一种利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法

1.本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法。


背景技术：

2.黄姜(dioscorea zingiberensis c.h.wright)学名盾叶薯蓣，又称火头根，多年生缠绕草本植物，为我国特有的野生植物资源，主要分布于湖南、陕西、湖北、四川、贵州及云南等省。黄姜的根状茎含薯蓣皂苷等甾体皂苷类成分、45％左右的淀粉、40％的纤维素以及一些甾体苷类、生物碱类、黄酮苷类、强心苷类、单宁、色素等化学成分。黄姜是一种重要的药源植物，含有丰富的薯蓣皂苷元，也称皂素(以下均称皂素)。皂素是黄姜皂苷的配基，以薯蓣皂苷的形式存在于黄姜中。黄姜皂素可以合成甾体激素中间体、皮质激素、性激素、蛋白同化激素等产品为主的数百种国计民生特需的药物，被誉为“药用黄金”。甾体激素类药物已成为仅次于抗生素的第二大类化学药物。
3.盾叶薯蓣植物中的木质纤维素类、淀粉、蛋白质、果胶等成分对甾体皂苷具有一定的包裹作用，而甾体皂苷又通过c3位糖苷与其他组分相连。因而简单的酸水解方法收率低，很难将植物中的薯蓣皂素提取完全，仅能提取其中的1/4左右。
4.目前，黄姜皂素的生产仍采用基于marker和wall为代表的先萃取后水解和rothrok提出的先水解后萃取的分离方法(直接酸解工艺)。传统皂素生产工艺废水废渣排放量大，废水含酸高、色素浓，污染严重，治理难度大、成本高。黄姜加工企业多位于丹江口库区周边及南水北调中线工程的源头，污染废水的排放严重危及南水北调中线工程水源区水质安全。然而，若全面禁止黄姜皂素生产行业，势必造成百万姜农的利益受损，而且给下游甾体激素行业造成严重影响。我国在rothrok法的基础上，围绕提高皂素提取率、解决污染等问题，相继出现了淀粉物理分离法、酶解糖液分离法和醇浸膏法等清洁生产工艺，但是，这些工艺方法依然存在诸多不足，亟待解决黄姜皂素生产过程的皂素得率低和污染问题。
5.专利cn1515585a公开了一种环保无污染生产薯蓣皂素的方法，但其中过筛分离40％的纤维素部分会带走一些与纤维素结合的皂苷，从而降低了皂素的得率，且膜过滤在实际工业化过程中存在通量低、易堵塞等问题(它所采用的膜过滤，是直接用孔径很小的超滤膜过滤处理过筛的混合溶液，里面含有大量淀粉及其他大颗粒物质，极易堵塞)。专利cn1970785a公开了一种薯蓣皂素清洁生产及综合利用的方法，将黄姜原料粉碎后直接进行溶剂提取，与黄姜木质纤维素结构共价偶联的结合态皂苷无法获得，皂素得率存在提升空间，且未能将黄姜其他组分高值化利用。专利cn1821380a公开了一种处理黄姜的高效复合微生物菌群，其使用的微生物菌群涵盖细菌、霉菌、酵母菌等多种微生物，但真菌生长时间较长，且细菌与真菌在生长过程中存在拮抗现象，大多数微生物在对黄姜木质纤维素处理过程中，存在分阶段生长的情况，与自然发酵过程一样存在不可控性，且一些微生物可能会对皂苷元母核产生降解与转化作用，从而降低皂素得率。专利cn103060416a公开了一种利
用微生物技术清洁生产黄姜皂素的方法，其使用单一微生物结合蒸汽爆破处理黄姜干粉或鲜料的方法获得了较好的收率，且大幅度降低了酸、水及有机溶剂的用量，但依然存在需要改进的地方：单一微生物处理黄姜的能力有限，需要结合蒸汽爆破等手段对黄姜进行预处理，蒸汽爆破等过程有噪音、能耗较高，且单批次处理容量较小，同时会产生一些有害分解物，另外在生产皂素的过程中依然使用了少量酸，不能做到全过程的绿色生产。专利cn106834407b公开了一种生物法绿色生产黄姜皂素的方法，其使用多种微生物混合处理黄姜材料，有效地促进皂苷的释放，并用微生物处理的方法完全替代化学酸水解，皂素收率较高，实现皂素的绿色制造，且水、有机溶剂用量大幅下降，但依然存在需要改进的地方：晒干黄姜和新鲜黄姜中所含水溶性和脂溶性皂苷的比例有很大不同，用同一种工艺会造成成本投入过大而收益较低，其处理过程需要用大量的有机溶剂萃取纤维渣中残留的少量皂苷，会损耗较多有机溶剂，增加成本，另外，皂苷的膜浓缩液中含有较多的纤维素类大分子物质，会抑制微生物对皂苷的生物转化，进而降低皂素得率，同时每批次皂苷浓缩液中抑制物的多少会影响皂苷的转化率，使得皂素收率不稳定，因此，依然存在需要改进的地方。
6.以最低的成本采用不同或者通用工艺技术处理皂苷组成不同的黄姜，最大限度提高黄姜皂素得率，并保障每批次产品的稳定，同时摒弃传统酸水解法，大幅减少有机溶剂用量，从而大幅降低黄姜皂素生产成本和污染程度成为核心问题，迫切需要通过科技创新，研发新的绿色生产工艺并进行工业化应用。


技术实现要素：

7.针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明的目的在于提供一种利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，其中通过对整体工艺流程设计进行改进，采用系列微生物菌群，包括能够分泌木质纤维素降解酶系、糖基转移酶且能分泌表面活性物质的高效微生物菌群a以及能够分泌糖苷酶的微生物菌b，分别进行促皂苷释放、皂苷富集以及皂苷转化，可有效解决黄姜皂素生产过程中黄姜皂苷释放率低、黄姜皂素得率低、能耗高、污染严重、资源利用不充分等突出问题，大幅降低了皂素生产成本，提高了皂素市场竞争力。本发明利用微生物菌群a和微生物菌b，通过生物方法绿色且高收率的生产黄姜皂素，完全不用酸，皂素得率为传统酸解工艺的1.3～1.6倍，且有机溶剂用量少，污染小，资源充分利用，易于产业化放大，在皂素产业极具推广价值。
8.为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
9.(1)黄姜预发酵处理：以黄姜鲜姜为原料，按照黄姜鲜姜与水的质量比为1:1～1:3粉碎匀浆制成均匀浆液；接着，直接在浆液中接种5～20vol％能够分泌木质纤维素降解酶系、糖基转移酶以及表面活性物质的微生物菌群a，发酵培养2～8小时，得到相应的发酵液；
10.(2)双酶处理：将步骤(1)得到的发酵液升温到90～100℃，保温20～40分钟，使淀粉彻底糊化，之后调节ph至5.0～8.0，再加入高温淀粉酶使淀粉液化；
11.或者，将步骤(1)得到的发酵液升温到90～100℃，保温20～40分钟，使淀粉彻底糊化，然后将温度降至60～80℃后，再调节ph至5.5～7.5，加入中温淀粉酶使淀粉液化；
12.接着，在淀粉液化完全后，将温度控制为50～65℃，调节ph至4.0～5.0，再加入糖化酶处理3～5小时，使淀粉完全转化为葡萄糖，得到糖化醪；
13.(3)过滤分离皂苷：将步骤(2)得到的糖化醪，用板框压榨过滤一次，得到第一次滤液和滤饼；接着，重复板框压滤至少1次，具体是按每1g滤饼对应1～3ml水的对应关系，向滤饼中加入水浸泡混匀，进行再次板框压滤，得到滤饼和滤液；然后将重复板框压滤得到的滤液与第一次滤液合并，即可得到含皂苷黄姜糖化液；
14.(4)浓缩富集皂苷：将步骤(3)所得的含皂苷黄姜糖化液经三级膜过滤获得截留液和透过液，所述截留液为皂苷浓缩液，所述透过液为黄姜糖液；接着，将皂苷浓缩液用离心机分离得到上清皂苷溶液和含皂苷沉淀；
15.然后，将含皂苷沉淀用40～90vol％乙醇溶液萃取3～5次后，合并萃取液，分离乙醇得到皂苷浸膏；
16.(5)配制皂苷转化培养基：对步骤(4)获得的上清皂苷溶液或皂苷浸膏进行稀释，使总皂苷浓度不超过300g/l；接着，向其中加入其它培养基成分，制成皂苷转化培养基；
17.或者，将步骤(4)获得的上清皂苷溶液和皂苷浸膏混合后稀释，使总皂苷浓度不超过300g/l，接着，向其中加入其它培养基成分，制成皂苷转化培养基；
18.(6)皂苷生物转化：将步骤(5)中的皂苷转化培养基，灭菌冷却后，加入0.05～0.1vol％tween 80，接种5～20vol％能够分泌多种具有不同功能的糖苷酶的微生物菌b，然后进行发酵转化；发酵完成后，将发酵产物经过离心过滤即可得到含皂素沉淀；其中，所述微生物菌b能够分泌多种具有不同功能的糖苷酶，这些糖苷酶能够水解不同皂苷；
19.(7)皂素产品制备：将步骤(6)得到的含皂素沉淀，进行晾晒或烘干，再经有机溶剂提取精制即可得到皂素产品。
20.按照本发明的另一方面，本发明提供了一种利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
21.(1)黄姜预发酵处理：以晒干黄姜为原料，按照干姜与水的质量比为1:3～1:10粉碎匀浆制成均匀浆液；接着，直接在浆液中接种5～20vol％能够分泌木质纤维素降解酶系、糖基转移酶以及表面活性物质的微生物菌群a，发酵培养2～8小时，得到相应的发酵液；
22.(2)双酶处理：将步骤(1)得到的发酵液升温到90～100℃，保温20～40分钟，使淀粉彻底糊化，之后调节ph至5.0～8.0，再加入高温淀粉酶使淀粉液化；
23.或者，将步骤(1)得到的发酵液升温到90～100℃，保温20～40分钟，使淀粉彻底糊化，然后将温度降至60～80℃后，再调节ph至5.5～7.5，加入中温淀粉酶使淀粉液化；
24.接着，在淀粉液化完全后，将温度控制为50～65℃，调节ph至4.0～5.0，再加入糖化酶处理3～5小时，使淀粉完全转化为葡萄糖，得到糖化醪；
