mettl3在缓解过敏性哮喘的气道炎症上的应用
技术领域
1.本发明涉及mettl3在缓解过敏性哮喘的气道炎症上的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术：2.支气管哮喘(简称哮喘)是一种由多种免疫细胞和炎症因子参与的慢性气道炎症性疾病。2010年全国城市儿童哮喘流行病学的调查发现，我国主要城市城区14岁以下儿童哮喘的累计患病率高达3.02％，相比较1990年的第一次调查结果0.91％增加至3倍(1)。研究揭示哮喘是一种复杂的异质性疾病，其中过敏性哮喘作为其重要表型之一，由遗传和环境因素共同调控，其发病机理十分复杂，至今尚未完全阐明(2)。目前哮喘的治疗主要依赖于糖皮质激素类药物和β2受体激动剂等，但这些药物都有其各自的用药局限性及相应的副作用。因此，深入探究儿童过敏性哮喘的发病机制，挖掘新的药物靶点及其靶向药物，具有重大的社会意义和经济效益。
3.巨噬细胞作为肺部最主要的免疫细胞之一，在所有免疫细胞中占比约为70％，可分为肺泡巨噬细胞和间质巨噬细胞(3)。巨噬细胞具有显著的异质性和可塑性。在不同环境因素下主要可以分化为经典激活的m1型和替代激活的m2型两种功能截然不同的亚型。m1型巨噬细胞主要由lps和ifn-γ等刺激分化而成，促进th1反应，在机体内参与促炎反应；另一方面，在il-4和il-13等刺激下巨噬细胞可以进一步激活为m2型巨噬细胞，m2型可进一步细分成m2a、m2b和m2c三种亚型。m2型可激活th2免疫细胞，从而发挥调节性或抑制性效应对抗急性炎症反应,参与组织修复以及过敏反应(4)。近来多项证据表明m2型巨噬细胞激活具有加重哮喘的作用。例如，在过敏性小鼠模型中，巨噬细胞主要为m2型，通过激活th2细胞来加重哮喘的发生(5)；在过敏性哮喘病人的肺泡灌洗液balf中m2型巨噬细胞表面的cd206分子的表达量比正常人高2.9倍，并且il-10等细胞因子的表达量显著升高(6)。因此，研究巨噬细胞的激活调控机制，对于探究儿童过敏性哮喘的发病机制、诊疗和预防措施都有着十分重要的意义。
4.腺嘌呤第6位氮原子甲基化(n6-methyladenosine，m6a)是真核生物mrna上最普遍和最丰富的转录后rna修饰。m6a修饰是一种动态可逆的修饰方式，修饰过程中主要涉及三类蛋白酶，包括甲基化转移酶、去甲基化酶和甲基化阅读蛋白，其中甲基化转移酶mettl3(methyltransferase-like 3)能够促进甲基化反应的发生(7)。近几年的研究表明，核rna输出、剪切、mrna稳定性和非编码rna的生成等各种细胞病理学过程都与m6a水平异常有关，揭示m6a参与调控多个重要的生命过程，如干细胞分化、动植物发育、癌症及免疫等(8-10)。然而目前关于m6a对巨噬细胞激活的调控及在儿童过敏性哮喘发病过程中的作用还知之甚少。
5.本发明研究中通过收集正常儿童和哮喘儿童患者的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,pbmcs)并从中分离培养巨噬细胞，发现甲基化转移酶mettl3在哮喘患儿的巨噬细胞中异常低表达，并参与负向调控关键下游基因正五聚蛋白
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技术实现要素：29.本发明要解决的技术问题之一是解决mettl3在缓解过敏性哮喘的气道炎症上如何应用的技术问题。
30.为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供mettl3在制备用于缓解过敏性哮喘的气道炎症药物上的应用。
31.本发明提供ptx3抑制剂在制备用于缓解过敏性哮喘的气道炎症药物上的应用。
