1.本发明属于新型冠状病毒主蛋白酶小分子抑制剂及其合成方法制备技术领域，尤其是涉及一种新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂及其制备方法和应用。
背景技术：2.冠状病毒是一类广泛存在于自然界的病原体，它的宿主范围很广，覆盖了鸟类、哺 乳动物和人类，自从1965年第一株冠状病毒被分离以来，到目前为止近60年的时间，它已 经引发了世界范围内的多次严重人类疫情。2020年2月11日世界卫生组织正式宣布由这一 病毒导致的疾病名称为covid-19。新型冠状病毒肺炎(covid-19)已经造成了累计三亿 多人的感染以及五百多万病例的死亡，对人类健康和世界公共卫生安全造成严重威胁，也给 世界经济的复苏带来了严重的负担。自新冠疫情爆发以来，新型冠状病毒的变异株不断被发 现，2020年10月在印度发现了其德尔塔(delta)变异株。2021年11月，在南非发现了其 奥密克戎(omicron)变异株，奥密克戎毒株比德尔塔毒株的传染性更强，该变异株导致人 体再次感染的风险比其他毒株高5倍以上，新冠病毒奥密克戎变异毒株在全球总体风险评估 为“非常高”，可能在世界广泛传播，可以看出新型冠状病毒与以往相比，其适应环境的变 异程度越来越高。也正是因为新冠病毒的高变异率和高变异速度，使得目前新冠疫苗的保护 率不断下降，即便目前新冠疫苗已在全球范围内进行了大规模和多次的接种，但依旧无法有 效的预防及阻止病毒给人类健康带来的危害。因此，在这种情况下，针对新型冠状病毒的小 分子药物的开发就显得尤为必要。
3.目前研究发现，sars-cov-2的主蛋白酶参与将冠状病毒基因组编码的复制酶多蛋白酶切水解为病毒基因组复制所必需的非结构蛋白的过程，因而在冠状病毒的转录复制中发挥了至关重要作用。并且在人体内不存在主蛋白酶的同源蛋白，因而主蛋白酶是一个良好的抗冠状病毒靶点。而且，酶学实验进一步证实了冠状病毒主蛋白酶的底物结合位点是保守的。因此，如果能够抑制sars-cov-2的主蛋白酶的水解作用，那么将会有效地抵御sars-cov-2对人体的侵染。因此，冠状病毒主蛋白酶是抗新型冠状病毒药物设计的理想靶标。基于此，利用靶蛋白晶体结构信息尝试了一些小分子抑制剂的设计、改造和优化，采用经典的基于结构的药物设计思路和流程，合成出一些小分子。经过验证发现，一些设计和改造后的小分子具有对sars-cov-2的显著抑制活性。
技术实现要素：4.本发明的一个目的是提供一种化合物，能够有效抑制新型冠状病毒主蛋白酶活性的小分子抑制剂，该化合物的结构通式如式1所示：
式1其中，u为或； r1选自如下基团：c1~c6的烷基羰基或者环烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑基羰基、吡啶基羰基、三氟甲基羰基、、、、、、、、、、、；r2选自如下基团：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基、羟甲基、、；r3选自如下基团：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、羟基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基、、、、、、、、；r4选自如下基团：c1~c6的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基；r5选自如下基团：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基。
5.较佳的，r1优选为如下基团：、、、、
；r2优选为甲基、异丙基、羟甲基、；r3优选为异丙基、叔丁基、环己基、苄基、苯基、羟基、对氟苄基、、、、、、、、、；r4优选为环己基、异丙基、苯基、氢原子；r5优选为异丁基、异丙基。
6.较佳的，所述化合物的结构为以下结构之一， 、、、
、、、、、、
、、、、、
、、、、、、
。
7.较佳的，所述化合物的结构如式2所示：式2其中，r1选自如下基团：c1~c6的烷基羰基或者环烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑基羰基、吡啶基羰基、三氟甲基羰基、、、、、、、、、、、；r2选自如下基团：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基、羟甲基、、；r3选自如下基团：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、羟基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基、、、、、、、、；r4选自如下基团：c1~c6的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基；r5选自如下基团：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代
