嗜热链球菌s869及其在调节免疫和调节肠道功能中的应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体的，涉及嗜热链球菌s869及其在调节免疫和调节肠道 功能中的应用。
背景技术：2.随着经济的快速发展和居民生活水平的提高，越来越多的人关注身体亚健康情况，随之 带来了益生菌组合物由于对身体无副作用，备受欢迎。而且科学合理的使用益生菌，有利于 人体微生态平衡和身体健康。
3.益生菌是一种通过定殖在人体内，改变宿主某一部位菌群组成的一类对宿主有益的活性 微生物。通过调节宿主黏膜与系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，促进营养吸收保持 肠道健康的作用，从而产生有利于健康作用的单微生物或组成明确的混合微生物。
4.益生菌对机体免疫的调节具有菌株特异性，不同菌株在调节免疫的能力上存在差异，市 场上多为活性益生菌，其在一定活菌数并摄入足够量时可调节机体免疫。但是活性乳酸菌在 调节免疫上有一定的局限性，灭活菌调节免疫的作用机制尚不明确。主要有乳酸杆菌、双歧 杆菌等这些最传统的益生菌被验证具有调节机体免疫的功能。
5.另外，益生菌另一大用途即调节肠道健康，而且目前市场上比较多的益生菌包括：乳双 歧杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖杆菌、干酪乳杆菌等，被验证能够调节肠道功能紊乱，预防腹 泻、减少便秘的作用。
6.而嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)主要用于酸奶发酵领域，且对嗜热链球菌单 菌株的益生作用研究较少。因此，需要更有针对性的筛选具有特殊生理活性的菌株。
技术实现要素：7.本发明提出嗜热链球菌s869及其在调节免疫和调节肠道功能中的应用，解决了现有菌株 中的活菌和灭活菌的免疫能力差异较大，且现有菌株无法同时都具备较好的调节机体免疫以 及调节肠道功能的问题。
8.本发明的技术方案如下：
9.一种嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)s869，于2021年12月24日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 保藏编号为cgmcc no.24190，该生物材料的存活性经保藏中心检测结果为存活。
10.本发明还提出了一种嗜热链球菌菌制剂，含有所述的嗜热链球菌，为固态或液态菌制剂。
11.本发明还提出了一种食品，含有所述的嗜热链球菌或所述的嗜热链球菌菌制剂。
12.本发明还提出了所述的嗜热链球菌s869在制备调节免疫的组合物中的应用，所述组合物 包括食品、保健品、药品、饲料。
13.本发明还提出了所述的嗜热链球菌s869在制备用于促进raw264.7巨噬细胞的增殖和吞 噬的组合物中的应用，所述组合物包括食品、保健品、药品、饲料。
14.本发明还提出了所述的嗜热链球菌s869在制备调节肠道功能的组合物中的应用，所述组 合物包括食品、保健品、药品、饲料。
15.本发明还提出了所述的嗜热链球菌s869在制备用于预防和修复etec造成的肠上皮细胞 损伤的组合物中的应用，所述组合物包括食品、保健品、药品、饲料。
16.本发明还提出了所述的嗜热链球菌s869在制备用于提高细胞黏蛋白muc2与muc5ac 基因表达水平的组合物中的应用，所述组合物包括食品、保健品、药品、饲料。
17.作为进一步的技术方案，所述组合物中包括嗜热链球菌s869活菌、灭活菌、代谢产物中 的一种或多种。
18.作为进一步的技术方案，所述组合物的剂型包括粉剂、颗粒剂、乳剂、片剂中的任一种。
19.本发明的有益效果：
20.1、本发明中的嗜热链球菌s869，能够高产胞外多糖，活性和灭活型嗜热链球菌s869都 能够促进raw264.7巨噬细胞的增殖和吞噬能力，并且可刺激细胞分泌tnf-α、il-6、il-10 等细胞因子；细胞因子tnf-α、il-6的增强可激发免疫防御机制，但过度分泌会造成免疫紊 乱，造成免疫失衡；抗炎因子il-10，可阻碍炎症因子的诱导合成和分泌，可保护机体。活性 和灭活型嗜热链球菌s869菌株都可提高机体免疫，具有极高的应用价值。
