一种扩增猫冠状病毒s基因全序列的引物、方法和应用
技术领域
1.本发明涉及猫冠状病毒s基因全序列扩增技术领域，更具体地说是涉及一种扩增猫冠状病毒s基因全序列的引物、方法和应用。
背景技术：2.猫冠状病毒是(feline coronavirus，fcov)是引起猫冠状病毒病的主要病原，具有两种生物型，分别为猫肠道冠状病毒(fecv)和猫传染性腹膜炎病毒(fipv)。fecv主要感染肠道细胞，通常无症状或引起轻微的肠道症状，如腹泻、呕吐等，偶尔引起严重的肠炎，致死率较低。而fipv的感染，则可导致猫腹膜急性、烈性的炎症反应，致死率极高。研究发现，fcov在猫群种普遍流行，且传播能力强，感染率高，在多猫家庭或流浪猫收容所等卫生条件相对较差的环境中较为多发，严重威胁猫的健康。
3.fcov属于套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属成员，是有囊膜的单链正股rna病毒，全长29kb左右，具有典型的冠状病毒基因组结构，包括11个开放阅读框，分别编码4个结构蛋白(s、e、m、n)、2个非结构蛋白(1a和1b)和5个辅助蛋白(3a、3b、3c、7a和7b)。其中，s蛋白，即纤突蛋白，是fcov重要的结构蛋白。研究证实，s蛋白在病毒的吸附和入侵宿主细胞过程中发挥着核心作用。s蛋白的n端与宿主细胞表面的受体结合，可使病毒与细胞膜靠近，并参与膜融合。s蛋白的c端参与病毒粒子的装配及蛋白的胞内运输，并在一定程度上决定病毒的致病性。同时，s蛋白含有的抗原表位是诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原。此外，研究发现，s基因的突变可能与fecv向fipv的转变有关，尤其是在s1/s2裂解位点发生的突变。因此了解、掌握fcov编码s蛋白的s基因的变异情况，有助于了解fcov的基因重组、抗原变异、病毒感染细胞机制和基因变化规律，对fcov致病机制的研究和疫苗等防控措施开发均有重要的指导意义。
4.fcov的s基因长度变化较大，一般为4401bp左右。且研究证实，s基因多为冠状病毒的高变区。因此，当前fcov s基因变异情况的研究主要通过选择s基因中部分序列片段进行，长度一般为200-500bp左右，无法准确反应整个s基因的变异情况；或通过将将fcov的s基因分成多个相互重叠的基因片段进行引物设计和扩增，拼接后获得s基因全长序列，该方法不仅工作量大，而且还存在高变区域无法扩增获得目的片段的风险。
5.因此，如何通过一次扩增法即可实现对猫冠状病毒s基因全序列的扩增是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现要素：6.有鉴于此，本发明提供了一种扩增猫冠状病毒s基因全序列的引物序列。通过对ncbi上已知全基因组fcov毒株的s基因上、下游比对，筛选获得其上下游保守区域，设计1对引物，实现猫冠状病毒s基因全序列的扩增，操作便捷，避免了在高变区域无法扩增获得目的片段的风险。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种扩增猫冠状病毒s基因全序列的引物，其特征在于，其核苷酸序列如下:
9.上游引物fcov-s1：tacttaggaccatactrtgac；seq id no.1；
10.其中，r为a或g；
11.下游因为fcov-s2：acttctcataaacggtgc；seq id no.2。
12.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护seq id no.1～seq id no.2所示的引物制备扩增和检测猫冠状病毒s基因全序列试剂盒中的应用。
13.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种扩增和检测猫冠状病毒s基因全序列的试剂盒，包括seq id no.1～seq id no.4所示的引物，其中，上游引物为1μl，浓度为10pmol/μl；下游引物为1μl，浓度是10pmol/μl。
