治疗或改善自闭症和相关病症的方法
1.相关申请
2.本技术要求2020年1月13日提交的u.s.s.n.62/960,328和2020年1月13日提交的u.s.s.n.62/960,331的优先权，其内容通过引用并入本文。
3.发明背景
4.益生菌是活的微生物，当以足够多的量摄入时，会给宿主带来健康益处(联合国粮食及农业组织和世界卫生组织，“health and nutritional properties of probiotics in food including powdered milk with live bacteria”(2001))。因此，益生菌作为治疗疾病的可行选择正受到关注(hemarajata,p.等人(2013)；therap adv gastroenterol.；6(1):39-51)。当细菌已经处于生物膜(表面和/或自粘附群落)的活化形式而不是浮游态(自由生活)时，它们更容易建立和持续存在。以活化状态提供益生菌可以增强益生菌的积极作用；这可以通过将细菌暴露于生物相容且无毒的微球表面来轻松实现。
5.催产素是源自下丘脑、储存于垂体后叶的九肽，除在哺乳和分娩中的经典作用之外，其作为重要的神经精神激素和代谢激素，最近引起了人们的兴趣。催产素是识别复杂社会认知和行为(如依恋、社会探索和识别)的核心。在健康人中，催产素与社交脑区如杏仁核和前扣带皮层中的受体结合(boccia,m.等人(2013)；neuroscience.；253,155-164)。其是调节社会大脑功能(如调节社会压力、情绪识别和记忆形成)的网络的关键组成部分(meyer-lindenberg,a.等人(2011)；nat.rev.neruosci.；12,524)。在自闭症中，一些研究报告催产素的鼻内施用可以改善情绪识别。此外，催产素通过鼻内施用不会跨越血液屏障导致分娩。然而，鼻内催产素无法达到脉动催产素信号传导的持续生理水平。自闭症患者还可能具有增加的胃肠道病症发病率。
6.此外，在许多患者中，抗生素的使用伴随从轻度(如胃部不适、恶心、腹泻和呕吐)到重度(如腹痛、假单胞菌结肠炎)的胃肠道病症的副作用。这些副作用在接受抗生素治疗的儿童和老年人(65岁以上的患者)人群中更为显著。据报道，这些抗生素方案相关的胃肠道副作用是由于消除了促进肠道正常消化过程所必需的有益菌群。科学研究表明，抗生素的使用会破坏肠道的正常生态，导致有益细菌数量减少，有害细菌异常且有害地增加。
7.因此，需要安全、有效的疗法来治疗或改善自闭症以及与自闭症和/或抗生素使用相关的胃肠道病症。
8.发明概述
9.本公开部分涉及在有此需要的受试者中治疗或改善自闭症谱系障碍的方法，包括向受试者施用治疗有效量的组合物，该组合物包含罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)、生物相容性微球和任选地益生元(例如，包含聚糖酐微粒；具有保藏号atcc 23272的罗伊氏乳杆菌；和益生元的组合物)。使用所提供的方法治疗的预期自闭症谱系障碍可以包括自闭症、阿斯伯格综合征、海勒氏综合征、瑞特综合征和待分类的广泛性发育障碍(pdd-nos)。
10.本文提供了治疗发育障碍和/或自闭症的方法，例如该发育障碍和/或自闭症可能例如与早产儿的早产有关，该方法包括向有此需要的患者(例如，早产儿)施用治疗有效量
的包含罗伊氏乳杆菌和药学上可接受的载剂的组合物。在某些实施方案中，组合物包含聚糖酐微粒、罗伊氏乳杆菌，atcc 23272和益生元。在某些实施方案中，在向受试者施用至少一剂每日剂量的组合物后，受试者具有催产素水平的上调。
11.在实施方案中，本文提供了治疗患者由于抗生素方案的施用而引起的胃肠道炎症的方法，包括向患者施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌、生物相容性微球和/或益生元的组合物。例如，本文提供治疗患有或预期患有与口服抗生素方案的施用有关的胃肠道炎症的患者的方法，包括向患者施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌、生物相容性微球和/或益生元的组合物。此类组合物可以在施用抗生素方案之前、施用抗生素方案期间和/或施用抗生素方案之后施用。在实施方案中还提供了在有此需要的受试者中基本上预防或减少口服抗生素相关的不良反应的方法，包括施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌、生物相容性微球的组合物，其中受试者正在经历口服抗生素治疗。
12.本文还考虑和提供了在有此需要的受试者中治疗抑郁症或焦虑症的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌、生物相容性微球和/或益生元的组合物。例如，本文提供使用本公开的方法治疗以下一种或多种的方法：临床抑郁症、出生后或产后抑郁症、强迫症、创伤后应激障碍、双相障碍、非典型抑郁症、忧郁性抑郁症、精神病性重度抑郁症(pmd)、紧张性抑郁症、季节性情感障碍(sad)、心境恶劣、双重抑郁症、抑郁型人格障碍(dpd)、复发性短暂抑郁症(rbd)、轻度抑郁症、双相障碍或躁狂抑郁症、治疗抵抗性抑郁症、难治性抑郁症、自杀倾向、自杀意念和自杀行为。在某些实施方案中，患者患有出生后或产后抑郁症。
13.在一些实施方案中，本文所考虑的治疗方法可针对有此需要的男性或女性受试者。在一些实施方案中，本文所考虑的治疗方法可针对婴儿、儿童或成人。在某些实施方案中，本文所考虑的治疗方法包括施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌和药学上可接受的载剂的组合物，其中该组合物作为单位剂量施用。在某些其他实施方案中，组合物以多剂量施用。在某些实施方案中，组合物至少每日施用。在某些实施方案中，组合物施用一次。
附图说明
14.图1a-b分别显示盐水处理的雌性大鼠幼崽和雄性大鼠幼崽的胃内容物干质量。图1c显示了第17天(d17)和第21天(d21)雄性幼崽的总胃热量。图1d-e分别显示了盐水处理的雌性幼崽和雄性幼崽的热量密度。
15.图2a-b比较了配制剂a处理的幼崽和盐水处理的幼崽的胃内容物干质量(来自d21雌性幼崽和d21雄性幼崽的数据分别显示在图2a和2b中)。图2c-d比较了配制剂a处理的幼崽和盐水处理的幼崽的胃热量含量(来自d21雌性幼崽和d21雄性幼崽的数据分别显示在图2c和2d中)。图2e-f比较了配制剂a处理的幼崽和盐水处理的幼崽的胃乳糖含量(来自d21雌性幼崽和d21雄性幼崽的数据分别显示在图2e和2f中)。
16.图3a显示盐水处理的雌性大鼠幼崽的胃内容物ph。图3b-c比较了配制剂a处理的幼崽和盐水处理的幼崽的胃内容物ph(来自d20雌性幼崽和d21雄性幼崽的数据分别显示在图3b和3c中)。
17.图4a显示血糖和空肠葡萄糖水平。图4b显示雌性大鼠幼崽中的空肠蛋白浓度。
18.图5a-c比较了施用盐水或配制剂a后(24小时)(图5a)、(48小时)(图5b)和(7天)(图5c)的16日龄雌性大鼠幼崽的血清肽聚糖水平。图5d显示成年雌性大鼠的血清肽聚糖水平。
19.图6a-b比较了在用盐水或配制剂a处理后的第二天(图6a)和第三天(图6b)在雌性大鼠幼崽的回肠中的维生素b12浓度。图6c-d比较了在用盐水或配制剂a处理后的第二天(图6c)和第三天(图6d)在雄性大鼠幼崽的回肠中的维生素b12浓度。
20.图7a-c比较了在施用盐水或配制剂a后2天，盐水或配制剂a处理的雌性幼崽中各种scfa(图7a中所示的盲肠乙酸盐；图7b中所示的盲肠丙酸盐；图7c中所示的盲肠丁酸盐)的浓度。图7d-f比较了在施用盐水或配制剂a后2天，盐水或配制剂a处理的雄性幼崽中各种scfa(图7d中所示的盲肠乙酸盐；图7e中所示的盲肠丙酸盐；图7f中所示的盲肠丁酸盐)的浓度。
21.图8a-b比较了在施用盐水或配制剂a后2天和3天，盐水或配制剂a处理的雌性大鼠幼崽(图8a)和雄性大鼠幼崽(图8b)的远端结肠粪便质量。图8c-d比较了在施用盐水或配制剂a后2天和3天，盐水或配制剂a处理的雌性幼崽(图8c)和雄性幼崽(图8d)的粪便水质量。
22.图9a显示了幼崽撤出后母鼠的血清催产素浓度。图9b比较了在施用盐水或配制剂a后24小时16日龄雄性幼崽的血清催产素水平。图9c比较了在施用盐水或配制剂a后48小时20日龄雄性大鼠幼崽的血清催产素水平。
23.图10是显示用配制剂b、浮游罗伊氏乳杆菌(lr)或盐水处理后雌性大鼠的血浆催产素水平的图。催产素水平显示为治疗后前三天的平均值
±
标准误差均值(天数标注于条上方)。使用anova及随后的tukey多重比较来比较各组。
24.图11a是显示用配制剂b、浮游罗伊氏乳杆菌(lr)或盐水处理后雌性幼崽的血浆催产素水平的图。图11b是显示用配制剂b、浮游罗伊氏乳杆菌(lr)或盐水处理后雄性大鼠幼崽的血浆催产素水平的图。这些值显示为治疗后前三天的平均值
±
标准误差均值(天数标注于条上方)。使用anova及随后的tukey多重比较来比较各组。
25.图12说明了在施用处方级阿奇霉素(阿奇霉素)后，罗伊氏乳杆菌(“l.reuteri”)配制剂的实验研究设计。
26.图13a-d分别显示盐水处理的和配制剂a处理的雌性大鼠的胃内容物干质量、胃水含量、胃热量含量和胃内容物ph。
27.图14a-b分别显示盐水处理的和配制剂a处理的雌性大鼠的粪便钙卫蛋白和粪便乳运铁蛋白水平。图14c-d分别显示盐水处理的和配制剂a处理的雌性大鼠的粪便il-22和粪便il-6水平。数据是在阿奇霉素施用后的第3天和第4天之间、第4天和第5天之间以及第5天和第6天之间收集的。
28.图15a-c分别显示在配制剂a或盐水施用后第三天盐水处理和配制剂a处理的雌性大鼠回肠中的il-6、il-10和il-22水平。
29.图16a显示在配制剂a或盐水施用后第三天盐水处理和配制剂a处理的雌性大鼠近端结肠中胰高血糖素样肽2(glp-2)的水平。图16b比较了盐水或配制剂a施用后第三
天雌性大鼠的血清肽聚糖水平。
30.图17显示了雌性大鼠中，配制剂a或盐水施用后第1、2和3天(或阿奇霉素施用后第4、5和6天)测量的粪便siga水平以评估肠道保护。
31.图18a-c比较了在第3天和第4天之间、第4天和第5天之间以及第5天和第6天之间从盐水或配制剂a处理的雌性大鼠收集的粪便颗粒中各种scfa(图18a中所示的粪便乙酸盐；图18b中所示的粪便丙酸盐；图18c中所示的粪便丁酸盐)的浓度。