21.2、本发明中的嗜热链球菌s869具有修复etec造成的肠上皮细胞损伤的能力，提高了 细胞黏蛋白muc2与muc5ac基因表达水平，能够修复和预防etec造成的肠道黏膜屏障 损伤的能力。s869可用于防治神经递质表达异常及产肠毒大肠杆菌感染引起的腹泻组合物 中，且s869在修复肠上皮细胞损伤及修复肠道黏膜屏障方面具有良好作用。
附图说明
22.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
23.图1为胞外多糖实验葡萄糖标准曲线；
24.图2为嗜热链球菌s869和mrs培养基胞外多糖产量对比图；
25.图3为嗜热链球菌s869、鼠李糖乳杆菌lgg、dmem培养基细胞增殖对比图；
26.图4为嗜热链球菌s869、鼠李糖乳杆菌lgg、dmem培养基细胞吞噬对比图；
27.图5为实验菌株对小鼠体质量的影响；
28.图6为实验菌株对肠上皮细胞黏蛋白muc2 mrna表达的影响；
29.图7为实验菌株对肠上皮细胞黏蛋白muc5ac mrna表达的影响；
30.图8为实验菌株对肠上皮细胞五羟色胺转运体sert mrna表达影响；
31.图9为实验菌株对肠上皮细胞增殖效果的影响。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，
都涉及本发明 保护的范围。
33.实施例1
34.一种嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)s869，于2021年12月24日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24190。
35.实验例1
36.实验步骤：
37.(1)筛选产胞外多糖的菌株
38.在mrs固体培养基上对嗜热链球菌s869进行划线分离(2个重复)得到嗜热链球菌s869 的分离纯化菌株，然后37℃厌氧培养48h，观察记录菌落特征。使用无菌牙签轻触菌落，轻 轻向外拉，并控制在2s内垂直离开，使得在培养基表面形成连续的拉丝，重复6个菌落，每 个菌落做2次平行试验，测量菌落拉丝的最大长度(mm)，以“平均值
±
标准方差”表示结果， 筛选拉丝长度在40mm以上分离菌株。结果显示实验菌株嗜热链球菌s869的菌落拉丝长度均 在40mm以上。
39.(2)提取胞外多糖
40.将上述菌株活化并转接于mrs液体培养基，37℃培养48h后，取10ml培养液95℃水 浴5min去酶活，离心后取上清液，冷却后量取5ml再加入2.5ml 12％的三氯乙酸，搅拌后 静置半小时离心，将上清液置于离心管中，加入三倍体积的95％乙醇，于4℃醇沉过夜，然 后离心取沉淀，沉淀即为胞外多糖，加入10ml纯水，在透析袋中透析2天得胞外粗多糖水 溶液，在透析过程中需要每隔8h换一次水。
41.(3)硫酸-苯酚法测定胞外多糖含量
42.取11个25ml的带塞试管，分别量取100μg/ml葡萄糖标准液0、0.1ml、0.2ml、0.3ml、 0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml、1ml，并分别加入纯水至1ml，再加入1ml 质量浓度为6％的苯酚溶液，摇匀后加入5ml浓硫酸，并再次摇匀，室温下静置30分钟后， 在酶标仪波长490nm处测定吸光度，以葡萄糖的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制 葡萄糖标准曲线，如图1所示，葡萄糖标准曲线y＝0.005x-0.01，r2＝0.998。
43.于带塞试管中加入1ml上述胞外粗多糖水溶液，并取1ml mrs培养基作为对照，然后 分别加入1ml质量浓度为6％的苯酚溶液，摇匀后加入5ml浓硫酸，再次摇匀，室温下静置 30分钟后，在酶标仪波长490nm处测定吸光度，按照葡萄糖标准曲线计算胞外多糖含量，如 图2所示。
44.实验结果：
45.如表1所示，以mrs为对照胞外多糖的产量为(304.2
±
0.416)μg/ml；嗜热链球菌s869 的胞外多糖产量为(317.2
±
1.217)μg/ml，且有显著差异(p＜0.001)。s869相比于mrs， 细胞多糖产量提高了4.3％。结果显示嗜热链球菌s869具有高产胞外多糖的能力。
46.表1乳酸菌的胞外多糖(eps)产量
47.组别对照组(mrs培养基)嗜热链球菌s869eps产量(μg/ml)304.2
±
0.416317.2
±
1.217
48.实验例2
49.实验步骤：
