1.本发明涉及生物
技术领域：
：，尤其涉及与胶质母细胞瘤预后显著相关的抗原及其应用。
背景技术：
：：2.胶质瘤是恶性程度最高的实体瘤之一，占原发性恶性脑肿瘤的大部分。与其他肿瘤类型相比，胶质母细胞瘤(胶质母细胞瘤)的5年生存率仅为6.8％，中位总生存期往往《1年。胶质母细胞瘤的标准治疗方法主要包括手术切除、化疗和放疗。近年来，随着科学技术的发展，基因治疗和免疫治疗逐渐改善了患者的临床疗效，但胶质母细胞瘤可能引起免疫功能障碍和免疫抑制，导致肿瘤微环境高度免疫抑制和治疗抵抗。3.个体新抗原癌症疫苗的开发和应用是癌症免疫治疗的新途径。新抗原是仅在癌细胞上发现的蛋白质片段。由于新抗原的独特特性，靶向它们可以让患者的免疫系统发现并攻击癌细胞，而不是攻击健康细胞。新抗原提供了一种新的、精确的方法来追踪癌细胞，对肿瘤具有高度特异性。例如，肿瘤新抗原癌症疫苗neovax在8名高危黑色素瘤患者中取得了疗效。平均随访4年后，所有患者均存活，其中6人无疾病活动。因此，寻找新型高效的胶质母细胞瘤相关新抗原对提高患者的治疗效率具有重要意义。4.选择性剪接事件(ase)在基因转录后调控中发挥重要作用，是维持生物多样性和组织特异性的生物学机制之一。选择性剪接调节基本的生物过程，例如细胞发育、细胞分化和对环境因素的反应。异常的可变剪接可能会改变mrna稳定性并影响蛋白质相互作用，尤其是在神经系统和免疫系统中。这与神经和免疫系统的功能多样性和反应敏感性密切相关。许多研究表明，异常的可变剪接事件参与了肿瘤的发生和发展。癌细胞迁移、生长调节、激素反应和对化疗反应的变化可能都与异常可变剪接有关。在癌细胞中，当替代剪接调节因子的表达和功能经常被破坏时，异常转录本可能会产生、逃脱降解并积累大量，直接参与恶性肿瘤的发生和发展。有趣的是，含有异常可变剪接模式的转录本可以产生抗原肽。此外，异常的rna剪接也代表了肿瘤转录组中新表位的另一个来源，因此，探索具有异常可变剪接的肿瘤新表位将有助于更全面地了解肿瘤免疫。5.此外，基于新抗原而非传统taa的疫苗具有几个优点。首先，新抗原仅由肿瘤细胞表达，可以触发真正的肿瘤特异性t细胞反应，从而防止对非肿瘤组织的“脱靶”损伤。其次，新抗原特异性t细胞反应的持续存在提供了治疗后免疫记忆的潜力，这为长期预防癌症复发提供了可能性。6.目前，许多基于个性化新抗原的癌症疫苗的临床试验正在进行中。这些初步研究为个性化新抗原癌症疫苗的临床治疗潜力提供了重要线索，包括gen-009、ro7198457和mrna-4157。因此，筛选具有更高免疫原性的新型有效新抗原，克服抑制性肿瘤微环境，是未来基于新抗原的个体化癌症疫苗研究最重要的方向。技术实现要素：7.针对上述问题，本发明提供与胶质母细胞瘤预后显著相关的新抗原及其应用，主要为了进一步探索研究胶质母细胞瘤的新的免疫治疗方案，并验证方案的可行性。8.为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：9.与胶质母细胞瘤预后显著相关的抗原，其中，所述抗原包括lrp1、tcf12、derl3、wipi2、tshz3抗原基因中至少一种。10.lrp1、tcf12、derl3、wipi2、tshz3抗原基因中至少一种的抗原在制备预防或治疗胶质母细胞瘤产品中的应用。11.在一些方式中，所述抗原为lrp1抗原基因。12.在一些方式中，所述预防或治疗胶质母细胞瘤产品包括胶质母细胞瘤疫苗。13.在一些方式中，所述胶质母细胞瘤疫苗为个体新抗原癌症疫苗。14.