一种筛选和识别具有抗衰老属性的小分子的方法
【技术领域】
1.本发明专利涉及医药技术领域，尤其涉及一种筛选和识别具有抗衰老属性的小分子的方法。
背景技术：2.大麻二酚(cbd)是在大麻中发现的一种主要的非精神科植物大麻素，已被用于多种疾病的治疗和临床试验，包括慢性疼痛、厌食症、恶心、痉挛和多发性硬化症。大麻二酚还被用于治疗多种皮肤病，包括痤疮、特应性皮炎、银屑病、皮肤癌、瘙痒症和疼痛。大麻二酚还被用作抗衰老补充剂和皮肤护理产品。
3.例如，美国专利公布us20190216695披露了用于淡化肤色的方法，包括局部施用含有大麻素、大麻二酚、大麻二酚类似物或其组合的组合物。然而，上述现有技术参考文献并没有披露筛选和识别小分子的方法。
4.又例如，中国发明专利cn114272356公开了一种用于延缓衰老的药物组合物的配方及其制备方法。所述具体配方含有β-葡聚糖、壳聚糖、辅酶q10、cbd(即大麻二酚)、谷胱甘肽、硫辛酸、叶黄素、烟酰胺、维生素b2。然而，该现有技术参考文献没有提到筛选和识别小分子的方法。
5.鉴于cbd应用场景的不断扩展，因此希望有一种快速且有效的方法来筛选和识别具有抗衰老作用的小分子，同时也希望能对其在哺乳动物身上的应用进行研究。
6.本发明提供了一种通过使用细胞模型(即早熟衰老小鼠胚胎成纤维细胞和人类hgps间充质干细胞)以及动物模型(即过早熟衰老小鼠和秀丽隐杆线虫)，来筛选和识别具有抗衰老属性的小分子的方法。根据本发明的实施方式，大麻二酚(cbd)被确定为一种抗衰老的小分子，具有潜在的抑制衰老作用。
技术实现要素：7.lamin a(lmna
g609g/g609g
)核纤层蛋白a突变小鼠是人类hgps(hutchinson gilford progeria syndrome，早衰症)的模型。hgps是由于人类lmna(核纤层蛋白a)的点突变引起的，导致产生截断形式的lmna蛋白，称为早衰素。早衰素的表达水平在老年人中也会增加。hgps综合症导致多种组织的过早衰老，因此被用作研究衰老和与衰老有关的退行性疾病的模型。
8.根据本发明，早衰小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)和人类间充质干细胞(mscs)用于筛选可延缓衰老的小分子，初步结果在2到3周的时间内即可获得。具有抗衰老属性的小分子被进一步使用动物模型进行测试，即秀丽隐杆线虫和早衰小鼠。秀丽隐杆线虫是一种蛔虫，几十年来一直被大量用于衰老研究，主要是因为它们的寿命相对较短，大约3周。多种类别的小分子可以在很短的时间内在秀丽隐杆线虫(c.elegans)上进行测试。对于早衰的
lmna
g609g/g609g
突变小鼠，它们的寿命为4至6个月。小分子对其健康期的影响，最快2到3个月就可以获得结果。
9.本发明利用2个细胞模型和2个动物模型，可以有效识别具有抗衰老属性的小分子。整个过程只需要4到5个月。识别出的抗衰老小分子可用于衰老相关退行性疾病的临床试验或促进健康衰老的补充剂。
10.根据本发明，大麻二酚(cbd)被确定为哺乳动物的抗衰老小分子。此外，不同实施方式中使用的cbd浓度有很大的变化，其范围从0.01μm到50μm。众所周知，细胞对不同浓度的cbd的反应是非常不同的。与高浓度的cbd处理相比，低浓度的cbd处理可以对基因表达产生相反的影响。根据本发明，已经确定了cbd的最佳浓度，以最大限度地发挥其对衰老的有益作用。导致不利影响的cbd浓度也已被确定。本发明的实施方式确定了使用cbd的最佳浓度，该浓度可对人类产生最有益的影响。
11.根据本发明的第一方面，提供一种筛选和识别具有抗衰老属性的小分子的方法。
12.根据本发明的第二方面，具有抗病毒属性的小分子是cbd。
13.根据本发明的第三方面，所述小分子在处理中的最佳浓度为10-20μm。
14.根据本发明的第四方面，提供了所筛选和识别的小分子在制备用于治疗代谢紊乱、衰老相关退行性疾病、脱发和伤口愈合的药物中的用途。
15.根据本发明的第五方面，提供了经筛选和识别的小分子用于治疗代谢紊乱、衰老相关退行性疾病、脱发和伤口愈合的用途，通过向哺乳动物施用所述小分子并调节蛋白质的表达。
16.根据本发明的第六方面，提供了所筛选和识别的小分子用于治疗代谢、衰老相关退行性疾病的用途，通过施用所述小分子，调节蛋白质atf5、cebpα和trib3的表达。
17.除非另有定义，本文使用的所有技术术语和/或科学术语与本发明相关技术领域普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本文描述的方法和材料相似或相当的方法和材料可被用于本发明实施例的实施或测试，但本文描述的方法和/或材料是示例性的,即这些材料、方法和实施方式仅为说明性的，并不产生对本发明的限制。
【附图说明】
18.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方式，下面将对实施例中所使用的附图作简单地介绍。需要强调的是，本说明书下面描述中的附图仅仅是本专利中记载的一些实施例，仅以举例的方式，参照附图对本发明的一些实施例进行了描述。对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