32.本发明提供mettl3联合ptx3抑制剂在制备用于缓解过敏性哮喘的气道炎症药物上的应用。
33.相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
34.本发明公开了mettl3通过m6a修饰抑制下游正五聚蛋白ptx3的表达，从而负向调控m2型巨噬细胞激活，且巨噬细胞特异性敲除mettl3小鼠可通过促进ptx3的蛋白表达加重过敏性哮喘的气道炎症。因此mettl3和ptx3蛋白作为新的生物标志物及药物干预靶点，为治疗儿童过敏性哮喘带来了新的希望。
附图说明
35.图1为mettl3在过敏性哮喘儿童和正常儿童中表达差异图；
36.图2为巨噬细胞特异性敲除mettl3显著加重哮喘小鼠的气道炎症相关实验结果图；
37.图3为巨噬细胞特异性敲除mettl3促进哮喘小鼠的肺巨噬细胞m2型激活相关实验结果图；
38.图4为巨噬细胞敲除mettl3可通过m6a修饰促进下游关键基因ptx3蛋白的表达相关实验结果图；
39.图5为巨噬细胞特异性敲除mettl3小鼠中，下调ptx3的蛋白表达可以显著缓解哮喘小鼠的气道炎症的相关实验结果图；
具体实施方式
40.为使本发明更明显易懂，兹以实施例作详细说明如下：
41.本发明所采取的技术方案是提供mettl3在制备用于缓解过敏性哮喘的气道炎症药物上的应用。
42.本发明提供ptx3抑制剂在制备用于缓解过敏性哮喘的气道炎症药物上的应用。
43.本发明提供mettl3联合ptx3抑制剂在制备用于缓解过敏性哮喘的气道炎症药物上的应用。
44.实施例
45.一.相关实验材料和实验方法：
46.1.正常和过敏性哮喘儿童pbmcs和巨噬细胞分离收集：
47.收集正常和过敏性哮喘儿童的全血，与等体积的pbs混合后，采用ge公司的ficoll-paque(p＝1.077g/ml)进行梯度离心，吸取中间的一圈的白色细胞即为pbmcs。将获取的pbmcs进行cd14磁珠分选(miltenyi biotec公司)获得单核细胞，进一步地通过添加20ng/ml m-csf贴壁培养7天获取巨噬细胞。
48.2.实时荧光定量pcr(rt-qpcr)：
49.使用酚氯仿法抽提rna，mrna的逆转录采用primescript rt reagent kit(takara公司),逆转录后的cdna经sybr premix ex taq rt-pcr kit(takara公司)扩增，在abi viia7测序仪(thermo fisher scientific公司)上进行实时荧光定量pcr操作，并采用2-δδct
方法统计基因的表达水平。
50.3.蟑螂提取物诱导的小鼠过敏性哮喘模型实验：
51.巨噬细胞特异性敲除mettl3小鼠以及对照c57bl/6小鼠由上海南方模式公司构建以及提供，所有小鼠均在spf环境下饲养。
52.选取6-8周龄的c57bl/6小鼠，分别在第0天、1天、2天、14天将20μg蟑螂提取物(cre，greer laboratories公司)通过气管注射入小鼠体内，并在第20天和22天再次气管刺激，于第23天处死小鼠。在体内敲低ptx3的表达实验中，将5
×
106的ptx3 shrna慢病毒(shptx3)或者是对照病毒(shctrl)于第14天通过气管注射到小鼠体内。
53.4.流式检测分析：
54.收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,balf)，计数细胞总数目，并通过流式分析检测灌洗液中的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞等炎症细胞数量。
55.5.气道高反应性检测(airway hyperresponsiveness，ahr)：
