1次，共治疗4次，每隔一天测量小鼠的肿瘤大小并记录小鼠的体重。治疗50天内，观察小鼠的生存状态，并随时记录小鼠的死亡情况。
109.如图11所示，与生理盐水组相比，其他治疗组小鼠的生存期明显延长，特别是双靶向磁性高分子纳米颗粒在50天结束后仍有部分小鼠存活，说明该纳米颗粒可以有效抑制肿瘤生长，延长小鼠生存期。
110.实施例15纳米颗粒体内磁共振效应
111.通过在7.0t micro-mr扫描仪(pharmascan，brukers，germany)上使用multi slice multi echo方法进行mri。以5mg fe/kg的剂量注射bms/fe3o4@plga-pei、bms/fe3o4@plga-pei@mno2、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@amd3100、bms/fe3o4@plga-pei@mno2@ha@amd3100纳米颗粒。在肿瘤内注射上述不同的纳米颗粒后的不同时间点(10分钟、2小时、4小时和8小时)进行体内mri。t1加权成像的参数如下：翻转角＝180，矩阵＝256
×
256，te＝14.0ms，tr＝579.2ms，fov＝5
×
5，si＝1.0mm/1.0mm，切片＝11，平均值＝3，nex＝1。用于t2加权成像的参数如下：翻转角＝180，矩阵＝256
×
256，te＝33.0ms，tr＝2500.0ms，fov＝5
×
5，si＝1.0mm/1.0毫米，切片＝11，平均值＝3，nex＝1。
112.如图12所示，从t1成像可以看，含有二氧化锰的材料会产生t1成像效果，特别是双靶向磁性纳米颗粒，2小时的成像相较于其他组效果明显；而t2结果表示在4小时时肿瘤部位t2效果发生变化，8小时变化更加明显，说明材料开始时进行t1加权成像，而随着时间的
进行，8小时主要进行t2加权成像。
技术特征：1.一种双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统，其特征在于，所述多功能纳米递送系统是以高分子聚合物为载体，在载体上包封磁性纳米颗粒及免疫抑制剂为内核，在内核表面负载二氧化锰并进一步修饰透明质酸以及趋化因子受体4抑制剂。2.根据权利要求1所述的一种双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统，其特征在于，所述高分子聚合物为聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-聚乙烯亚胺嵌段聚合物或聚乳酸-羟基乙酸-聚乙烯亚胺嵌段共聚合物中的一种或几种；所述磁性纳米颗粒为四氧化三铁纳米颗粒；所述免疫抑制剂为pd-l1小分子抑制剂；所述的趋化因子受体4抑制剂包括但不限于amd3100、e5、mavorixafor、balixafortide的一种或几种组合。3.权利要求1或2所述的一种双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）制备包裹磁性纳米颗粒及免疫抑制剂的高分子聚合物纳米颗粒：将高分子聚合物、磁性纳米颗粒及免疫抑制剂溶于有机试剂中，并加入到乳化剂水溶液中，在冰浴条件下超声破碎得到初乳液转移到三颈瓶中，机械搅拌并超声震荡以挥发有机试剂，超滤洗涤去除多余的乳化剂及其他杂质，收集包裹磁性纳米颗粒与免疫抑制剂的高分子聚合物纳米颗粒；2）原位合成法制备负载二氧化锰并包裹磁性纳米颗粒与免疫抑制剂的高分子聚合物纳米颗粒：将包裹磁性纳米颗粒与免疫抑制剂的高分子聚合物纳米颗粒溶于水，用氢氧化钠调节ph至碱性得到水溶液，然后将高锰酸钾缓慢滴加至水溶液中，在室温下继续搅拌，将高锰酸钾还原为二氧化锰颗粒，最后磁分离以去除单独的二氧化锰即得到负载二氧化锰的磁性纳米颗粒；3）制备透明质酸修饰的负载二氧化锰的磁性纳米颗粒：将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于水，混合于透明质酸水溶液中，置于恒温摇床中对透明质酸的羧基进行活化，随后缓慢滴加入高分子聚合物磁性纳米颗粒水溶液中，并在摇床中下震荡反应，之后超滤去除多余的透明质酸，纯水洗涤，最终获得透明质酸修饰的负载二氧化锰的磁性纳米颗粒；4）在透明质酸修饰的二氧化锰负载的磁性纳米颗粒表面修饰趋化因子受体4抑制剂：在将透明质酸修饰的负载二氧化锰的磁性纳米颗粒溶于水中，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐对透明质酸表面羧基进行活化，之后缓慢加入趋化因子受体4抑制剂，置于摇床中振荡孵育；反应结束后，超滤去除游离趋化因子受体4抑制剂，纯水洗涤收集趋化因子受体4抑制剂偶联透明质酸修饰的负载二氧化锰并包裹磁性纳米颗粒与免疫抑制剂的高分子聚合物纳米颗粒，即为所述双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统。4.根据权利要求3所述的一种双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统的制备方法，其特征在于，步骤1）中，免疫抑制剂为bms-202或bms-37，所述有机试剂为三氯甲烷或二氯甲烷。5.根据权利要求3所述的一种双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统的制备方法，其特征在于，步骤1）中所述的超声破碎时间为5～8 min，超声间隔时间为2～3 s，超声功率为180～300 w；机械搅拌时间为3～5 h，搅拌速度为400～600 rpm。6.根据权利要求3所述的一种双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统的制备方法，其特征在于，步骤2）中，所述高锰酸钾注入速度为3～5 ml/h；机械搅拌速度为400～
500 rpm，搅拌时间为30～60 min。7.根据权利要求3所述的一种双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统的制备方法，其特征在于，步骤3）中，所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐对透明质酸进行活化时其浓度为1～5 mg/ml，恒温摇床温度为25～30℃，摇床转速为120～150 rpm，孵育时间为4～6 h。8.根据权利要求3所述的一种双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统的制备方法，其特征在于，步骤4）中，所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐对透明质酸进行活化时其浓度为1～5 mg/ml，反应体系ph为7.4～9.0，室温孵育48～72 h。9.权利要求1或2所述的一种双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统在制备乳腺癌药物中的用途。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物通过抑制乳腺癌转移至肺部或其他组织并同时增强t细胞对乳腺癌细胞免疫应答作用。
技术总结本发明公开了双靶向的肿瘤微环境响应的多功能纳米递送系统及其制备方法与应用，本发明材料安全易得且制备方法简单，制备的纳米递送系统具有较好的双靶向能力、肿瘤微环境敏感释药能力，能够增强乳腺癌化学动力学治疗效果并抑制乳腺癌的转移，提高免疫治疗的效果。本发明的双靶向的多功能纳米递送系统用于克服肿瘤缺氧耐受性问题，增强化学动力学治疗、免疫治疗，同时可提供磁共振成像（MRI）监测，本发明整合了每种治疗方式的治疗潜力，多模式协同治疗发挥了显着的协同效应，强于单一治疗方式，可为肿瘤治疗提供一种有价值的诊疗技术。此外，纳米递送系统提供了T2加权和T1加权磁共振成像（MRI），实现了纳米诊疗一体化。实现了纳米诊疗一体化。实现了纳米诊疗一体化。
技术研发人员：张宇 刘迪 何泓良 马明 王建国
受保护的技术使用者：徐州淮海生命科学产业研究院有限公司
技术研发日：2022.06.21
技术公布日：2022/11/1
