1.本发明涉及微生物菌种及其应用的技术领域，具体涉及一种放线菌新物种streptomyces populiradicis trm70303产硫藤黄菌素的制备方法和应用技术领域。
背景技术：2.农业病虫害是我国农业上的主要灾害，据联合国粮农组织(fao)的统计，每年因遭受植物病害引起的减产平均损失为总产量的10％-15％。农用抗生素发展迅速，并且新产品不断的投放市场，但终因生产水平太低、生产成本过高、防治效率低下等原因，很大程度上限制了在经济作物上的高效使用。
3.人类对环保的呼声越来越高，化学农药的开发难度也越来越大。作为生物防治重要内容的农用抗生素已经成为研究开发的热点。解决这一系列新问题的办法之一就是大量寻找和发现新的生物活性物质，微生物抗生素的研究已成为我国科学研究的重点。作为获得先导化合物的基础和源泉，菌株资源的获取至关重要，尤其是极端环境微生物抗生素的合成研究更是学术界研究的热点领域。
4.沙漠作为特殊生态环境，具有太阳辐射强烈、水分蒸发量大、极度干旱炎热、营养贫瘠、土壤盐渍化等特点。为适应自然环境，微生物在长期生活及进化过程中形成其特有的代谢物质，这些物质具有很高的研究和开发价值，也是寻找新型活性次级代谢产物的重要资源。
5.硫藤黄菌素是一种具有广谱抗菌活性的二硫吡咯酮类抗生素，现有的采用微生物发酵制备硫藤黄菌素虽然有报道，中国专利(“硫藤黄菌素二氧化物及其衍生物在制备用于治疗cns疾病的药物中的用途及其制备方法”，cn1279906c)公开了采用诺卡氏菌种st 100692,dsm 13834生产硫藤黄菌素二氧化物，以及文献(“微生物来源白细胞介素-4受体拮抗剂的筛选”，王柯等，中国新药杂志，2007,16(14)：1088-1090)公开了采用链霉菌4849发酵液分离纯化得到含有金丝菌素、硫藤黄菌素和4,7-二甲氧基异黄酮三种化合物，但硫藤黄菌素的产量均不高，制备过程复杂且成本较高、原始菌株发酵水平低；化学合成生产硫藤黄菌素步骤复杂，且存在高温、高压、强酸、强碱等较为极端的化工过程，生产安全性低、环境污染较重；同时已有技术报道硫藤黄菌素对金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肿瘤细胞等有良好的活性，但对棉花枯萎病、棉花黄萎病、香梨腐烂病，梨火疫病、志贺氏杆菌、鲍曼不动杆菌是否有抑制作用还未见报道。
技术实现要素：6.针对现有硫藤黄菌素的制备过程复杂、成本高，安全性低、环境污染较重、利用微生物发酵产量低，且未见有文献和专利记载有关streptomyces populiradicis发酵制备硫藤黄菌素的技术现状，本发明旨在于提供一种放线菌新物种streptomyces populiradicis trm70303产硫藤黄菌素的制备方法和应用。利用从新疆塔克拉玛干沙漠胡杨根际土壤中分离得到的放线菌新物种streptomyces populiradicis trm70303，发酵、分离纯化获得化合
物硫藤黄菌素，产量为0.27mg/ml，与现有的硫藤黄菌素制备方法相比，产量大幅提高，制备过程简单、菌株发酵水平高，成本低、发酵周期短，可通过大规模发酵方式实现活性物质的大量生产，从而从根本上解决药源短缺；抑菌活性测试表明本发明制备方法获得的硫藤黄菌素对棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、香梨腐烂病、梨火疫病、志贺氏杆菌、梨黑斑病、鲍曼不动杆菌具有广谱而高效的拮抗活性，对植物病害以及细菌性感的染防控具有重要的应用价值和良好的开发前景，将其应用于制备防治棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、香梨腐烂病、梨火疫病、志贺氏杆菌、梨黑斑病和鲍曼不动杆菌的药物中，具有广泛的生物农药和生物医药价值。
7.为了达到以上技术效果，本发明通过如下技术方案实现。
8.一种streptomyces populiradicis trm70303产硫藤黄菌素的制备方法，具体包括如下步骤：将菌株streptomyces populiradicis trm70303的单菌落接种于tsb培养基中，于33℃、120rpm培养3天，得streptomyces populiradicis trm70303种子液；将streptomyces populiradicis trm70303种子液，按照体积比为1％的接种量接入到燕麦液体培养基，于33℃、120rpm发酵培养5天，得streptomyces populiradicis trm70303发酵液；收集发酵液，过滤后上样于d101型号大孔树脂，100％甲醇洗脱，收集洗脱液，于50℃减压浓缩，获得片状晶体硫藤黄菌素。
9.本发明硫藤黄菌素制备方法中，所述streptomyces populiradicis trm70303菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctcc no：m2021450。