25.(3)过滤分离皂苷：将步骤(2)得到的糖化醪，用板框压榨过滤一次，得到第一次滤液和滤饼；接着，重复板框压滤至少1次，具体是按每1g滤饼对应1～3ml水的对应关系，向滤饼中加入水浸泡混匀，进行再次板框压滤，得到滤饼和滤液；然后将重复板框压滤得到的滤液与第一次滤液合并，即可得到含皂苷黄姜糖化液；
26.(4)浓缩富集皂苷：向步骤(3)得到的含皂苷黄姜糖化液中加入纤维素酶和木聚糖酶，且每种酶在体系中的最终比活力为100～300u/g黄姜干重，40～60℃恒温处理12～60小时，离心得黄姜糖液和含皂苷沉淀；
27.然后，将含皂苷沉淀用40～90vol％乙醇溶液萃取3～5次后，合并萃取液，分离乙醇得到皂苷浸膏；
28.(5)配制皂苷转化培养基：对步骤(4)获得的皂苷浸膏进行稀释，使总皂苷浓度不超过300g/l；接着，向其中加入其它培养基成分，制成皂苷转化培养基；
29.(6)皂苷生物转化：将步骤(5)中的皂苷转化培养基，灭菌冷却后，加入0.05～0.1vol％tween 80，接种5～20vol％能够分泌多种具有不同功能的糖苷酶的微生物菌b，然后进行发酵转化；发酵完成后，将发酵产物经过离心过滤即可得到含皂素沉淀；其中，所述微生物菌b能够分泌多种具有不同功能的糖苷酶，这些糖苷酶能够水解不同皂苷；
30.(7)皂素产品制备：将步骤(6)得到的含皂素沉淀，进行晾晒或烘干，再经有机溶剂提取精制即可得到皂素产品。
31.作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中，所述表面活性物质包括表面活性素或地衣素；所述发酵培养是在30～40℃，转速为100～300r/min，通气量为0.1～1vvm条件下培养2～8h。
32.作为本发明的进一步优选，所述步骤(1)中，所述微生物菌群a包括bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena这四种菌；
33.其中，bacillus sp.保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc m 2016791；bacillus licheniformis保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc m 2010113。
34.作为本发明的进一步优选，所述微生物菌群a的菌液是按包括以下步骤的制备方法制备得到的：
35.(i)分别取菌株bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacteriumcarotovorum和cellulomonas flavigena的单菌落接种于lb培养基中，在30～40℃，100～300r/min条件下培养8～16h，分别获得bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的一级种子；
36.(ii)分别将步骤(i)获得的bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的一级种子按1～5vol％的接种量接入lb培养基中，在30～40℃，100～300r/min，通气量0.1～1vvm条件下培养2～8h，分别获得bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的二级种子液；
37.(iii)分别将步骤(ii)获得的bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的二级种子液按1～5vol％的接种量接入细菌培养基中，在通气量0.1～1vvm，搅拌转速100～300r/min，温度30～40℃下，培养2～8h，分别获得bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的三级种子；
38.(iv)将步骤(iii)获得的bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的三级种子按预先设定的体积比例混合制成微生物菌群a的菌液；优选的，所述预先设定的体积比例具体为体积等比例；
39.优选的，所述步骤(iii)中，所述细菌培养基为廉价细菌培养基，其配方如下：黄豆饼粉1～5g/l，蛋白胨2～5g/l，酵母粉1～2.5g/l，氯化钠5～12g/l，消泡剂0.05～0.1vol％。
40.作为本发明的进一步优选，所述步骤(6)中，所述微生物菌b具体为aspergillus tubingensis，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc m2016389。
41.作为本发明的进一步优选，所述微生物菌b的菌液是按包括以下步骤的制备方法制备得到的：
42.(s1)取斜面保藏菌株aspergillus tubingensis接种于真菌培养基中，在25～30℃，100～300r/min，通气量0.1～1vvm条件下培养10～18h，获得aspergillus tubingensis的一级种子；
43.(s2)将步骤(s1)获得的aspergillus tubingensis的一级种子按接种量1～5vol％接入真菌培养基中，在25～30℃，100～300r/min，通气量0.1～1vvm条件下培养16～32h，获得aspergillus tubingensis的二级种子；
44.(s3)将步骤(s2)获得的aspergillus tubingensis的二级种子按接种量1～5vol％接入真菌诱导培养基中，在30～40℃，100～300r/min，通气量0.1～1vvm条件下培养16～32h，获得aspergillus tubingensis的三级种子；
45.优选的，所述步骤(s1)和所述步骤(s2)中，所述真菌培养基的配方如下：蛋白胨5～10g/l，酵母粉2～5g/l，葡萄糖5～10g/l；
46.所述步骤(s3)中，所述真菌诱导培养基为廉价真菌诱导培养基，其配方如下：黄豆饼粉1～5g/l，酵母粉2～5g/l，黄姜总皂苷醇提物2～30g/l；其中，所述黄姜总皂苷醇提物优选按如下制备方法获得：取烘干后的黄姜，打粉，每1000g黄姜干粉加入3l 70vol％乙醇，搅拌和超声辅助萃取30分钟，离心后，取上清；沉淀继续加入3l 70vol％乙醇，重复上述操作2次及以上；合并上清，分离乙醇后，将浸膏冷冻干燥，得黄姜总皂苷醇提物。
47.作为本发明的进一步优选，所述步骤(5)中，所述其它培养基成分包括无机盐和氮源；优选包括：氯化钠0.5～2g/l、硝酸钾0.5～2g/l、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l；
48.或者，优选包括：氯化钠0.5～2g/l、黄豆饼粉1～5g/l、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l。
49.作为本发明的进一步优选，所述步骤(6)中，所述发酵转化是在30～40℃，转速为100～300r/min，通气量为0.1～1vvm的条件下培养24～144h；
50.其中，对于某一皂苷转化培养基：
51.当所述皂苷转化培养基使用上清皂苷溶液、不使用皂苷浸膏配制时，所述发酵转化的时间为24～48h；
52.当所述皂苷转化培养基使用皂苷浸膏、不使用上清皂苷溶液配制时，所述发酵转化的时间为96～144h；
53.当所述皂苷转化培养基同时使用上清皂苷溶液和皂苷浸膏配制时，所述发酵转化的时间为96～144h。
54.作为本发明的进一步优选，所述步骤(7)中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、汽油、石油醚、氯仿。
55.通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，能够取得以下有益效果：
56.1、本发明根据黄姜采收与储藏过程中总皂苷等有效成分的变化，以及微生物对不同类型皂苷的转化效果，将皂素的生产工艺分为鲜姜工艺和干姜工艺，以达到皂素高收率
且高效生产效果。
57.2、此外，在双酶处理阶段，本发明提供了两种方案(即，高温淀粉酶+糖化酶，或，中温淀粉酶+糖化酶)，在实际应用时，可结合现有的双酶市场，根据不同设备、技术、成本等要求采用不同方法。
58.3、本发明采用能够分泌木质纤维素降解酶系、糖基转移酶以及表面活性物质的微生物菌群a预处理黄姜原料，使木质纤维素结构松散，有效断开糖苷键，释放被束缚的皂苷，使存在于黄姜组织细胞中被木质纤维素、果胶、淀粉等包裹的皂苷充分游离；再通过转糖基作用及表面活性物质使得游离皂苷在水中的溶解性增加，使得存在于固形物中少量皂苷溶于水相中。