56.用50mg/kg苯巴比妥麻醉小鼠，随后采用不同浓度的乙酰胆碱雾化处理小鼠，利用buxco research systems公司的finepointe resistance and compliance系统检测小鼠的气道高反应性，并用finepointe软件分析检测结果。
57.6.小鼠肺组织病理损伤分析：
58.将小鼠的肺组织用中性甲醛固定并进行石蜡切片，随后进行h&e和pas染色，分析其病理变化，并对病理损伤进行评分。
59.7.多色免疫荧光实验：
60.将小鼠的肺组织用中性甲醛固定并进行石蜡切片，随后采用上海爱必信公司的多重荧光免疫组化染色试剂盒对肺组织进行f4/80和cd206蛋白(抗体均来自proteintech公司)染色，最后采用dapi进行细胞核复染，并在莱卡共聚焦显微镜下拍摄。
61.8.小鼠骨髓来源的原代巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages，bmdms)和肺泡巨噬细胞的分离培养：
62.从c57/b6的小鼠股骨中提取骨髓，裂解红细胞，pbs洗涤2次，离心去上清，培养于dmem(加10％小牛血清，加100u/ml青霉素-链霉素，加10ng/ml m-csf)，培养至7天，传代获取bmdms。小鼠bmdms中使用的敲低病毒(shptx3)及相应的阴性对照来自上海吉玛公司。
63.分离哮喘模型小鼠的肺组织，用剪刀将其剪至1-2cm的碎块，采用miltenyi biotec公司的肺组织解离试剂盒和全自动组织处理器对上述碎块组织进行37℃消化半小时，获得单细胞悬液；随后将细胞悬液进行滤网过滤，离心弃去上清并裂解红细胞，离心弃去上清；最后加入cd11b磁珠并通过磁珠分选以及24小时的贴壁来获得肺泡巨噬细胞。
64.9.免疫印迹实验(western blot)：
65.分离的小鼠bmdms培养于6孔板中，24小时后，除去上清并用ripa lysis buffer(thermo fisher scientific公司)裂解法抽提总蛋白。采用抗体mettl3(cell signaling technology公司)，β-tubulin(abcam公司)对目的蛋白进行孵育，并在bio-rad公司的多功能成像分析仪下拍摄分析。
66.10.酶联免疫吸附实验(elisa)：
67.使用duoset elisa kit(r&d systems公司)检测细胞培养上清的的il-10和tnf-α蛋白水平，以及人血浆或小鼠血清中ptx3的蛋白水平。
68.11.mrna稳定性实验：
69.分离的小鼠bmdms培养于24孔板中，采用500ng/ml放线菌素d分别处理上述细胞0小时、1小时、2小时和3小时，随后收集细胞并抽提rna，进行rt-qpcr检测。
70.12.数据统计分析：
71.数据利用graphpad prism 7.0软件进行统计分析，按照means
±
sem表示数据及组内差异，采用双尾student’s t test和one-way anova探究两个或多个实验组间的差异，以及pearson进行相关性分析，*p《0.05表示具有统计学差异。
72.二.实验结果：
73.1.mettl3在过敏性哮喘儿童的巨噬细胞中异常低表达；
74.通过从复旦大学附属儿科医院收集40例正常儿童和40例过敏性哮喘儿童的pbmcs以及巨噬细胞样本，并进行rt-qpcr检测，发现mettl3在过敏性哮喘儿童的pbmcs和巨噬细胞中的表达水平都显著降低(如图1a和图1b)。进一步地对哮喘患儿巨噬细胞中mettl3的表达水平进行了roc曲线分析，结果显示其曲线下面积(auc)是0.72(如图1c)。同时，也检测到哮喘患儿巨噬细胞中mettl3的表达水平与反映嗜酸性气道炎症的外周血嗜酸性粒细胞数目(eosinophils number)和呼出气一氧化氮(feno)水平均呈负相关，与反映肺功能障碍的第1秒用力呼气容积(％fev1)水平呈正相关(如图1d)。这些结果揭示巨噬细胞中的mettl3基因极有可能参与到儿童过敏性哮喘的发生发展过程中，是一种潜在的新型生物标志物。