苯基、氟代苄基。
8.较佳的，所述化合物的结构为以下结构之一，、、、、、
、、、、。
9.本发明的另一目的是提供所述小分子抑制剂的合成方法，其包括：将式3化合物中的氨基保护基r6脱除，其中的r6选自由如下基团构成的组：叔丁氧羰基、三氟乙酰基、苄氧羰基、笏甲氧羰基、烯丙氧羰基；在缩合剂的存在下，将上一步的产物与式4化合物进行缩合，得到式5；
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式3
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式4式5其中，u为或； r1选自如下基团：c1~c6的烷基羰基或者环烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑基羰基、吡啶基羰基、三氟甲基羰基、、、、、、、、、、、；r2选自如下基团：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基、羟甲基、、；r3选自如下基团：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、羟基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基、、、、、、、、。
10.较佳的，在有机溶剂中，使式3化合物与酸或碱在室温下反应2~8h，脱去氨基的保护基r6，并抽去所述有机溶剂；随后将得到的产物与式4化合物溶于非质子性溶剂中，加入所述缩合剂和有机碱，在室温下反应16~24h，得到式5化合物。
11.较佳的，所述酸为三氟乙酸或/和盐酸；所述碱为氢氧化钠或/和甲醇钠；所述有机溶剂为：ch2cl2、thf、dmf、二氧六环中的一种或几种；所述非质子性溶剂为：ch2cl2、thf、dmf、二氧六环、二甲亚砜、苯中的一种或几种；所述缩合剂为：hatu、hbtu、edci、hobt中的一种或几种；所述有机碱为：lda、三乙胺、diea中的一种或几种。
12.本发明的又一个目的为提供一种化合物及其可药用盐在制备治疗或预防冠状病毒感染的药物中的应用；优选地，所述冠状病毒为新型冠状病毒sars-cov-2。
13.本发明的最后一个目的为提供一种化合物及其可药用盐在制备新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂中的应用。
14.采用上述技术方案，通过相关实验证明，本发明化合物能够显著抑制sars-cov-2主蛋白酶的活性，在制备用于治疗或者预防冠状病毒感染的药物方面具有良好的应用前景。
附图说明
15.图1是本发明实施例一种化合物m1的1h-nmr图；图2是本发明实施例一种化合物m1的
13
c-nmr；图3是本发明实施例一种化合物m1的ms谱图；图4是本发明实施例一种化合物m2的1h-nmr图；图5是本发明实施例一种化合物m2的
13
c-nmr图；图6是本发明实施例一种化合物m2的ms谱图；图7是本发明实施例一种化合物m3的1h-nmr图；图8是本发明实施例一种化合物m3的
13
c-nmr图；图9是本发明实施例一种化合物m3的ms谱图；图10是本发明实施例一种化合物m4的1h-nmr图；图11是本发明实施例一种化合物m4的
13
c-nmr图；图12是本发明实施例一种化合物m4的ms谱图；图13是本发明实施例一种化合物m5的1h-nmr图；图14是本发明实施例一种化合物m5的
13
c-nmr图；图15是本发明实施例一种化合物m5的ms谱图；图16是本发明实施例一种化合物m6的1h-nmr图；图17是本发明实施例一种化合物m6的
13
c-nmr图；图18是本发明实施例一种化合物m6的ms谱图；图19是本发明实施例一种化合物m7的1h-nmr图；图20是本发明实施例一种化合物m7的
13
c-nmr图；
图21是本发明实施例一种化合物m7的ms谱图；图22是本发明实施例一种化合物m8的1h-nmr图；图23是本发明实施例一种化合物m8的
13
c-nmr图；图24是本发明实施例一种化合物m8的ms谱图；图25是本发明实施例一种化合物m9的1h-nmr图；图26是本发明实施例一种化合物m9的
13
c-nmr图；图27是本发明实施例一种化合物m9的ms谱图；图28是本发明实施例一种化合物m10的1h-nmr图；图29是本发明实施例一种化合物m10的
13