19.在附图中：
20.图1是筛选、识别、验证具有抗衰老属性的小分子的方法流程图。
21.图2说明了cbd对野生型和lmna
g609g/g609g
小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)群体倍增的影响。wt代表野生型mefs，而609代表lmna
g609g/g609g mefs。【*代表p值在0.01和0.05之间，**代表p值在0.001和0.01之间，***代表p值在0.0001和0.001之间。(a,b)条形图显示4天cbd处理对野生型和lmna
g609g/g609g mefs的群体倍增水平(pdl)的影响。(c,d)条形图显示8天cbd处理对野生型和lmna
g609g/g609g mefs的pdl的影响。】
22.图3说明了cbd对野生型和lmna
g609g/g609g mefs的衰老水平的影响。wt代表野生型
mefs，609代表lmna
g609g/g609g mefs。【*代表p值在0.01和0.05之间，**代表p值在0.001和0.01之间，***代表p值在0.0001和0.001之间。(a,b)条形图显示4天高剂量(50μm)的cbd处理分别显著增加了野生型和lmna
g609g/g609g mefs的衰老水平。(c,d)条形图显示8天最佳剂量(10μm)的cbd处理分别显著降低了野生型和lmna
g609g/g609g mefs的衰老水平。】
23.图4说明了cbd对野生型和lmna
g609g/g609g mefs的核圆度的影响。wt代表野生型mefs，而609代表lmna
g609g/g609g mefs。【*代表p值在0.01和0.05之间，**代表p值在0.001和0.01之间，***代表p值在0.0001和0.001之间。12天的cbd处理明显增加了lmna
g609g/g609g mefs的核圆度。】
24.图5说明了cbd对野生型和lmna
g609g/g609g mefs衰老标记蛋白的影响。wt代表野生型mefs，而609代表lmna
g609g/g609g mefs。通过western免疫印迹法(western blotting method)，4天的cbd处理明显下调了野生型和lmna
g609g/g609g mefs的衰老标记蛋白,即蛋白p21和蛋白p16，其中β-肌动蛋白(β-actin)作为加载对照。
25.图6说明了cbd对早衰lmna
g609g/g609g
小鼠的健康期和秀丽隐杆线虫(c.elegans)的生命期的影响。【*代表p值在0.01和0.05之间，**代表p值在0.001和0.01之间，***代表p值在0.0001和0.001之间。(a)接受10或20μm cbd处理的秀丽隐杆线虫显示出明显的寿命增长。对于对照组，n＝30；对于10μm cbd组，n＝25；对于20μm cbd组，n＝15。(b)从2个月大开始，每周两次接受50毫克/千克cbd处理的小鼠，健康期明显增加，增加了11.2％，其中对于对照组，n＝10。对于处理组，n＝9。】
26.图7说明了cbd对早衰lmna
g609g/g609g
小鼠的骨髓基质细胞集落形成能力的影响。(wt代表野生型小鼠，609代表lmna
g609g/g609g
小鼠。【*代表p值在0.01和0.05之间，**代表p值在0.001和0.01之间，***代表p值在0.0001和0.001之间。(a)从野生型、lmna
g609g/g609g
对照组和lmna
g609g/g609g cbd处理小鼠中分离出的骨髓基质细胞的结晶紫染色集落形成实验。(b)cbd结晶紫染色集落形成实验的量化。由图可见，cbd明显挽救了早衰的lmna
g609g/g609g
小鼠的骨髓基质细胞的下降。】
27.图8说明了cbd对早衰lmna
g609g/g609g
小鼠皮肤的早衰特征的影响。wt代表野生型小鼠，609代表lmna
g609g/g609g
小鼠。苏木精-伊红染色实验结果显示早衰的lmna
g609g/g609g
小鼠的皮肤毛囊密度和皮肤脂肪层的宽度下降，而这些都被cbd处理所挽救。
28.图9显示了cbd对早衰lmna
g609g/g609g
小鼠肝脏中衰老水平的影响。wt代表野生型小鼠，609代表lmna
g609g/g609g
小鼠。衰老相关的β-半乳糖苷酶染色实验结果显示早衰lmna
g609g/g609g
小鼠肝脏中的衰老水平增加，而cbd处理可以挽救这种情况。
29.图10说明了野生型和lmna
g609g/g609g mefs接受对照或cbd处理的rna测序的生物信息学分析结果。(wt_c代表接受对照处理的野生型mefs，wt_10代表接受10μm cbd处理的野生型mefs，mut_c代表接受对照处理的lmna
g609g/g609g mefs，mut_10代表接受10μm cbd处理的lmna