50.(1)细胞培养
51.将raw264.7细胞复苏后置于含有dmem完全培养液的培养瓶中，并在培养箱中孵育， 孵育条件为37℃、5％co2，待细胞生长良好，密度达80％进行传代，传代3次进行实验。
52.(2)制备菌悬液
53.按照如下方法制备嗜热链球菌s869活菌菌悬液和灭活菌菌悬液、鼠李糖乳杆菌lgg活 菌菌悬液和灭活菌菌悬液。
54.①
将乳酸菌接种于mrs液体培养基中活化3代后，37℃培养18h，4℃5000r/min离心 5min，收集菌体；
55.②
用pbs洗涤收集的菌体1次后，离心去除上清液，离心的条件为4℃、5000r/min离心 5min，菌体用含10％胎牛血清的dmem培养液重悬混匀，用0.9％生理盐水对重悬后的1ml 菌液进行梯度稀释，用流式细胞仪检测菌浓，调整菌液浓度1.5
×
108cfu/ml，得到活菌菌 悬液。
56.③
用pbs洗涤收集的菌体1次后离心去除上清液，离心的条件为4℃、5000r/min离心 5min，离心得到的菌体用pbs重悬，在80℃水浴灭活30min，再次离心去除上清液，沉淀用 含10％胎牛血清的dmem培养液重悬混匀，用0.9％生理盐水对重悬后的1ml菌液进行梯度 稀释，用流式细胞仪检测菌浓，调整菌液浓度1.5
×
108cfu/ml，得到灭活菌菌悬液。
57.(3)细胞增殖实验
58.将步骤(1)中得到的raw264.7传3代后的细胞，用0.4％台盼蓝染色液染色，取细胞 悬液40μl与40μl 0.4％台盼蓝溶液以1:1混匀后，取20μl用自动细胞计数仪计数，将细胞 稀释，在96孔板按密度1.5
×
105个/ml接种，每孔100μl细胞悬液在37℃、5％co2培养箱 中过夜孵育。
59.细胞贴壁后除去上清液，每孔加入100μl细胞培养液(含10％胎牛血清的dmem培养 基)再分别加入100μl的步骤(2)中的活菌菌悬液或灭活菌悬液，空白对照组为100μl细 胞培养液，每组5个重复，活菌组与细胞在37℃、5％co2条件下共孵育4h，灭活菌组与细 胞在相同条件下共孵育24h。
60.cck-8法检测细胞活性及增殖情况，具体操作为：每孔加入10μl cck-8溶液，37℃、 5％co2培养箱中孵育1h，在450nm波长下测定吸光度od值。
61.根据如下公式计算细胞增殖指数和增殖率：
62.细胞增殖指数＝(as-ac)/ac；
63.增殖率＝细胞增殖指数
×
100％；
64.式中：as为实验组od值，ac为空白对照组od值。
65.(4)吞噬实验
66.用0.4％台盼蓝染色液对对数生长期的raw264.7细胞进行染色，取细胞悬液40μl与 40μl 0.4％台盼蓝溶液混匀，3分钟后，取20μl用自动细胞计数仪计数和细胞稀释，调整浓 度为1.5
×
105cells/ml，96孔板的每孔加入100μl细胞悬液，37℃、5％co2培养箱中过夜孵育。
67.除去培养液，每孔加入100μl细胞培养液(含10％胎牛血清的dmem培养基)再分别 加入100μl的步骤(2)中的活菌菌悬液或灭活菌悬液，每组5个复孔，空白对照组为含10％ 胎牛血清的dmem培养基，活菌组与细胞共孵育4h，灭活菌组与巨噬细胞共孵育24h。
68.中性红试剂盒检测细胞吞噬效果，具体操作为：孵育结束后，吸出96孔板中的上清
液， pbs洗涤2次后加入200μl细胞培养液和20μl中性红染液，在细胞培养箱中孵育2h。除去 含有中性红染液的细胞培养液，pbs洗涤1次，于每孔加入200μl中性红检测裂解液，至室 温摇床裂解10min。于540nm波长处测定od值，根据如下公式计算细胞增殖指数和增殖率：
69.细胞吞噬指数＝as/ac；
70.吞噬率＝细胞吞噬指数
×
100％；
71.式中：as表示实验组od值，ac表示空白对照组od值
72.(5)elisa法检测上清液中细胞因子的含量
73.按照上述方法进行细胞培养和制备菌悬液，将2ml浓度为2
×
105个/ml的细胞接种于24 孔板中，在37℃、5％co2培养箱中过夜培养，除去上清液后加入2ml含10％胎牛血清的dmem 培养基。利用lps介导细胞产生炎症细胞，lps的浓度为1μg/ml，设置阴性对照组、阳性对 照组、lgg组、s869组、预防组、治疗组六个不同组，每组5个重复，六个不同组与细胞共 孵育，具体为：
74.①
阴性对照组(dmem)
75.24孔板中加100μl/孔dmem，于细胞培养箱中孵育，阴性对照组一孵育4h，阴性对照 组二孵育24h；