10.本发明硫藤黄菌素制备方法中，所述streptomyces populiradicis trm70303的基因序列如seqid no：1所示。
11.本发明硫藤黄菌素制备方法中，streptomyces populiradicis trm70303微生物新物种的分离培养基为：可溶性淀粉20g/l，kno31g/l，k2hpo40.5g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，nacl 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，琼脂18g/l，土壤浸提液1000ml，ph 7.5。
12.本发明硫藤黄菌素制备方法中，streptomyces populiradicis trm70303微生物新物种的纯化培养基为：可溶性淀粉10.0g、k2hpo41.0g、mgso4·
7h2o 1.0g、nacl 1.0g、(nh4)2so42.0g、cacl22.0g、feso4·
7h2o 0.001g、mnso40.001g、znso4·
7h2o 0.001g、琼脂15.0g、蒸馏水1.0l、ph 7.2。
13.本发明提供的放线菌streptomyces populiradicis trm70303是从新疆塔克拉玛干沙漠胡杨根际土壤中筛选分离，经16sr rna序列系统发育分析和形态学分析，trm70303菌株属于streptomyces。通过对该菌株基因测序，所得序列在ncbi网站进行blast比对分析，菌株trm70303的16sr rna基因序列与枸杞链霉菌streptomyces lycii trm 66187
t
的相似度最高，为98.15％。选取同源性较高的序列构建16sr rna系统发育树，菌株trm70303与streptomyces lycii trm 66187
t
(mn567187)亲缘关系最近。经过系列多相分类鉴定可知该菌株trm70303确定其为streptomyces新物种，具有新物种典型性的特点。
14.本发明提供的放线菌streptomyces populiradicis trm70303经过上述本领域熟知公认的菌种系统分子水平鉴定，结合形态学鉴定、生理生化特征、化学特征等多相分类系统鉴定分析，本发明涉及放线菌trm70303与该属同源性最近的3标准模式菌株存在多项不同，证实该放线菌菌株trm70303属于链霉菌属的新物种，将其命名为streptomyces populiradicis trm70303，已保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctcc no：
m2021450，保藏日期：2021年4月25日。
15.同时，本发明提供一种streptomyces populiradicis trm70303产硫藤黄菌素在制备防治棉花枯萎病、棉花黄萎病、香梨腐烂病，梨火疫病、志贺氏杆菌、鲍曼不动杆菌药物中的应用。
16.通过以上技术方案，本发明得到以下技术效果：
17.(1)本发明利用获得的放线菌新物种streptomyces populiradicis trm70303发酵生产硫藤黄菌素，产量为0.27mg/ml，相对于本领域常见的微生物菌种发酵代谢和化学合成生产的硫藤黄菌素产量显著提高、制备方法简单、成本低、发酵周期短、安全性高、污染低，可通过大规模发酵方式实现活性物质的大量生产，从而从根本上解决药源短缺。
18.(2)本发明利用放线菌新物种streptomyces populiradicis trm70303主要次级代谢产物制备的硫藤黄菌素对棉花黄萎病菌(verticillium dahliae,accc 36211)、棉花枯萎病菌(fusarium oxysporumfsp accc 31038)、香梨腐烂病(valsapyri wtz-19)、梨火疫病(erwinia amylovor trm-03)、志贺氏杆菌(shigella castellani trm-11)、梨黑斑病(alternaria gaisen trm-09)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii atcc19606)的防控具有高效应用价值，可用于开发高效的生物农药和生物医药。
附图说明
19.图1所示为基于16sr rna序列的菌株trm70303的系统发育进化树。
20.图2显示为菌株trm70303形态特征图，其中，a为菌株trm70303在培养基上的菌落形态图；b为菌落扫描电镜照片。
21.图3所示为本发明硫藤黄菌素分子结构示意图。
22.图4所示为本发明硫藤黄菌素的1h nmr谱图。
23.图5所示为本发明硫藤黄菌素的
13
c nmr谱图.