c-nmr图；图30是本发明实施例一种化合物m10的ms谱图。
具体实施方式
16.下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明：除非另有定义，下文中所使用的的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的的专业术语只是为了描述具体实施例和对比例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。应当特殊说明的是对于同一种有机物结构可能有多种名称，只要其结构在本专利范围内都属于本专利的保护对象。
17.除非另有定义，以下实施例中和对比例中的原料、试剂等都可以从市场上够买所得或根据已报导的方法制备所得。
18.为了叙述上的方便，本文中使用了一些特定的术语，下面逐一对其进行解释。
19.m1-m10是本发明特别优选的小分子抑制剂代号；本文中所使用的术语“sars-cov-2 m
pro”指sars-cov-2冠状病毒的主要蛋白水解酶。
20.在部分结构式中，“et”代表乙基，“bn”代表苄基，“boc”代表叔丁氧羰基。“tfa”代表三氟乙酸，“dcm”代表二氯甲烷，“ea”代表乙酸乙酯，“thf”代表四氢呋喃，“dmf”代表n,n-二甲基甲酰胺，“dmso”代表二甲基亚砜,
ꢀ“
et3n”代表三乙胺，“diea”代表n,n-二异丙基乙胺，“edci”代表1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，“hatu”代表2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸酯，“hobt”代表1-羟基苯并三唑。
21.本发明化合物的结构如前所述，本发明化合物的结构如通式1所示：式1r1选为：c1~c6的烷基羰基或者环烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑基羰基、吡啶基羰基、
三氟甲基羰基、、、、、、、、、、、中的一种或几种；r2选为：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基、羟甲基、、中的一种或几种；r3选为：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、羟基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基、、、、、、、、中的一种或几种；r4选为：c1~c6的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基中的一种或几种；r5选为：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基中的一种或几种。
22.本发明中优选地化合物结构通式如式2所示：式2r1、r2、r3的选择范围与上述一致，在此不再赘述。
23.下面列举本发明优选地具体化合物m1-m10：
本发明的另一目的是提供所述小分子抑制剂的合成方法，其包括：将式3化合物中的氨基保护基r6脱除，其中的r6选自由如下基团构成的组：叔丁氧羰基、三氟乙酰基、苄氧羰基、笏甲氧羰基、烯丙氧羰基；在缩合剂的存在下，将上一步的产物与式4化合物进行缩合，得到式5；
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式3
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式4式5其中，u， r1，r2，r3与上述的选择范围一致，在此不再赘述。
24.式3化合物的合成可参考文献：linlin zhang, daizong lin, yuri kusov, etc., j. med. chem. 2020, 63, 4562-4578；式4化合物合成可参考文献：dawei ma, weiqing xie, bin zou, qiong lei and duanqing pei tetrahedron lett. 2004, 45, 8103-8105。
25.具体的，在有机溶剂中，使式3化合物与酸或碱在室温下反应2~8h，优选为4-6h，脱去氨基的保护基r6，并抽去有机溶剂；随后将得到的产物与式4化合物溶于非质子性溶剂中，加入缩合剂和有机碱，在室温下反应16~24h，优选为12-24h，得到式5化合物。
26.上述的酸为三氟乙酸或/和盐酸；碱为氢氧化钠或/和甲醇钠；有机溶剂为：ch2cl2、thf、dmf、二氧六环中的一种或几种；非质子性溶剂为：ch2cl2、thf、dmf、二氧六环、二甲亚砜、苯中的一种或几种；缩合剂为：hatu、hbtu、edci、hobt中的一种或几种；有机碱为：lda、三乙胺、diea中的一种或几种。