76.②
阳性对照组(lps)
77.24孔板中加lps使其终浓度为1μg/ml，于细胞培养箱中孵育，阳性对照组一孵育4h， 阳性对照组二孵育24h；
78.③
lgg组
79.24孔板中加100μl/孔鼠李糖乳杆菌lgg活菌菌悬液或灭活菌菌悬液，于细胞培养箱中 孵育，活菌组孵育4h，灭活菌组孵育24h；
80.④
s869组
81.24孔板中加100μl/孔嗜热链球菌s869活菌菌悬液或灭活菌菌悬液，于细胞培养箱中孵 育，活菌组孵育4h，灭活菌组孵育24h；
82.⑤
预防组(s869/lps)
83.在24孔板中先加入嗜热链球菌s869活菌菌悬液或灭活菌菌悬液100μl/孔，于细胞培养 箱中孵育，活菌组先孵育4h，灭活菌组先孵育12h；然后再加入lps(终浓度为1μg/ml)， 活菌组孵育4h，灭活菌组孵育12h；
84.⑥
治疗组(lps/s869)
85.在24孔板中先加入lps(终浓度为1μg/ml)，于细胞培养箱中孵育，活菌组先孵育4h， 灭活菌组先孵育12h；然后再加入嗜热链球菌s869活菌菌悬液或灭活菌菌悬液100μl/孔，活 菌组孵育4h，灭活菌组孵育12h；
86.孵育结束后，收集各个组别的细胞培养上清液，1000r/min离心10min去除颗粒和聚合物， 分别分装到无菌离心管中，低温保藏。
87.根据elisa试剂盒说明书测定上组上清液中的tnf-α、il-6、il-10细胞因子的分泌量。
88.荧光定量qpcr测定细胞因子mrna水平的表达量。
89.实验结果：
90.(1)细胞增殖结果
91.统计结果如图3所示，与对照组相比，嗜热链球菌s869的活菌与灭活菌对巨噬细胞都有 较好的增殖效果。与鼠李糖乳杆菌lgg相比，在活菌中，嗜热链球菌s869对巨噬细胞的增 殖效果低于鼠李糖乳杆菌lgg；在灭活菌中，灭活型嗜热链球菌s869对巨噬细胞的增殖能 力高于灭活型鼠李糖乳杆菌lgg，且有显著性差异(p＜0.05)。
92.(2)细胞吞噬结果
93.计算结果如图4所示，与对照组相比，嗜热链球菌s869的活菌与灭活菌均能大幅度促进 巨噬细胞的吞噬效果；在活菌中，嗜热链球菌s869对促进巨噬细胞的吞噬能力高于鼠李糖乳 杆菌lgg，且有显著性差异(p＜0.05)；在灭活菌中，灭活型嗜热链球菌s869可显著促进 巨噬细胞的吞噬作用，且吞噬效果明显高于鼠李糖乳杆菌lgg，且有极显著性差异(p＜ 0.001)。
94.(3)elisa法检测细胞因子的含量结果
95.表2活菌对细胞因子分泌量的影响
[0096][0097]
注：
“‑”
代表细胞因子分泌量小于检出限；“+”代表分泌量15.625-125pg/ml；“++”代表分泌量125-500pg/ml；“+++”代表 分泌量500-1000pg/ml；“++++”代表分泌量大于1000pg/ml；
[0098]
如表2所示，与阴性对照一组相比，s869活菌组和lgg活菌组与细胞共孵育都可促进 细胞因子tnf-α、il-6和il-10的分泌，而且s869活菌组促进细胞分泌il-10的能力高于lgg 活菌组，这说明s869活菌在正常情况下能够激活巨噬细胞，并上调细胞因子tnf-α、il-6 和il-10的分泌，产生生理性炎症反应，提高机体免疫能力。当lps诱导细胞形成炎症细胞 时，与阳性对照一组相比，s869活菌的预防组、治疗组的tnf-α和il-6值没有差异，但分 泌抑炎因子il-10增多，说明发生炎症后，s869活菌能够促进抑炎因子il-10的分泌，从而 调节细胞炎症反应，进而提高机体免疫力。
[0099]
表3灭活菌对细胞因子分泌量的影响
[0100]
[0101][0102]
注：
“‑”
代表细胞因子分泌量小于检出限；“+”代表分泌量15.625-125pg/ml；“++”代表分泌量125-500pg/ml；“+++”代表 分泌量500-1000pg/ml；“++++”代表分泌量大于1000pg/ml；
[0103]
如表3所示，与阴性对照二组相比，灭活型s869组和灭活型lgg组与细胞共孵育都可 促进细胞因子tnf-α、il-6和il-10的分泌，而且s869灭活菌促进细胞分泌il-10的能力高 于lgg灭活菌，这说明s869灭活菌在正常情况下能够激活巨噬细胞，并上调细胞因子tnf-α、 il-6和il-10的分泌，产生生理性炎症反应，提高机体免疫能力。当lps诱导细胞形成炎症 细胞时，与阳性对照二组相比，灭活型s869的预防组、治疗组的tnf-α和il-6值没有差异， 但分泌抑炎因子il-10增多，说明发生炎症后，s869灭活菌能够促进抑炎因子il-10的分泌， 从而调节细胞炎症反应，进而提高机体免疫力。