59.单一菌株的纤维素类酶系不全，且酶活很低，由于半纤维素、木质素的包裹，导致微生物未能接触到纤维素，因此几乎不分泌纤维素酶；单一菌株分泌的木聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶酶活水平很低，影响整体降解作用，发酵促进黄姜皂苷游离的效果很有限。而本发明的微生物菌群a为能够分泌木质纤维素降解酶系、糖基转移酶以及表面活性物质的混合微生物菌群，酶活力很高，能够分工合作，既避免了不同种微生物对有限底物的竞争作用，又提高了不同底物的降解效率，同时分泌高酶活性的各种酶，各种酶之间的协同作用更明显，快速释放被包裹及共价结合的黄姜皂苷。本发明中的微生物菌群a可优选采用bacillus sp.(更优选采用保藏号cctcc m 2016791所对应的bacillus sp.)、bacillus licheniformis(更优选采用保藏号cctcc m 2010113所对应的bacillus licheniformis)、pectobacterium carotovorum(无限定)和cellulomonas flavigena(无限定)这四种，其中，bacillus sp.能够产生淀粉酶、糖基转移酶和脂肽类生物表面活性剂，bacillus licheniformis能够产生淀粉酶、蛋白酶，pectobacteriumcarotovorum能够产生果胶酶，cellulomonas flavigena能够产生纤维素酶，这些菌的活动可以高效的破坏黄姜组织结构，使黄姜皂苷充分释放、游离到水相中。
60.4、通过微生物菌群a等处理和多次板框压滤(如水浸泡后再次板框过滤)，黄姜纤维渣中所含皂苷量可以忽略不计，低于黄姜中总皂苷的2％，无需进行有机溶剂萃取黄姜纤维渣中的皂苷，避免了有机溶剂的大量使用和损耗，大幅节约了生产成本，且黄姜纤维渣烘干后，可直接作为生物活性炭、板材、有机肥料等的原料。
61.5、黄姜皂苷的膜浓缩液中含有25～40％的固形物，固形物干物质中40～65％为纤维素类大分子物质，能有效抑制皂苷的生物转化。通过40～90％乙醇多次萃取可以有效去除其中的抑制物。相较于直接在黄姜或者黄姜纤维渣中用有机溶剂萃取皂苷，对黄姜皂苷的膜浓缩液沉淀进行有机溶剂萃取既避免了有机溶剂的大量使用和损耗，又能大幅节约生产成本，同时解除了大分子物质对皂苷生物转化的抑制，提高了皂苷的转化效率和皂素收率。此外，本发明方法中的膜分离，是采用三级膜处理，即孔径不同的三种膜过滤分离，能够有效解决单个孔径膜处理的通量低、易堵塞问题。
62.6、本发明所得上清皂苷溶液和皂苷浸膏，可分别进一步提取纯化，得到水溶性皂苷和脂溶性皂苷，用于制备各类皂苷产品及药物，如不同种类皂苷标品、薯蓣皂苷片等。
63.7、采用能够分泌系列高活性糖苷酶的微生物菌b，直接在水相皂苷或者皂苷混合液配制的转化培养基中转化总皂苷生产皂素，所得的皂素产品纯度高、得率高，且相较于酸解工艺无副产物生成。本发明中的微生物菌b可优选采用aspergillus tubingensis(保藏
号cctcc m2016389)，它能够以黄姜皂苷为碳源进行生长繁殖，并生产各种能够充分水解不同黄姜皂苷的糖苷酶，对水相皂苷和非水相皂苷都有很好的水解能力，并且不会降解皂苷元，使得皂苷元可以积累。皂苷转化培养基尤其可优选采用包括：氯化钠0.5～2g/l、硝酸钾0.5～2g/l(或黄豆饼粉1～5g/l)、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l、0.05～0.1vol％的tween 80的配方，能够为aspergillus tubingensis的生长繁殖提供必需的生长因子、氮源、无机盐，例如，镁离子可以有效提高aspergillus tubingensis所生产糖苷酶的活性，培养基灭菌后接种前添加tween 80可以有效提高非水相皂苷在水中的溶解度，提高酶促反应效率。
64.8、本发明的一种利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，整个工艺绿色环保，适应性强，无污染，成本低，可生产多种产品，产品附加值高，产业化前景广阔。
65.综上，本发明通过分阶段投入不同微生物单菌株或菌群和酶处理黄姜材料，使木质纤维素结构松散，有效断开糖苷键，使得结合态黄姜皂苷释放，再通过糖基转移酶作用将游离的还原糖连接到皂苷上，使其在水中的溶解性增加，同时由菌株分泌的生物表面活性物质使得游离的水不溶皂苷溶于水相；固形物中的皂苷游离程度高，残留量低；获得的水相皂苷和去除抑制物的非水相皂苷采用微生物菌株所产的高效糖苷酶将其全部转化为皂素，完全替代酸解。
66.本发明的方法与直接酸解法相比，完全不用酸，无废水排放，黄姜资源可以得到充分利用，且相较于传统酸解法，皂素得率能够提高31.3～58.7％。此外，新工艺已将水溶性皂苷和脂溶性皂苷分开富集，也可以将脂溶性皂苷直接进行酸水解处理，此时无需消耗大量强酸、成本低，且污染易处理。本发明的方法与专利cn106834407b相比，具有更宽的适应性，且皂苷转化更高效，解决了抑制物的影响和皂素得率不稳定的问题，同时可以高效利用水相皂苷，生产皂素和皂苷产品。
附图说明
67.图1是基于本发明的新鲜黄姜微生物法绿色生产黄姜皂素的工艺流程图。
68.图2是基于本发明的晒干黄姜微生物法绿色生产黄姜皂素的工艺流程图。
具体实施方式
69.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
70.基于本发明，以黄姜鲜姜为原料为例，如图1所示，利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，可包括如下步骤：
71.(1)黄姜材料的预处理
72.取新鲜黄姜适量，洗去泥土并去须，按照黄姜鲜重和水比例1:1～1:3(w/w)粉碎匀浆配制成黄姜浆液。
73.(2)微生物菌群制备
74.微生物菌群a的制备方法包括如下步骤：
75.1)取菌株bacillus sp.的单菌落接种于100ml lb培养基的250ml摇瓶中，在30～40℃，100～300r/min条件下培养8～16h，获得bacillus sp.的一级种子；
76.2)将bacillus sp.的一级种子接入装有lb培养基的10l种子罐中，接种量1vol％，罐温30～40℃，100～300r/min，通气量0.1～1vvm条件下培养2～8h，获得bacillus sp.的二级种子；
77.3)将bacillus sp.的二级种子接入装有廉价细菌培养基的1m3发酵罐中，通气量0.1～1vvm，搅拌转速100～300r/min，罐温30～40℃，培养2～8h，获得bacillus sp.的三级种子；
78.采用如上同样的方法分别获得bacillus licheniformis、pectobacteriumcarotovorum和cellulomonas flavigena的三级种子。
79.4)将bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的三级种子按照等比例混合制成微生物菌群a。
80.所述廉价细菌培养基配方如下：黄豆饼粉1～5g/l，蛋白胨2～5g/l，酵母粉1～2.5g/l，氯化钠5～12g/l，消泡剂0.05～0.1vol％；
81.微生物菌b的制备方法包括如下步骤：
82.1)取斜面保藏菌株aspergillus tubingensis的孢子液接种于100ml真菌培养基的250ml摇瓶中，在25～30℃，100～300r/min条件下培养10～18h，获得aspergillus tubingensis的一级种子；
83.2)将aspergillus tubingensis的一级种子接入装有真菌培养基的7l种子罐中，接种量1～5vol％，罐温25～30℃，100～300r/min，通气量0.1～1vvm条件下培养16～32h，获得aspergillus tubingensis的二级种子；
84.3)将aspergillus tubingensis的二级种子接入装有廉价真菌诱导培养基的1m3发酵罐中，接种量1～5vol％，通气量0.1～1vvm，搅拌转速100～300r/min，罐温30～40℃，培养16～32h，离心后，获得aspergillus tubingensis的三级种子。
85.(3)微生物发酵促进皂苷游离
86.在步骤(1)所得到的黄姜浆液中接种5～20vol％的微生物菌群a，在30～40℃，转速为100～300r/min，通气量为0.1～1vvm条件下发酵培养2～8h，得到相应的发酵液。
87.(4)双酶处理
88.将步骤(3)所得到的发酵液升温到90～100℃，保温20～40分钟，使淀粉彻底糊化。再按黄姜浆液体积加入高温α-淀粉酶，使酶活单位在300u/ml及以上，在ph 6.2、95℃条件下液化20min(当然，ph值、温度条件，也可以参照现有技术中的其它高温淀粉酶设置值进行设定)；再按黄姜浆液体积加入糖化酶，使酶活单位在300u/ml及以上，在ph 4.2、温度60℃条件下糖化3～6h，使淀粉完全转化为葡萄糖，得到糖化醪。
89.当然，除了高温淀粉酶外，也可以采用中温淀粉酶(此时，ph值、温度条件，也可以参照现有技术已知的中温淀粉酶设置值进行设定)，配合后续的糖化酶处理，同样可以得到糖化醪。
90.(5)过滤分离皂苷
91.将步骤(4)得到的糖化醪，用板框压榨过滤一次，得到滤液和滤饼。之后，按质量体积比1:1～1:3，向滤饼中加入水浸泡混匀，进行二次板框压滤，得到第二次滤饼和滤液，之