14.作为上述技术方案优选的技术方案，所述试剂盒还包括：2
×
green taq mix 12.5μl、cdna 1μl、ddh2o9.5μl。
15.作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种扩增猫冠状病毒s基因全序列的方法，其特征在于，提取病毒rna，反转录成cdna，以seq id no.1～seq id no.2所示的引物对cdna序列进行扩增，最后对扩增片段进行纯化。
16.作为上述技术方案优选的技术方案，扩增程序为：
[0017][0018]
作为上述技术方案优选的技术方案，所述纯化为采用fastpure gel dna extractionmini kit试剂盒进行纯化。
[0019]
根据本公开的一个方面，一种猫冠状病毒s基因全序列扩增方法的应用，用于对猫冠状病毒s基因全序列序列的检测与分析。
[0020]
根据本公开的至少一个实施方式，将所述扩增方法获得的产物，测序后，进行同源性比对，对所扩增的猫冠状病毒进行分类。
[0021]
根据本公开的至少一个实施方式，所述同源性比对为将测序获得的序列与ncbi上已知的猫冠状病毒s基因进行比对。
[0022]
采用上述技术方案之后，本公开具有以下有益效果：
[0023]
1、本公开仅仅使用1对引物扩增包含s基因全序列的片段，较之前使用2对、3对引物进行扩增和拼接，更加便捷、节约成本。
[0024]
2、本公开使用的引物设计位置位于fcov s基因上、下游保守区域，能够有效的提高扩增的成功率，降低因位于高变区引物造成的扩增失败。
[0025]
3、本公开能够更加快捷的获得s基因的全序列，有利于对所扩增的fcov进行分类，掌握病毒进化规律，同时指导临床疫苗的使用及开发。
[0026]
4、本公开上游引物距离s基因起始位点316bp，下游引物距离s基因终止位点801bp，可以有效避免因测序起始阶段不准确所导致的序列信息不准确，在测序时，确保在序列信息准确的基础上减少构建t载体的步骤。
附图说明
[0027]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0028]
图1附图为本发明猫冠状病毒s基因全序列的pcr扩增结果，其中，m：dl5000 plus dna marker；1-10：泳道1为实施例2中bq08，2-3月龄中华田园猫粪便样品结果，泳道2为实施例3中bd22，3月龄蓝白猫粪便样品结果，泳道3为实施例4中bs78，3月龄蓝猫粪便样品结果，泳道4-10：其他来源的fcov阳性粪便样品；11：阳性对照(以之前用该引物已经扩增获得目的条带样品核酸作为模板)；12：阴性对照(用ddh2o作为模板)；
[0029]
图2附图为本发明提供的系统进化树图；
[0030]
图3附图为本发明实施例6中不同退火温度的fcov的s基因全序列扩增pcr电泳图；m：marker 15000；1：45℃；2：48.7℃；3：50.6℃；4：52.5℃；5：54.2℃；6：55.8℃；7：57.4℃；8:60℃。
具体实施方式
[0031]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0032]
实施例1
[0033]
从ncbi上下载已知的fcov毒株的全基因组序列，并分别收集各毒株s基因上、下游各1000bp的序列信息。利用megalign软件进行序列比对，确定s基因上、下游序列中保守片段。参照ncbi中猫冠状病毒hlj/hrb/2016/10毒株(genebank登录号为ky566209.1)基因组序列，s基因位全长从20468nt-24877nt，通过引物设计软件primer premier 5.0设计用于s结构蛋白核苷酸序列扩增引物。上游引物fcov-s1从20196nt-20216nt(21nt)，下游引物fcov-s2从25678nt-25695nt(18nt)，上游引物距离s基因起始位点316bp，下游引物距离s基因终止位点引物801bp，序列覆盖整个s基因，且位于猫冠状病毒保守区域，并采用ncbi中primer blast功能进行引物评估，发现部分fcov毒株中上游引物tacttaggaccatactgtgac中第17位“g”为“a”，故形成上游序列tacttaggaccatactatgac。