g609g/g609g mefs。【(a)维恩图显示野生型和lmna
g609g/g609g mefs在对照或cbd处理下差异表达基因的比较。(b)转录因子，即激活转录因子5(atf5)、ccaat增强子结合蛋白α(cebpα)、组蛋白乙酰转移酶抑制因子的新型抑制剂(nir)和蛋白激酶,即丝裂原活蛋白激酶3(map4k3)和tribbles假激酶3(trib3)通过rna测序识别为野生型和lmna
g609g/g609g mefs中cbd处理显示差异性表达的基因。(c)atf5、cebpα和trib3的蛋白质相互作用网络。这种网络还包括众所周知的其他衰老相关基因，包括tp53、pten、pcna、ep300等。这表明由cbd处理引
起的atf5、cebpα和trib3路径的不同表达有助于其抗衰老作用。】
30.图11显示了cbd对早衰lmna
g609g/g609g
小鼠皮肤中通过rna测序确定的目标水平的影响。(wt代表野生型小鼠，609代表lmna
g609g/g609g
小鼠。【(a)免疫荧光染色显示trib3在早衰的lmna
g609g/g609g
小鼠皮肤中下调，而cbd处理可以挽救这一现象。(b)免疫荧光染色显示atf5在早衰的lmna
g609g/g609g
小鼠皮肤中下调，但被cbd处理所挽救。(c)免疫荧光染色显示cebpα在早衰的lmna
g609g/g609g
小鼠的皮肤中下调，这被cbd处理所挽救。】
31.图12说明了cbd在辐照诱导衰老时对间充质干细胞(mscs)的抑制老化作用。non-ir代表非辐照的间充质干细胞，而ir代表辐照的间充质干细胞。【*代表p值在0.01和0.05之间，**代表p值在0.001和0.01之间，***代表p值在0.0001和0.001之间。(a)条形图显示cbd处理在辐照诱导衰老时对间充质干细胞的pdl的衰老作用。(b)通过western免疫印迹法实验(western blotting)，结果显示6小时10μm的cbd处理明显降低了衰老标记蛋白p21、bcl-2抗凋亡家族成员中bcl-w、bcl-xl和mcl-1蛋白的水平，同时上调了辐照样品中的trib3(其中β-actin,即β-肌动蛋白作为加载对照)，这有助于cbd的抗衰老效应。结果还显示6小时的10μm cbd处理明显提高了非辐照样品中p-akt(蛋白激酶b)的水平，这也有助于cbd的抗衰老作用(其中akt作为加载对照)。】【缩写语】
【具体实施方式】
32.下面将结合以下实施例对本发明作进一步描述。应该理解的是，以下实施例仅用于说明本发明，但不用于限制本发明的保护范围。在以下实施例中没有指出具体条件的地方，是按照常规条件或参照制造商的协议进行的。所使用的仪器或试剂，如果没有指明制造商，则为商业上可获得的常规产品。
33.本发明的一个实施方式利用早衰lmna
g609g/g609g
小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)、人类间充质干细胞(mscs)、秀丽隐杆线虫(caenorhabditis elegans)和早衰lmna
g609g/g609g
小鼠来快速筛选出抗衰老的小分子。lmna g609g突变小鼠是早衰综合症(hutchinson gilford progeria syndrome，简称早衰症，缩写hgps)的模型。
34.根据本发明的实施方式，cbd被确定为一种具有抗衰老属性的小分子，具有通过调节akt和bcl-2抗凋亡家族路径从而抑制衰老。本发明发现和验证了新的衰老相关基因，包括trib3、atf5和cebpα，这些基因可以作为新的基因靶点，用于开发新的抗衰老干预措施。
35.根据本发明的实施例，提供了一种筛选和识别具有抗衰老功能和属性的小分子的方法。图1是一种筛选和识别具有抗衰老功能的小分子的方法的流程图。参照图1，该方法包括以下步骤：步骤(a)：从杂合子小鼠中分离小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)；步骤(b)：通过用不同浓度的小分子处理步骤(a)的mefs，确定细胞的增殖率和小分子的最佳浓度，并计算细胞的pdl(群体加倍水平)；步骤(c)：通过对步骤(a)的mefs进行染色，用不同浓度的小分子处理所述mefs，然后计算染色和未染色细胞的数量，确定步骤(a)的mefs的衰老水平和小分子的最佳浓度；步骤(d)：通过用不同浓度的小分子处理，确定步骤(a)的mefs的相对核圆度，然后测定不同核圆度的细胞百分比；步骤(e)：通过用小分子处理细胞，确定步骤(a)的mefs的衰老标记蛋白的蛋白表达水平，然后测量衰老标记蛋白的蛋白表达水平，其中衰老标记蛋白是蛋白p21和p16；步骤(f)：通过分析秀丽隐杆线虫在不同浓度的小分子处理下的生命期来确定小分子的最佳浓度；步骤(g)：通过分析lmna
g609g/g609g
小鼠在不同浓度的小分子处理下的健康期来确定小分子的最佳浓度；步骤(h)：通过分离小鼠的骨髓基质细胞并进行结晶紫染色集落形成实验来验证小分子的抗衰老作用；以及步骤(i)：通过对小鼠皮肤和肝脏进行组织学分析来证实小分子的抗衰老作用。