后合并两次滤液，即为含皂苷黄姜糖化液(含固形物)，所述滤饼为黄姜纤维渣。
92.(6)浓缩富集皂苷
93.将步骤(5)所得的黄姜含皂苷糖化液先后通过微滤、超滤和纳滤得到截留液(含固形物)和透过液。所述截留液为皂苷浓缩液，透过液为黄姜淀粉糖化液。对所述截留液进行离心得到上清皂苷溶液和含皂苷沉淀。含皂苷沉淀用40～90vol％乙醇溶液萃取3～5次后，合并萃取液，并回收乙醇，得皂苷浸膏。
94.(7)制备皂苷转化培养基
95.将步骤(6)获得的上清皂苷溶液和皂苷浸膏混合，使总皂苷浓度不超过300g/l，然后添加无机盐等常规培养基成分制成皂苷转化培养基，例如可包括：氯化钠0.5～2g/l、硝酸钾0.5～2g/l、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l。
96.或包括：氯化钠0.5～2g/l、黄豆饼粉1～5g/l、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l。
97.(8)皂苷生物转化
98.将步骤(7)所得到的皂苷转化培养基，灭菌冷却后，加入0.05～0.1vol％tween 80，接种体积比为5～20vol％能够分泌多种具有不同功能的糖苷酶的微生物菌b，发酵培养转化2～6天，得到相应的发酵产物，然后，经过离心过滤得到含皂素沉淀。
99.(9)皂素产品的制备
100.可以将步骤(8)所得到的沉淀，干燥后再以无水乙醇提取4h，回收有机溶剂循环利用，提取物结晶干燥后得到白色黄姜皂素产品。
101.步骤(3)中微生物菌群a的接种量优选范围为5～20vol％，微生物菌群a逐渐增加有助于提高其工作效率，菌群a分泌的酶在预处理反应时间内使得皂苷游离溶解于水相；考虑到微生物菌群a的加入量过大时，会导致游离的皂苷上面的糖基进一步降解从而使得皂苷溶解性下降而沉淀，影响皂苷的溶解性，因此将接种比例控制为5～20vol％。
102.步骤(4)所用高温淀粉酶、糖化酶等，包括后文中使用的纤维素酶、木聚糖酶，不做限定，现有技术中已知的同一类型、有相同功能的酶均可参与。本发明中采用的这些酶均为现有商品，后文实施例中所用高温α-淀粉酶、糖化酶购于苏柯汉生物，纤维素酶、木聚糖酶购于阿拉丁。
103.步骤(5)所得滤饼为黄姜纤维渣，烘干后，可直接作为生物活性炭、板材、有机肥料等的原料。
104.步骤(6)所得黄姜糖液，葡萄糖浓度在5～9g/l，可以当做水循环利用至少10次，且其糖浓度对双酶处理过程中淀粉酶和糖化酶的活性无明显抑制现象，对皂苷的释放也无影响。
105.步骤(6)所得上清皂苷溶液和皂苷浸膏，可分别进一步提取纯化，得到水溶性皂苷和脂溶性皂苷，用于制备各类皂苷产品及药物，如不同种类皂苷标品、薯蓣皂苷片等。其中，皂苷浸膏主要为非水相的脂溶性皂苷，生物转化效率偏低，也可以采用传统酸解工艺处理这一部分皂苷，强酸用量少，废水量少，且废水cod、bod很低，易于处理，成本低。
106.步骤(8)中微生物菌b的优选范围为5～20vol％，微生物菌b逐渐增加有助于提高其工作效率，大幅缩短菌b的调整期，加快产酶；考虑到进一步提高其加入量则对皂苷转化效率没有显著提高，并且会增加成本，因此将接种比例控制为5～20vol％。
107.步骤(8)所得发酵废液可以循环利用至少10次，且无需添加无机盐。每次循环使用均需补充水，且循环使用10次以上需添加少量氮源，如黄豆饼粉、硝酸钾等。
108.单一菌株的纤维素类酶系不全，且酶活很低，由于半纤维素、木质素的包裹，导致微生物未能接触到纤维素，因此几乎不分泌纤维素酶；单一菌株分泌的木聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶酶活水平很低，影响整体降解作用，发酵促进黄姜皂苷游离的效果很有限。而本发明的微生物菌群a为能够分泌木质纤维素降解酶系、糖基转移酶以及表面活性物质的混合微生物菌群，能够分工合作，既避免了不同种微生物对有限底物的竞争作用，又提高了不同底物的降解效率，同时分泌高酶活性的各种酶，各种酶之间的协同作用更明显，快速释放被包裹及共价结合的黄姜皂苷。本发明的微生物菌b能够分泌多种高活性糖苷酶，这些丰富的糖苷酶酶系相互协同配合，同时又不需要严苛的环境和培养条件，只需要去除抑制物，就可以保证对皂苷的高效率、低成本转化。
109.本发明通过分阶段投入不同微生物单菌株或菌群和酶处理黄姜材料，使木质纤维素结构松散，有效断开糖苷键，使得结合态黄姜皂苷释放，再通过糖基转移酶作用将游离的还原糖连接到皂苷上，使其在水中的溶解性增加，同时由菌株分泌的生物表面活性物质使得游离的水不溶皂苷溶于水相；固形物中的皂苷游离程度高，残留量低；获得的水相皂苷和去除抑制物的非水相皂苷采用微生物菌株所产的高效糖苷酶将其全部转化为皂素，完全替代酸解。本发明黄姜皂素收率高，整个生产过程完全不用酸，有机溶剂用量少，无废水排放，废渣量少，产品多样化，黄姜资源可利用度高，且多工艺处理适用于所有含皂苷类新鲜和晒干植物。
110.所述微生物菌群a包括但不仅限于bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena；所述微生物菌b为aspergillus tubingensis。
111.所述bacillus sp.其于2016年12月30日保藏于中国武汉，中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc m 2016791。
112.所述bacillus licheniformis其于2010年5月12日保藏于中国武汉，中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc m 2010113。
113.所述pectobacterium carotovorum没有特定的菌株限定。
114.所述cellulomonas flavigena没有特定的菌株限定。
115.所述aspergillus tubingensis，其于2016年7月11日保藏于中国武汉，中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctcc m2016389。
116.另外，因黄姜皂素生产企业生产皂素具有季节性变化特点，只在黄姜采收期间才开始大规模生产皂素，因此企业收购黄姜多为鲜姜，部分因存储原因为晒干黄姜，因此，后文实施例将分别以鲜姜和干姜为例，对本发明方法进行详细说明(以干姜为原料时，基于本发明方法的流程示意图如图2所示)。
117.以下为具体实施例(其中，实施例1－3是以新鲜黄姜为原材料，实施例4－5是以晒干黄姜为原材料)：
118.实施例1
119.一种利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，包括如下步骤：
120.(1)黄姜材料的预处理
121.取新鲜黄姜8850kg，洗去泥土去须，按照黄姜鲜重和水比例1:1(w/w)粉碎匀浆配制成黄姜浆液。该黄姜浆液不需要灭菌处理，且均匀浆液中无需额外添加无机盐、氮源、碳源、生长因子及其它物质(也就是说，均匀浆液无需额外添加营养元素或处理)。
122.(2)微生物菌群制备
123.微生物菌群a的制备方法为：
124.取菌株bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的单菌落分别接种于装有100ml lb培养基的250ml摇瓶，每个菌株各1瓶，在30℃，100r/min条件下培养12h，获得一级种子。
125.将一级种子分别接入装有8l lb培养基的10l种子罐中，罐温37℃，100r/min，通气量0.1vvm条件下培养6h，获得二级种子。
126.将二级种子分别接入装有800l廉价细菌培养基的1m3发酵罐中，罐温37℃，200r/min，通气量0.1vvm条件下培养6h，获得三级种子。
127.将上述获得的bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacteriumcarotovorum和cellulomonas flavigena的三级种子按照等比例混合菌液制成微生物菌群a。
128.所述廉价细菌培养基配方如下：黄豆饼粉1～5g/l，蛋白胨2～5g/l，酵母粉1～2.5g/l，氯化钠5～12g/l，消泡剂0.05～0.1vol％。
129.微生物菌群b的制备方法为：
130.取斜面保藏菌株aspergillus tubingensis接种于装有100ml真菌培养基的250ml摇瓶，接种1瓶，在28℃，100r/min条件下培养18h，获得一级种子。
131.将一级种子接入装有4l真菌培养基的7l种子罐中，罐温28℃，200r/min，通气量0.2vvm条件下培养24h，获得二级种子。
132.将二级种子接入装有400l廉价真菌诱导培养基的1m3发酵罐中，罐温37℃，200r/min，通气量0.2vvm条件下培养24h，获得三级种子。
133.(3)微生物发酵促进皂苷游离
134.在步骤(1)所得到的黄姜浆液中接种微生物菌群a，在37℃，转速为200r/min，通气为0.1vvm条件下发酵培养8h，得到相应的发酵液。
135.(4)双酶处理