32.图19a-d比较了在盐水或配制剂a施用后第三天盐水或配制剂a处理的雌性大鼠中各种scfa(图19a中所示的粪便乙酸盐；图19b中所示的粪便丙酸盐；图19c中所示的粪便丁酸盐；图19d中所示的粪便异戊酸盐)的浓度。
33.发明详述
34.本公开部分涉及使用包含益生菌、生物相容性微球和/或益生元的细菌配制剂来治疗或预防疾病或病症的方法。
35.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本文引用的所有技术和专利出版物均通过整体引用并入本文。
36.除非另有说明，否则本技术的实践将采用本领域技术范围内的组织培养、免疫学、分子生物学、微生物学、细胞生物学和重组dna的常规技术。参见例如，sambrook和russell编辑(2001)molecular cloning:a laboratory manual,3rd edition；ausubel等人编辑(2007)current protocols in molecular biology系列；methods in enzymology(academic press,inc.,n.y.)系列；macpherson等人(1991)pcr 1:a practical approach(irl press at oxford university press)；macpherson等人(1995)pcr 2:a practical approach；harlow and lane eds.(1999)antibodies,a laboratory manual；freshney(2005)culture of animal cells:a manual of basic technique,5th edition；gait编辑(1984)oligonucleotide synthesis；美国专利号4,683,195；hames和higgins编辑(1984)nucleic acid hybridization；anderson(1999)nucleic acid hybridization；hames和higgins编辑(1984)transcription and translation；immobilized cells and enzymes(irl press(1986))；perbal(1984)a practical guide to molecular cloning；miller和calos编辑(1987)gene transfer vectors for mammalian cells(cold spring harbor laboratory)；makrides编辑(2003)gene transfer and expression in mammalian cells；mayer和walker编辑(1987)immunochemical methods in cell and molecular biology(academic press,london)；以及herzenberg等人编辑(1996)weir's handbook of experimental immunology。
37.所有数字标示，例如ph、温度、时间、浓度和分子量，包括范围，都是近似值，可酌情以1.0或0.1的增量变化(+)或(-)，或可选地以+/-15％、或可选地10％、或可选地5％或可选地2％的变化而变化。应当理解，尽管并非总是明确说明，所有数字标示前面都带有术语“约”。还应理解，尽管并非总是明确说明，本文所述的试剂仅是示例性的并且其等效物在本领域中是已知的。
38.如在说明书和权利要求中使用的，单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一种细菌”包括多种细菌，包括其混合物。
39.如在说明书中使用的，术语“配制剂”可以与“组合物”互换使用。
40.出于理解本发明主题的目的以及为了构建所附专利权利要求，以下定义包括在内。本文使用的缩写在化学和生物学领域具有它们的常规含义。
41.定义
42.如本文所用，术语“处理”、“治疗”等在本文中用于表示获得期望的药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防病症或其体征或其症状而言，该效果可以是预防性的和/或就对病症和/或可归因于该病症的不良反应的部分或完全治愈而言可以是治疗性的。
[0043]“预防”意指在易感于病症或反应的体外或体内系统或受试者中预防病症或反应。这样的实例是通过在受试者中实现饱腹感来预防肥胖。
[0044]
如本文所述，“受试者”或“患者”是指处于疾病或病症(例如，自闭症谱系障碍、抑郁症、焦虑症或发育障碍)的风险、患有疾病或病症或被诊断出疾病或病症的任何动物，包括但不限于哺乳动物、灵长类动物和人类。在某些实施方案中，受试者可以是非人哺乳动物，例如猫、大鼠、狗或马。在某些实施方案中，受试者是人受试者。在某些实施方案中，受试者是男性或女性。在一些实施方案中，受试者是婴儿、儿童或成人。在某些实施方案中，受试者可以是产后妇女、怀孕妇女或哺乳期妇女。
[0045]“益生元”意指益生菌的营养补充剂。益生元是食物成分，例如寡糖，其不能由受试者(例如，哺乳动物如人类)消化，并且刺激一种或多种有益细菌的生长或活性和/或抑制一种或多种病原菌的生长或活性。益生元可以选择性地刺激受试者中一种或有限数量的细菌的生长和/或活性。
[0046]“微球”意指在所述特定尺寸范围内的多孔和/或半渗透性的携带生物膜和/或携带化合物(例如，携带药物)的微粒或颗粒材料。如本文所用，微球由直径为50毫米或更小，以及直径约1微米或更多(例如，约1至约100微米或可选地、或可选地约1至约75微米、或可选地约1至约50微米、或可选地约1至约25微米、或可选地约1至约10微米、或可选地约0.5至约200微米、或可选地约0.5至约700微米、或可选地约1至约600微米、或可选地小于700微米、或可选地小于约600微米、或可选地小于500微米、或可选地小于约400微米、或可选地小于约300微米、或可选地小于约200微米、或可选地小于约100微米)的颗粒组成。此类的非限制性实例包括：多孔和/或半渗透性的中空微球，并且在一些方面可以含有药品或药物、微胶囊(其中赋形剂形成包围并含有货物的外皮或外壳，货物如药物、化学还原剂或吸收性或吸附性分子)和微粒，它们被用作在所述尺寸范围内的任何颗粒的通用术语，无论是否为球形，因为这些术语通常在本领域中使用。
[0047]“可生物降解的聚合物”是指生物相容的并且可以通过机体过程在体内降解成易于被机体丢弃并且不应在体内积聚的产物的聚合物。
[0048]“生物相容的”是指递送系统的组件不会引起组织损伤或引起对人体生物系统的损伤。为了赋予生物相容性，优先使用在人体中具有安全使用历史或具有gras(公认安全)状态的聚合物和赋形剂。生物相容性是指组合物中使用的成分和赋形剂最终将被机体“生物吸收”或清除，而对机体没有不良反应。对于生物相容的并被认为无毒的组合物，其必须不对细胞造成毒性。类似地，术语“可生物吸收的”是指由在一段时间内经历体内生物吸收的材料制成的微球，从而避免了材料在患者体内的长期积累。生物相容性纳米颗粒可以在少于2年、少于1年或例如少于6个月的时间内被生物吸收。生物吸收率与颗粒大小、所用材
料和本领域技术人员熟知的其他因素有关。可使用生物可吸收、生物相容性材料的混合物来形成本公开所用配制剂中的微球。
[0049]“药学上可接受的载剂”是指可用于本公开的组合物中的任何稀释剂、赋形剂或载剂。药学上可接受的载剂包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂肪。合适的药物载剂描述于本领域的标准参考文本remington's pharmaceutical sciences,mack publishing company中。它们优选地根据预期的施用形式进行选择，即口服片剂、胶囊、酏剂、糖浆等并且与常规药学实践一致。
[0050]“施用”意指将物质递送至受试者，如动物或人。施用可以在整个治疗过程中以一剂、连续或间断的方式实现。确定最有效的施用方式和施用剂量的方法是本领域技术人员已知的，并且会随着用于疗法的组合物、疗法的目的以及治疗受试者的年龄、健康或性别而变化。可以进行单次或多次施用，剂量水平和模式由治疗医师选择，或者在宠物和动物的情况下，由治疗兽医选择。合适的剂量配制剂和施用药剂的方法是本领域已知的。还可以确定施用途径，并且确定最有效施用途径的方法是本领域技术人员已知的，并且将随用于治疗的组合物、治疗目的、治疗的受试者和靶细胞或组织的健康状况或疾病阶段而变化。施用途径的非限制性实例包括经口施用、阴道施用、肠内施用、鼻腔施用(吸入)、注射、局部应用和通过栓剂。
[0051]
术语“有效量”是指足以实现有益或期望结果或效果的量。在治疗或预防应用的情况下，有效量将取决于所讨论病症的类型和严重程度以及个体受试者的特征，如一般健康状况、年龄、性别、体重和对药物组合物的耐受性。在治疗组合物的情况下，在一些实施方案中，有效量是足以导致针对病原体的保护性反应或可选地支持健康生存状态的量。在一些实施方案中，该量足以实现以下一项或多项：1)清除病原体；2)恢复健康的微生物群；3)调节免疫系统；4)维持新陈代谢和代谢途径；5)减少热量摄入；6)改善社会行为。
[0052]
在体外或离体应用的情况下，在一些实施方案中，有效量将取决于所讨论应用的大小和性质。其还取决于体外靶标的性质和敏感性以及使用的方法。技术人员将能够基于这些和其他考虑确定有效量。取决于实施方案，有效量可以包括组合物的一次或多次施用。
[0053]
药剂和组合物可用于药物制造和通过按照常规程序施用(如药物组合物中的活性成分)来治疗人和其他动物。
[0054]
组合物
[0055]
用于所公开方法的组合物可以包含药学上可接受的赋形剂例如微球、益生菌(例如，罗伊氏乳杆菌)和益生元，其中益生元包含益生菌的营养补充剂。在一方面，组合物进一步包含以下中的一种或多种：生物膜、前生物膜、微球表面上的包衣、治疗药物或药剂、化学还原剂、促进吸附的分子、支持吸收的分子。所公开的微球可以具有实心核、中空核或多孔核，其中在一方面，微球将益生元包封在中空核或多孔核内。微球可以是生物相容的和/或半渗透的。在一方面，微球包含生物膜层或微球外表面上的包衣。在一方面，微球活化细菌，增强持久性和功能。
[0056]
预期的生物相容性微球可以包括选自下组的材料：可生物降解的聚合物和/或不可降解的聚合物，并且此类公开的微球可以具有约0.5微米至约1000微米。额外的优选范围在本文中描述并通过引用并入本文。微球可以是多孔的和/或半渗透的。
[0057]