36.利用如图1所述的方法，可以快速筛选和识别小分子是否具有抗衰老属性。本实施例的材料和方法详述如下。步骤(a)：小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)的分离
37.在分离小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)的步骤中，设置杂合子(lmnag609g/+)小鼠进行交配。在交配后的次日早上，通过检查阴道塞子来确定小鼠的怀孕日期。如果发现阴道塞，则认为该小鼠怀孕0.5天(e0.5)。当胚胎达到e12.5至e13.5时，牺牲怀孕的小鼠，并在组织培养罩内用无菌器具将胚胎从小鼠身上分离出来。胚胎被放置在磷酸盐缓冲盐水(pbs)中。他们的头部和肝脏被移除。头部的一部分被用于基因分型，以确定每个胚胎的基因型。每个胚胎的身体被转移到12孔板的1ml 0.1％胰蛋白酶-edta溶液中。使用无菌剪刀，将胚胎切成小块。然后将12孔板放在37℃的孵化器中10分钟。然后将胚胎置于胰蛋白酶-edta溶液中，大力震荡直到胚胎完全溶解在溶液中。然后将12孔板放在37℃培养箱中5分钟。然后将均质化的溶液转移到9毫升的gibco公司生产的高糖达氏修正依氏培养基(dmem)中，补充碳酸氢钠(3.7g/l)、hepes缓冲液(6g/l)、10％胎牛血清(fbs)和青霉素-链霉素(100单位/毫升)。分离得到的mefs被认为是在第0阶段(p0，或称第0代)。3代mefs被用于实验中，因为它们对刺激有最佳的细胞反应。原代小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)在补充有碳酸氢钠(3.7g/l)和10％胎牛血清(fbs)的gibco公司生产的高糖达氏修正依氏培养基(dmem)中培养。步骤(b)：确定细胞的增殖率和最佳浓度
38.在确定细胞增殖率和最佳浓度的步骤中，使用luna-ii自动细胞计数器对3代小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)进行计数。1.0x105个细胞被传到到6孔板的一个孔中。用dmso作为对照，分别用10μm或50μm浓度的cbd处理细胞。在4天和8天的处理后，用luna-ii自动细胞计数器再次对细胞进行计数。反映细胞增殖率的群体倍增水平(pdl)按公式n＝3.32
×
(logucy-logi)+x计算，其中n＝pdl数量，ucy＝该时间点的细胞产量，i＝初始细胞数量，x＝用于启动被定量的亚培养的细胞的倍增水平。
39.参照图2a-d，对于大麻二酚(cbd)处理，最佳浓度为10μm，其在处理4天和8天后使pdl增加到最大程度。参照图2a-b，而4天的50μm cbd处理导致pdl的减少，这表明由于高浓度而产生的毒性效应。步骤(c)：确定衰老水平和最佳浓度
40.在确定衰老水平和最佳浓度的步骤中，将3代小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)传到并培养在培养玻片中。用冰冻后的磷酸盐缓冲盐水(pbs)清洗玻片两次。使用衰老相关的β-半乳糖苷酶染色试剂盒，用提供的多聚甲醛固定细胞10分钟，用pbs洗两次。然后将载玻片与染色液在37℃下孵育过夜。次日将玻片用pbs洗两次，用pbs中的40％甘油装裱。在光学显微镜下观察被染色的细胞。衰老的细胞被染成蓝色，而增殖的细胞没有被染色。通过计算染色和未染色细胞的数量，对衰老细胞的百分比进行量化。
41.参照图3c-d，通过比较cbd处理的细胞和对照组细胞，8天的10μm cbd处理显示衰老水平下降。参照图3a-b，而4天的50μm cbd处理显示了衰老水平的增加，这表明由于高浓度的毒性效应。步骤(d)相对核圆度的测定
42.在确定相对核圆度的步骤中，将3代小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)传到并培养在培养玻片上。使用dapi或lmna/c抗体对细胞核进行染色。使用共聚焦显微镜捕捉荧光图像。使
用cellprofiler软件测量单个细胞核的周长和面积。相对核的圆度用公式计算。相对核圆度的值为1表示是一个完美的圆。相对核圆度接近于0的核表示它们的形状更不规则。
43.参照图4，与野生型mefs相比，lmna
g609g/g609g mefs的相对核圆度明显下降。而cbd处理在lmna
g609g/g609g mefs中的相对核圆度与对照组相比明显增加。步骤(e)：测定衰老标记蛋白的蛋白表达水平