24.图6所示为本发明硫藤黄菌素的hsqc图。
25.图7所示为本发明硫藤黄菌素的hmbc图。
26.图8所示为本发明浓度为0.5mg/ml硫藤黄菌素的hplc图。
27.图9所示为本发明硫藤黄菌素的hplc标准曲线图。
28.图10所示为本发明菌株trm 70303粗提液的hplc图。
29.图11显示为滤纸片法测定本发明硫藤黄菌素抑菌活性结果，其中，c.a为白色念珠菌，e.c为大肠杆菌，s.a为金黄色葡萄球菌。
具体实施方式
30.下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为体积百分比，除非特别指出除外。
31.本发明streptomyces populiradicis trm70303微生物菌剂制备中采用的tsb培养基为(g/l)：胰酪胨15g/l，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g/l，nacl 5.0g/l，ph值7.3
±
0.2。
32.实施例1：发酵代谢生产硫藤黄菌素的放线菌streptomyces populiradicis trm70303
33.(一)分离、纯化
34.采用平板稀释法分离放线菌。从塔克拉玛干沙漠胡杨根际土壤样品取样1g，用无菌水稀释至10-4
，各取0.2ml均匀涂布于分离平板培养基上，每个稀释梯度涂布10个平板，37℃倒置培养，挑取单菌落划线纯化，分离培养基为：可溶性淀粉20g/l，kno31g/l，k2hpo40.5g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，nacl 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，琼脂18g/l，土壤浸提液1000ml，ph 7.5；纯化的培养基为：可溶性淀粉10.0g、k2hpo41.0g、mgso4·
7h2o 1.0g、nacl 1.0g、(nh4)2so42.0g、cacl22.0g、feso4·
7h2o 0.001g、mnso40.001g、znso4·
7h2o 0.001g、琼脂15.0g、蒸馏水1.0l、ph 7.2。
35.(二)16sr rna基因鉴定
36.1.dna的提取
37.将streptomyces populiradicis trm70303接种于纯化液体培养基中，37℃培养7d，获得菌体细胞，采用新型植物基因组dna快速提取试剂盒进行基因组dna提取。
38.2.pcr扩增
39.16sr rna序列引物：
40.27f：5
′‑
aga gtt tga tcc tgg ctc-3
′
；
41.1492r：5
′‑
cgg cta cct tgt tac gac tt-3
′
。
42.反应体系及条件：
[0043][0044]
3.序列测定
[0045]
pcr扩增产物经电泳检测和纯化后测序，其序列长度为1407bp，测序结果见seq id no：1，于ncbi进行blast同源序列检索，利用本领域常见采用的mega 7.0软件通过neighbor-joining方法建立系统进化树(重复抽样1000次)，结果见附图1所示，所得序列在ncbi网站进行比对分析发现，菌株trm70303的16sr rna基因序列与枸杞链霉菌streptomyces lycii trm 66187
t
的同源性最高，相似性为98.43％，以16sr rna基因序列构建的系统发育树中，菌株trm70303的16sr rna序列与streptomyces lycii trm 66187
t
(mn567187)菌株的亲缘关系最近，但不在同一分支上，表明该放线菌trm70303作为新物种的支持率极高，在进化树中体现极好的稳定性。通过菌种的相似性和同源性的综合判定，证实获得的streptomyces属范畴内菌种编号为trm70303属于一种典型的放线菌新物种。
[0046]
(三)streptomyces populiradicis trm70303的菌落形态特征
[0047]
将待观察的菌株trm70303接种到高氏一号平板上，于37℃培养5天，待菌落长满整个平板观察菌落特征记录并拍照保存，同时记录菌落的扫描电镜照片，记录结果参见附图2所示。
[0048]
由附图2结果可知，菌株trm70303在高氏一号培养基37℃培养5天，可观察到大量的基内菌丝呈亮黄色和白色的气生菌丝附着在其表面，菌丝分枝少、无横隔，呈亮黄色；气生菌丝丰富，形成长短不一的孢子链，孢子成椭圆形、光滑无刺，成串生长，孢子丝呈螺旋状。
[0049]