可生物降解聚合物的非限制性实例选自以下的一种或多种：右旋糖酐；聚糖酐；例如sephadex(与环氧氯丙烷交联的右旋糖酐)，sephadex g-25；聚(乳酸-共-乙醇酸)或plga；聚己内酯或plc；壳聚糖；明胶；乙酰化右旋糖酐；聚(丙交酯)；聚(乙交酯)；聚(丙交酯-共-乙交酯)；聚(乳酸)；聚(乙醇酸)；聚(乳酸-共-乙醇酸)；聚(丙交酯)/聚(乙二醇)共聚物；聚(乙交酯)/聚(乙二醇)共聚物；聚(丙交酯-共-乙交酯)/聚(乙二醇)共聚物；聚(乳酸)/聚(乙二醇)共聚物；聚(乙醇酸)/聚(乙二醇)共聚物；聚(乳酸-共-乙醇酸)/聚(乙二醇)共聚物；聚(己内酯)；聚(己内酯)/聚(乙二醇)共聚物；聚(原酸酯)；聚(磷腈)；聚(羟基丁酸酯)；聚(羟基丁酸酯)；聚(丙交酯-共-己内酯)；聚碳酸酯；聚酯酰胺；聚酐；聚(二恶烷酮)；聚(亚烷基烷基化物)；聚乙二醇/聚原酸酯共聚物；聚氨酯；聚(氨基酸)；聚醚酯；聚缩醛；聚氰基丙烯酸酯；聚(氧乙烯)/聚(氧丙烯)共聚物；共聚物和/或其组合。
[0058]
不可生物降解的聚合物的非限制性实例选自以下的一种或多种：聚(乙烯乙酸乙烯酯)、聚(乙酸乙烯酯)、硅氧烷聚合物、聚氨酯、多糖如纤维素聚合物和纤维素衍生物、酰基取代的乙酸纤维素和其衍生物、聚(乙二醇)和聚(对苯二甲酸丁二醇酯)的共聚物、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烃、聚环氧乙烷、以及它们的共聚物和共混物。
[0059]
用于所公开方法的预期组合物可以包括益生元，例如以下的一种或多种：水溶性碳水化合物、菊粉、低聚糖、果寡糖、低聚果糖、低聚半乳糖、葡萄糖、淀粉、麦芽糖、麦芽糖糊精、聚葡萄糖、直链淀粉、蔗糖、果糖、乳糖、异麦芽酮糖、多元醇、甘油、碳酸盐、硫胺素、胆碱、组氨酸、海藻糖、氮、硝酸钠、硝酸铵、β-葡聚糖、磷、磷酸盐、羟基磷灰石、钾、钾碱、硫、同多糖、杂多糖、纤维素、几丁质、维生素及其组合。
[0060]
在另一方面，益生元选自以下的一种或多种：海藻糖；氮如硝酸钠、硝酸铵，磷如磷酸盐例如羟基磷灰石，钾如钾碱，硫，低聚糖、同多糖、杂多糖、纤维素、几丁质、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、聚葡萄糖、直链淀粉、甘油、碳酸盐及其组合。例如，本文公开的是包括麦芽糖和/或罗伊氏乳杆菌的组合物。
[0061]
用于所公开方法的组合物可以包括益生菌，其被选择以提供以下一种或多种：支持抗细菌免疫、增强或支持受试者的健康状态、增强或支持胃肠屏障、或拮抗疾病相关的细菌感染。在另一方面，选择益生菌以防止病原体定殖和/或限制和/或清除病原体和/或通过下调细胞因子和趋化因子产生来限制过度炎症反应。在某些实施方案中，选择益生菌以诱导在社会连结、能量代谢、伤口愈合中起作用的激素，从而有助于良好的身体、精神和社会健康。益生菌的非限制性实例是以下的一种或多种：嗜酸乳杆菌(l.acidophilus)、卷曲乳杆菌(l.crispatus)、加氏乳杆菌(l.gasseri)、德氏乳杆菌(l.delbrueckii)、唾液乳杆菌(l.salivarius)、干酪乳杆菌(l.casei)、类干酪乳杆菌(l.paracasei)、植物乳杆菌(l.plantarum)、鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus)、罗伊氏乳杆菌(l.reuteri)、短乳杆菌(l.brevis)、布氏乳杆菌(l.buchneri,)、发酵乳杆菌(l.fermentum)、鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus)、青春双歧杆菌(b.adolescentis)、角双歧杆菌(b.angulation)、分叉双歧杆菌(b.bifidum)、短双歧杆菌(b.breve)、链状双歧杆菌(b.catenulatum)、婴儿双歧杆菌
(b.infantis)、乳酸双歧杆菌(b.lactis)、长双歧杆菌(b.longum)、假链状双歧杆菌(b.pseudocatenulatum)、嗜热链球菌(s.thermophiles)、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、生防假单胞菌(p.protegens)、芸苔假单胞菌(p.brassicacearum)、绿脓假单胞菌(p.aeruginosa)；巴西固氮螺菌(azospirillum.brabrasilense)、生脂固氮螺菌(a.lipferum)、高盐固氮螺菌(a.halopraeferens)、伊拉克固氮螺菌(a.irakense)；固氮醋酸杆菌(acetobacter diazotrophicus)；织片草螺菌(herbaspirillum seropedicae)；枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、施氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)、荧光、恶臭假单胞菌(p.putida)、洋葱假单胞菌(p.cepacian)、泡囊假单胞菌(p.vesicularis)、少动假单胞菌(p.paucimobilis)；蜡状芽孢杆菌(bacillus cereus)、苏云金芽孢杆菌(b.thuringiensis)、球形芽孢杆菌(b.sphaericus)；奥奈德希瓦氏菌(shewanella oneidensis)；geobacter bemidjiensis、金属还原地杆菌(g.metallireducens)、硫还原地杆菌(g.sulfurreducens)、g.uraniireducens、g.lovleyi；粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)、脱硫弧菌(desulfovibrio vulgaris)、脱硫脱硫弧菌(d.desulfuricans)、dechloromonas aromatic、耐辐射球菌(deinococcus radiodurans)、methylibium petroleiphilum、泊库岛食烷菌(alcanivorax borkumensis)、富贵古菌(archaeglobus fulgidus)、极嗜盐菌种(haloferax sp.)、极端嗜盐菌种(halobacterium sp.)及其组合。在某些实施方案中，所提供的用于所公开的治疗方法的组合物包括罗伊氏乳杆菌(23272
tm
)。
[0062]
所公开的组合物可以包括另外的试剂，例如选择性针对可能与益生菌竞争的病原体的试剂。此类互补剂在包含微球的组合物中可以在微球的核心中或表面上。此类的非限制性实例包括化学还原剂；促进吸附的分子和/或表面(在微球核心中或表面上)；促进吸收的分子和/或表面(在微球核心中或表面上)。在一方面，化学还原剂和促进吸收的分子和/或表面包被在微球的表面上。
[0063]
例如，所公开的组合物可以包括活化细菌菌落，其可以在微粒的外表面上形成生物膜层，例如包括罗伊氏乳杆菌的组合物。此类层的深度可以是约0.5微米至约1毫米，并且在以下范围之间：例如约1微米至约500微米、约1微米至约250微米、约1微米至约200微米、约1微米至约100微米、约1微米至约50微米、约1微米至约40微米、约1微米至约30微米、约2微米至约100微米、约2微米至约50微米、约2微米至约40微米、约2微米至约30微米、约3微米至约100微米、约3微米至约50微米、约3微米至约40微米、约3微米至约30微米、约5微米至约100微米、约5微米至约50微米、约5微米至约40微米、以及约5微米至约30微米。在其他实施方案中，考虑的组合物包括支架或基质，用于在施用于待处理的受试者或环境时支持细菌(例如，罗伊氏乳杆菌)的活化。
[0064]
如本文所考虑的，用于所公开方法的组合物可以包含一种或多种微球组合物与载剂组合，载剂例如药学上可接受的载剂或生物相容性支架。药学上可接受的载剂的非限制性实例包括可用于本公开的组合物中的稀释剂、赋形剂或载剂。药学上可接受的载剂包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、
聚乙二醇和羊毛脂肪。
[0065]
所公开的组合物可以配制成生物膜生成的、活化的益生菌的剂型，例如，或提供有效量的微球组合物用于最终用途，例如约1
×
105至1
×
10
11
cfu/ml，或可选地约1
×
105至约1
×
10
11
cfu/ml，或约1
×
105至约1
×
109cfu/ml，或约1
×
106至约1
×
10
11
cfu/ml，或约1
×
106至约1
×
109cfu/ml，或约1
×
107至约1
×
10
11
cfu/ml，或约1
×
107至约1
×
10
10
cfu/ml，或约1
×
107至约1
×
109cfu/ml，或约1
×
108cfu/ml。
[0066]
在某些实施方案中，细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)可以在约6、12、18、24、36、48和72小时施用，或可以单剂量施用用于治疗。在某些实施方案中，细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)可以经口、阴道、局部、通过吸入、静脉内、肌内或通过栓剂施用。它们可以以任何合适的配制剂施用。
[0067]
可以配制或加工组合物以便于施用、储存和应用，例如冷冻、冻干、悬浮(悬浮液配制剂)或成粉；并加工成栓剂、片剂、溶液剂、混悬剂、丸剂、胶囊剂、缓释配制剂。
[0068]
基于预期目标确定有效量的治疗组合物。术语“单位剂量”或“剂量”是指适用于受试者的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的组合物，该组合物经计算可产生与其施用(即适当的途径和方案)相关的上文讨论的期望反应。根据治疗次数和单位剂量，施用量取决于期望的结果和/或保护。组合物的精确量还取决于从业者的判断并且对于每个个体是特定的。影响剂量的因素包括受试者的身体和临床状态、施用途径、预期治疗目标(缓解症状与治愈)以及特定组合物的效力、稳定性和毒性。在配制时，溶液将以与剂量配制相容的方式和治疗或预防有效的量施用。配制剂很容易以多种剂型施用，如以上述的注射溶液类型施用。
[0069]