136.将步骤(3)所得到的发酵液升温到90～100℃，保温20～40分钟，使淀粉彻底糊化，之后调节ph至6.2，再加入高温淀粉酶，使酶活单位在300u/ml及以上，在ph 6.2、95℃条件下液化20min；再按黄姜浆液体积加入糖化酶，使酶活单位在300u/ml及以上，在ph 4.2、温度60℃条件下糖化6h，使淀粉完全转化为葡萄糖，得到糖化醪。
137.(5)过滤分离皂苷
138.将步骤(4)得到的糖化醪，用板框压榨过滤一次，得到滤液和滤饼。按质量体积比1:1，向滤饼中加入水浸泡混匀，再进行第二次板框压滤，之后合并滤液，所述滤液为含皂苷黄姜糖化液(含固形物)，滤饼为黄姜纤维渣。
139.另外，本步骤中，重复板框压滤的次数还可以更多，滤液同样合并，此过程均无有机溶剂使用。
140.(6)浓缩富集皂苷
141.将步骤(5)所得的黄姜含皂苷糖化液先后通过微滤、超滤和纳滤得到截留液(含固形物)和透过液。所述截留液为皂苷浓缩液，透过液为黄姜淀粉糖化液。对所述截留液进行离心得到上清皂苷溶液和含皂苷沉淀。含皂苷沉淀用70vol％乙醇溶液萃取3次后，合并萃取液，并回收乙醇，得皂苷浸膏。
142.(7)制备皂苷转化培养基
143.将步骤(6)获得的上清皂苷溶液和皂苷浸膏混合后稀释，并添加无机盐制成皂苷转化培养基，总体积为1.7m3。
144.所述其它培养基成分包括无机盐、氮源，包括：氯化钠0.5～2g/l、硝酸钾0.5～2g/l、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l；
145.或者，包括：氯化钠0.5～2g/l、黄豆饼粉1～5g/l、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l。
146.(8)皂苷的微生物转化
147.将步骤(7)所得到的皂苷转化培养基灭菌，冷却后，加入0.05vol％tween 80，接种5vol％能够分泌多种具有不同功能的糖苷酶的微生物b，发酵培养转化6天，得到相应的发酵产物，然后，经过离心过滤得到含皂素沉淀。
148.(9)皂素产品的制备
149.将步骤(8)所得到的沉淀，干燥后再以无水乙醇提取4h，回收有机溶剂循环利用，提取物结晶干燥后得到白色黄姜皂素产品。
150.与直接酸解法相比，生物的方法完全不用酸，无污染，并得到可综合利用的黄姜淀粉糖液和黄姜纤维渣，皂素收率为133.43mg/g黄姜干重，皂素得率提高了35.0％(本技术中的黄姜干重，与常规定义类似，是指新鲜黄姜在烘干或晒干后对应得到的干黄姜/晒干黄姜的重量)。相较于专利cn106834407b，由于酶抑制物的去除和工艺的优化，皂素收率比较稳定，且皂素得率有明显提高。
151.实施例2
152.一种利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，包括如下步骤：
153.(1)黄姜材料的预处理
154.取新鲜黄姜5010kg，洗去泥土去须，按照黄姜鲜重和水比例1：1(w/w)粉碎匀浆配制成黄姜浆液。该黄姜浆液不需要灭菌处理，且均匀浆液中无需额外添加无机盐、氮源、碳源、生长因子及其它物质。
155.(2)微生物菌群制备
156.微生物菌群a的制备方法为：
157.取菌株bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的单菌落分别接种于装有100ml lb培养基的250ml摇瓶，每个菌株各1瓶，在30℃，100r/min条件下培养12h，获得一级种子。
158.将一级种子分别接入装有6l lb培养基的种子罐中，罐温37℃，100r/min，通气量0.1vvm条件下培养8h，获得二级种子。
159.将二级种子分别接入装有550l廉价细菌培养基的1m3发酵罐中，罐温37℃，200r/min，通气量0.1vvm条件下培养6h，获得三级种子。
160.将上述获得的bacillus sp.、bacillus licheniformis、
pectobacteriumcarotovorum和cellulomonas flavigena的三级种子按照等比例混合菌液制成微生物菌群a。
161.所述廉价细菌培养基配方如下：黄豆饼粉1～5g/l，蛋白胨2～5g/l，酵母粉1～2.5g/l，氯化钠5～12g/l，消泡剂0.05～0.1vol％。
162.微生物菌b的制备方法为：
163.取斜面保藏菌株aspergillus tubingensis接种于装有100ml真菌培养基的250ml摇瓶，接种1瓶，在28℃，100r/min条件下培养18h，获得一级种子。
164.将一级种子接入装有2.5l真菌培养基的7l种子罐中，罐温28℃，200r/min，通气量0.2vvm条件下培养24h，获得二级种子。
165.将二级种子接入装有250l廉价真菌诱导培养基的1m3发酵罐中，罐温37℃，200r/min，通气量0.2vvm条件下培养36h，获得三级种子。
166.(3)微生物发酵促进皂苷游离
167.在步骤(1)所得到的黄姜浆液中接种微生物菌群a，在37℃，转速为200r/min，通气为0.1vvm条件下发酵培养6h，得到相应的发酵液。
168.(4)双酶处理
169.将步骤(3)所得到的发酵液升温到90～100℃，保温20～40分钟，使淀粉彻底糊化，之后调节ph至6.2，再加入高温淀粉酶，使酶活单位在300u/ml及以上，在ph 6.2、95℃条件下液化20min；再按黄姜浆液体积加入糖化酶，使酶活单位在300u/ml及以上，在ph 4.2、温度60℃条件下糖化6h，使淀粉完全转化为葡萄糖，得到糖化醪。
170.(5)过滤分离皂苷
171.将步骤(4)得到的糖化醪，用板框压榨过滤一次，得到滤液和滤饼。之后，按质量体积比1:2，向滤饼中加入水浸泡混匀，进行二次板框压滤，得到第二次滤饼和滤液，之后合并两次滤液，即为含皂苷黄姜糖化液(含固形物)，所述滤饼为黄姜纤维渣。
172.(6)浓缩富集皂苷
173.将步骤(5)所得的黄姜含皂苷糖化液先后通过微滤、超滤和纳滤得到截留液(含固形物)和透过液。所述截留液为皂苷浓缩液，透过液为黄姜淀粉糖化液。对所述截留液进行离心得到上清皂苷溶液和含皂苷沉淀。含皂苷沉淀用70vol％乙醇溶液萃取4次后，合并萃取液，并回收乙醇，得皂苷浸膏。
174.(7)制备皂苷转化培养基
175.将步骤(6)所得的上清皂苷溶液和皂苷浸膏混合后稀释，并添加无机盐制成皂苷转化培养基，总体积为1.0m3。
176.所述其它培养基成分包括无机盐、氮源，包括：氯化钠0.5～2g/l、硝酸钾0.5～2g/l、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l；
177.或者，包括：氯化钠0.5～2g/l、黄豆饼粉1～5g/l、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l。
178.(8)皂苷的微生物转化
179.将步骤(7)所得到的皂苷转化培养基灭菌，冷却后，加入0.1vol％tween80，接种10vol％能够分泌多种具有不同功能的糖苷酶的微生物菌b，发酵培养转化6天，得到相应的发酵产物，然后，经过离心过滤得到含皂素沉淀。
180.(9)皂素产品的制备
181.将步骤(8)所得到的沉淀，干燥后再以无水乙醇提取4h，回收有机溶剂循环利用，提取物结晶干燥后得到白色黄姜皂素产品。
182.与直接酸解法相比，生物的方法完全不用酸，污染小，并得到可综合利用的黄姜淀粉糖液和黄姜纤维渣，皂素收率为144.57mg/g黄姜干重，皂素得率提高了46.3％。相较于专利cn106834407b，由于酶抑制物的去除和工艺的优化，皂素收率比较稳定，且皂素得率有明显提高。
183.实施例3
184.一种利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，包括如下步骤：
185.(1)黄姜材料的预处理
186.取新鲜黄姜6500kg，洗去泥土去须，按照黄姜鲜重和水比例1：1(w/w)粉碎匀浆配制成黄姜浆液。该黄姜浆液不需要灭菌处理，且均匀浆液中无需额外添加无机盐、氮源、碳源、生长因子及其它物质。
187.(2)微生物菌群制备
188.微生物菌群a的制备方法为：
189.取菌株bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的单菌落分别接种于装有100ml lb培养基的250ml摇瓶，每个菌株各1瓶，在30℃，100r/min条件下培养12h，获得一级种子。
190.将一级种子分别接入装有7l的lb培养基10l种子罐中，罐温37℃，200r/min，通气量0.1vvm条件下培养6h，获得二级种子。
191.将二级种子分别接入装有700l廉价细菌培养基的1m3发酵罐中，罐温37℃，200r/min，通气量0.1vvm条件下培养6h，获得三级种子。
192.将上述获得的bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacteriumcarotovorum和cellulomonas flavigena的三级种子按照等比例混合菌液制成微生物菌群a。