基于以上生物学特征，将上述菌株trm70303鉴定为streptomyces。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072，保藏日期：2021年4月25日，保藏号为cctcc no：m2021450。
[0050]
(四)streptomyces populiradicis trm70303的生理生化特征
[0051]
将菌株trm70303接种于高氏一号培养基上，分别检测各生理生化特征。生长温度、盐度、ph值范围、明胶液化、硝酸盐还原、过氧化氢产生、尿素酶、淀粉酶、酯酶、纤维素分解、碳源利用等特征分析主要参考《常见细菌系统鉴定手册》，并与相似菌株s.lycii trm66187
t
、s.chumphonensis k1-2
t
、s.durbertens neau-s1gs20
t
的生理化特性进行对比，具体结果参见表1-3所示。
[0052]
由表1数据可知，菌株trm70303的生长耐受温度范围为15-45℃、ph值为6-10、nacl耐受试验范围为0-10％，最适生长条件为：40℃、1％nacl、ph＝7；菌株trm70303能利用碳源为乳糖、阿拉伯糖、d-山梨糖、蔗糖、甘露糖、葡萄糖、d-果糖、鼠李糖，不能利用棉子糖、木糖、肌醇作为唯一碳源；尿素酶、硝酸盐还原、纤维素水解酶、淀粉水解酶、脂酶的结果呈阳性，过氧化氢酶、明胶液化结果呈阴性。
[0053]
表1：菌株trm70303的生理生化特性对比试验
[0054][0055]
(五)streptomyces populiradicis trm70303的化学特征
[0056]
对菌株trm70303全细胞水解糖成分、全细胞水解氨基酸成分、极性脂、主要醌型、脂肪酸组分进行检测(lechevalier mp,lechevalier ha(1980)the chemotaxono-my of actinomycetes.in:dietz a,thayer dw(eds)actinomycete taxonomy special publication,vol 6.society of industrial microbiology,arlington,pp 227
–
291)。
[0057]
表2和表3为对菌株trm70303全细胞水解糖成分、全细胞水解氨基酸成分、极性脂、主要醌型、脂肪酸组分的检测结果。菌株trm70303的全细胞水解糖类型主要为葡萄糖和核糖，与其他相似菌株一致；全细胞水解氨基酸dap类型主要为ll-dap；主要极性脂为pe，pc，pg和pi，与其他菌株相似；主要的醌型为mk-9(h6)、mk-9(h8)、mk-10(h2)，与其他菌株相似，但含量上有所不同。主要脂肪酸是anteiso-c
15:0
，含量为33.87％，与三株相似菌株相似，但又具有anteiso-c
17:1
和iso-c
16:1
这两种独有组分。
[0058]
表2：菌株trm70303与相似菌株细胞化学组分差异表
[0059][0060]
表3：菌株trm70303与相似菌株各脂肪酸组分差异表(》2％)
[0061][0062]
由此可见，菌株trm70303其与该属同源性最近的菌株s.lycii trm66187
t
、s.chumphonensis k1-2
t
和s.durbertens neau-s1gs20
t
生理化特性相似，但存在多项不同，是链霉菌属的潜在新种。
[0063]
综合16srrna基因序列同源性对比分析以及形态学鉴定、生理生化特征对比、化学特征分析等多个方面与同源性最近的3个标准模式菌株具有鲜明的区别，确定该菌株trm70303为一种放线菌streptomyces新物种，根据其分离来源将其命名为streptomyces populiradicis。
[0064]
实施例2：利用放线菌streptomyces populiradicis trm70303生产硫藤黄菌素的制备
[0065]
本实施例在实施例1的基础上，利用获得的放线菌新物种streptomyces populiradicis trm70303产硫藤黄菌素的制备方法，具体包括如下步骤：将菌株streptomyces populiradicis trm70303的单菌落接种于tsb培养基中，于33℃、120rpm培养3天，得streptomyces populiradicis trm70303种子液；将streptomyces populiradicis trm70303种子液，按照体积比为1％的接种量接入到燕麦液体培养基，于33℃、120rpm发酵培养5天，得streptomyces populiradicis trm70303发酵液；收集发酵液，过滤后上样于d101型号大孔树脂，100％甲醇洗脱，收集洗脱液，于50℃减压浓缩，去除甲醇溶解部分，获得片状晶体硫藤黄菌素。
[0066]