在某些实施方案中，本公开提供了通过施用治疗有效量的细菌配制剂(例如；罗伊氏乳杆菌配制剂)的治疗方法。在某些实施方案中，细菌配制剂包含罗伊氏乳杆菌、生物相容性微球和/或益生元。
[0070]
方法
[0071]
本文提供了用于在有此需要的受试者中治疗或预防通过细菌配制剂适当治疗的疾病或病症的方法。该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的细菌配制剂，其具有为特定疗法选择的组分。在一个实施方案中，本公开提供了通过施用治疗有效量的细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)来诱导催产素的方法。在某些实施方案中，通过施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌、生物相容性微球和/或益生元的组合物在受试者中诱导催产素。在某些实施方案中，施用治疗有效量的细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)活化催产素受体。
[0072]
在某些实施方案中，本公开在实施方案中提供了通过向受试者施用细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)的药学上可接受的组合物在受试者中治疗、改善和/或预防自闭症谱系障碍的方法，自闭症谱系障碍包括但不限于自闭症、阿斯伯格综合征、海勒氏综合征、瑞特综合征、和待分类的广泛性发育障碍(pdd-nos)。
[0073]
本文还提供了用于在有此需要的受试者中治疗或预防通过细菌配制剂适当治疗的由于抗生素方案的施用所致的疾病或病症(例如，胃肠道炎症)的方法。该方法包括向受试者施用有效量的本文公开的细菌配制剂，其具有为特定疗法选择的组分。疾病的非限制性实例包括胃肠道病症如胃肠道炎症、或由抗生素的使用引起并导致病原菌取代健康细菌
的任何慢性和/或复发性疾病、涉及肠道运动障碍的疾病或病症、或拮抗疾病相关的细菌感染。
[0074]
在实施方案中，本公开提供了通过施用治疗有效量的细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)来治疗患者由于抗生素方案(例如，阿奇霉素)的施用而引起的胃肠道炎症的方法。在某些实施方案中，通过施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌、生物相容性微球和/或益生元的组合物来减少或减轻受试者的胃肠道炎症。
[0075]
在某些实施方案中，本公开提供了治疗患有或预期患有与口服抗生素方案的施用相关的胃肠道炎症的患者的方法，该方法通过向有此需要的患者施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌和药学上可接受的载剂的组合物来进行。在某些实施方案中，通过施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌、生物相容性微球和/或益生元的组合物，胃肠道炎症显著减轻。此类口服抗生素方案可以包括以下一般类别的口服抗生素施用，例如磺胺类药物；叶酸类似物；β-内酰胺类，包括青霉素和头孢菌素；四环素类；大环内酯类；林可酰胺类；链阳霉素类；喹诺酮类药物，包括氟喹诺酮类药物；多肽如多粘菌素；氨基环醇类；糖肽；恶唑烷酮类；等等。“抗生素”是指抗生素、抗菌剂、抗微生物剂、抗感染剂等。
[0076]
示例性抗生素包括阿莫西林、阿莫西林和克拉维酸钾的组合、氨苄青霉素、氨苄青霉素和舒巴坦的组合、阿托伐醌、阿奇霉素、羧苄青霉素、头孢克洛、头孢地尼、头孢尼西、头孢布烯、头孢替坦、头孢泊肟、头孢曲松、头孢呋辛、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢霉素、金霉素、环丙沙星、克林霉素、克拉霉素、环丝氨酸、达福普汀、双氯西林、强力霉素、红霉素、左氧氟沙星、利奈唑胺、莫西沙星、莫匹罗星、土霉素、青霉素、利福平、奎奴普汀、达福普汀和奎奴普汀的组合、壮观霉素、磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺美曲、磺胺二甲恶唑、磺胺甲氧吡嗪、磺胺、四环素、甲氧苄啶、甲氧苄啶和磺胺甲恶唑的组合、万古霉素、包含上述至少一种的组合等。在某些实施方案中，抗生素方案包括阿奇霉素。
[0077]
在某些实施方案中，本公开提供治疗患者的胃肠道病症的方法，包括施用包含罗伊氏乳杆菌、生物相容性微球和/或益生元的组合物。在某些实施方案中，胃肠道病症是便秘、腹痛、胀气和腹泻中的一种或多种。
[0078]
在某些实施方案中，本公开提供了治疗患者的胃肠道病症的方法，其中该患者处于自闭症谱系中或患有自闭症。
[0079]
本文提供了使用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌、生物相容性微球和/或益生元的组合物在有此需要的受试者中基本上预防或减少口服抗生素相关的不良反应的方法。
[0080]
在某些实施方案中，本公开中描述的细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)可以用于预防和/或改善和/或治疗不良胃肠道(gi)副作用(例如，来自具有gi副作用的另一种治疗，例如，抗生素施用)，包括但不限于伪膜性结肠炎(由于艰难梭菌(clostridium difficile)过度生长引起的大肠炎症)、恶心、痉挛、腹泻和呕吐。这些是与抗生素有关的一些副作用。然而，在本公开的上下文中使用的配制剂对这些病症的影响可以全部或部分通过对体重的影响来介导，或者可以独立于体重介导。在某些实施方案中，公开的细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)可用作预防上述病症和/或疾病的药剂。在一些实施方案中，施用引起以下一项或多项：减少或消除一种或多种病症症状，预防一种或多种病症症状增加的严重性，和/或减少、预防或消除进一步的疾病或病症。
[0081]
在某些实施方案中，本公开中描述的细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)的
药学上可接受的组合物的施用导致受试者的胃肠道炎症减少。在某些实施方案中，施用导致患者的胃肠道炎症至少5％的减少(例如，至少7％、10％、20％、30％、50％、75％或更多的减少)。
[0082]
在某些实施方案中，细菌组合物(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)在施用抗生素方案之前、施用抗生素方案期间和/或施用抗生素方案之后施用。
[0083]
在实施方案中，本公开提供了通过向受试者施用细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)的药学上可接受的组合物来治疗受试者的抑郁症或焦虑症的方法。在某些实施方案中，抑郁症或焦虑症包括临床抑郁症、出生后或产后抑郁症、产后强迫症、创伤后应激障碍例如产后创伤后应激障碍、产后双相障碍、非典型抑郁症、忧郁性抑郁症、精神病性重度抑郁症(pmd)、紧张性抑郁症、季节性情感障碍(sad)、心境恶劣、双重抑郁症、抑郁型人格障碍(dpd)、复发性短暂抑郁症(rbd)、轻度抑郁症、双相障碍或躁狂抑郁症、治疗抵抗性抑郁症、难治性抑郁症、自杀倾向、自杀意念和自杀行为。在一些实施方案中，受试者患有焦虑症。在一些实施方案中，受试者患有抑郁症。在一些实施方案中，受试者患有出生后或产后抑郁症。
[0084]
在实施方案中，本公开提供了通过向早产儿施用细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)的药学上可接受的组合物来治疗早产儿中与早产相关的发育障碍的方法。在某些实施方案中，用于治疗的细菌配制剂包含治疗有效量的组合物，该组合物包含罗伊氏乳杆菌和药学上可接受的载剂。
[0085]
在某些实施方案中，本公开提供了治疗与早产相关的发育障碍的方法，与早产相关的发育障碍包括但不限于支气管肺发育不良(bpd)；智力缺陷、脑瘫、白质疾病；和早产儿视网膜病变。
[0086]
在某些实施方案中，本公开提供了通过向早产儿施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌和药学上可接受的载剂的组合物在有需要的早产儿中诱导催产素的方法。在某些实施方案中，通过施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌、生物相容性微球和/或益生元的组合物在早产儿中诱导催产素。
[0087]
在某些实施方案中，向受试者施用至少一剂每日剂量的细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)导致催产素水平的上调。在某些实施方案中，催产素在施用后在受试者中上调至少5％(例如，至少5％、10％、20％、30％、50％、75％上调或更多)。
[0088]
在某些实施方案中，本公开提供了在有需要的受试者中增强泌乳的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌、生物相容性微球和/或益生元的组合物。在某些实施方案中，在施用本公开的细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)后泌乳的增强是由于已知与泌乳和分泌有关的催产素水平增加(参见pang,w.w.等人；(2007)；j mammary gland biol neoplasia 12,211-221)。
[0089]
在某些实施方案中，本公开的细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)的施用增加了催产素水平(例如，约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约120％、约140％、约160％、约180％、约200％、约220％、约240％、约260％、约280％、或约300％)。在某些实施方案中，单剂量的细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)提高催产素水平达数小时(例如，约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、或约96小时)。在某些实施方案中，多剂量的细菌配制剂(例如，