[0034]
上游引物fcov-s1：tacttaggaccatactrtgac；seq id no.1；
[0035]
其中，r为a或g；
[0036]
下游因为fcov-s2：acttctcataaacggtgc；seq id no.2。
[0037]
实施例2
[0038]
一种猫冠状病毒s基因全序列扩增方法，包括以下步骤:
[0039]
步骤一、提取病毒rna：取适量猫冠状病毒阳性的粪便病料，加入9倍体积的无菌pbs，匀浆后于-20℃保存；反复冻融3次，采用trizol试剂法提取病毒rna；
[0040]
所述trizol试剂法的具体方法为：所述trizol试剂法的具体方法为：a、取1ml组织悬液，于4℃，经8000rpm离心10min，获得第一上清液；b、取300μl第一上清液于无rna酶的灭
菌1.5ml ep管中，加入1000μl trizol，充分混匀，25℃静置5min；c、加入200μl三氯甲烷，充分混匀，25℃静置5min，于4℃，经12000rpm离心10min，获得第二上清液；d、取500μl第二上清液至新的1.5mlep管中，加入500μl异丙醇，充分混匀，-20℃静置20min，于4℃，经12000rpm离心10min；e、小心弃掉上清，加入1000ul 75％的乙醇(depc水配置)，震荡混匀后，4℃12000r离心10min；f、小心倒掉上清液，倒置于吸水纸上，25℃自然风干；g、加入30μl无rnase ddh2o，溶解沉淀，即为病毒rna，将样品保存于-80℃。
[0041]
步骤二、cdna合成：采用ⅲ1st strand cdna synthesis kit(gdna digesterplus)试剂盒对提取的病毒rna进行反转录，获得cdna；
[0042]
步骤三、pcr扩增：
[0043]
使用上游引物fcov-s1和下游引物fcov-s2对cdna进行pcr扩增，得到含有s基因全序列片段的pcr扩增产物。
[0044]
上游引物fcov-s1：tacttaggaccatactrtgac；seq id no.1；
[0045]
其中，r为a或g；
[0046]
下游因为fcov-s2：acttctcataaacggtgc；seq id no.2。
[0047]
所述pcr扩增反应体系为：
[0048][0049]
上游引物fcov-s1的浓度为10pmol/μl，下游引物fcov-s2的浓度为10pmol/μl；
[0050]
所述pcr扩增反应程序为95℃预变性5min；95℃变性30s，52.5℃退火30s，72℃延伸5min，设置35个循环；72℃终延伸10min；
[0051]
步骤四、基因片段检测及测序：将所述pcr扩增产物经核酸凝胶电泳进行检测，电泳结果如图1中的泳道1所示，该样品中扩增出大小约为5500bp的单一条带。
[0052]
将目的片段采用fastpure gel dnaextraction mini kit试剂盒进行纯化，再送至深圳华大基因股份有限公司进行测序，测序结果如seq id no.3所示。命名该病料样品中含有的fcov毒株为bq08。
[0053]
实施例3
[0054]
一种猫冠状病毒s基因全序列扩增方法，步骤一采用的病料为猫冠状病毒阳性的粪便，上游引物为tacttaggaccatactgtgac；seq id no:3其余步骤同实施例2。在基因片段检测及测序步骤中，电泳结果如图1中的泳道2所示，测序结果如seq id no.4所示。命名该病料样品中含有的fcov的毒株为bd22。
[0055]
实施例4
[0056]
一种猫冠状病毒s基因全序列扩增方法，步骤一采用的病料为猫冠状病毒阳性的粪便，tacttaggaccatactatgac；其余步骤同实施例2。在基因片段检测及测序步骤中，电泳结果如图1中的泳道5所示，测序结果如seq id no.5所示。命名该病料样品中含有的fcov毒