44.在测定衰老标记蛋白的蛋白表达水平的步骤中，将3代小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)在6孔板中培养，用cbd处理4天。然后用冰冻后磷酸盐缓冲盐水(pbs)清洗细胞两次。将补充有1mm二硫苏糖醇(dtt)和蛋白酶抑制剂的ripa 150缓冲液(20mm tris-hcl ph 7.5，1mm edta ph 8.0，150mm nacl，1％nonidet p-40(诺乃p-40洗洗剂)，0.5％脱氧胆酸钠)加入细胞中，在4℃下震荡15分钟。然后将细胞收集到eppendorf微量离心管中，在4℃下以12000rpm离心10分钟。收集上清液并加入6x十二烷基硫酸钠(sds)样品缓冲液(20mm tris-hcl ph 7.5，30％甘油，10％十二烷基硫酸钠(sds)，0.6m dtt，0.03％溴酚蓝)。将样品煮沸5分钟。然后准备进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)，进行western免疫印迹分析(western blotting analysis)。根据目标蛋白的大小，制作7-15％聚丙烯酰胺分离凝胶和4％聚丙烯酰胺堆积凝胶。样品和蛋白梯带被加载到聚丙烯酰胺凝胶上。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)在电泳缓冲液(25mm tris-hcl，190mm甘氨酸和0.1％sds)中在100v的恒定电压下进行20-30分钟，直到样品和蛋白梯带到达分离凝胶上。然后，根据目标蛋白的大小，sds-page被设定为在120v的恒定电压下运行约1小时。分离凝胶中的蛋白质在转移缓冲液(25mm tris-hcl，190mm甘氨酸和20％甲醇)中在冰上以0.4a恒定电流1.5小时后转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜上。该膜用含有5％的脱脂牛奶的含有吐温20(tween-20)的磷酸盐缓冲盐水(pbst)(即1x pbs和0.1％tween-20)阻断并在室温下震荡1小时。将在pbst中用5％脱脂牛奶稀释的第一抗体加入到膜上，在4℃下震荡过夜。用pbst清洗膜三次，每次在室温下摇动10分钟。将在pbst中用5％脱脂奶稀释的第二抗体加入膜上，在室温下摇动1-2小时。用pbst重新清洗膜三次。使用supersignal
tm west pico plus化学发光基板，使用chemidoc成像系统对蛋白质的信号进行成像和可视化。
45.参照图5，可以看出cbd处理可以下调野生型和lmna
g609g/g609g mefs中蛋白p21和蛋白p16的水平，而早衰素水平不受影响。因此可以看出，cbd可以下调p21蛋白和p16蛋白的水平，与早衰素无关。步骤(f)：秀丽隐杆线虫的寿命分析
46.在分析秀丽隐杆线虫的寿命的步骤中，为了对秀丽隐杆线虫进行处理，在秀丽隐杆线虫生长培养基(ngm)皿中加入小分子溶液。含有琼脂糖的ngm经过高压灭菌，然后冷却到65℃以下。将不同浓度的小分子加入到ngm中。然后将ngm倒入60毫米的盘子中，在室温下孵化过夜。凝固的ngm盘子被储存在4℃。大肠杆菌op50菌株被用来作为秀丽隐杆线虫的食物来源。将op50的单个菌落在200ml溶菌肉汤(lb)培养基中于37℃培养过夜。然后将op50在65℃下培养数分钟，将其杀死。死亡的op50被分散到整个ngm培养皿的表面。含有死亡的op50和cbd的ngm培养皿在4℃下储存2周。秀丽隐杆线虫的同步化是通过漂白法进行的。在每个60毫米的培养皿中挑出20只l4阶段幼虫，加入不同浓度的小分子物质，在20℃下培养。
每天对它们进行监测，并记录活的、死的和缺失的秀丽隐杆线虫的数量。每隔2天将秀丽隐杆线虫转移到新鲜的培养皿中，以便将目标虫与它们的后代分开，确保它们有足够的食物来源。10-20μm的cbd被确定为延长秀丽隐杆线虫寿命的最佳剂量。
47.参照图6a，cbd处理的秀丽隐杆线虫的寿命增长中位数为55-61.5％，而最大寿命增长为8-12.5％。步骤(g)：lmna
g609g/g609g
小鼠的健康期分析
48.在分析lmna
g609g/g609g
小鼠的健康期的步骤中，对于小鼠的处理，使用2个月大的lmna
g609g/g609g
小鼠。它们每周接受两次腹腔注射(ip)，直到它们达到人道的程度。注射时使用了不同的剂量，50毫克/千克的cbd被确定为最佳剂量，可最大限度地延长小鼠的健康期。cbd被溶解在5％的dmso和5％的聚乙二醇(peg)的无菌盐水中，并储存在-80℃，最长可保存1个月。
49.参考图6b，cbd处理的lmna
g609g/g609g
小鼠的中位数和最大健康期分别增加了8％和19.8％。步骤(h)：分离小鼠骨髓基质细胞和结晶紫染色集落形成实验
50.在分离小鼠骨髓基质细胞以测量克隆性的步骤中，将小鼠牺牲并置于组织培养罩内。使用无菌器具将股骨解剖出来。用29g针头和1ml冰冻后的磷酸盐缓冲盐水(pbs)将小鼠骨髓基质细胞从股骨中冲出。将收集到的骨髓基质细胞在4℃下以3000rpm离心5分钟。去除上清液，将细胞颗粒重新悬浮在补充有20％胎牛血清(fbs)和青霉素-链霉素(100单位/毫升)的依氏α修正最低必需培养基(α-mem)中。培养基每3天更换一次。培养12天后，进行结晶紫染色集落形成实验。用冰冻后的pbs清洗细胞两次。用冰冻后的甲醇固定细胞10分钟。然后用0.5％的结晶紫溶于25％的甲醇，在室温下对细胞进行染色10分钟。然后除去结晶紫溶液，用双蒸水(ddh2o)冲洗细胞，直到冲洗液变清。将平板擦干，并拍照分析。