罗伊氏乳杆菌配制剂)提高催产素水平达数小时(例如，约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、或约96小时)。在某些实施方案中，本公开的细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)的施用增加催乳素水平(例如，约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约100％、约120％、约140％、约160％、约180％、约200％、约220％、约240％、约260％、约280％、或约300％)。
[0090]
在一些实施方案中，向受试者施用单剂量的细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)。在其他实施方案中，多剂量在两个或更多个时间点施用，间隔数小时、数天、数周(例如，在约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时之后)。在一些实施方案中，细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)长时间段(例如，长期地)施用，例如，持续几个月或几年(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多月或年)的时段。在某些实施方案中，细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)可以在延长的时段的持续时间内定期(例如，每日、每周等)服用。
[0091]
在一些实施方案中，施用该方法的组合物以提供约1
×
107至约1
×
10
10
cfu/ml(例如，约1.5
×
107、约2
×
107、约2.5
×
107、约3
×
107、约3.5
×
107、约4
×
107、约4.5
×
107、约5
×
107、约5.5
×
107、约6
×
107、约6.5
×
107、约7
×
107、约7.5
×
107、约8
×
107、约8.5
×
107、约9
×
107、约9.5
×
107、约1
×
108、约1.5
×
108、约2
×
108、约2.5
×
108、约3
×
108、约3.5
×
108、约4
×
108、约4.5
×
108、约5
×
108、约5.5
×
108、约6
×
108、约6.5
×
108、约7
×
108、约7.5
×
108、约8
×
108、约8.5
×
108、约9
×
108、约9.5
×
108,1
×
109、约1.5
×
109、约2
×
109、约2.5
×
109、约3
×
109、约3.5
×
109、约4
×
109、约4.5
×
109、约5
×
109、约5.5
×
109、约6
×
109、约6.5
×
109、约7
×
109、约7.5
×
109、约8
×
109、约8.5
×
109、9
×
109、或约9.5
×
109)的活化的生成生物膜的益生菌。
[0092]
在某些实施方案中，在本公开的上下文中采用的公开的细菌配制剂(例如，罗伊氏乳杆菌配制剂)可以作为与至少一种用于治疗本公开中讨论的疾病或病症的其他药剂的联合疗法的一部分来施用。
[0093]
现在对本公开进行一般性描述，通过参考以下实施例将更容易理解，包括这些实施例仅仅是为了说明本公开的某些方面和实施方案，并非旨在以任何方式限制本公开。
实施例
[0094]
以下实施例仅是说明性的，并非旨在以任何方式限制本公开的范围或内容。
[0095]
实施例1-罗伊氏乳杆菌配制剂
[0096]
该配制剂以粉末形式提供，用于重构为液体，经口施用。每ml配制剂a含有1.9x109个罗伊氏乳杆菌菌落形成单位和74mm麦芽糖中的18.5mg sephadex。剂量为10ml配制剂，每日一次，每日剂量为1.9x10
10
个罗伊氏乳杆菌菌落形成单位和74mm麦芽糖中的185mg sephadex。
[0097]
实施例2-罗伊氏乳杆菌配制剂的研究
[0098]
对罗伊氏乳杆菌配制剂进行了研究。罗伊氏乳杆菌配制剂的临床前安全性研究设计包括负载24μmole益生元麦芽糖和6x10
9 cfu罗伊氏乳杆菌(atcc 23272)的60mg聚糖酐微粒(与表氯醇(epicholorhydine)交联的右旋糖酐)。[配制剂a]。简而言之，将自然分娩的新生大鼠分为以下处理组：(1)处方级盐水(盐水)和(2)配制剂a。每个处理组由24只雄性
幼崽和24只雌性幼崽组成。在第15天，每只幼崽接受单次肠内剂量的：盐水或配制剂a。在整个研究过程中，幼崽与它们的母亲(母鼠)待在一起。幼崽母乳喂养以获取营养。随着幼崽接近第21天，只有配制剂a处理的幼崽开始食用为母鼠准备的食物。在施用后24小时、48小时和7天，对幼崽(每个处理组的n＝8(8只雄性和8只雌性))实施安乐死。对食道、胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、近端结肠、远端结肠、直肠、肺、肾和肝进行组织学研究。盐水和配制剂a处理的幼崽的整个gi道的组织病理学表现正常。光学显微镜成像表明，经口管饲后48小时，粪便中的微球被完整清除。临床前毒理学研究表明，配制剂a配方是安全的。对大鼠幼崽的宏观评价表明，用配制剂a处理的幼崽比用盐水处理的幼崽更早地进食，而第17天和第21天的热量相等。在第17天，即使幼崽消耗的质量更少，热量密度更高，但它们的热量等于第21天，此时食物摄入量(总质量)更高，热量密度更低。这表明建立了调节能量平衡的下丘脑设定点。这些照片展示了用固体食物补充母乳喂养的幼崽。
[0099]
实施例3-自发断奶：向新生大鼠施用罗伊氏乳杆菌配制剂的效果
[0100]
新生大鼠的断奶研究设计如下。简而言之，将自然分娩的幼崽分为以下处理组：(1)处方级盐水(盐水)和(2)配制剂a。每个处理组由20只雄性幼崽和20只雌性幼崽组成。在第18天，每只幼崽接受单次肠内剂量的：盐水或配制剂a。在施用后48小时和72小时，对幼崽(每个处理组的n＝10(10只雄性和10只雌性))实施安乐死。在第20天和第21天收获躯干血、胃、空肠、回肠、盲肠、近端结肠和远端结肠。此外，还分析了每只幼崽的身体组成、胸腺质量和脾脏质量。
[0101]
对热量摄入的影响
[0102]
图1a-b分别显示了盐水处理的雌性幼崽和雄性幼崽的胃内容物干质量。图1c显示了第17天(d17)和第21天(d21)雄性幼崽的总胃热量。雌性幼崽的总胃热量相同。从母乳到食物的转变过程中，总热量保持不变。图1a-c显示d17和d21的热量相等。在第17天，即使幼崽消耗的质量更少，热量密度更高，但它们的热量等于第21天，此时食物摄入量(总质量)更高，热量密度更低。这表明建立了调节能量平衡的下丘脑设定点。图1d-e分别显示了盐水处理的雌性幼崽和雄性幼崽的热量密度。图1a-e显示，当盐水处理的幼崽接近断奶时，它们的胃内容物质量增加而热量密度降低。图2a-b比较了配制剂a处理的幼崽和盐水处理的幼崽的胃内容物干质量(来自d21雌性幼崽和d21雄性幼崽的数据分别显示在图2a和2b中)。图2c-d比较了配制剂a处理的幼崽和盐水处理的幼崽的胃热量含量(来自d21雌性幼崽和d21雄性幼崽的数据分别显示在图6c和6d中)。图2e-f比较了配制剂a处理的幼崽和盐水处理的幼崽的胃乳糖含量(来自d21雌性幼崽和d21雄性幼崽的数据分别显示在图2e和2f中)。图2a-f显示，尽管建立了热量摄入设定点，配制剂a减少了食物摄入。图2a-f还表明，配制剂a处理可能会加速雄性更早从母乳转向食物。
[0103]
对胃酸的影响
[0104]
进行胃内ph测量以测试罗伊氏乳杆菌配制剂对胃酸的影响。简而言之，将动物安乐死，并取出胃内容物进行测定。第16-19天22只幼崽的数据获自实施例2中描述的安全性研究。图3a中描述的数据来自盐水处理的大鼠幼崽或未处理的大鼠幼崽。图3a显示盐水处理的雌性幼崽的胃内容物ph。图3b-c比较了配制剂a处理的幼崽和盐水处理的幼崽的胃内容物ph(来自d20雌性幼崽和d21雄性幼崽的数据分别显示在图3b和3c中)。图3a-c显示18日龄后胃酸的产生增加。图3a-c还显示配制剂a的施用不会通过增加胃酸产生来促进断奶。
[0105]
对空肠蛋白质浓度的影响
[0106]
空肠专门用于吸收营养。简而言之，从安乐死的幼崽中分离空肠。将空肠的内容物收集到小瓶中，并在-20℃下储存直至进行测定。图4a显示血糖和空肠葡萄糖水平。图4b显示雌性大鼠幼崽中的空肠蛋白质浓度。图4a还显示血糖依赖于空肠葡萄糖浓度。图4a显示从第16天开始，大鼠幼崽的肠葡萄糖转运蛋白(sglt1、glut2)和果糖转运蛋白(glut5)的功能活跃。图4b显示空肠蛋白质浓度依赖于胃酸的产生，因此在18日龄后降低。
[0107]
对血清肽聚糖浓度的影响
[0108]
在配制剂a处理的雌性幼崽中测量血清肽聚糖水平。简而言之，通过断头对幼崽实施安乐死，并将躯干血液收集到试管中，并在置于冰中时使其凝固。通过离心分离血清并储存在-20℃，直到通过酶联免疫吸附测定(elisa)对肽聚糖进行测定。图5a-c比较了在施用盐水或配制剂a后，16日龄雌性幼崽(24小时)(图5a)、17日龄幼崽(48小时)(图5b)和21日龄幼崽(7天)(图5c)的血清肽聚糖水平。图5d显示成年雌性大鼠的血清肽聚糖水平。
[0109]
对维生素b12产生的影响
[0110]
在雌性幼崽和雄性幼崽用配制剂a或盐水处理后的第二天和第三天测量回肠维生素b12的含量。简而言之，从安乐死的幼崽中分离回肠。将回肠的内容物收集到小瓶中并在-20℃下储存直至进行测定。通过elisa测定维生素b12。图6a-b比较了在用盐水或配制剂a处理后的第二天(图6a)和第三天(图6b)在雌性大鼠幼崽的回肠中的维生素b12浓度。图6c-d比较了在用盐水或配制剂a处理后的第二天(图6c)和第三天(图6d)在雄性大鼠幼崽回肠中的维生素b12浓度。图6a和6c显示配制剂a的施用增加了大鼠幼崽(雄性和雌性)回肠中的维生素b12浓度。维生素b12由罗伊氏乳杆菌在回肠中合成。图6b显示配制剂a处理的雌性大鼠幼崽回肠中的维生素b12浓度降低。图6d显示在盐水或配制剂a处理的雄性幼崽中维生素b12浓度没有统计学差异。这些图显示维生素b12在第3天从回肠清除。维生素b12还用作罗伊氏菌素的标志物，罗伊氏菌素是由罗伊氏乳杆菌产生的强效抗微生物化合物。
[0111]
对短链脂肪酸(scfa)的影响
[0112]