其中，燕麦培养基为：燕麦20g，水1000ml，ph 7.5。
[0067]
tsb培养基为(g/l)：胰酪胨15g/l，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g/l，nacl5.0g/l，ph
值7.3
±
0.2。
[0068]
实施例3：streptomyces populiradicis trm70303产硫藤黄菌素的鉴定
[0069]
本实施例在实施例2的基础上，将菌株streptomyces populiradicis trm70303的单菌落接种于tsb培养基中，于37℃、120rpm培养3天，得streptomyces populiradicis trm70303种子液；将streptomyces populiradicis trm70303种子液，按照体积比为1％的接种量接入到燕麦液体培养基，于37℃、120rpm发酵培养5天，得streptomyces populiradicis trm70303发酵液；收集发酵液，过滤后上样过d101型号大孔树脂，100％甲醇洗脱，收集洗脱液，于50℃减压浓缩，去除甲醇溶解部分，获得硫藤黄菌素纯品，该硫藤黄菌素的分子结构式参见附图3所示。
[0070]
(1)鉴定及纯度检测
[0071]
本试验获得的硫藤黄菌素纯品，化合物为金黄色片状晶体，溶于dmso，于甲醇及水中几乎不溶。熔点：273-276℃。硫藤黄菌素的结构经nmr鉴定，核磁图1h nmr谱图参见附图4，
13
c nmr谱图参见附图5，hsqc(heteronuclear single quantum coherence)谱图参见附图6，hmbc(heteronuclear multiple-bond correlation)谱图参见附图7所示。其波谱数据与文献报道的硫藤黄菌素报道一致，表明本发明通过菌株trm70303发酵分离纯化获得的化合物为硫藤黄菌素，该化合物的nmr数据详见表4所示。
[0072]
表4：硫藤黄菌素的nmr数据(dmso-d6,1h:500mhz,
13
c:125mhz)
[0073][0074]
采用tlc薄层色谱(二氯甲烷：甲醇＝10:1，石油醚：乙酸乙酯＝3:1，采用3种显色方法：254nm紫外显色、碘显色、乙醇-浓硫酸显色，均成单一般点)，并用高效液相色谱hplc测定：通过面积规依法，采用5个不同波长(254nm、302nm、365nm、388nm、440nm)测定，记录色谱图的时间宽度为硫藤黄菌素出峰时间的2倍以上。由附图8数据可知，在选定的5个波长下，硫藤黄菌素的纯度均大于98％以上，符合标准品的纯度要求。
[0075]
(2)标准曲线绘制
[0076]
以上纯度大于98％的硫藤黄菌素为标准品，通过面积归一法，采用hplc法(流动相：100％甲醇-水溶液，流速1ml/min，样品浓度0.5mg/ml，依次稀释为0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml，进样量10μl，检测波长388nm)测定标准曲线，具体结果参见附图9所示。硫藤黄菌素的标准曲线为：y＝(2e+07x)-111616，r2＝0.9995，公式中x为峰面积，y为硫藤黄菌素的含量，r2的值表示曲线的线性关系良好，可用于硫藤黄菌素含量的测定。
[0077]
(3)硫藤黄菌素的定量分析
[0078]
采用hplc法对200ml发酵液的粗提物中硫藤黄菌素的产量进行分析。色谱条件为：
4.6mm
×
150mm的c18色谱柱(0.5μm)，100％甲醇-水作为流动相，流速为1ml/min，检测波长为388nm，具体结果参见附图10所示。
[0079]
本发明提供的硫藤黄菌素的制备方法，硫藤黄菌素的产量为0.27mg/ml，较现在报道的硫藤黄菌素的制备方法产量大幅提高，制备过程简单、菌株发酵水平高，成本低、发酵周期短、安全性高、污染性降低，可通过大规模发酵方式实现活性物质的大量生产，从而从根本上解决药源短缺。
[0080]
实施例4：streptomyces populiradicis trm70303产硫藤黄菌素的抑菌活性试验
[0081]
本实施例在时实施例1-3的基础上，采用滤纸片法进行拮抗活性初步测试。分别选取一株真菌、一株革兰阴性菌、一株革兰阳性菌病原菌为代表靶标菌，初步考察本发明streptomyces populiradicis trm70303产硫藤黄菌素的抑菌活性。所选病原菌为白色念珠菌(atcc 64550)、大肠杆菌(atcc 25922)、金黄色葡萄球菌(atcc 6538)。
[0082]