[0104]
综上，根据嗜热链球菌s869活菌菌悬液和灭活菌菌悬液与巨噬细胞共孵育可激活巨噬细 胞，并上调细胞因子tnf-α、il-6和il-10的分泌，且s869活菌与灭活菌分泌il-10的能力 高于lgg活菌与灭活菌；当lps诱导细胞形成炎症细胞时，促炎因子tnf-α和il-6值没有 出现差异，但分泌抑炎因子il-10增多，说明发生炎症后s869活菌与灭活菌可以增加抑炎因 子il-10的分泌，从而调节细胞炎症反应，进而提高机体免疫力。
[0105]
实施例3
[0106]
实验步骤：
[0107]
嗜热链球菌s869活菌菌粉、嗜热链球菌s869灭活菌菌粉、40只6周龄雄性spf级babl/c 健康小鼠(购自北京维通利华公司)。
[0108]
40只小鼠的饲养环境保持在(23
±
2)℃，相对湿度(50
±
10)％，12h光照12h黑夜交 替。将小鼠适应性饲养1周后，将40只小鼠随机分为4组，每组10只，分别为空白组、模 型组、嗜热链球菌s869活菌组、嗜热链球菌s869灭活菌组。除空白组外，其余3组采取连 续3天皮下注射环磷酰胺(80mg/kg)的方法建立免疫抑制小鼠模型。造模后各组按0.lml/(10g
·
d) 剂量连续灌胃4周，空白组和模型组给予灭菌生理盐水，嗜热链球菌s869活菌组和嗜热链球 菌s869灭活菌组为1
×
108cfu/天(生理盐水稀释嗜热链球菌s869活菌菌粉和灭活菌菌粉得 到)。实验结束时，检测相应指标。
[0109]
实验结果：
[0110]
(1)小鼠体质量变化
[0111]
每周定期对小鼠称重，记录小鼠体质量变化，并根据体质量调整灌胃量。实验期间小鼠 体质量变化情况如图5所示。由图中可知，与空白组相比，免疫抑制小鼠(模型组、嗜热
链 球菌s869活菌组、嗜热链球菌s869灭活菌组)的生长受到明显抑制，体重增长缓慢，说明 免疫抑制小鼠造模成功，环磷酰胺可抑制小鼠食欲，影响吸收，进而抑制小鼠体质量增长。 通过干预灌胃4周的乳酸菌，嗜热链球菌s869活菌组和灭活菌组的体质量增长速度明显快于 模型组，嗜热链球菌s869活菌组和灭活菌组都可促进体质量的增长，其中嗜热链球菌s869 活菌组体质量增长速度较快，嗜热链球菌s869灭活菌组体质量增长速度较慢。
[0112]
(2)脏器指数
[0113]
灌胃4周后，小鼠称体质量，摘眼球取血，颈椎脱白处死之后摘取胸腺、脾脏、肝脏和 肾脏，将周围组织剥离干净后称重。
[0114]
脏器指数计算公式：脏器指数＝(小鼠脏器湿重/体质量)
×
100％
[0115]
表4脾脏指数和胸腺指数结果
[0116][0117]
注：含*表示模型组与其他组有显著性差异(p《0.05)
[0118]
由表4数据可知，模型组小鼠的脾脏指数和胸腺指数显著低于其他组(空白组、s869活 菌组和s869灭活菌组)；与模型组相比，通过干预灌胃4周的乳酸菌，嗜热链球菌s869活菌 组和灭活菌组的脾脏指数和胸腺指数明显升高，其中嗜热链球菌s869活菌组小鼠的脾脏指数 和胸腺指数高于嗜热链球菌s869灭活菌组。
[0119]
(3)血液中白细胞数
[0120]
灌胃4周后，将小鼠眼眶取血，吸取20μl并将其放入盛有380μl白细胞稀释液中，摇 匀。按红细胞计数的方法，将白细胞混悬液滴入计数池内，静置3min，待白细胞下沉后可计 数。白细胞特点为呈圆形，浆透亮，核呈紫黑色，稍有折光。白细胞数＝5个大格的总数*500， 检测结果如表5所示。
[0121]
表5血液中白细胞数结果
[0122][0123][0124]
注：含**表示模型组与其他组有显著性差异(p《0.01)
[0125]
由表5数据可知，模型组小鼠血液中白细胞数显著低于其他组(空白组、s869活菌组和 s869灭活菌组)，说明服用环磷酰胺，可造成白细胞数量明显减少。与模型组相比，服用嗜 热链球菌s869活菌和灭活菌后，可显著提高血液中白细胞的数量，可减轻机体免疫系统的损 伤，可增强机体免疫。
[0126]
(4)血清中细胞因子含量
[0127]
灌胃4周后，每只小鼠取眼球血0.5～1.0ml置于1.5ml离心管中，静置1h后，4℃离心 (3000r/min，15min)使得血清充分析出，转移血清至另一离心管，低温保藏，待测。采用 elisa法按照试剂盒说明测定小鼠血清tnf-a、il-6、il-10的含量。测定结果如表6所示。