通过气相色谱-质谱(gc/ms)进行scfa(乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐)的测量。简而言之，从安乐死的幼崽中分离盲肠。将盲肠的内容物收集到小瓶中，并在-20℃下储存直至进行测定。样品在0.5％磷酸(200mg/ml)中进行超声处理，离心以去除未提取的固体物质，并通过0.6μm过滤器过滤以去除任何大颗粒。将这些样品(1μl)注射入具有stabilwax-da色谱柱的gc/ms中。使用6种短链脂肪酸的标准溶液来校准样品。图7a-c比较了在施用盐水或配制剂a后2天，盐水或配制剂a处理的雌性幼崽中各种scfa(图7a中所示的盲肠乙酸盐；图7b中所示的盲肠丙酸盐；图7c中所示的盲肠丁酸盐)的浓度。图7d-f比较了在施用盐水或配制剂a后2天，盐水或配制剂a处理的雄性幼崽中各种scfa(图7d中所示的盲肠乙酸盐；图7e中所示的盲肠丙酸盐；图7f中所示的盲肠丁酸盐)的浓度。图7a-f显示配制剂a的施用不改变大鼠幼崽(雄性和雌性)盲肠中scfa的产生，因此断奶效应不是通过scfa的产生。
[0113]
对粪便排出的影响
[0114]
从安乐死的幼崽中分离远端结肠。将远端结肠中的粪便颗粒收集到小瓶中，并在-20℃下储存直至进行测定。为了测量干质量和水质量，将粪便颗粒冻干以除去水。湿质量和干质量之间的差异是水质量。图8a-b比较了在施用盐水或配制剂a后2天和3天，盐水或配制剂a处理的雌性幼崽(图8a)和雄性幼崽(图8b)的远端结肠粪便质量。图8b显示配制剂a处
理的雄性幼崽的粪便排出增加。从图8b获得的数据还显示配制剂a可用于治疗不规律。图8c-d比较了在施用盐水或配制剂a后2天和3天，盐水或配制剂a处理的雌性幼崽(图8c)和雄性幼崽(图8d)的粪便水质量。图8c-d显示配制剂a的施用不会在雄性大鼠幼崽或雌性大鼠幼崽中引起腹泻或便秘。
[0115]
实施例3中提供的数据表明，配制剂a在下丘脑水平促进断奶和饱腹感，而不改变肠功能。
[0116]
实施例4
–
向成年大鼠施用罗伊氏乳杆菌配制剂的效果
[0117]
图9a显示了幼崽撤出后母鼠的血清催产素浓度。该图显示，在配制剂a处理的成年雌性母鼠中，在它们的哺乳幼崽撤出后，血清催产素水平保持升高约11天。数据显示，母乳喂养期间观察到的升高的催产素水平在母鼠的幼崽撤出后约11天后降低。这些结果表明，配制剂a可以调节雌性大鼠的产后抑郁症。图9b比较了施用盐水或配制剂a后24小时16日龄雄性幼崽的血清催产素水平。图9c比较了施用盐水或配制剂a后48小时20日龄雄性幼崽的血清催产素水平。图9b-c显示在施用24小时后配制剂a处理的雄性幼崽的血清催产素水平增加，并且表明催产素水平升高可能有助于调节幼年时期的食物摄入以及社交和探索行为。一剂配制剂a之后的数据显示在图9b-c中。多剂配制剂a可能有助于维持升高的催产素水平。
[0118]
实施例5-用聚糖酐微粒(dm)活化罗伊氏乳杆菌
[0119]
包含麦芽糖和dm的罗伊氏乳杆菌配制剂显示了增强的生物活性。体外活化模拟当微生物与粘蛋白聚糖结合时胃肠道中的活化。dm是含有右旋糖酐的生物相容性多孔半渗透性固体颗粒，右旋糖酐类似于粘蛋白的o-连接聚糖。本公开的罗伊氏乳杆菌菌株表达胞外葡糖基转移酶(gtf)酶。体外活化过程是对罗伊氏乳杆菌与回肠中粘蛋白聚糖接触并结合时诱导的生物学变化的模拟。因此，活化提供了优于未活化的罗伊氏乳杆菌的优势，以更好地启动定植。
[0120]
实施例6-施用罗伊氏乳杆菌配制剂对血浆催产素水平的影响
[0121]
罗伊氏乳杆菌(atcc23272菌株)在含有冻干罗伊氏乳杆菌的小瓶中以1.7x10
11 cfu/g提供。将1ml无菌盐水添加到冻干细菌中，并在室温下再水化5分钟，然后添加到dm-麦芽糖浆中。通过称重高压灭菌的干燥sephadex g25 superfine微球(dm)，并将其添加到过滤灭菌的1m麦芽糖溶液(25％w/v混悬液)中制备dm-麦芽糖浆。为了启动活化步骤，在使用前将罗伊氏乳杆菌和dm-麦芽糖浆的混合物在室温下一起孵育60分钟。罗伊氏乳杆菌配制剂每次施用的最终剂量为500μl2x10
9 cfu罗伊氏乳杆菌、20mg dm和28.8mg麦芽糖(在1ml盐水中)[“配制剂b”]。类似地但不添加dm-麦芽糖浆制备浮游罗伊氏乳杆菌。
[0122]
为了研究罗伊氏乳杆菌配制剂对血浆催产素水平的影响，成年sprague-dawley雌性大鼠在单剂量处方级阿奇霉素(45mg/kg，通过经口管饲法施用)为罗伊氏乳杆菌创造生态位2天后，给予单次口服剂量的浮游罗伊氏乳杆菌(lr)或盐水(在抗生素和处理之间使用2天的洗脱期)。在给药后第1、2和3天，将血液收集在含有抑肽酶的试管中(500激肽释放酶灭活剂单位(kiu)/ml血液；由于催产素在血液中的短半衰期而使用)，并通过酶免疫测定法(eia；assay designs)确定血浆催产素水平。图10是显示用配制剂b、浮游罗伊氏乳杆菌(lr)或盐水处理后雌性大鼠的血浆催产素水平的图。催产素水平显示为处理后前三天的平均值
±
标准误差均值(天数标注于条上方)。使用anova及随后的tukey多重比较来比较各
组。如图10所示，配制剂b处理的动物中的第1天血浆催产素水平显著高于用浮游罗伊氏乳杆菌或盐水处理的动物。组间的催产素水平在第3天趋于平稳。这项研究表明，配制剂b在第1天有效刺激循环催产素，并在第2天保持。此外，浮游罗伊氏乳杆菌在第2天表现出刺激催产素水平的能力的趋势，但水平与盐水处理组没有显著差异。
[0123]
为了研究罗伊氏乳杆菌配制剂对幼崽血浆催产素水平的影响，向幼崽给药盐水、罗伊氏乳杆菌或300μl配制剂b(如上所述制备)。未成熟大鼠幼崽的基线循环催产素水平低，基线水平或对配制剂b的反应没有性别差异。所有动物在15日龄时通过经口管饲法处理一次。在处理后的第1、2和3天收集血液，并使用上述方法测量血浆催产素。图11a是显示用配制剂b、浮游罗伊氏乳杆菌(lr)或盐水处理后雌性幼崽的血浆催产素水平的图。图11b是显示用配制剂b、浮游罗伊氏乳杆菌(lr)或盐水处理后雄性幼崽的血浆催产素水平的图。这些值显示为处理后前三天的平均值
±
标准误差均值(天数标注于条上方)。使用anova及随后的tukey多重比较来比较各组。该研究证实，配制剂b能够增加循环的催产素水平。
[0124]
实施例7-罗伊氏乳杆菌配制剂的评估
[0125]
该实施例描述了各种制备方法对罗伊氏乳杆菌配制剂的影响，包括测量罗伊氏乳杆菌在配制剂中产生的乳酸、组胺、维生素b-12和甘油以及其对糖的利用。这些实施例描述了对以下两种罗伊氏乳杆菌配制剂的评估：1)配制剂b(2x109cfu罗伊氏乳杆菌、20mg dm和28.8mg麦芽糖(在1ml盐水中))；和2)配制剂c(含有与配制剂b相同量的罗伊氏乳杆菌(2x109cfu)，但10倍的dm和麦芽糖(200mg dm和288mg麦芽糖))。配制剂制备过程如实施例6中所述进行，不同之处在于在评估培养基中的各种分析物之前，将细菌与dm-麦芽糖浆在不同时间点(1小时、6小时、24小时和96小时)进行孵育。这些研究的结果总结在表1中。
[0126]
表1.两种罗伊氏乳杆菌配制剂(配制剂b和配制剂c)的评估总结
[0127][0128]
实施例8
–
鉴定罗伊氏乳杆菌配制剂以增加血浆催产素水平
[0129]
使用实施例6中描述的大鼠幼崽模型以确定最佳的罗伊氏乳杆菌配制剂和给药策略以增加血浆催产素水平。用各种浓度和方案的罗伊氏乳杆菌配制剂进行处理以确定最小有效剂量，与用盐水处理的动物相比，其确定了在最初48小时内血浆催产素的显著刺激。然后用活化的罗伊氏乳杆菌配制剂评估最佳的罗伊氏乳杆菌配制剂和剂量，然后采用裂解罗伊氏乳杆菌的方案来确定是否实现了与含有完整罗伊氏乳杆菌的配制剂所见的相似功效。在成年非妊娠大鼠中测试提供最小有效剂量的配制剂，以确保在成熟雌性大鼠中的功效。
[0130]
15日龄的雄性未成熟大鼠幼崽和雌性未成熟大鼠幼崽被随机分配以接受以下处理。每组5只雄性大鼠幼崽和5只雌性大鼠幼崽随机分配：1)盐水；2)浮游罗伊氏乳杆菌；或3)罗伊氏乳杆菌配制剂。如实施例6中所述制备罗伊氏乳杆菌配制剂和浮游罗伊氏乳杆菌，并且包括2x109cfu罗伊氏乳杆菌/1ml盐水。连同2x109cfu罗伊氏乳杆菌/1ml盐水一起，罗伊氏乳杆菌配制剂还包括10mg dm和14.4mg麦芽糖、20mg dm和28.8mg麦芽糖、100mg dm和144mg麦芽糖或200mg dm和288mg麦芽糖。如实施例6中所述，罗伊氏乳杆菌配制剂的活化进
行1小时，并且通过经口管饲法给予一次300μl的剂量。该研究使用递减方法，首先评估含有2x109cfu/ml罗伊氏乳杆菌、200mg dm和288mg麦芽糖的配制剂。给药后，使用具有较低水平的dm和麦芽糖的配制剂，减少配制剂直到观察不到统计学上刺激血浆催产素水平的功效。在24小时和48小时通过剪尾法采集血液并测定催产素(参见grewen,k.m.等人(2010)；psychophysiology 47,625-632)。使用单向anova和tukey检验进行多重比较来比较各组。然后用活化的罗伊氏乳杆菌配制剂随后采用裂解罗伊氏乳杆菌的方案评估最小有效的罗伊氏乳杆菌配制剂。裂解方案使用stet缓冲液，其含有溶菌酶以裂解细胞膜和细胞壁；蔗糖以维持渗透压；triton x有助于裂解细胞壁，乙二胺四乙酸(edta)作为螯合剂，以及tris hcl用于缓冲。将完整的罗伊氏乳杆菌配制剂与裂解的罗伊氏乳杆菌配制剂进行比较，使用如先前研究中所述的雄性和雌性未成熟大鼠幼崽(每组5只雄性大鼠幼崽和5只雌性大鼠幼崽)以及接受盐水或含有stet缓冲液的盐水的动物作为对照。然后在成熟的雌性sprague dawley大鼠中评估提供催产素水平统计学显著增加的最小有效罗伊氏乳杆菌配制剂(裂解或完整)，以确认在大鼠幼崽中观察到的活性转化到成年。每组八只雌性成年大鼠通过经口管饲法(500μl)用罗伊氏乳杆菌配制剂、浮游罗伊氏乳杆菌或盐水进行处理，并如实施例6中所述在给药后24小时、48小时和72小时评估催产素水平。最小有效剂量是在2个时间点中的1个(24小时或48小时)时催产素的显著刺激。使用含有最高水平的dm和麦芽糖(最大有效剂量)的配制剂，催产素的刺激可以持续72小时。使用单向anova和tukey检验用于多重比较将催产素水平与盐水处理组进行比较。
[0131]
实施例9
–
施用阿奇霉素后施用罗伊氏乳杆菌配制剂的效果
[0132]
图12说明了评估施用罗伊氏乳杆菌配制剂的效果的实验研究设计，其包括在处方级阿奇霉素(阿奇霉素)施用后第3天上午，负载有400μmole益生元麦芽糖的100mg聚糖酐微粒(与表氯醇交联的右旋糖酐)和1
×