51.参照图7a-b，结果显示，与野生型小鼠相比，从lmna
g609g/g609g
小鼠分离的骨髓基质细胞的菌落数量较少。而与lmna
g609g/g609g
对照小鼠和野生型小鼠相比，从用50mg/kg cbd处理的lmna
g609g/g609g
小鼠中分离的骨髓基质细胞具有较高的菌落数。步骤(i)：小鼠皮肤和肝脏的组织学研究
52.在研究小鼠皮肤和肝脏组织学的步骤中，在腹腔注射100mg/kg氯胺酮和16mg/kg赛拉嗪的无菌水的麻醉下，将小鼠颈椎脱臼牺牲。收集主要器官，包括皮肤、肌肉、肠道、肾脏、脾脏、肝脏、肺、心脏和主动脉。一半的组织在液氮中快速冷冻，并储存在-80℃以提取蛋白质和rna。另一半组织被固定在pbs中的4％多聚甲醛(pfa)中，并在4℃下震荡过夜。对于石蜡切片，将固定的组织在70％的乙醇中孵化，并在4℃震荡过夜。随后在90％、95％、100％和100％的乙醇中逐步脱水，各1小时。然后将组织在50％的二甲苯和50％的乙醇中培养30到40分钟，并转到100％的二甲苯中培养10到15分钟。然后将组织在蜡中培养30分钟，并转移到新的蜡中培养3次。然后将组织放在真空室内的蜡中过夜。次日将组织嵌入石蜡块中，并将其切成厚度为6微米的组织切片。组织切片干燥后，在二甲苯溶液中孵化两次，每次5分钟。然后将组织切片在100％、95％、90％、75％、50％和30％的乙醇中各孵育5分钟，并在水中冲洗3分钟，进行分步补水。然后根据制造商提供的标准程序进行苏木精-伊红染色分析。最后，将染色后的组织切片用dpx封固并干燥一晚，然后在光学显微镜下观察。
53.参照图8，可以观察到lmna
g609g/g609g
的皮肤显示出衰老的特征，包括皮肤脂肪层的丧失和毛囊密度的降低，这可以通过cbd处理来挽救。为了进行衰老染色，在逐步对组织进行补水后，使用衰老相关的β-半乳糖苷酶染色试剂盒。
54.参照图9，可以看出lmna
g609g/g609g
小鼠的肝脏显示出衰老细胞的增加，而这可以通过cbd处理得以挽救。
55.从以上实施例可以看出，本发明采用筛选和识别具有抗衰老属性的小分子的方法，已经成功筛选和识别了cbd这种具有抗衰老属性的小分子。同时确定cbd处理的最佳剂量为10-20μm。
56.上述实施例和变体的任何特征、属性或步骤可根据需要与上述实施例和变体的任何其他特征、属性和步骤结合使用。
57.根据本发明的实施例，选择cbd来验证抗衰老效果。基于多种模型的效果已经得到验证。同时，通过使用多种方法确定了小分子的抗衰老作用背后的机制。本实施方式的材料和方法详述如下。通过rna测序识别差异表达的基因，并通过定量聚合酶链反应(qpcr)进行验证
58.将3代小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)在10厘米的培养皿中培养，用cbd处理4天。后用冰冻后的磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤细胞两次，并加入1ml trizol试剂。在室温下孵化5分钟后，将样品收集到eppendorf微量离心管中。将上清液收集到eppendorf微量离心管中。在每个样品中加入200μl氯仿，大力震荡试管15秒。样品在室温下孵化5分钟，然后在4℃下以12000rcf离心15分钟。离心后，溶液被分离成3层。收集450微升的透明顶层，并加入500微升的异丙醇。在室温下孵化10分钟后，在4℃下以12000rcf离心10分钟。rna颗粒将在试管的底部可见。rna颗粒被75％的乙醇在二乙基碳酸盐(depc)水中洗净。对于每个条件，对两个生物重复进行rna测序。将rna样品溶解在depc水中并进行质量控制分析。使用纳米微滴(nanodrop)和agilent 2100生物分析仪进行rna定量。rna的完整性用agilent 2100生物分析仪测量。rna纯度用琼脂糖凝胶电泳和agilent 2100生物分析仪测量。浓度超过50纳克/微升，体积超过20微升，rin值超过6.3，od260/280值超过2.0的样品被认为是通过了质量控制分析并被用于rna测序。