27.下面列举几个具体实施例：本发明挑选化合物m1的合成来对本发明的合成方法及应用进行详细说明，但不意味着限制本发明其余化合物的应用范围。
28.实施例1合成路线1
将200mg m1-2溶解于4ml dcm中，之后依次加入108
µ
l diea，269mg m1-1和299mg hatu，室温搅拌反应12h。反应完毕后，依次用1m hcl溶液、饱和nahco3溶液以及饱和nacl溶液洗涤，之后收集dcm相，加入无水硫酸钠干燥，之后硅胶柱纯化得276mg白色固体，即m1，产率62%。
29.如图1-图3所示，m1的相关数据为：1h nmr (600 mhz, dmso-d6) δ 8.21 (t, j = 6.2 hz, 1h), 8.09
ꢀ–ꢀ
8.04 (m, 1h), 7.92 (d, j = 9.0 hz, 1h), 7.51 (d, j = 6.0 hz, 1h), 7.43 (dd, j = 9.6, 6.0 hz, 1h), 7.32
ꢀ–ꢀ
7.20 (m, 5h), 6.56
ꢀ–ꢀ
6.55 (m, 1h), 5.79 (dd, j = 15.0, 6.0 hz, 1h), 4.55 (m, 1h), 4.33 (m, 1h), 4.28
ꢀ–ꢀ
4.24 (m, 1h), 4.23
ꢀ–ꢀ
4.16 (m, 2h), 3.91 (dd, j = 6.1, 3.2 hz, 1h), 3.15
ꢀ–ꢀ
3.11 (m, 1h), 3.02 (m, 1h), 2.46 (s, 3h), 2.26
ꢀ–ꢀ
2.21 (m, 1h), 2.18
ꢀ–ꢀ
2.12 (m, 1h), 1.98 (m, 2h), 1.57 (m, 2h), 1.44
ꢀ–ꢀ
1.36 (m, 3h), 1.30 (d, j = 7.1 hz, 2h), 1.24 (d, j = 3.1 hz, 1h), 0.86
ꢀ–ꢀ
0.78 (m, 12h). 13
c nmr (151 mhz, dmso) δ 172.23, 171.81, 171.72, 170.06, 159.05, 158.71, 138.64, 136.26, 128.84, 128.58, 128.45, 128.20, 127.48, 101.78, 66.40, 60.21, 56.07, 55.35, 51.00, 49.02, 38.70, 24.66, 23.09, 23.04, 21.77, 21.38, 18.44, 14.54, 12.28. esi-ms:calcd for c
34h47
n7o
8 [m+h]
+
:682.79,found 682.71。
[0030]
其中，m1-1的制备过程为：具体的，化合物5的制备：将1g氢氧化钠溶于10ml水中，加入5ml 1,4-二氧六环，在冰浴下冷却后，加入1g化合物1，然后加入1.8g (boc)2o，室温下搅拌12小时，用1m盐酸溶液调节ph4-5，之后用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去乙酸乙酯得1.7g油状物，即化合物2，产率95%，无需进一步纯化继续投料。将得到的1.7g化合物2溶于25ml dmf，加入2g无水碳酸钾，反应体系置于冰浴下冷却，然后加入1ml溴化苄，室温搅拌12小时，然后加入少量水，室温搅拌30分钟，将反应体系过滤，收集滤液，将体系用二氯甲烷稀释，水洗涤，收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发除去溶剂得2.1g油状物，即化合物3，产率90%，无需进一步
mg，即m3，产率62%。
[0040]
如图7-图9所示， m3的相关检测数据为：1h nmr (600 mhz, chloroform-d) δ 8.33 (d, j = 6.4 hz, 1h), 7.56 (t, j = 6.2 hz, 1h), 7.36
ꢀ–ꢀ
7.29 (m, 5h), 7.03 (d, j = 8.5 hz, 1h), 6.34 (s, 1h), 5.28 (m, 1h), 4.77 (p, j = 7.1 hz, 1h), 4.57 (m, 1h), 4.50 (d, j = 6.2 hz, 2h), 4.41 (dd, j = 9.1, 6.1 hz, 1h), 3.50 (s, 1h), 3.38 (td, j = 8.7, 6.2 hz, 2h), 2.57
ꢀ–ꢀ
2.47 (m, 2h), 2.45 (s, 3h), 2.08 (m, 2h), 2.04
ꢀ–ꢀ
1.97 (m, 3h), 1.93 (m, 2h), 1.75