109cfu罗伊氏乳杆菌(atcc 23272)[配制剂a]。简而言之，在实验研究的第0天，对teklad 2920x饲喂的雌性sprague-dawley大鼠(重量170g)施用阿奇霉素(45mg/kg，经口施用)。阿奇霉素施用后第3天上午，对6只雌性大鼠施用单次肠内剂量的处方级盐水(盐水)，并对7只雌性大鼠施用单次肠内剂量的处方级配制剂a(配制剂a)。在施用阿奇霉素后的第4、5和6天，但在施用盐水或配制剂a后的第1、2和3天，从雌性大鼠收集粪便颗粒。在第4、5和6天测量血糖。在第5天和第6天对雌性大鼠实施安乐死。在第6天收集组织(胃、空肠、回肠、盲肠、近端结肠和远端结肠)。
[0133]
胃内容物的评估
[0134]
图13a-d分别显示在生理盐水处理和配制剂a处理的雌性大鼠中施用阿奇霉素或生理盐水后第3天上午的胃内容物干质量、胃水含量、胃热量含量和胃内容物的ph。图13b显示在施用阿奇霉素后向雌性大鼠施用配制剂a增加胃水含量。
[0135]
通过分析粪便样品评估肠道炎症
[0136]
肠道炎症可以通过分析粪便钙卫蛋白和乳运铁蛋白水平来评估。图14a-b分别显示盐水处理和配制剂a处理的雌性大鼠的粪便钙卫蛋白和粪便乳运铁蛋白水平。图14a显示施用后第二天，与盐水处理的雌性大鼠相比，配制剂a处理的雌性大鼠的粪便钙卫蛋白水平降低。图14b显示施用后第三天，与盐水处理的雌性大鼠相比，配制剂a处理的雌性大鼠的粪便乳运铁蛋白水平降低。图14c-d分别显示盐水处理的和配制剂a处理的雌性大鼠的粪便il-22和粪便il-6水平。图14c显示施用后第二天，与盐水处理的雌性大鼠相比，配制剂a处
理的雌性大鼠的粪便il-22水平降低。图14d显示粪便il-6水平未因配制剂a的施用而改变。图14a-d中显示的数据在阿奇霉素施用后的第3天和第4天之间、第4天和第5天之间以及第5天和第6天之间收集。
[0137]
回肠中促炎细胞因子和抗炎细胞因子的评估
[0138]
可以使用炎症的粪便标志物评估回肠中的炎症。il-10和il-22是抗炎细胞因子。简而言之，从安乐死的雌性大鼠中分离回肠。将回肠的内容物收集到小瓶中并在-20℃下储存直至进行测定。图15a-c分别显示在施用配制剂a或盐水后第三天盐水处理的雌性大鼠和配制剂a处理的雌性大鼠的回肠中的il-6、il-10和il-22水平。图15a显示配制剂a的施用导致配制剂a处理的雌性大鼠的回肠中il-6(促炎细胞因子)水平降低。图15b显示配制剂a的施用导致配制剂a处理的雌性大鼠的回肠中il-10(抗炎细胞因子)水平降低。图15c显示配制剂a的施用导致配制剂a处理的雌性大鼠的回肠中il-22(抗炎细胞因子)水平增加。
[0139]
肠道修复评估
[0140]
胰高血糖素样肽2(glp-2)促进紧密连接并刺激小肠和大肠生长，以及用于葡萄糖和脂肪酸摄取的转运蛋白。为了评估肠道修复，在近端结肠测量glp-2水平。在施用配制剂a或盐水后的第三天，从安乐死的雌性大鼠获取近端结肠。图16a显示盐水处理的和配制剂a处理的雌性大鼠近端结肠中的glp-2水平。图16a显示配制剂a的施用引起近端结肠中glp-2水平的增加。
[0141]
肠漏评估
[0142]
在配制剂a处理的和盐水处理的雌性大鼠中测量血清肽聚糖水平。简而言之，成年雌性大鼠在施用盐水或配制剂a 3天后通过断头实施安乐死，并将躯干血液收集到试管中并在置于冰中时使其凝固。通过离心分离血清并储存在-20℃，直到通过elisa测定肽聚糖。图16b比较了雌性大鼠在施用盐水或配制剂a后第三天的血清肽聚糖水平。图16b显示配制剂a的施用不改变由于阿奇霉素的施用而升高的血清肽聚糖水平。
[0143]
肠道保护评估
[0144]
粪便分泌免疫球蛋白a(siga)提供针对潜在的致病微生物的保护，因为它能够抵抗酶的降解并在恶劣环境如胃肠道中存活。具有低iga水平的患者发生黏膜表面感染、食物过敏、乳糜泻样肠病和自身免疫性病症的风险增加。在配制剂a处理和盐水处理的雌性大鼠中测量粪便siga水平以评估肠道保护。图17显示了在雌性大鼠中，在配制剂a或盐水施用后第1、2和3天(或阿奇霉素施用后第4、5和6天)测量的粪便siga水平以评估肠道保护。图17显示在施用配制剂a后第三天雌性大鼠的粪便siga水平增加。施用配制剂a后成年雌性大鼠肠腔中粪便siga水平的增加提供了肠道保护的证据。
[0145]
scfa产生评估
[0146]
通过气相色谱-质谱(gc/ms)进行scfa(乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐)的测量。简而言之，在第3天和第4天、第4天和第5天、第5天和第6天之间从配制剂a处理的和盐水处理的雌性大鼠中收集粪便颗粒。将粪便颗粒储存在-20℃直至进行测定。样品在0.5％磷酸(200mg/ml)中进行超声处理，离心以去除未提取的固体物质，并通过0.6μm过滤器过滤以去除任何大颗粒。将这些样品(1μl)注射入具有stabilwax-da色谱柱的gc/ms中。使用6种短链脂肪酸的标准溶液来校准样品。图18a-c比较了用盐水或配制剂a处理的雌性大鼠中各种scfa(图18a中所示的粪便乙酸盐；图18b中所示的粪便丙酸盐；图18c中所示的粪便丁酸盐)的浓度。
图18a和18c分别显示在施用配制剂a后第2天和第3天之间排泄的粪便颗粒中乙酸盐和丁酸盐水平增加。如图18b所示，配制剂a处理的和盐水处理的成年雌性大鼠之间的丙酸盐水平没有统计学差异。
[0147]
除了测量来自收集的粪便颗粒的scfa外，还在施用配制剂a或盐水后的第三天，在来自安乐死的雌性大鼠的远端结肠的粪便中测量各种scfa水平。简而言之，将远端结肠中的粪便颗粒收集到小瓶中，并储存在-20℃直至进行测定。图19a-d比较了在施用生理盐水或配制剂a后的第三天，盐水或配制剂a处理的雌性大鼠的各种scfa(图19a中所示的粪便乙酸盐；图19b中所示的粪便丙酸盐；图19c中所示的粪便丁酸盐；图19d中所示的粪便异戊酸盐)浓度。如图19a和19d所示，在施用配制剂a后第三天，雌性大鼠的乙酸盐和异戊酸盐水平增加。图19b显示在施用配制剂a后第三天雌性大鼠中丙酸盐水平降低。如图19c所示，配制剂a处理的和盐水处理的成年雌性大鼠之间的丁酸盐水平没有统计学差异。
[0148]
实施例3中提供的数据表明，单剂量的配制剂a在施用2-3天后显著降低了肠道炎症，并且有效地减轻了阿奇霉素的副作用。
[0149]
实施例10-评估罗伊氏乳杆菌配制剂的研究
[0150]
本实施例描述了一项随机、双盲、安慰剂对照、单剂量研究，以评估单剂量罗伊氏乳杆菌配制剂(罗伊氏乳杆菌与和麦芽糖)在健康成年志愿者中的安全性和耐受性。此类研究监测健康成人胃肠(gi)道中罗伊氏乳杆菌和的消除情况，包括评估健康成人单次经口施用罗伊氏乳杆菌配制剂后微生物群功能、免疫调节和消化的生物标志物。
[0151]
罗伊氏乳杆菌kandler(atcc 23272)与和麦芽糖以2x10
10
菌落形成单位(cfu)，与200mg和1m麦芽糖，最终体积为10ml[“配制剂b”]的剂量经口施用。罗伊氏乳杆菌kandler作为冻干粉提供，用于在无菌盐水中重构。重构后，将罗伊氏乳杆菌kandler与和麦芽糖的浆体混合。
[0152]
30名符合条件的受试者以1:1的比例随机分配以接受配制剂b或安慰剂(盐水)的处理。在施用配制剂b或安慰剂之前的14天内对受试者进行筛选。在进行任何研究特定程序之前，所有受试者都必须提供书面知情同意书。受试者的研究资格在筛选时通过评估纳入和排除标准来确定。要求受试者提供同意书以允许生物样品的生物库供将来分析。向符合条件的受试者提供粪便采样试剂盒，以在接受配制剂b或安慰剂之前的48小时内收集预处理粪便样品(收集时间由受试者排便的频率确定)。
[0153]
受试者在隔夜禁食8小时后在第1天返回研究地点。在确认合格标准后，受试者根据他们被分配到的处理组接受单次口服剂量的配制剂b或安慰剂，然后是100ml水。禁食维持至配制剂b或安慰剂施用后1小时。受试者根据事件时间表在第1天经历研究特定程序。在配制剂b或安慰剂施用前和施用后1小时测量生命体征(脉搏率、收缩压和舒张压、呼吸频率和口腔温度)。在第一次给药前的48小时窗口内收集基线粪便样品，以确定罗伊氏乳杆菌和微球的存在和探索性生物标志物分析。在完成所有第1天评估后，受试者离开。指示受试者按照以下时间表在家中收集4份粪便样品：向受试者提供采样试剂盒以在家中收集粪便样品。试剂盒包括样品容器的标记，标记上填写获得样品的时间和日期。指示受试
者使用预先标记的运输容器返回所有粪便样品；研究者和受试者也可以协商返回粪便样品的替代策略。
[0154]
在第8天和第15天进行随访。受试者参加第30天的研究结束访问。
[0155]
符合条件的受试者根据他们被分配到的处理组接受单剂量的配制剂b或安慰剂。第1天在禁食条件下在研究地点施用配制剂b或安慰剂。施用后，向受试者提供100ml水饮用。配制剂b和安慰剂均在不透明塑料注射器中提供给受试者，因此内容物不可见，以使研究保持盲态。在施用配制剂b或安慰剂之前，要求受试者禁食至少8小时。受试者在参与研究期间必须避免使用其他益生菌和任何抗生素。安全性终点包括处理中出现的ae(teae)、严重ae(sae)、aesi的发生率和严重程度以及导致研究中止的ae；实验室结果(血液学[全血细胞计数、差异和红细胞沉降率]、生化和尿液分析)、生命体征结果和身体检查结果；粪便中存在罗伊氏乳杆菌kandler、微球和白细胞的发生率；布里斯托大便图表分数；罗伊氏乳杆菌鉴定呈阳性的症状性菌血症发生率。该研究的其他终点包括：微生物群功能的生物标志物：短链脂肪酸(乙酸盐、丁酸盐、丙酸盐)、乳酸和ph；免疫调节的生物标志物：促炎和抗炎细胞因子(干扰素-γ、白细胞介素[il]-2、il-4、il-5、il-6、il-10、il-22、趋化因子配体1和肿瘤坏死因子-α)，以及钙卫蛋白、乳铁蛋白和分泌性免疫球蛋白a；消化的生物标志物：葡萄糖、甘油三酯、总胆汁酸、蛋白质、乳糖的粪便含量。
[0156]
人口统计学和基线特征(包括年龄、性别、人种、种族、重量、身高和体重指数)使用描述性统计数据进行总结，并对粪便样品中的罗伊氏乳杆菌、微球和白细胞水平进行定性评估，使用描述性统计汇总结果。
[0157]
整个研究持续时间包括1个月的主动注册和1个月的随访。研究期间的顺序和最长持续时间如下：筛选：14天；处理：1天；随访：30天。每个受试者的最大研究持续时间约为6周。每个受试者的最长处理持续时间为1天。
[0158]
实施例11
–
施用罗伊氏乳杆菌配制剂对自闭症的影响
[0159]