59.本实施例采用illumina测序系统用于读取长度为pe150的配对末端读数。本实施例进行了生物信息学分析，其中包括数据质量控制、比对、基因表达水平分析、差异基因表达分析和功能分析。结果通过定量聚合酶链反应(qpcr)进行验证。对于用于qpcr的rna，样品在4℃下以7500rcf离心5分钟。去除乙醇，并将样品风干，直到rna颗粒变成透明。然后用depc水重新悬浮rna颗粒。用纳米微管法测量rna的浓度。2μg的rna用于dnase酶消化和反转录。对于dnase酶消化，使用promega rq1 rnase-free dnase试剂盒并按照制造商的操作指引操作，每个反应使用2μg rna。dnase酶消化可以去除rna样品中的dna污染物，从而防止qpcr中基因组dna的扩增。然后使用thermo scientific的高容量cdna反转录试剂盒与rnase抑制剂，并按照制造商的操作流程指引，将dnase酶消化后的rna样品用于反转录。转录的cdna用milli-q水稀释5倍，然后对样品进行qpcr。对于qpcr，每10μl反应使用0.5-1μl cdna。qpcr仪器根据与看家基因(housekeeping genes)归一化的目标基因(target genes)的信号计算delta-delta-ct值(2
–
δδct
)。
60.参照图10a，可以看出，经cbd处理的mefs的rna测序结果显示，lmna
g609g/g609g mefs中1363个差异表达基因中的1066个基因的表达在cbd处理后恢复到正常水平，占差异表达基因的78％。由于大量的基因在cbd处理后出现差异表达，表明这是转录因子或影响转录活性的蛋白质差异表达的结果。在图10a的上部维恩图中，左上圈代表与wt_c相比mut_c中上调的基因，右上圈代表与mut_c相比mut_10中下调的基因，下部圈代表与wt_c相比wt_10中下调的基因。在图10a的底部维恩图中，左上圈代表mut_c与wt_c相比下调的基因，右上圈代表mut_10与mut_c相比上调的基因，下圈代表wt_10与wt_c相比上调的基因。
61.参照图10b，在相同的操作流程和标准下对每个基因进行rna测序和qpcr，确定了5个基因。它们是转录因子，即激活转录因子5(atf5)、ccaat增强子结合蛋白α(cebpα)、组蛋白乙酰转移酶抑制因子的新型抑制剂(nir)和蛋白激酶，即丝裂原活蛋白激酶3(map4k3)和tribbles假激酶3(trib3)。
62.参考图10c，通过比较每个基因的蛋白相互作用谱，发现atf5、cebpα和trib3在同一个蛋白相互作用网络中密切相关。这样的网络还包括与衰老、dna损伤、增殖有关的基因，如atm、pten、p53 53bp1、p300等。因此，cbd的抗衰老属性部分地是由atf5、cebpα和trib3在这个蛋白质相互作用网络中的不同表达所促成。组织的免疫荧光(if)染色
63.组织切片用pbs洗两次，并在pbstr(0.1％triton x-100in pbs)中孵育10分钟。然后细胞在室温下用在含有5％胎牛血清(fbs)的pbstr中阻断1小时。加入用含有5％胎牛血清的pbstr稀释的第一抗体，在4℃下孵育过夜。次日用pbstr清洗细胞三次，每次孵化10分钟。加入用含有5％fbs的pbstr稀释的第二抗体，在室温下孵育1小时。再次用pbstr清洗细胞3次，然后用pbs清洗2次。组织切片用slowfade gold防褪色试剂进行封固。然后，组织切片在共聚焦显微镜下进行分析。
64.参照图11a-c，由图可见，根据小鼠皮肤免疫荧光染色的结果，atf5、cebpα和trib3的蛋白水平在早衰小鼠中都有所下降，而这都被cbd处理所逆转。因此可见，这三个蛋白是重要的衰老相关蛋白。检查小分子的抗衰老作用
65.通过使用luna-ii自动细胞计数器对人类间充质干细胞(mscs)进行计数。将1.0x105个细胞传到6孔板的每个孔中，并培养24小时。细胞被分为两组：非辐照组和辐照组。辐照组接受辐照机的伽马辐照。使用的辐照剂量是10gy。辐照24小时后，非辐照组和辐照组用不同浓度的小分子处理。处理24小时后，使用luna-ii自动细胞计数器再次对细胞进行计数。反映细胞增殖率的群体倍增水平(pdl)通过公式n＝3.32
×
(logucy-logi)+x计算。其中n＝pdl数，ucy＝该时间点的细胞产量，i＝初始细胞数量，x＝用于启动被定量的亚培养的细胞的倍增水平。
66.通过将每个样品与非辐照对照样品归一化来计算相对细胞存活率。参照图12a，显示cbd处理可以明显增加非辐照对照间充质干细胞的细胞活力，同时明显减少辐照的衰老间充质干细胞的细胞活力。由于cbd能选择性地杀死衰老的间充质干细胞，而保持增殖的间充质干细胞不受伤害，因此可以确认该小分子是一种新型的抑制老化剂。
67.参照图12b，通过western免疫印迹法(western blotting)来检查cbd的抗衰老作用背后的机制。发现和确认了抗衰老的bcl2家族蛋白包括bcl-w、mcl-1和bcl-xl的表达被
下调。而增殖期和衰老期的间充质干细胞在磷酸化akt水平上有不同的反应。衰老的间充质干细胞中trib3的表达水平被下调，而cbd处理后则被挽救。因此，可以证明cbd可以促进衰老的间充质干细胞的凋亡，从而具有抗衰老的效果和属性。
68.综上，本发明在此提供了大麻二酚(cbd)可以延迟小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)的细胞衰老。首先，表明cbd可以提高野生型和早衰型lmna
g609g/g609g mefs的复制率。其次，cbd可以降低野生型和早衰型lmna