ꢀ–ꢀ
1.71 (m, 3h), 1.69
ꢀ–ꢀ
1.58 (m, 3h), 1.55
ꢀ–ꢀ
1.47 (m, 3h), 0.92
ꢀ–ꢀ
0.89 (m, 6h), 0.85 (m, 6h)。 13
c nmr (151 mhz, dmso) δ 196.90, 178.47, 172.57, 171.72, 170.90, 161.33, 159.08, 158.59, 140.95, 138.93, 128.75, 127.76, 127.40, 101.77, 55.36, 51.36, 49.04, 42.53, 38.06, 34.14, 31.75, 29.48, 29.15, 28.47, 26.04, 24.52, 23.26, 23.23, 22.55, 22.29, 21.99, 18.54, 14.40, 12.29。 ms m/z= 722.86 [m+1]
+
，m/z=720.82[m-1]-。
[0041]
实施例4合成路线4将269mg m4-1溶解于5ml dcm中，依次加入273mg hatu、592
µ
l diea和182mg m1-2，搅拌过夜。反应完后依次用1m盐酸溶液、饱和nahco3溶液以及饱和氯化钠溶液洗涤，之后收集dcm相，加入无水硫酸钠干燥，之后旋干得到油状物，对其进行硅胶纯化得白色固体264 mg，即m4，产率61%。
[0042]
如图10-图12所示，m4的相关检测数据为：1h nmr (600 mhz, chloroform-d) δ 8.33 (d, j = 6.3 hz, 1h), 7.56 (t, j = 6.2 hz, 1h), 7.36
ꢀ–ꢀ
7.29 (m, 5h), 7.03 (d, j = 8.6 hz, 1h), 6.34 (d, j = 1.0 hz, 1h), 5.28 (m, 1h), 4.77 (p, j = 7.1 hz, 1h), 4.57 (m, 1h), 4.50 (d, j = 6.2 hz, 2h), 4.41 (dd, j = 9.1, 6.1 hz, 1h), 3.50 (s, 1h), 3.37 (dd, j = 8.7, 6.1 hz, 2h), 2.56
ꢀ–ꢀ
2.51 (m, 1h), 2.46
ꢀ–ꢀ
2.44 (m, 3h), 2.08 (m, 2h), 2.04
ꢀ–ꢀ
1.88 (m, 5h), 1.74 (m, 4h), 1.68
ꢀ–ꢀ
1.57 (m, 5h), 1.50 (d, j = 7.0 hz, 3h), 1.29 (d, j = 17.4 hz, 10h)。 13
c nmr (151 mhz, dmso) δ 196.90, 178.47, 172.57, 171.72, 170.90, 161.33, 159.08, 158.59, 140.95, 138.93, 128.75, 127.76, 127.40, 101.77, 55.36, 51.36, 49.04, 42.53, 38.06, 34.14, 31.75, 29.48, 29.15, 28.47, 26.04, 24.52, 23.26, 23.23, 22.55, 22.29, 21.99, 18.54, 14.40, 12.29。ms m/z= 722.82 [m+1]
+
，m/z=720.64[m-1]-。
[0043]
实施例5
(m, 10h), 6.59 (dd, j = 7.1, 1.1 hz, 1h), 5.07 (m, 1h), 4.33 (dd, j = 7.1, 2.5 hz, 1h), 4.31 (d, j = 6.6 hz, 1h), 4.29
ꢀ–ꢀ
4.17 (m, 2h), 3.07 (m, 1h), 2.47
ꢀ–ꢀ
2.47 (s, 3h), 2.37 (m, 1h), 2.14 (m, 1h), 1.99
ꢀ–ꢀ
1.85 (m, 2h), 1.64 (m, 3h), 1.43 (t, j = 7.4 hz, 1h), 1.39
ꢀ–ꢀ
1.34 (m, 1h), 1.25 (d, j = 14.0 hz, 2h), 0.89 (d, j = 6.6 hz, 1h), 0.88
ꢀ–ꢀ
0.79 (m, 7h), 0.76 (d, j = 6.6 hz, 1h), 0.64 (dd, j = 8.2, 6.8 hz, 3h)。 13
c nmr (151 mhz, dmso) δ 171.91, 171.74, 171.70, 171.55, 159.06, 158.64, 136.30, 128.82, 128.54, 101.77, 66.33, 60.20, 57.97, 57.51, 55.35, 54.08, 49.08, 42.32, 38.69, 31.37, 30.19, 21.20, 19.56, 19.29, 18.58, 18.54, 18.48, 18.38, 17.19, 14.53, 12.93, 12.28。ms m/z= 744.59 [m+1]