193.所述廉价细菌培养基配方如下：黄豆饼粉1～5g/l，蛋白胨2～5g/l，酵母粉1～2.5g/l，氯化钠5～12g/l，消泡剂0.05～0.1vol％。
194.微生物菌b的制备方法为：
195.取斜面保藏菌株aspergillus tubingensis接种于装有100ml真菌培养基的250ml摇瓶，接种1瓶，在28℃，100r/min条件下培养18h，获得一级种子。
196.将一级种子接入装有3l真菌培养基的7l种子罐中，罐温28℃，200r/min，通气量0.2vvm条件下培养24h，获得二级种子。
197.将二级种子接入装有300l廉价真菌诱导培养基的1m3发酵罐中，罐温37℃，200r/min，通气量0.2vvm条件下培养48h，获得三级种子。
198.(3)微生物发酵促进皂苷游离
199.在步骤(1)所得到的黄姜浆液中接种微生物菌群a，在37℃，转速为200r/min，通气为0.1vvm条件下发酵培养4h，得到相应的发酵液。
200.(4)双酶处理
201.将步骤(3)所得到的发酵液升温到90～100℃，保温20～40分钟，使淀粉彻底糊化，
之后调节ph至6.2，再加入高温淀粉酶，使酶活单位在300u/ml及以上，在ph 6.2、95℃条件下液化20min；再按黄姜浆液体积加入糖化酶，使酶活单位在300u/ml及以上，在ph 4.2、温度60℃条件下糖化6h，使淀粉完全转化为葡萄糖，得到糖化醪。
202.(5)过滤分离皂苷
203.将步骤(4)得到的糖化醪，用板框压榨过滤一次，得到滤液和滤饼。按质量体积比1:3，向滤饼加入水浸泡混匀，再进行第二次板框压滤，之后合并滤液，所述滤液为含皂苷黄姜糖化液(含固形物)。
204.(6)浓缩富集皂苷
205.将步骤(5)所得的黄姜含皂苷糖化液先后通过微滤、超滤、纳滤膜得到透过液和截留液(含固形物)。所述截留液为皂苷浓缩液，透过液为黄姜淀粉糖化液。对所述截留液进行离心得到上清皂苷溶液和含皂苷沉淀。含皂苷沉淀用70vol％乙醇溶液萃取5次后，合并萃取液，并回收乙醇，得皂苷浸膏。
206.(7)制备皂苷转化培养基
207.将步骤(6)获得的上清皂苷溶液和皂苷浸膏混合后稀释，并添加无机盐制成皂苷转化培养基，总体积为1.25m3。
208.所述其它培养基成分包括无机盐、氮源，包括：氯化钠0.5～2g/l、硝酸钾0.5～2g/l、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l；
209.或者，包括：氯化钠0.5～2g/l、黄豆饼粉1～5g/l、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l。
210.(8)皂苷的微生物转化
211.将步骤(7)所得到的皂苷转化培养基灭菌，冷却后，加入0.1vol％tween80，接种15vol％能够分泌多种具有不同功能的糖苷酶的微生物菌b，发酵培养转化6天，得到相应的发酵产物，然后，经过离心过滤得到含皂素沉淀；
212.(9)皂素产品的制备
213.将步骤(8)所得到的沉淀，干燥后再以无水乙醇提取4h，回收有机溶剂循环利用，提取物结晶干燥后得到白色黄姜皂素产品。
214.与直接酸解法相比，生物的方法完全不用酸，污染小，并得到可综合利用的黄姜淀粉糖液和黄姜纤维渣，皂素收率为156.84mg/g黄姜干重，皂素得率提高了58.7％。相较于专利cn106834407b，由于酶抑制物的去除和工艺的优化，皂素收率比较稳定，且皂素得率有明显提高。
215.实施例4
216.一种利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，包括如下步骤：
217.(1)黄姜材料的预处理
218.取晒干黄姜2200kg，洗去泥土去须，按照黄姜鲜重和水比例1：3(w/w)粉碎匀浆配制成黄姜浆液。该黄姜浆液不需要灭菌处理，且均匀浆液中无需额外添加无机盐、氮源、碳源、生长因子及其它物质。
219.(2)微生物菌群制备
220.微生物菌群a的制备方法为：
221.取菌株bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum
和cellulomonas flavigena的单菌落分别接种于装有100ml lb培养基的250ml摇瓶，每个菌株各1瓶，在30℃，100r/min条件下培养12h，获得一级种子。
222.将一级种子分别接入装有6l lb培养基的10l种子罐中，罐温37℃，200r/min，通气量0.1vvm条件下培养6h，获得二级种子。
223.将二级种子分别接入装有500l廉价细菌培养基的1m3发酵罐中，罐温37℃，200r/min，通气量0.1vvm条件下培养6h，获得三级种子。
224.将上述获得的bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacteriumcarotovorum和cellulomonas flavigena的三级种子按照等比例混合菌液制成微生物菌群a。
225.所述廉价细菌培养基配方如下：黄豆饼粉1～5g/l，蛋白胨2～5g/l，酵母粉1～2.5g/l，氯化钠5～12g/l，消泡剂0.05～0.1vol％。
226.微生物菌b的制备方法为：
227.取斜面保藏菌株aspergillus tubingensis接种于装有30ml真菌培养基的100ml摇瓶，接种1瓶，在28℃，100r/min条件下培养18h，获得一级种子。
228.将一级种子接入装有2l真菌培养基的7l种子罐中，罐温28℃，200r/min，通气量0.2vvm条件下培养24h，获得二级种子。
229.将二级种子接入装有200l廉价真菌诱导培养基的1m3发酵罐中，罐温37℃，200r/min，通气量0.2vvm条件下培养48h，获得三级种子。
230.(3)微生物发酵促进皂苷游离
231.在步骤(1)所得到的黄姜浆液中接种微生物菌群a，在37℃，转速为200r/min，通气为0.1vvm条件下发酵培养4h，得到相应的发酵液。
232.(4)双酶处理
233.将步骤(3)所得到的发酵液升温到90～100℃，保温20～40分钟，使淀粉彻底糊化，之后调节ph至6.2，再加入高温淀粉酶，使酶活单位在300u/ml及以上，在ph 6.2、95℃条件下液化20min；再按黄姜浆液体积加入糖化酶，使酶活单位在300u/ml及以上，在ph 4.2、温度60℃条件下糖化6h，使淀粉完全转化为葡萄糖，得到糖化醪。
234.(5)过滤分离皂苷
235.将步骤(4)得到的糖化醪，用板框压榨过滤一次，得到滤液和滤饼。按质量体积比1:2，向滤饼加入水浸泡混匀，再进行第二次板框压滤，之后合并滤液，所述滤液为含皂苷黄姜糖化液(含固形物)。
236.(6)浓缩富集皂苷
237.向将步骤(5)所得的黄姜含皂苷糖化液中加入纤维素酶和木聚糖酶，且每种酶在体系中的最终比活力为300u/g黄姜干重，在50℃条件下处理24小时，离心得黄姜糖液和含皂苷沉淀。含皂苷沉淀用70vol％乙醇溶液萃取3次后，合并萃取液，并回收乙醇，得皂苷浸膏。
238.(7)制备皂苷转化培养基
239.将步骤(6)获得的皂苷浸膏用自来水稀释，并添加无机盐制成皂苷转化培养基，总体积为1m3。
240.所述其它培养基成分包括无机盐、氮源，包括：氯化钠0.5～2g/l、硝酸钾0.5～2g/
l、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l；
241.或者，包括：氯化钠0.5～2g/l、黄豆饼粉1～5g/l、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l。
242.(8)皂苷的微生物转化
243.将步骤(7)所得到的皂苷转化培养基灭菌，冷却后，加入0.1vol％tween80，接种15vol％能够分泌多种具有不同功能的糖苷酶的微生物菌b，发酵培养转化6天，得到相应的发酵产物，然后，经过离心过滤得到含皂素沉淀；
244.(9)皂素产品的制备
245.将步骤(8)所得到的沉淀，干燥后再以无水乙醇提取4h，回收有机溶剂循环利用，提取物结晶干燥后得到白色黄姜皂素产品。
246.与直接酸解法相比，生物的方法完全不用酸，污染小，并得到可综合利用的黄姜淀粉糖液和黄姜纤维渣，皂素收率为129.80mg/g黄姜干重，皂素得率提高了31.3％(由于本实施例中采用的是晒干黄姜为原料，其黄姜干重即等于原料晒干黄姜的重量)。相较于专利cn106834407b，由于酶抑制物的去除和工艺的优化，皂素收率比较稳定，且皂素得率有明显提高。
247.实施例5
248.一种利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，包括如下步骤：
249.(1)黄姜材料的预处理
250.取晒干黄姜2600kg，洗去泥土去须，按照黄姜鲜重和水比例1：4(w/w)粉碎匀浆配制成黄姜浆液。该黄姜浆液不需要灭菌处理，且均匀浆液中无需额外添加无机盐、氮源、碳源、生长因子及其它物质。
251.(2)微生物菌群制备
252.微生物菌群a的制备方法为：
253.取菌株bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的单菌落分别接种于装有100ml lb培养基的250ml摇瓶，每个菌株各1瓶，在30℃，100r/min条件下培养12h，获得一级种子。