75.如图1所示；rt-qpcr检测mettl3在过敏性哮喘患儿(40例)和正常儿童(40例)，图a中pbmcs和图b中巨噬细胞中的表达水平；图c为哮喘患儿和对照组巨噬细胞中mettl3 mrna表达水平的roc曲线分析；图d为pearson分析哮喘患儿巨噬细胞中mettl3水平与外周血嗜酸性粒细胞数目(eosinophils number)、呼出气一氧化氮(feno)和第1秒用力呼气容积(％fev1)水平的相关性。
76.2.在蟑螂提取物诱导的过敏性哮喘小鼠模型中，巨噬细胞特异性敲除mettl3显著加重小鼠的气道炎症；
77.构建巨噬细胞特异性敲除mettl3的小鼠(mettl3 ko)，western blot结果显示与野生型小鼠(wt)相比，mettl3 ko小鼠bmdms中mettl3的表达水平降低了75％以上，证明巨噬细胞中mettl3蛋白特异敲除成功(如图2a)。随后结合蟑螂提取物(cre)诱导的小鼠过敏性哮喘模型，收集肺泡灌洗液(balf)进行计数以及流式检测分析，发现与pbs wt组小鼠相比，cre wt组小鼠的balf中总细胞数量和嗜酸性粒细胞数目都是明显增加的，而在cre mettl3 ko组小鼠中这一现象更加显著(如图2b和2c)。再者，采用不同剂量的乙酰胆碱刺激，发现与cre wt组小鼠相比，cre mettl3 ko组小鼠的气道反应性显著加强(如图2d)；最后，对肺组织进行h&e以及pas染色来检测评估肺组织的病理状态，结果显示与cre wt组小鼠相比，cre mettl3 ko组小鼠的肺呈现出更加严重的病理损伤，例如炎症细胞的浸润、杯状细胞的增生和粘液的分泌等都显著增加(如图2e和2f)。以上体内实验结果表明体内巨噬细胞缺失mettl3可以显著加重过敏性哮喘小鼠的气道炎症。
78.如图2所示为巨噬细胞特异性敲除mettl3显著加重哮喘小鼠的气道炎症。图2a为western blot检测wt和mettl3 ko组小鼠bmdms中mettl3的蛋白表达水平，以及蟑螂提取物(cre)诱导的过敏性哮喘模型的构建示意图；图2b为小鼠肺气泡灌洗液(balf)中总细胞计数；图2c为流式检测分析balf中嗜酸性粒细胞等免疫细胞的数目；图2d为采用不同浓度的
乙酰胆碱刺激上述模型小鼠，检测小鼠的气道高反应性；图2e为肺组织切片的h&e和pas染色；图2f为肺组织病理损伤评分统计图。
79.3.巨噬细胞特异性敲除mettl3，通过促进肺巨噬细胞m2型激活来加重哮喘小鼠的气道炎症：
80.鉴于巨噬细胞的m2型激活在肺功能以及哮喘发病机制中的重要作用，分离培养wt和mettl3 ko组小鼠的bmdms并分别进行il-4和lps刺激诱导m2型或m1型巨噬细胞，rt-qpcr和elisa实验结果都证实在巨噬细胞中缺失mettl3不仅能够明显促进il-4诱导的m2型活化相关基因(il-10、cd206和arg-1)的表达，而且可以显著抑制lps诱导的m1型活化相关基因(tnf-α、il-6和il-1β)的表达(如图3a和3b)。同时，通过分离哮喘小鼠肺泡巨噬细胞，rt-qpcr检测显示与cre wt组小鼠相比，cre mettl3 ko组小鼠肺组织的巨噬细胞中m2型活化相关基因的表达水平都是显著升高的(如图3c)。进一步地结合流式检测分析以及多色免疫荧光实验，也发现与cre wt组小鼠相比，cre mettl3 ko组小鼠肺组织中的m2型巨噬细胞(cd206+/f4/80+)数目也是明显上调的(图3d和3e)。综上，这些体内数据揭示巨噬细胞中缺失mettl3可以通过促进m2型巨噬细胞的激活进而加重哮喘小鼠的气道炎症。