+
，m/z=742.76[m-1]-。
[0047]
实施例7合成路线7将249mg m7-1溶解于5ml dcm中，依次加入280mg hatu、609
µ
l diea和188mg m1-2，搅拌过夜。反应完后依次用1m盐酸溶液、饱和nahco3溶液以及饱和氯化钠溶液洗涤，之后收集dcm相，加入无水硫酸钠干燥，之后旋干得到油状物，对其进行硅胶纯化得白色固体258 mg，即m7，产率62%。
[0048]
如图19-图21所示，m7的相关检测数据为：1h nmr (600 mhz, dmso-d6) δ 8.61 (dt, j= 14.9, 6.1 hz, 1h), 8.53 (dd, j = 7.4, 1.5 hz, 1h), 7.99 (dd, j = 9.5, 7.8 hz, 1h), 7.87 (dq, j = 7.2, 1.4 hz,2h), 7.74 (dd, j = 8.8, 3.7 hz, 1h), 7.55
ꢀ–ꢀ
7.52 (m, 1h), 7.47 (t, j = 7.9 hz, 2h), 7.32
ꢀ–ꢀ
7.19 (m, 5h), 4.52 (td, j = 7.3, 2.8 hz, 1h), 4.35
ꢀ–ꢀ
4.07 (m, 4h), 3.18 (d, j = 5.2 hz, 1h), 3.12
ꢀ–ꢀ
3.06 (m, 1h), 3.03
ꢀ–ꢀ
2.97 (m, 1h), 2.25
ꢀ–ꢀ
2.13 (m, 2h), 2.12
ꢀ–ꢀ
1.99 (m, 3h), 1.97
ꢀ–ꢀ
1.87 (m, 2h), 1.57 (dq, j = 13.5, 6.7 hz, 1h), 1.43 (m, 3h), 1.32 (dd, j = 7.1, 2.3 hz, 3h), 0.91
ꢀ–ꢀ
0.76 (m, 12h)。 13
c nmr (151 mhz, dmso) δ 178.65, 172.73, 172.62, 172.56, 172.01, 171.67, 171.53, 159.06, 159.00, 101.73, 52.37, 51.29, 50.69, 49.20, 48.81, 41.05, 38.09, 32.65, 27.61, 24.77, 23.50, 21.66, 18.30, 18.27, 12.28。ms m/z= 677.67 [m+1]
+
，m/z=675.72[m-1]-。
[0049]
实施例8
cov-2 m
pro
的活性影响进行评价。该底物被m
pro
剪切后可产生edans荧光基团，edans的最大激发光为340 nm，最大发射波长为490 nm，通过测定荧光来检测m
pro
的活性。
[0057]
首先，进行sars-cov-2 m
pro
使用浓度的确定：s1：配制反应缓冲液：20 mm hepes，120 mm nacl，0.4 mm edta， 4 mm dtt ，20%甘油，ph=7.5；s2：配制底物溶液：将反应底物dabcyl-ktsavlqsgfrkme-edans用dmso稀释至终浓度为500 μm；s3：将纯化得到的sars-cov-2 m
pro
用透析管置换到上述s1得到的反应缓冲液中，并用反应缓冲液将其稀释至4 μm、2 μm、1 μm、0.5 μm、0.25 μm 、0.125 μm；s4：分别吸取100 μl上述所有浓度的sars-cov-2 m
pro
分别加入黑色96孔板中，两次独立实验，每次实验三个复孔，将96孔板置于恒温均匀仪中孵育30 min，温度设置为30℃；s5：孵育完成后，使用酶标仪测定荧光值，设定条件为激发波长340 nm、发射波长490 nm，保存数据作为背景值；s6：向96孔板中加入500 μm 冠状病毒主蛋白荧光底物2 μl，与步骤s4一致，设置两次独立实验，每次实验三次复孔，置于恒温均匀仪中孵育60 min，温度设置为30℃；s7：孵育完成后，使用酶标仪测定荧光值，设定条件为激发波长340 nm、发射波长490 nm，保存数据作为反应值。
[0058]
数据处理：实际反应值（
△
rfu）=反应值-背景值，将稀释的sars-cov-2 m
pro
浓度取以10为底的对数作为x轴，对应
△
rfu作为y轴，用graphpad prism 8处理数据，根据实验结果sars-cov-2 m
pro
使用浓度的确定为1 μm。
[0059]
然后进行m1-m10对sars-cov m
pro