254.将一级种子分别接入装有7l lb培养基的10l种子罐中，罐温37℃，200r/min，通气量0.1vvm条件下培养6h，获得二级种子。
255.将二级种子分别接入装有700l廉价细菌培养基的1m3发酵罐中，罐温37℃，200r/min，通气量0.1vvm条件下培养6h，获得三级种子。
256.将上述获得的bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacteriumcarotovorum和cellulomonas flavigena的三级种子按照等比例混合菌液制成微生物菌群a。
257.所述廉价细菌培养基配方如下：黄豆饼粉1～5g/l，蛋白胨2～5g/l，酵母粉1～2.5g/l，氯化钠5～12g/l，消泡剂0.05～0.1vol％。
258.微生物菌b的制备方法为：
259.取斜面保藏菌株aspergillus tubingensis接种于装有30ml真菌培养基的100ml摇瓶，接种1瓶，在28℃，100r/min条件下培养18h，获得一级种子。
260.将一级种子接入装有3l真菌培养基的7l种子罐中，罐温28℃，200r/min，通气量
0.2vvm条件下培养24h，获得二级种子。
261.将二级种子接入装有300l廉价真菌诱导培养基的1m3发酵罐中，罐温37℃，200r/min，通气量0.2vvm条件下培养48h，获得三级种子。
262.(3)微生物发酵促进皂苷游离
263.在步骤(1)所得到的黄姜浆液中接种微生物菌群a，在37℃，转速为200r/min，通气为0.1vvm条件下发酵培养4h，得到相应的发酵液。
264.(4)双酶处理
265.将步骤(3)所得到的发酵液升温到90～100℃，保温20～40分钟，使淀粉彻底糊化，之后调节ph至6.2，再加入高温淀粉酶，使酶活单位在300u/ml及以上，在ph 6.2、95℃条件下液化20min；再按黄姜浆液体积加入糖化酶，使酶活单位在300u/ml及以上，在ph 4.2、温度60℃条件下糖化6h，使淀粉完全转化为葡萄糖，得到糖化醪。
266.(5)过滤分离皂苷
267.将步骤(4)得到的糖化醪，用板框压榨过滤一次，得到滤液和滤饼。按质量体积比1:2，向滤饼加入水浸泡混匀，再进行第二次板框压滤，之后合并滤液，所述滤液为含皂苷黄姜糖化液(含固形物)。
268.(6)浓缩富集皂苷
269.向将步骤(5)所得的黄姜含皂苷糖化液中加入纤维素酶和木聚糖酶，且每种酶在体系中的最终比活力为300u/g黄姜干重，在55℃条件下处理48小时，离心得黄姜糖液和含皂苷沉淀。含皂苷沉淀用70％乙醇溶液萃取5次后，合并萃取液，并回收乙醇，得皂苷浸膏。
270.(7)制备皂苷转化培养基
271.将将步骤(6)获得的皂苷浸膏用自来水稀释，并添加无机盐制成皂苷转化培养基，总体积为1.5m3。
272.所述其它培养基成分包括无机盐、氮源，包括：氯化钠0.5～2g/l、硝酸钾0.5～2g/l、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l；
273.或者，包括：氯化钠0.5～2g/l、黄豆饼粉1～5g/l、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l。
274.(8)皂苷的微生物转化
275.将步骤(7)所得到的皂苷转化培养基灭菌，冷却后，加入0.1vol％tween80，接种15vol％能够分泌多种具有不同功能的糖苷酶的微生物菌b，发酵培养转化6天，得到相应的发酵产物，然后，经过离心过滤得到含皂素沉淀；
276.(9)皂素产品的制备
277.将步骤(8)所得到的沉淀，干燥后再以无水乙醇提取4h，回收有机溶剂循环利用，提取物结晶干燥后得到白色黄姜皂素产品。
278.与直接酸解法相比，生物的方法完全不用酸，污染小，并得到可综合利用的黄姜淀粉糖液和黄姜纤维渣，皂素收率为134.42mg/g黄姜干重，皂素得率提高了36.0％。相较于专利cn106834407b，由于酶抑制物的去除和工艺的优化，皂素收率比较稳定，且皂素得率有明显提高。
279.本技术使用的bacillus sp.，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，其微生物保藏编号为：cctcc m 2016791；分类命名为：芽孢杆菌；保藏时间为：2016年12月30日；保藏
单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
280.本技术使用的bacillus licheniformis，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，其微生物保藏编号为：cctcc m 2010113；分类命名为：地衣芽孢杆菌；保藏时间为：2010年5月12日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
281.本技术使用的aspergillus tubingensis，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，其微生物保藏编号为：cctcc m2016389；分类命名为：塔宾曲霉；保藏时间为：2016年7月11日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
282.本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)黄姜预发酵处理：以黄姜鲜姜为原料，按照黄姜鲜姜与水的质量比为1:1～1:3粉碎匀浆制成均匀浆液；接着，直接在浆液中接种5～20vol％能够分泌木质纤维素降解酶系、糖基转移酶以及表面活性物质的微生物菌群a，发酵培养2～8小时，得到相应的发酵液；(2)双酶处理：将步骤(1)得到的发酵液升温到90～100℃，保温20～40分钟，使淀粉彻底糊化，之后调节ph至5.0～8.0，再加入高温淀粉酶使淀粉液化；或者，将步骤(1)得到的发酵液升温到90～100℃，保温20～40分钟，使淀粉彻底糊化，然后将温度降至60～80℃后，再调节ph至5.5～7.5，加入中温淀粉酶使淀粉液化；接着，在淀粉液化完全后，将温度控制为50～65℃，调节ph至4.0～5.0，再加入糖化酶处理3～5小时，使淀粉完全转化为葡萄糖，得到糖化醪；(3)过滤分离皂苷：将步骤(2)得到的糖化醪，用板框压榨过滤一次，得到第一次滤液和滤饼；接着，重复板框压滤至少1次，具体是按每1g滤饼对应1～3ml水的对应关系，向滤饼中加入水浸泡混匀，进行再次板框压滤，得到滤饼和滤液；然后将重复板框压滤得到的滤液与第一次滤液合并，即可得到含皂苷黄姜糖化液；(4)浓缩富集皂苷：将步骤(3)所得的含皂苷黄姜糖化液经三级膜过滤获得截留液和透过液，所述截留液为皂苷浓缩液，所述透过液为黄姜糖液；接着，将皂苷浓缩液用离心机分离得到上清皂苷溶液和含皂苷沉淀；然后，将含皂苷沉淀用40～90vol％乙醇溶液萃取3～5次后，合并萃取液，分离乙醇得到皂苷浸膏；(5)配制皂苷转化培养基：对步骤(4)获得的上清皂苷溶液或皂苷浸膏进行稀释，使总皂苷浓度不超过300g/l；接着，向其中加入其它培养基成分，制成皂苷转化培养基；或者，将步骤(4)获得的上清皂苷溶液和皂苷浸膏混合后稀释，使总皂苷浓度不超过300g/l，接着，向其中加入其它培养基成分，制成皂苷转化培养基；(6)皂苷生物转化：将步骤(5)中的皂苷转化培养基，灭菌冷却后，加入0.05～0.1vol％tween 80，接种5～20vol％能够分泌多种具有不同功能的糖苷酶的微生物菌b，然后进行发酵转化；发酵完成后，将发酵产物经过离心过滤即可得到含皂素沉淀；其中，所述微生物菌b能够分泌多种具有不同功能的糖苷酶，这些糖苷酶能够水解不同皂苷；(7)皂素产品制备：将步骤(6)得到的含皂素沉淀，进行晾晒或烘干，再经有机溶剂提取精制即可得到皂素产品。2.一种利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)黄姜预发酵处理：以晒干黄姜为原料，按照干姜与水的质量比为1:3～1:10粉碎匀浆制成均匀浆液；接着，直接在浆液中接种5～20vol％能够分泌木质纤维素降解酶系、糖基转移酶以及表面活性物质的微生物菌群a，发酵培养2～8小时，得到相应的发酵液；(2)双酶处理：将步骤(1)得到的发酵液升温到90～100℃，保温20～40分钟，使淀粉彻底糊化，之后调节ph至5.0～8.0，再加入高温淀粉酶使淀粉液化；或者，将步骤(1)得到的发酵液升温到90～100℃，保温20～40分钟，使淀粉彻底糊化，然后将温度降至60～80℃后，再调节ph至5.5～7.5，加入中温淀粉酶使淀粉液化；接着，在淀粉液化完全后，将温度控制为50～65℃，调节ph至4.0～5.0，再加入糖化酶处理3～5小时，使淀粉完全转化为葡萄糖，得到糖化醪；