81.如图3所示为巨噬细胞特异性敲除mettl3促进哮喘小鼠的肺巨噬细胞m2型激活的相关实验结果图。图3a为分离培养wt和mettl3 ko小鼠的bmdms，rt-qpcr分别检测il-4诱导的m2型活化以及lps诱导的m1型活化相关基因表达水平；图3b为elisa检测巨噬细胞分泌的il-10和tnf-α蛋白水平；图3c为分离培养哮喘小鼠肺泡巨噬细胞，rt-qpcr检测m2型活化相关基因的表达水平；图3d为流式检测分析肺组织中的m2型巨噬细胞(cd206+)激活情况(左图)，并进行平均荧光度(mfi)统计(右图)；图3e为多色免疫荧光实验分析哮喘小鼠肺组织中的m2型巨噬细胞(cd206+/f4/80+)数目。
82.4.巨噬细胞敲除mettl3可通过m6a修饰促进下游关键基因ptx3蛋白的表达：
83.通过m6a高通量测序以及结合iga软件分析，发现正五聚蛋白ptx3的3’utr区域存在着多个m6a修饰位点(图4a)，因此可以合理的推测mettl3极有可能通过m6a修饰调控ptx3的表达水平。随后，通过rt-qpcr和elisa实验结果证实巨噬细胞中敲除mettl3确实能够显著提高ptx3的mrna和分泌蛋白水平(如图4b)；同时，通过对巨噬细胞进行放线菌素d处理，发现敲除mettl3能够显著减缓ptx3 mrna的降解，从而提高ptx3的mrna稳定性和表达水平。进一步地，在上述40例哮喘患儿巨噬细胞以及血浆样本中进行rt-qpcr和elisa实验检测，发现相比于正常样本，ptx3的表达水平是显著升高的(如图4d)；roc曲线分析结果显示其曲线下面积(auc)是0.73(如图4e)，并且ptx3的高表达与外周血嗜酸性粒细胞数目(eosinophils number)和呼出气一氧化氮(feno)水平均呈正相关。以上结果说明在巨噬细胞中敲除mettl3可通过m6a修饰来促进ptx3的蛋白表达，且高表达的血浆ptx3蛋白水平与患儿哮喘的气道炎症程度密切相关。
84.如图4所示；巨噬细胞敲除mettl3通过m6a修饰促进下游关键基因ptx3蛋白的表达。如图4a所示结合m6a高通量测序，igv软件显示巨噬细胞中缺失mettl3之后ptx3 mrna转录本上m6a位点分布图；如图4b所示，为分离wt和mettl3 ko小鼠的bmdms，rt-qpcr检测ptx3的mrna表达水平，elisa检测分泌的蛋白水平实验结果图；图4c为对wt和mettl3 ko小鼠进行放线菌素d(actd)处理，rt-qpcr检测ptx3的mrna表达水平图；图4d为rt-qpcr和elisa分别检测ptx3在哮喘患儿(40例)和正常儿童(40例)巨噬细胞中以及血浆中的表达水平图；图
4e为哮喘患儿和对照组血浆中ptx3蛋白水平的roc曲线分析图；图4f为pearson分析哮喘患儿血浆中ptx3蛋白水平与外周血嗜酸性粒细胞数目(eosinophils number)和呼出气一氧化氮(feno)水平呈现正相关图。
85.5.在巨噬细胞特异性敲除mettl3小鼠中，下调ptx3的蛋白表达可以显著缓解哮喘小鼠的气道炎症；