该实施例详述了评估在自闭症治疗中施用罗伊氏乳杆菌配制剂的效果的研究设计。与出生时有发展nec风险伴胃肠道(gi)系统不成熟且发育不全的早产儿相比，目标人群的gi系统发育更良好(参见yatsunenko,t.等人(2012)；nature.；486,222-227)。然而，gi症状，包括便秘、腹痛、胀气和腹泻，通常与自闭症相关，患病率范围在23％到70％之间(参见chaidez,v.等人(2014)；journal of autism and developmental disorders.；44(5),1117-1127；holingue,calliope等人(2018)；autism research:official journal of the international society for autism research.；11(1),24-36)。在使用罗伊氏乳杆菌配制剂的临床前研究中，既没有观察到组织学检查后的gi病理学，也没有观察到粪便稠度和粪便排出的变化。此外，已经观察到粪便钙卫蛋白(gi炎症的临床生物标志物)水平降低，这表明罗伊氏乳杆菌配制剂可以减少临床或亚临床肠道炎症，并可以改善通常与自闭症相关的gi症状。
[0160]
在初步筛选后，受试者被随机分配到2组中的一组，每组8名受试者。a组接受罗伊氏乳杆菌配制剂28天，而b组接受安慰剂(盐水)。在初始给药后，存在14天的洗脱期，在此期间受试者既不接受罗伊氏乳杆菌配制剂也不接受安慰剂。在洗脱期之后，a组接受安慰剂(盐水)28天，而b组将接受罗伊氏乳杆菌配制剂。主要结果是评估在28天时段内每日施用的
罗伊氏乳杆菌配制剂的安全性和耐受性，通过不良事件和实验室异常的频率和严重程度进行评估。次要结果包括评估罗伊氏乳杆菌配制剂对循环催产素水平、宿主和微生物衍生代谢物的全身和粪便水平、肠道炎症的血液和粪便生物标志物、以及在自闭症背景下经过验证的行为工具的影响。总研究持续时间约为70天。
[0161]
如果如使用dsm-5标准的金标准临床访谈和自闭症诊断观察时间表2的施用所确认的，受试者具有自闭症诊断确认，则该受试者有资格参与研究。罗伊氏乳杆菌kandler以2
×
10
10
个菌落形成单位，与185mg和74mm麦芽糖，最终体积为10ml的剂量经口施用。受试者每日接受单剂量，持续28天。罗伊氏乳杆菌kandler作为冻干粉提供，用于在盐水(已提供)中重构。重构后，将罗伊氏乳杆菌kandler与和麦芽糖的浆体混合。参考产品/安慰剂是盐水。受试者接受单次口服剂量的10ml匹配盐水，持续28天。
[0162]
符合条件的受试者根据分配到的处理组每日接受一剂罗伊氏乳杆菌或安慰剂，持续28天。向受试者提供28剂，在家中制备并与优选的饮料或软食物(例如苹果酱、酸奶、布丁)混合。第一剂ip在诊所施用。受试者在参与研究期间必须避免使用益生菌。
[0163]
临床医生和护理人员报告结果测量分析由罗伊氏乳杆菌kandler与安慰剂之间的两个配对t检验组成。每个受试者的测量值是连续测量的变化，包括cgi-s、cgi-i、abc、cfql-2、wj3空间关系和听觉注意子测试、kitap、rbans、眼动追踪和心理物理测量。对于每个受试者，推导出连续结果测量评分变化与安慰剂变化之间的差异。对这些受试者内差异进行单样品(配对)t检验。如果两侧p值小于0.05，并且使用错误发现率(fdr)方法对多重性进行了校正，则认为结果具有统计显著性。此外，分析了两处理交叉设计的线性混合模型。该模型的响应是在时段终点感兴趣的连续结果度量。固定效应协变量是处理、时段、性别和残留(carry-over)。
[0164]
研究时段的顺序和最长持续时间如下：筛选：14天；处理时段1：28天；洗脱：14天；处理时段2：28天；随访：30天；每个受试者的研究持续时间最长约为17周。在asd参与者的筛查或基线访问时进行眼动追踪测量。ados-2＝自闭症诊断观察时间表模块3或4；wasi-ii＝韦克斯勒简明智力量表-第二版，_scq＝社会沟通问卷；cgi-s＝临床总体印象严重程度量表，cgi-i＝临床总体印象改善量表；vineland-3＝文兰适应行为量表第3版；pk＝药代动力学；eeg＝脑电图方案；wj3＝woodcock johnson空间关系和听觉注意子测试；rbans＝重复性成套神经心理状态；kitap＝儿童注意力表现的计算机化测试；abc＝异常行为清单；cfql-2＝儿童和家庭生活质量第二版。
[0165]
等效物
[0166]
尽管已经讨论了本公开的特定实施方案，但上述说明书是说明性的而非限制性的。在阅读本说明书后，本公开的许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。本公开的全部范围应通过参考权利要求及其等效物的全部范围和说明书以及此类变化来确定。
[0167]
除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的所有表示成分的量、反应条件等的数字都应理解为在所有情况下都被术语“约”修饰。因此，除非有相反的说明，否则本说明书和所附权利要求中阐述的数值参数是近似值，其可以根据本公开寻求获得的期望特性而变化。
[0168]
通过引用并入
[0169]
本文引用的所有专利、公开的专利申请、网站和其他参考文献的全部内容在此通过引用明确并入本文。
技术特征：1.治疗或改善有此需要的受试者的自闭症谱系障碍的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)、生物相容性微球和任选地益生元的组合物。2.权利要求1的方法，其中所述自闭症谱系障碍选自自闭症、阿斯伯格综合征、海勒氏综合征、瑞特综合征、和待分类的广泛性发育障碍(pdd-nos)。3.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述组合物包含聚糖酐微粒；罗伊氏乳杆菌，atcc 23272；和益生元。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中在向所述受试者施用至少一剂每日剂量的所述组合物后，所述受试者具有催产素水平的上调。5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述受试者是儿科患者。6.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述受试者还患有胃肠道病症。7.治疗患者的胃肠道病症的方法，其包括施用包含聚糖酐微粒；罗伊氏乳杆菌，atcc 23272；和益生元的组合物。8.权利要求7的方法，其中所述患者处于自闭症谱系中或患有自闭症。9.权利要求7或8的方法，其中所述胃肠道病症与抗生素施用有关。10.治疗患有胃肠道病症的自闭症患者的方法，其包括施用组合物，所述组合物包含：聚糖酐微粒；罗伊氏乳杆菌，atcc 23272；和益生元。11.权利要求7-10中任一项的方法，其中所述胃肠道病症为便秘、腹痛、胀气和腹泻中的一种或多种。12.治疗早产儿中与早产有关的发育障碍的方法，所述方法包括向所述早产儿施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌和药学上可接受的载剂的组合物。13.在有此需要的早产儿中诱导催产素的方法，所述方法包括向所述早产儿施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌和药学上可接受的载剂的组合物。14.权利要求12或13的方法，其中所述组合物进一步包含生物相容性微球和/或益生元。15.权利要求12-14中任一项的方法，其中所述组合物包含聚糖酐微粒、罗伊氏乳杆菌，atcc 23272和益生元。16.权利要求12-14中任一项的方法，其中在向所述早产儿施用至少一剂每日剂量的所述组合物时，所述早产儿具有催产素水平的上调。17.治疗患者中由于抗生素方案的施用而引起的胃肠道炎症的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌、生物相容性微球和/或益生元的组合物。18.治疗患有或预期患有与口服抗生素方案的施用有关的胃肠道炎症的患者的方法，其包括向所述患者施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌、生物相容性微球和/或益生元的组合物。19.权利要求17或18的方法，其中在施用所述抗生素方案之前、施用所述抗生素方案期间和/或施用所述抗生素方案之后施用所述组合物。20.在有此需要的受试者中基本上预防或减少口服抗生素相关不良反应的方法，其包括施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌、生物相容性微球的组合物，其中所述受试者正在经受所述口服抗生素的治疗。
21.在有此需要的受试者中治疗抑郁症或焦虑症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含罗伊氏乳杆菌、生物相容性微球和/或益生元的组合物。22.权利要求21的方法，其中抑郁症选自临床抑郁症、出生后或产后抑郁症、强迫症、创伤后应激障碍、双相障碍、非典型抑郁症、忧郁性抑郁症、精神病性重度抑郁症(pmd)、紧张性抑郁症、季节性情感障碍(sad)、心境恶劣、双重抑郁症、抑郁型人格障碍(dpd)、复发性短暂抑郁症(rbd)、轻度抑郁症、双相障碍或躁狂抑郁症、治疗抵抗性抑郁症、难治性抑郁症、自杀倾向、自杀意念和自杀行为。23.权利要求21的方法，其中所述患者患有出生后或产后抑郁症。24.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述组合物施用一次。25.权利要求1-23中任一项的方法，其中所述组合物每日施用。26.权利要求1-25的方法，其中所述益生元包括水溶性碳水化合物，其中所述水溶性碳水化合物包含以下的一种或多种：菊粉、果寡糖、低聚果糖、低聚半乳糖、葡萄糖、淀粉、麦芽糖、麦芽糖糊精、聚葡萄糖、直链淀粉、蔗糖、果糖、乳糖、异麦芽酮糖、多元醇、甘油、碳酸盐、硫胺素、胆碱、组氨酸、海藻糖、氮、硝酸钠、硝酸铵、磷、磷酸盐、羟基磷灰石、钾、钾碱、硫、同多糖、杂多糖、纤维素、几丁质、维生素或其组合。27.权利要求1-26中任一项的方法，其中所述益生元是麦芽糖。
技术总结本公开部分涉及使用包含益生菌、生物相容性微球和/或益生元的细菌配制剂治疗或预防疾病的方法。病的方法。病的方法。
技术研发人员：M.海曼
受保护的技术使用者：赛欧托生物科技股份有限公司
技术研发日：2021.01.13
技术公布日：2022/11/1