[0128]
表6血清中细胞因子含量测定
[0129][0130]
注：含*表示模型组与其他组有显著性差异(p《0.05)
[0131]
由表6数据可知，模型组小鼠血清中的tnf-a和il-6含量高于空白组，il-10含量低于 空白组；说明环磷酰胺影响了小鼠血清中的相关细胞因子含量。用嗜热链球菌s869活菌和灭 活菌干预4周后，与模型组相比，血清中的tnf-a含量无显著性差异；但炎症因子il-6的含 量显著降低，抗炎因子il-10的含量显著增加。说明嗜热链球菌s869活菌和灭活菌可通过调 节血清中的细胞因子含量，提高机体免疫。
[0132]
实验例4
[0133]
实验菌株为s869l1、s869l2、s869l3、s869d1、s869d2、s869d3、s869s，其中
[0134]
s869l1为高浓度s869活菌菌体；
[0135]
s869l2为中浓度s869活菌菌体；
[0136]
s869l3为低浓度s869活菌菌体；
[0137]
s869d1为高浓度s869灭活菌体；
[0138]
s869d2为中浓度s869灭活菌体；
[0139]
s869d3为低浓度s869灭活菌体；
[0140]
s869s为代谢产物。
[0141]
实验步骤：
[0142]
(1)s869在肠道菌群体外发酵模拟状态下调控ht-29细胞黏蛋白表达
[0143]
将成人健康粪便与无氧生理盐水按照1:10稀释制成粪便悬液，并在每个发酵小瓶接入 500μl粪便悬液。(每个发酵小瓶中含有5ml ycfa培养基其成分为：1g/l阿拉伯半乳聚糖、 2g/l果胶、1g/l木聚糖、3g/l淀粉、0.4g/l葡萄糖、3g/l酵母膏、3g/l蛋白胨、0.8g/l nacl、 0.5g/l kh2po4、0.5g/l k2hpo4、0.4g/l cacl2.2h2o、0.08g/l mgso4.7h2o、0.01g/l氯化血红 素，并加入0.3μg/l维生素混合物)
[0144]
制备益生菌组：
[0145]
干预组(对应附图中的s869/l/d/s)：将实验菌株各100μl接入发酵小瓶，于37℃培养 箱培养24h；
[0146]
治疗组(对应附图中的e+s869/l/d/s)：将100μl产肠毒素大肠埃希氏(etec)菌液接 入上述发酵小瓶使终浓度为107菌体/ml，于37℃培养箱培养12h，之后将实验菌株各100μl 接入发酵小瓶中，于37℃培养箱共同培养12h；
[0147]
预防组(对应附图中的s869/l/d/s+e)：将实验菌株各100μl接入发酵小瓶，于37℃培 养箱培养12h，之后将100μl etec菌液接入发酵小瓶，于37℃培养箱共同培养12h；
[0148]
对照组(对应附图中的control)：加入100μl无氧生理盐水，于37℃培养箱培养24h； 培养完成后取发酵液然后以12000r/min离心2min，将上清用0.22μm滤膜过滤除菌保存得无 菌发酵上清液；
[0149]
etec组：100μl etec菌液接入发酵小瓶使终浓度约107菌体/ml，于37℃培养箱共同 培养24h；
[0150]
将ht-29细胞复苏后，于5％co2培养箱中37℃培养，收集第3代ht-29细胞，调整细 胞浓度，按密度2.5
×
105个细胞/ml接种于24孔板，每孔2ml，在37℃、5％co2培养箱中 孵育24h。待细胞贴壁后，弃去上清液，每孔加入2ml mycoy’s 5a培养基(10％血清)， 再加入200μl肠道菌群体外批量培养中获得的益生菌组上清液，对照组加200μl mycoy’s 5a 培养基(10％血清)，每组3个重复，在37℃、5％co2条件下孵育24h，收集各孔细胞。
[0151]
(2)rna水平验证
[0152]
①
采用rna easy fast动物组织/细胞总rna提取试剂盒(离心柱型)dp451提取rna， 检测rna的完整性、纯度、浓度。
[0153]
②
反转录
[0154]
使用快速反转录试剂盒，按照说明书的步骤合成第一链cdna。
[0155]
得到的cdna用于后续实验，或低温保存。
[0156]
③
荧光定量pcr检测黏蛋白muc2、muc5ac基因表达
[0157]
引物设计：管家基因采用18srrna和gapdh
[0158]