抑制效果的测定：将纯化得到的sars-cov-2 m
pro
稀释至终浓度为2 μm，m1-m10用上述的缓冲液以4倍梯度稀释6个梯度，最高浓度为100 μm，阳性参照药物选用已经报道可以有效抑制sars-cov-2 m
pro
活性的gc376，用反应缓冲液稀释至100 μm；设立三个对照实验小组：药物组：分别吸取50 μlsars-cov-2 m
pro
（2 μm）和50 μl的待测药物（m1-m10中的任意一种）加入黑色96孔板中；阳性药物组：分别吸取50 μlsars-cov-2 m
pro
（2 μm）和50 μl gc376 (100 μm)加入黑色96孔板中；不加药对照组：分别吸取50 μl sars-cov-2 m
pro
（2 μm）和50 μl 反应缓冲液加入黑色96孔板中。
[0060]
采用与sars-cov-2 m
pro
使用浓度确定步骤的相同测定方法进行测定，数据处理：实际反应值=反应值-背景值，抑制率=(不加药物组的实际反应值-药物组的实际反应值)/不加药物组的实际反应值
×
100%。
[0061]
结果与分析：m1-m10对sars-cov-2 m
pro
的抑制活性如表1所示：表1 m1-m10对新型冠状病毒主蛋白酶测定的ic
50
由测试结果可以看出，m1-m10对sars-cov-2 m
pro
具有显著的抑制活性。
[0062]
综上，本发明提供了一种式1以及式2所示的新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂及其制备方法和应用。式1和式2所示化合物能够有效抑制sars-cov-2 m pro
活性，可以用来制备sars-cov-2 m
pro
抑制剂，阻断sars-cov-2 病毒在患者体内的复制和转录。本发明的化合物在制备sars-cov-2 m pro 抑制剂，抗sars-cov-2的药物中具有非常好的应用前景。
[0063]
本发明中所涉及的参考文献，包括专利文件、学术论文、出版物等，均以引用的方
式将其全部内容包括在本文中。
[0064]
应当注意，本发明中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，如果在文中没有特别说明，则本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
[0065]
本文中所涉及的各种实验用品（包括但不限于：化学试剂、生物制品、细胞、生物体、仪器等）之中，对于那些特殊的或者不宜获得的，文中均已注明了制造商、参考文献或详细的制备方法；未经特别说明的，均为常规实验用品，在本发明申请日之前，可以通过各种方式（例如购买、自行制备等）很方便地获得。应当理解，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以在形式和细节上对其做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。
技术特征：1.一种化合物、或其药学上可接受的盐，其特征在于：该化合物的结构通式如式1所示：式1其中，u为或；r1选自如下基团构成的组：c1~c6的烷基羰基或者环烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑基羰基、吡啶基羰基、三氟甲基羰基、、、、、、、、、、、；r2选自如下基团构成的组：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基、羟甲基、、；r3选自如下基团构成的组：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、羟基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基、、、、、、、、；r4选自如下基团构成的组：c1~c6的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基；r5选自如下基团构成的组：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、
氟代苯基、氟代苄基。2.根据权利要求1所述的一种化合物、或其药学上可接受的盐，其特征在于：r1为如下基团构成的组：、、、、；r2为甲基、异丙基、羟甲基、；r3为异丙基、叔丁基、环己基、苄基、苯基、羟基、对氟苄基、、、、、、、、、；r4为环己基、异丙基、苯基、氢原子；r5为异丁基、异丙基。3.根据权利要求1所述的一种化合物、或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述化合物的结构为以下结构之一，、、、、、