分别挑取大肠杆菌(atcc 25922)、金黄色葡萄球菌(atcc 6538)接种于lb液体培养基，37℃过夜培养，制成备用菌悬液，吸取200μl于lb固体平板上涂布均匀待用；白色念珠菌(atcc 64550)接种于pda液体培养基中28℃过夜培养，制成备用菌悬液，吸取200μl于pda固体平板上涂布均匀待用。
[0083]
吸取浓度为1mg/ml的硫藤黄菌素10μl于滤纸片(直径约为0.6mm)，贴在上述涂布好病原菌的培养基上，每皿贴3片(设置dmso和甲醇为空白对照)。做好标记后分别置于37℃和28℃培养过夜，测量抑菌圈大小并拍照记录，具体结果参见附图11和表5所示。
[0084]
表5：抑菌圈大小统计表
[0085]
靶标菌抑菌圈直径大小白色念珠菌(c.aatcc 64550)26.1
±
0.05mm大肠杆菌(e.catcc 25922)24.0
±
0.15mm金黄色葡萄球菌(s.aatcc 6538)12.0
±
0.15mm
[0086]
由附图11和表5数据可知，硫藤黄菌素对真菌(白色念珠菌)、革兰阴性菌(大肠杆菌)、革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌)均具有良好的抑菌活性，具有广阔的应用前景。
[0087]
实施例5：利用streptomyces populiradicis trm70303产硫藤黄菌素的生防应用试验
[0088]
以0.05mg/ml浓度的硫藤黄菌素为基础进行2倍系列稀释，使其终浓度分别为50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.7μg/ml、0.8μg/ml、0.4μg/ml。
[0089]
分别挑取不同病原菌单菌落于lb培养基中活化，生长后的菌液用生理盐水配制成0.5麦氏比浊标准，再用mh肉汤进行1：10稀释，使之含菌量为107cfu/ml。接种时用微量加样器取0.1ml菌液依次由低浓度到高浓度加样，使每孔的最终菌液浓度为5
×
105cfu/ml。接种后置37℃孵育16-20h，以小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为该抗菌药物对待测菌的mic值，每个处理重复3次，试验结果参见表6所示。
[0090]
表6：硫藤黄菌素的抑菌作用
[0091]
病原菌菌株病害名称硫藤黄菌素mic值verticillium dahliae accc 36211棉花黄萎病菌12.5μg/mlfusarium oxysporumfsp accc 31038棉花枯萎病菌12.5μg/mlvalsa pyri wtz-19香梨腐烂病6.215μg/ml
erwinia amylovor trm-03梨火疫病12.5μg/mlshigella castellani trm-11志贺氏杆菌12.5μg/mlalternaria gaisen trm-09梨黑斑病12.5μg/mlacinetobacter baumannii atcc 19606鲍曼不动杆菌12.5μg/ml
[0092]
由表6数据可知，本发明提供的新菌streptomyces populiradicis trm70303产硫藤黄菌素对棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、梨火疫病、志贺氏杆菌、梨黑斑病和鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度均为12.5μg/ml，对香梨腐烂病的最低抑菌浓度仅为6.215μg/ml，表明本发明利用新物种streptomyces populiradicis trm70303生产的硫藤黄菌素对棉花枯萎病、棉花黄萎病、香梨腐烂病，梨火疫病、志贺氏杆菌、鲍曼不动杆菌均有显著的抑制作用，对香梨腐烂病菌的抑制力最强，说明该菌株发酵代谢的硫藤黄菌素在制备防治棉花枯萎病、棉花黄萎病、香梨腐烂病，梨火疫病、志贺氏杆菌、鲍曼不动杆菌药物中的应用，对植物病害以及细菌性感的染防控具有重要的应用价值和良好的开发前景。
[0093]
综上数据可知，本发明提供的硫藤黄菌素的制备方法，产量为0.27mg/ml，与现有的硫藤黄菌素制备方法相比，产量大幅提高，制备过程简单、菌株发酵水平高，成本低、发酵周期短，可通过大规模发酵方式实现活性物质的大量生产，从而从根本上解决药源短缺；放线菌新物种streptomyces populiradicis trm70303主要次级代谢产物分离纯化获得的硫藤黄菌素对棉花黄萎病菌(verticillium dahliae,accc 36211)、棉花枯萎病菌(fusarium oxysporumfsp accc 31038)、香梨腐烂病(valsa pyri wtz-19)、梨火疫病(erwinia amylovor trm-03)、志贺氏杆菌(shigella castellani trm-11)、梨黑斑病(alternaria gaisen trm-09)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii atcc19606)的防控有高效的应用价值，可用于开发高效的生物农药和生物医药。