86.近来的研究揭示ptx3基因为先天体液免疫的重要组成成分，在m2型巨噬细胞激活过程中扮演着重要角色(11)。在小鼠的bmdms中采用ptx3 shrna慢病毒(shptx3)敲低ptx3并进行il-4刺激诱导m2型巨噬细胞，rt-qpcr和elisa实验结果都证实降低ptx3的表达能够明显抑制m2型活化相关基因的表达(如图5a)。随后，在巨噬细胞特异性敲除mettl3小鼠以及哮喘小鼠的基础上，采用shptx3体内下调ptx3的表达，检测ptx3蛋白在过敏性哮喘中的干预治疗作用(如图5b)。首先，elsia检测证实了与cre wt+shctrl组小鼠相比，cre mettl3ko+shctrl组小鼠中血清中ptx3蛋白显著升高，而敲低ptx3之后(cre mettl3ko+shptx3组)其蛋白水平显著下降(如图5c)，证明体内ptx3蛋白敲除成功。其次，发现相对于cre mettl3 ko+shctrl组小鼠来说，cre mettl3 ko+shptx3组小鼠的balf中总细胞和嗜酸性粒细胞等数目都显著下降(如图5d和5e)，并且其气道高反应性也减弱(如图5f)。再者，病理分析揭示与cre mettl3ko+shctrl组小鼠相比，cre mettl3 ko+shptx3组小鼠的气道炎症也得到了有效缓解，例如炎症细胞的浸润、杯状细胞的增生和粘液的分泌都大大减少(如图5g)。以上体内实验结果表明在巨噬细胞特异性敲除mettl3小鼠中，下调ptx3的蛋白表达可以显著缓解哮喘小鼠的气道炎症。
87.如图5所示，在巨噬细胞特异性敲除mettl3小鼠中，下调ptx3的蛋白表达可以显著缓解哮喘小鼠的气道炎症。如图5a所示，在小鼠的bmdms中分别加入ptx3 shrna(shptx3)或ctrl(shctrl)慢病毒,rt-qpcr检测il-4诱导的m2型活化相关基因表达水平，elisa检测分泌的il-10蛋白水平图；图5b为巨噬细胞特异性敲除mettl3小鼠以及哮喘小鼠体内下调ptx3蛋白的构建示意图；图5c为elisa检测ptx3蛋白在各处理组小鼠血清中的表达水平图；图5d为小鼠肺气泡灌洗液(balf)中总细胞计数图；图5e为流式检测分析balf中嗜酸性粒细胞等免疫细胞的数目；图5f为小鼠的气道高反应性检测结果图；图5g肺组织切片的h&e和pas染色，以及病理损伤评分统计图。
88.三.结论：
89.在过敏性哮喘患儿的pbmcs和巨噬细胞中，发现m6a甲基化转移酶mettl3异常低表达，且与患儿的气道炎症程度呈现负相关。在小鼠过敏性哮喘模型中，证实巨噬细胞特异性敲除mettl3可以通过促进肺巨噬细胞m2型激活来加重哮喘小鼠的气道炎症。进一步地机制分析揭示mettl3可以依赖m6a修饰下调下游关键基因正五聚蛋白ptx3的表达，从而抑制m2型巨噬细胞激活。高表达的血浆ptx3蛋白水平与患儿哮喘的气道炎症程度呈现正相关，而在巨噬细胞特异性敲除mettl3小鼠中下调ptx3的蛋白表达又可以显著缓解哮喘小鼠的气道炎症。以上结果表明揭示mettl3/ptx3轴通过调控巨噬细胞m2型激活参与到过敏性哮喘的发病过程中。
90.近30年来儿童过敏性哮喘发病率明显上升，其主要的发病机理是由于th2细胞介导的免疫反应紊乱导致嗜酸性粒细胞的浸润、ige抗体产生以及组胺的释放等(12)。值得注意的是，近来多项研究揭示先天免疫系统是哮喘发生的另一重要发病机制，其中m2型巨噬
细胞激活在其中发挥关键作用。例如，儿童过敏性哮喘外周血中发现了显著增加的m2型巨噬细胞(13)；在尘螨诱发的小鼠过敏性哮喘模型中，m2型巨噬细胞的数量与气道炎症的严重程度呈现正相关，而将表达il-4受体的m2型巨噬细胞注入到小鼠中，能够明显加重肺部炎症反应(14,15)；长链非编码rna可通过调控组蛋白修饰来介导m2型巨噬细胞激活，从而参与过敏性哮喘的发病过程(16)。因此，通过抑制异常活化的m2型巨噬细胞，将可以有效治疗和缓解过敏性哮喘疾病的发生发展，然而人们目前对m2型巨噬细胞激活的调控并不是十分清楚。