g609g/g609g mefs的衰老水平。第三，cbd可以挽救过早衰老的lmna
g609g/g609g mefs的错形的核形态表型。第四，cbd可以下调衰老标记蛋白，即p21和p16的蛋白水平。第五，cbd可以增加秀丽隐杆线虫的生命期和早衰lmna
g609g/g609g
小鼠的健康期。第六，cbd可以挽救骨髓基质细胞的衰退，增加皮肤毛囊密度，并增加lmna
g609g/g609g
小鼠的皮肤脂肪层宽度。第七，cbd通过调节akt和bcl-2抗凋亡家族路径，在辐照诱导衰老的间充质干细胞(mscs)中显示出抗衰老作用。cbd处理杀死了衰老的细胞，同时保持非衰老细胞不受伤害。最后，转录因子，即激活转录因子5(atf5)，ccaat增强器结合蛋白α(cebpα)，组蛋白乙酰转移酶抑制剂的新型抑制剂(nir)和蛋白激酶，即丝裂原活蛋白激酶3(map4k3)和tribbles假激酶3(trib3)被rna测序确定为在野生型和lmna
g609g/g609g mefs中通过cbd处理显示不同表达的基因。它们都涉及与衰老有关的基因路径。atf5、cebpα和trib3被发现在同一个蛋白质相互作用网络中被密切调节。该网络还包括众所周知的衰老相关基因，包括tp53、pten、pcna、ep300等。cbd处理对所述基因表达水平的影响有助于抗衰老作用。根据小鼠皮肤的免疫荧光染色的结果，在早衰的lmna
g609g/g609g
小鼠中，atf5、cebpα和trib3的蛋白水平都有所下降，而cbd处理后都能有所逆转。
69.尽管本发明已经就某个或某些实施例进行了展示和描述，但显然本发明可以以许多不同的形式体现，并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下可以进行许多其他的修改和变化。
70.此外，虽然这里已经描述了示范性的实施方式，但本领域的普通技术人员将很容易理解，上面列出的示范性实施方式仅仅是说明性的，不应该被解释为以任何方式限制权利要求。相反，本发明的范围仅由所附的权利要求和它们的等同物来界定，而不是由前面的描述来界定。
技术特征：1.一种筛选和识别具有抗衰老特性的小分子的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(a)从杂合子小鼠中分离出小鼠胚胎成纤维细胞(mefs)；(b)通过用不同浓度的小分子处理步骤(a)的mefs，确定细胞的增殖率和小分子的最佳浓度，并计算细胞的pdl(群体倍增水平)；(c)通过对步骤(a)的mefs进行染色，用不同浓度的小分子处理所述mefs，然后计算染色和未染色细胞的数量，确定步骤(a)的mefs的衰老水平和小分子的最佳浓度；(d)通过用不同浓度的小分子处理，确定步骤(a)的mefs的相对核圆度，并测量不同核圆度的细胞百分比；(e)通过用小分子处理细胞，确定步骤(a)的mefs的衰老标记蛋白的蛋白表达水平，然后测定衰老标记蛋白的蛋白表达水平，其中衰老标记蛋白是蛋白p21和p16；(f)通过分析秀丽隐杆线虫在不同浓度的小分子处理下的生命期来确定小分子的最佳浓度；(g)通过分析lmna
g609g/g609g
小鼠在不同浓度的小分子处理下的健康期来确定小分子的最佳浓度；(h)通过分离小鼠的骨髓基质细胞并进行结晶紫染色集落形成实验来验证小分子的抗衰老作用；以及(i)通过对小鼠皮肤和肝脏进行组织学研究来证实小分子的抗衰老作用。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小分子是大麻二酚(cbd)。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述小分子在处理中的最佳浓度为10-20μm。4.根据权利要求1筛选和识别的小分子在开发治疗代谢紊乱、衰老相关退行性疾病、脱发和伤口愈合的药物中的用途，通过给予哺乳动物一定浓度的所述小分子，从而调节蛋白质的表达。5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述小分子是大麻二酚(cbd)。6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述蛋白质是atf5、cebpα或trib3。7.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述小分子在给予时的最佳浓度为10-20μm。
技术总结本发明涉及医学技术领域，尤其涉及一种筛选和识别具有抗衰老属性的小分子的方法。所述方法包括采用细胞模型，即早衰小鼠胚胎成纤维细胞和人HGPS间质干细胞，以及采用动物模型，即早衰小鼠和秀丽隐杆线虫，成功地筛选并识别了具有抗衰老作用的小分子，即大麻二酚(CBD)，同时本发明还确定CBD处理的最佳浓度为10-20μM。μM。μM。
技术研发人员：黄常健 周中军 王雪莱 陈静 英亮 张剑
受保护的技术使用者：飞象生物科技有限公司
技术研发日：2022.05.05
技术公布日：2022/11/1