primer名称序列(5' to 3')muc2-fgacccgcactatgtcaccttmuc2-rggacaggacaccttgtcgttmuc5ac-fccagctctgtggcttactccmuc5ac-rtcggaggtggatattgaagg18srrna-ftgtgatgcccttagatgtcc18srrna-rgatagtcaagttcgaccgtcgapdh-fcccttcattgacctcaactacatgggapdh-rcatggtggtgaagacgccag
[0159]
程序设定：95℃15min；40个循环：95℃10s，60℃30s，72℃30s；融解曲线：65℃-95℃， 每步0.5℃保持5s。
[0160]
实验结果：
[0161]
肠道黏膜屏障具有保护肠道健康的能力，在便秘及腹泻中均具有重要作用，益生菌对肠 上皮细胞黏蛋白muc2、muc5ac mrna表达影响的结果如图6和图7所示。干预组中，高 浓度s869菌体提高了细胞黏蛋白muc2 mrna表达，具有提高肠道润滑性，缓解便秘的作 用；治疗组中s869代谢产物提高了muc2与muc5ac基因表达水平，具有较优的提高肠上 皮细胞黏蛋白基因表达水平，从而修复etec造成的肠道黏膜屏障损伤的能力。预防组中s869 菌体及灭活菌体提高了细胞黏蛋白基因表达水平，从而预防etec造成的肠道黏膜屏障受损 的能力。
[0162]
综上所述，s869菌体在增加肠道润滑度、促进排便方面发挥较好的作用；s869代谢产物 具有修复etec造成的肠道黏膜屏障损伤的能力，s869菌体及灭活菌体具有预防etec
造成 的肠道黏膜屏障损伤的能力。
[0163]
实验例5
[0164]
采用菌体及发酵上清液与ht-29细胞共培养后检测五羟色胺转运体基因sert表达，其 中处理方式同实验例4。
[0165]
引物设计：管家基因采用18srrna和gapdh
[0166][0167][0168]
程序设定：95℃15min；40个循环：95℃10s，60℃30s，72℃30s；融解曲线：65℃-95℃， 每步0.5℃保持5s。
[0169]
实验结果：
[0170]
实验菌株对肠上皮细胞五羟色胺转运体sert mrna表达影响如图8所示，干预组、治 疗组及预防组均降低了细胞sert mrna表达水平，干预组中，s869的代谢产物对细胞sertmrna表达水平的降低效果最好，治疗组中，s869低浓度活菌组效果最佳，预防组中，代谢 产物组效果最佳，表示s869具有抑制肠道蠕动，预防etec引起的腹泻症状，其中代谢产物 对etec引起的腹泻症状的预防和治疗的综合性能最好。
[0171]
实验例6
[0172]
实验步骤：
[0173]
采用cck-8试剂盒测定细胞增殖率，具体为收集第3代培养2d后的ht-29细胞，按密 度105个细胞/ml接种于96孔板，每孔100μl在37℃、5％co2培养箱中孵育24h。待细胞贴 壁后，弃去上清液，每孔加入100μl mycoy’s 5a培养基，再加入10μl过滤除菌的肠道菌群 体外发酵上清液样品(详见实验例4)，每组5个重复，在37℃、5％co2条件下孵育12h。每 孔内加入10μl的cck-8溶液，细胞培养箱内孵育1h，在450nm波长下测定od值，计算细 胞增殖指数。细胞增殖指数＝(as-ac)/ac，式中as表示实验组od值，ac表示空白对照组 od值。
[0174]
如图9所示，s869上清均未表现出细胞增殖效果。干预组中，中浓度s869灭活菌体表 现出一定的细胞增殖效果。治疗组中，s869灭活菌体细胞增殖能力随浓度下降而降低，高浓 度s869灭活菌体表现出较优的修复etec造成的肠上皮细胞损伤的能力。预防组中，s869 菌体细胞增殖能力随浓度降低呈先下降后升高的趋势，低浓度s869菌体表现出较好的预防 etec造成的肠上皮细胞损伤的能力。
[0175]
表7 s869对便秘的改善情况
[0176]
[0177][0178]
表8 s869对腹泻的改善情况
[0179][0180]
s869可用于防治神经递质表达异常及产肠毒大肠杆菌感染引起的腹泻组合物中。另外， s869在修复肠上皮细胞损伤及修复肠道黏膜屏障方面具有良好作用。
[0181]
表9 s869便秘缓解功能开发结果
[0182]
实验菌株细胞增殖肠道黏膜屏障调节神经递质s869l1-++-s869l2
‑‑‑
s869l3
‑‑‑
s869d1
‑‑‑
s869d2+
‑‑
s869d3