(3)过滤分离皂苷：将步骤(2)得到的糖化醪，用板框压榨过滤一次，得到第一次滤液和滤饼；接着，重复板框压滤至少1次，具体是按每1g滤饼对应1～3ml水的对应关系，向滤饼中加入水浸泡混匀，进行再次板框压滤，得到滤饼和滤液；然后将重复板框压滤得到的滤液与第一次滤液合并，即可得到含皂苷黄姜糖化液；(4)浓缩富集皂苷：向步骤(3)得到的含皂苷黄姜糖化液中加入纤维素酶和木聚糖酶，且每种酶在体系中的最终比活力为100～300u/g黄姜干重，40～60℃恒温处理12～60小时，离心得黄姜糖液和含皂苷沉淀；然后，将含皂苷沉淀用40～90vol％乙醇溶液萃取3～5次后，合并萃取液，分离乙醇得到皂苷浸膏；(5)配制皂苷转化培养基：对步骤(4)获得的皂苷浸膏进行稀释，使总皂苷浓度不超过300g/l；接着，向其中加入其它培养基成分，制成皂苷转化培养基；(6)皂苷生物转化：将步骤(5)中的皂苷转化培养基，灭菌冷却后，加入0.05～0.1vol％tween 80，接种5～20vol％能够分泌多种具有不同功能的糖苷酶的微生物菌b，然后进行发酵转化；发酵完成后，将发酵产物经过离心过滤即可得到含皂素沉淀；其中，所述微生物菌b能够分泌多种具有不同功能的糖苷酶，这些糖苷酶能够水解不同皂苷；(7)皂素产品制备：将步骤(6)得到的含皂素沉淀，进行晾晒或烘干，再经有机溶剂提取精制即可得到皂素产品。3.如权利要求1或2所述利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述表面活性物质包括表面活性素或地衣素；所述发酵培养是在30～40℃，转速为100～300r/min，通气量为0.1～1vvm条件下培养2～8h。4.如权利要求1或2所述利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述微生物菌群a包括bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena这四种菌；其中，bacillus sp.保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc m 2016791；bacillus licheniformis保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc m 2010113。5.如权利要求4所述利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，其特征在于，所述微生物菌群a的菌液是按包括以下步骤的制备方法制备得到的：(i)分别取菌株bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacteriumcarotovorum和cellulomonas flavigena的单菌落接种于lb培养基中，在30～40℃，100～300r/min条件下培养8～16h，分别获得bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的一级种子；(ii)分别将步骤(i)获得的bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的一级种子按1～5vol％的接种量接入lb培养基中，在30～40℃，100～300r/min，通气量0.1～1vvm条件下培养2～8h，分别获得bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的二级种子液；(iii)分别将步骤(ii)获得的bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的二级种子液按1～5vol％的接种量接入细菌培养基中，在通气量0.1～1vvm，搅拌转速100～300r/min，温度30～40℃下，
培养2～8h，分别获得bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的三级种子；(iv)将步骤(iii)获得的bacillus sp.、bacillus licheniformis、pectobacterium carotovorum和cellulomonas flavigena的三级种子按预先设定的体积比例混合制成微生物菌群a的菌液；优选的，所述预先设定的体积比例具体为体积等比例；优选的，所述步骤(iii)中，所述细菌培养基为廉价细菌培养基，其配方如下：黄豆饼粉1～5g/l，蛋白胨2～5g/l，酵母粉1～2.5g/l，氯化钠5～12g/l，消泡剂0.05～0.1vol％。6.如权利要求1或2所述利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，所述微生物菌b具体为aspergillus tubingensis，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为cctcc m2016389。7.如权利要求6所述利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，其特征在于，所述微生物菌b的菌液是按包括以下步骤的制备方法制备得到的：(s1)取斜面保藏菌株aspergillus tubingensis接种于真菌培养基中，在25～30℃，100～300r/min，通气量0.1～1vvm条件下培养10～18h，获得aspergillus tubingensis的一级种子；(s2)将步骤(s1)获得的aspergillus tubingensis的一级种子按接种量1～5vol％接入真菌培养基中，在25～30℃，100～300r/min，通气量0.1～1vvm条件下培养16～32h，获得aspergillus tubingensis的二级种子；(s3)将步骤(s2)获得的aspergillus tubingensis的二级种子按接种量1～5vol％接入真菌诱导培养基中，在30～40℃，100～300r/min，通气量0.1～1vvm条件下培养16～32h，获得aspergillus tubingensis的三级种子；优选的，所述步骤(s1)和所述步骤(s2)中，所述真菌培养基的配方如下：蛋白胨5～10g/l，酵母粉2～5g/l，葡萄糖5～10g/l；所述步骤(s3)中，所述真菌诱导培养基为廉价真菌诱导培养基，其配方如下：黄豆饼粉1～5g/l，酵母粉2～5g/l，黄姜总皂苷醇提物2～30g/l；其中，所述黄姜总皂苷醇提物优选按如下制备方法获得：取烘干后的黄姜，打粉，每1000g黄姜干粉加入3l 70vol％乙醇，搅拌和超声辅助萃取30分钟，离心后，取上清；沉淀继续加入3l 70vol％乙醇，重复上述操作2次及以上；合并上清，分离乙醇后，将浸膏冷冻干燥，得黄姜总皂苷醇提物。8.如权利要求1或2所述利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，其特征在于，所述步骤(5)中，所述其它培养基成分包括无机盐和氮源；优选包括：氯化钠0.5～2g/l、硝酸钾0.5～2g/l、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l；或者，优选包括：氯化钠0.5～2g/l、黄豆饼粉1～5g/l、磷酸二氢钾0.5～5g/l、硫酸镁0.5～2g/l。9.如权利要求1或2所述利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，所述发酵转化是在30～40℃，转速为100～300r/min，通气量为0.1～1vvm的条件下培养24～144h；其中，对于某一皂苷转化培养基：当所述皂苷转化培养基使用上清皂苷溶液、不使用皂苷浸膏配制时，所述发酵转化的时间为24～48h；
当所述皂苷转化培养基使用皂苷浸膏、不使用上清皂苷溶液配制时，所述发酵转化的时间为96～144h；当所述皂苷转化培养基同时使用上清皂苷溶液和皂苷浸膏配制时，所述发酵转化的时间为96～144h。10.如权利要求1或2所述利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，其特征在于，所述步骤(7)中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、汽油、石油醚、氯仿。

技术总结
本发明属于生物技术领域，公开了一种利用微生物绿色高收率生产黄姜皂素的方法，具体是黄姜匀浆后，用菌群A处理释放皂苷，双酶处理使淀粉糖化，板框压滤得滤液和滤饼，滤饼加水混匀再次压滤，合并滤液，即含皂苷黄姜糖液。若原料为干黄姜，向滤液中加入复合酶处理，离心得黄姜糖液和含皂苷沉淀。若原料为鲜姜，滤液经膜分离得黄姜糖液和皂苷浓缩液，离心得上清皂苷溶液和含皂苷沉淀。含皂苷沉淀用乙醇萃取得皂苷浸膏。用上清皂苷溶液、皂苷浸膏配成培养基，用菌B处理，离心得含皂素沉淀。沉淀经烘干、溶剂提取精制得皂素产品。本发明对整体工艺流程设计进行改进，可得两类皂苷，皂苷提取率高，大大提高黄姜皂素得率，是酸解工艺的1.3～1.6倍。倍。倍。


技术研发人员：余龙江 邱海亮 徐航 张立伟 敖明章 郭梦真 陈玉龙
受保护的技术使用者：华中科技大学
技术研发日：2022.06.30
技术公布日：2022/11/1