[0094]
上述的实施例仅仅是对本试验的优选实施方式进行描述，并非对本试验的范围进行限定，在不脱离本试验设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本试验的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本试验确定的保护范围内。
技术特征：1.一种streptomyces populiradicis trm70303产硫藤黄菌素的制备方法，其特征在于，将菌株streptomyces populiradicis trm70303的单菌落接种于tsb培养基中，于33℃、120rpm培养3天，得streptomyces populiradicis trm70303种子液；将streptomyces populiradicis trm70303种子液，按照体积比为1％的接种量接入到燕麦液体培养基，于33℃、120rpm发酵培养5天，得streptomyces populiradicis trm70303发酵液；收集发酵液，过滤后上样于d101型号大孔树脂，100％甲醇洗脱，收集洗脱液，于50℃减压浓缩，获得片状晶体硫藤黄菌素。2.如权利要求1所述的一种streptomyces populiradicis trm70303产硫藤黄菌素的制备方法，其特征在于，所述streptomyces populiradicis trm70303菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctcc no：m2021450。3.如权利要求1所述的一种streptomyces populiradicis trm70303产硫藤黄菌素的制备方法，其特征在于，所述streptomyces populiradicis trm70303的基因序列如seq id no：1所示。4.如权利要求1所述的一种streptomyces populiradicis trm70303产硫藤黄菌素的制备方法，其特征在于，所述streptomyces populiradicis trm70303的分离培养基为：可溶性淀粉20g/l，kno
3 1g/l，k2hpo
4 0.5g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，nacl 0.5g/l，feso4·
7h2o 0.01g/l，琼脂18g/l，土壤浸提液1000ml，ph7.5。5.如权利要求1所述的一种streptomyces populiradicis trm70303产硫藤黄菌素的制备方法，其特征在于，所述streptomyces populiradicis trm70303的纯化培养基为：可溶性淀粉10.0g、k2hpo
4 1.0g、mgso4·
7h2o 1.0g、nacl 1.0g、(nh4)2so
4 2.0g、cacl
2 2.0g、feso4·
7h2o 0.001g、mnso
4 0.001g、znso4·
7h2o 0.001g、琼脂15.0g、蒸馏水1.0l、ph 7.2。6.一种如权利要求1所述的streptomyces populiradicis trm70303产硫藤黄菌素制备方法制备的硫藤黄菌素在制备防治棉花枯萎病、棉花黄萎病、香梨腐烂病，梨火疫病、志贺氏杆菌、鲍曼不动杆菌药物中的应用。
技术总结本发明涉及一种StreptomycespopuliradicisTRM70303产硫藤黄菌素的制备方法和应用。本发明利用从新疆塔克拉玛干沙漠胡杨根际土壤中分离得到的放线菌新物种StreptomycespopuliradicisTRM70303，经其培养获得发酵液经分离纯化获得硫藤黄菌素，产量为0.27mg/mL，与现已有技术披露报道的硫藤黄菌素制备方法相比，产量大幅提高、制备过程简单、菌株发酵水平高、成本低、发酵周期短；通过抑菌活性实验测试证实本发明获得的硫藤黄菌素对棉花黄萎病菌、棉花枯萎病菌、香梨腐烂病、梨火疫病、志贺氏杆菌、梨黑斑病、鲍曼不动杆菌具有广谱而高效的拮抗活性，对植物病害以及细菌性感的染防控具有重要的应用价值和良好的开发前景。开发前景。开发前景。
技术研发人员：张利莉 刘占文 万传星 骆新荣 夏占峰 罗晓霞 任强 姚宇翔
受保护的技术使用者：塔里木大学
技术研发日：2022.06.30
技术公布日：2022/11/1