‑‑‑
[0183]
细胞增殖中-表示细胞增殖率《0％；+表示细胞增殖率0-5％；++表示细胞增殖率5-10％；+++表示细胞增殖率》10％；肠 道黏膜屏障及调节神经递质中-表示黏蛋白或神经递质转运体基因表达倍数《1；+表示黏蛋白或神经递质转运体基因表达倍数 为1-1.5；++表示黏蛋白或神经递质转运体基因表达倍数为1.5-2；+++表示黏蛋白或神经递质转运体基因表达倍数》2；调节 水通道蛋白中-表示水通道蛋白基因表达倍数《1；+表示水通道蛋白基因表达倍数为0.5-1；++表示水通道蛋白基因表达倍数 为0.4-0.5；+++表示水通道蛋白基因表达倍数《0.1；
[0184]
表10 s869腹泻缓解功能开发结果
[0185][0186][0187]
注：细胞增殖中-表示细胞增殖率《0％；+表示细胞增殖率0-5％；++表示细胞增殖率5-10％；+++表示细胞增殖率》10％； 肠道黏膜屏障及调节水通道蛋白中-表示黏蛋白或神经递质转运体基因表达倍数《1；+表示黏蛋白或神经递质转运体基因表达 倍数为1-1.5；++表示黏蛋白或神经递质转运体基因表达倍数为1.5-2；+++表示黏蛋白或神经递质转运体基因表达倍数》2； 调节神经递质中-表示水通道蛋白基因表达倍数《1；+表示水通道蛋白基因表达倍数为0.5-1；++表示水通道蛋白基因表达倍 数为0.4-0.5；+++表示水通道蛋白基因表达倍数《0.1；
[0188]
s869可用于防治神经递质表达异常及产肠毒大肠杆菌感染引起的腹泻组合物中，且s869 在修复肠上皮细胞损伤及修复肠道黏膜屏障方面具有良好作用。
[0189]
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之 内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)s869，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.24190。2.一种嗜热链球菌菌制剂，其特征在于，含有权利要求1所述的嗜热链球菌，为固态或液态菌制剂。3.一种食品，其特征在于，含有权利要求1所述的嗜热链球菌或权利要求2所述的嗜热链球菌菌制剂。4.如权利要求1所述的嗜热链球菌s869或权利要求2所述的嗜热链球菌菌制剂在制备调节免疫的组合物中的应用，其特征在于，所述组合物包括食品、保健品、药品、饲料。5.如权利要求1所述的嗜热链球菌s869或权利要求2所述的嗜热链球菌菌制剂在制备用于促进raw264.7巨噬细胞的增殖和吞噬的组合物中的应用，其特征在于，所述组合物包括食品、保健品、药品、饲料。6.如权利要求1所述的嗜热链球菌s869或权利要求2所述的嗜热链球菌菌制剂在制备调节肠道功能的组合物中的应用，其特征在于，所述组合物包括食品、保健品、药品、饲料。7.如权利要求1所述的嗜热链球菌s869或权利要求2所述的嗜热链球菌菌制剂在制备用于预防和修复etec造成的肠上皮细胞损伤的组合物中的应用，其特征在于，所述组合物包括食品、保健品、药品、饲料。8.如权利要求1所述的嗜热链球菌s869或权利要求2所述的嗜热链球菌菌制剂在制备用于提高细胞黏蛋白muc2与muc5ac基因表达水平的组合物中的应用，其特征在于，所述组合物包括食品、保健品、药品、饲料。9.根据权利要求4-8任意一项所述的应用，其特征在于，所述组合物中包括嗜热链球菌s869活菌、灭活菌、代谢产物中的一种或多种。10.根据权利要求4-8任意一项所述的应用，其特征在于，所述组合物的剂型包括粉剂、颗粒剂、乳剂、片剂中的任一种。
技术总结本发明涉及微生物技术领域，提出了一种嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)S869，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24190。通过上述技术方案，解决了现有菌株中的活菌和灭活菌的免疫能力差异较大，且现有菌株无法同时具备较好的调节机体免疫以及调节肠道功能的问题。较好的调节机体免疫以及调节肠道功能的问题。较好的调节机体免疫以及调节肠道功能的问题。
技术研发人员：赵林森 杨玲 贾晓蒙 路江浩 郭润晴 李思童 李旭阳 鄢梦洁 张欢欢 梁丛丛
受保护的技术使用者：河北一然生物科技股份有限公司
技术研发日：2022.05.06
技术公布日：2022/11/1