91.mettl3是最早报道的m6a甲基化转移酶，大量的研究数据表明mettl3通过m6a修饰发挥生物学效应的可能机制包括非编码rna基因调控、mrna稳定性及翻译等靶向调控下游信号因子。例如，chen等发现在原发性肝癌中过表达的mettl3会增加抑癌基因socs2的m6a修饰水平，使抑癌基因socs2的mrna加速降解，从而促进癌细胞增殖、迁移和集落形成等(17)；patil等发现长链非编码rna xist是高度甲基化的，敲除mettl3会损害xist介导的x染色体基因沉默(18)。这些研究都揭示mettl3在人类的多种疾病的调控过程中起到极其重要的作用，有在未来成为疾病的新型生物标志物的潜力。然而目前关于mettl3对巨噬细胞激活的调控及在儿童过敏性哮喘发病过程中的作用还知之甚少。而通过分离收集过敏性哮喘患儿和正常儿童的pbmcs和巨噬细胞，发现哮喘患儿巨噬细胞中低表达的mettl3与患儿的气道炎症程度呈现负相关。更为重要的是，在过敏性哮喘小鼠模型中，证实巨噬细胞特异性敲除mettl3可以通过促进肺巨噬细胞m2型的激活来加重哮喘小鼠的气道炎症，揭示mettl3在儿童过敏性哮喘的发病过程中发挥重要作用，是一种潜在的新型生物标志物。
92.接着进一步证实mettl3可以通过改变m6a修饰水平来抑制下游关键基因正五聚蛋白ptx3的表达，从而抑制m2型巨噬细胞激活。长链正五聚蛋白ptx3是一类多功能保守的蛋白，可以由多种类型的细胞受刺激产生，例如巨噬细胞、髓样树突状细胞、血管内皮细胞等。ptx3蛋白作为先天体液免疫的重要组成成分，可以通过模式识别外源性微生物和激活补体等机制发挥功能，在脓毒症和心血管疾病等多种疾病中发挥着重要作用(19,20)，并可作为脓毒症和慢性肺阻(copd)等疾病的生物标志物(21,22)。过敏性哮喘患儿血浆中高表达的ptx3蛋白水平与患儿的气道炎症程度呈现正相关，并且证实在巨噬细胞特异性敲除mettl3小鼠中下调ptx3的蛋白表达可以显著缓解哮喘小鼠的气道炎症，揭示mettl3/ptx3轴通过调控巨噬细胞m2型激活从而参与到儿童过敏性哮喘的发生发展。
93.综上，m6a修饰作为一种表观遗传调控修饰，在人类多种疾病的发病过程中都扮演重要角色。不同于以往的有或无的调节特点，mettl3参与的m6a修饰主要是在数量上对靶基因进行调节，这一特点是sirna单靶点强大的调节作用或一些分子的拮抗剂和激动剂所无法比拟的，展示了其在临床应用方面的巨大前景。本研究首次发现mettl3通过m6a修饰抑制下游正五聚蛋白ptx3的表达，从而负向调控m2型巨噬细胞激活，且巨噬细胞特异性敲除mettl3小鼠可通过促进ptx3的蛋白表达加重过敏性哮喘的气道炎症。因此mettl3和ptx3蛋白可能作为新的生物标志物及药物干预靶点，为治疗儿童过敏性哮喘带来新的希望。
94.以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、
修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
技术特征：1.mettl3在制备用于缓解过敏性哮喘的气道炎症药物上的应用。2.ptx3抑制剂在制备用于缓解过敏性哮喘的气道炎症药物上的应用。3.mettl3联合ptx3抑制剂在制备用于缓解过敏性哮喘的气道炎症药物上的应用。
技术总结本发明涉及METTL3在缓解过敏性哮喘的气道炎症上的应用，属于生物医药技术领域。本发明提供一种METTL3在制备用于缓解过敏性哮喘的气道炎症药物上的应用；PTX3抑制剂在制备用于缓解过敏性哮喘的气道炎症药物上的应用；以及METTL3联合PTX3抑制剂在制备用于缓解过敏性哮喘的气道炎症药物上的应用。性哮喘的气道炎症药物上的应用。性哮喘的气道炎症药物上的应用。
技术研发人员：韩晓 刘丽娟 黄赛花
受保护的技术使用者：复旦大学附属儿科医院
技术研发日：2022.06.22
技术公布日：2022/11/1