株为bs78。
[0057]
实施例5
[0058]
分离得bq08、bd22、bs78三个毒株的s基因序列，与ncbi上已知的猫冠状病毒s基因进行比对，同源性比对毒株的名称、genebank登录号、来源及年份如表1所示。
[0059]
进化树结果如图2所示bq08、bd22、bs78毒株的s基因序列均与fcov经典毒株black进化距离较远，bs78与中国xxn毒株在一个分支上，二者亲缘性较高。bq08、bd22毒株均自成一个分支且相邻，二者进化关系较近，与中国qs毒株sd毒株亲缘关系较近。分离出来的三个福建毒株均与中毒株的进化关系较近，且均有进化有所变异。
[0060]
表1同源性比对毒株信息一览表
[0061][0062]
实施例6
[0063]
在上述反应体系与反应程序中，控制退火温度(δ
tm
)为45、50.6和55.8℃，结果如图3，除出现预期大小的目的条带外，还出现杂带；当退火温度为48.7、52.5、54.2和57.4、60.0℃时，均只出现预期大小的目的条带，且52.5℃时条带最亮，确立52.5℃为本方法的最适退火温度。
[0064]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0065]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
技术特征：1.一种扩增猫冠状病毒s基因全序列的引物，其特征在于，其核苷酸序列如下:上游引物fcov-s1：tacttaggaccatactrtgac；seq id no.1；其中，r为a或g；下游因为fcov-s2：acttctcataaacggtgc；seq id no.2。2.权利要求1所述的引物制备扩增和检测猫冠状病毒s基因全序列试剂盒中的应用。3.一种扩增和检测猫冠状病毒s基因全序列的试剂盒，其特征在于，包括seq id no.1～seq id no.2所示的引物，其中，上游引物为1μl，浓度为10pmol/μl；下游引物为1μl，浓度是10pmol/μl。4.根据权利要求3所述的一种扩增和检测猫冠状病毒s基因序列的试剂盒，其特征在于，还包括：2
×
green taq mix 12.5μl、cdna 1μl、ddh2o9.5μl。5.一种扩增猫冠状病毒s基因的方法，其特征在于，提取病毒rna，反转录成cdna，以seq id no.1～seq id no.2所示的引物对cdna序列进行扩增，最后对扩增片段进行纯化。6.根据权利要求5所述的一种扩增猫冠状病毒s基因的方法，其特征在于，扩增程序为：7.根据权利要求5所述的一种扩增猫冠状病毒s基因的方法，其特征在于，所述纯化为采用fastpure gel dna extraction mini kit试剂盒进行纯化。8.一种猫冠状病毒s基因全序列扩增方法的应用，其特征在于，用于对猫冠状病毒s基因全序列的检测与分析。9.如权利要求8的应用，其特征在于，将扩增方法获得的产物，测序后，进行同源性比对，对所扩增的猫冠状病毒进行分类。10.如权利要求9的应用，其特征在于，所述同源性比对为将测序获得的序列与ncbi上已知的猫冠状病毒s基因进行比对。
技术总结本发明公开了一种扩增猫冠状病毒S基因全序列的引物、方法和应用，引物序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；方法包括以下步骤:步骤一、提取病毒RNA；步骤二、cDNA合成；步骤三、PCR扩增；步骤四、基因片段检测及测序。本发明还提供了一种猫冠状病毒S基因全序列扩增方法的应用，用于对猫冠状病毒S基因全序列的检测与分析。本公开的扩增方法，无需采用常规多对引物进行拼接的方案，通过设计1对引物即实现了猫冠状病毒S基因S基因全序列的扩增，不仅操作便捷，还可以避免在高变区域无法扩增获得目的片段的风险。的片段的风险。的片段的风险。
技术研发人员：包银莉 许洵锴 郑灿阳 黄翠琴 李世媛
受保护的技术使用者：龙岩学院
技术研发日：2022.06.30
技术公布日：2022/11/1