、、、、、、、、
、、、、、
、、。4.根据权利要求1所述的一种化合物、或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述化合物的结构如式2所示：式2其中，r1选自如下基团构成的组：c1~c6的烷基羰基或者环烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑基羰基、吡啶基羰基、三氟甲基羰基、、、、、、、、、、、；r2选自如下基团构成的组：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基、羟甲基、、；
r3选自如下基团构成的组：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、羟基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基、、、、、、、、；r4选自如下基团构成的组：c1~c6的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基；r5选自如下基团构成的组：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基。5.根据权利要求4所述的一种化合物、或其药学上可接受的盐，其特征在于：所述化合物的结构为以下结构之一，、、、、、
、、、、。6.一种制备如权利要求1所述的化合物、或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于：将式3化合物中的氨基保护基r6脱除，其中的r6选自由如下基团构成的组：叔丁氧羰基、三氟乙酰基、苄氧羰基、笏甲氧羰基、烯丙氧羰基；在缩合剂的存在下，将上一步的产物与式4化合物进行缩合，得到式5；
式3
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
式4式5其中，u为或；r1选自如下基团构成的组：c1~c6的烷基羰基或者环烷基羰基、叔丁氧羰基、苯甲酰基、异噁唑基羰基、呋喃基羰基、吡咯基羰基、噻吩基羰基、咪唑基羰基、吡唑基羰基、噻唑基羰基、吡啶基羰基、三氟甲基羰基、、、、、、、、、、、；r2选自如下基团构成的组：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基、羟甲基、、；r3选自如下基团构成的组：c1~c5的烷基或者环烷基、氢原子、苯基、苄基、羟基、对甲基苯基、氟代苯基、氟代苄基、、、、、、
、、。7.根据权利要求6所述的一种化合物、或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于：在有机溶剂中，使式3化合物与酸或碱在室温下反应2~8h，脱去氨基的保护基r6，并抽去所述有机溶剂；随后将得到的产物与式4化合物溶于非质子性溶剂中，加入所述缩合剂和有机碱，在室温下反应16~24h，得到式5化合物。8.根据权利要求7所述的一种化合物、或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于：所述酸为三氟乙酸或/和盐酸；所述碱为氢氧化钠或/和甲醇钠；所述有机溶剂为：ch2cl2、thf、dmf、二氧六环中的一种或几种；所述非质子性溶剂为：ch2cl2、thf、dmf、二氧六环、二甲亚砜、苯中的一种或几种；所述缩合剂为：hatu、hbtu、edci、hobt中的一种或几种；所述有机碱为：lda、三乙胺、diea中的一种或几种。9.一种如权利要求1-5任一所述的化合物、或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防冠状病毒感染的药物中的应用，其中，所述冠状病毒为新型冠状病毒sars-cov-2。10.一种如权利要求1-5任一所述的化合物、或其药学上可接受的盐在制备新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂中的应用。
技术总结本发明提供一种新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂及其制备方法和应用，具体提供一种化合物或其药学上可接受的盐。本发明的有益效果是本发明化合物能够显著抑制SARS-CoV-2主蛋白酶的活性，在制备用于治疗或者预防冠状病毒感染的药物方面具有良好的应用前景。的药物方面具有良好的应用前景。的药物方面具有良好的应用前景。
技术研发人员：蔡岩 王薇 步敏 刘洋 张月丽 赵佩佩 贺万丽
受保护的技术使用者：中国科学院武汉病毒研究所
技术研发日：2022.06.21
技术公布日：2022/11/1