在一些方式中，所述胶质母细胞瘤疫苗为mrna新抗原癌症疫苗。15.lrp1、tcf12、derl3、wipi2、tshz3中至少一种表达水平检测剂在制备胶质母细胞瘤治疗预后效果检测分析产品中应用。16.lrp1表达水平检测剂在制备胶质母细胞瘤免疫细胞浸润水平检测产品中的应用。17.在一些方式中，所述免疫细胞为抗原呈递细胞；所述抗原呈递细胞包括cd8+t细胞、cd4+t细胞、树突状细胞、巨噬细胞、b细胞。18.筛选适合接种新抗原癌症疫苗的胶质母细胞患者的方法，包括下述步骤19.针对胶质母细胞患者样本中的候选抗原基因的表达谱进行分析，构件一致性聚类；20.根据其累计的分布函数和增量区域图，选择免疫相关基因稳定聚类的k＝3，得三种免疫亚型；21.特征分析：22.(a)对三种免疫亚型间tmb及异常可变剪切事件的出现频率分析，23.(b)对三种免疫亚型间免疫治疗预后省生存率进行分析，24.(c)将三种免疫亚型与肿瘤生物标志物和泛癌亚型进行比较；25.若(a)、(b)、(c)三者分析确定的免疫亚型相同，则确认该免疫亚型为适合接种人群。26.本发明的有益效果是：27.为胶质母细胞瘤患者开发新型新抗原和治疗靶点提供了重要指导。lrp1等被证实为胶质母细胞瘤免疫治疗的潜在新抗原，其中cluster3患者更适合接种疫苗。同时也提供了一种用于筛选适合接种相应抗原疫苗人群的方法。附图说明28.图1突变基因分析。(a)突变基因的瀑布图，(b)改变基因组部分的样本分布，(c)突变计数组中的样本分布，(d)改变的基因组分数中的top10高频突变基因，(e)突变计数组中的高频突变基因。29.图2异常可变剪接事件识别和概述。(a)异常可变剪接事件的类型，(b-c)异常可变剪接事件的概述。30.图3异常可变剪接事件识别(a)和概述(b)。31.图4筛选抗原候选基因。(a)抗原候选基因的鉴定，(b-c)抗原候选基因的富集分析。32.图5抗原候选基因的总体预后功效。(a)抗原候选基因的总体预后功效，(b)概述异常可变剪接、移码和抗原候选基因，(c)五种预后抗原候选基因的生存曲线，(d)抗原候选基因与抗原呈递细胞浸润之间的相关性。33.图6免疫亚型的鉴定。(a)样本聚类的热图，(b)累积分布函数曲线，(c)免疫相关基因的delta区域，(d)胶质母细胞瘤样本的主成分分析(pca)分布，(e)cluster1、cluster2和cluster3中免疫相关基因表达的热图，(f)cluster1、cluster2和cluster3在测试队列中的生存曲线。34.图7免疫亚型之间的突变和cnv分析。(a)tmb评分在免疫亚型中的分布，(b)免疫亚型中突变基因的数量，(c)三种免疫亚型的g评分，(d-f)cluster1、cluster2和cluster3中突变基因的瀑布图，(g-i)cluster1、cluster2和cluster3中染色体上拷贝数的分布。35.图8免疫亚型中抗原候选基因的可变剪接分析。(a-c)基因在不同亚型中显着上调，*p《＝0.05，**p《＝0.01，***p《＝0.001。36.图9免疫亚型间免疫活性评分的分布。(a)免疫活性，(b)icp，(c)三种免疫亚型中的icd，(e)热图和(f)三种亚型中免疫细胞浸润的箱线图，*p《＝0.05，**p《＝0.01，***p《＝0.001。37.图10免疫亚型之间的肿瘤生物标志物(a)和泛癌(b)分析，*p《＝0.05，**p《＝0.01，***p《＝0.001。具体实施方式38.下面对本发明作出进一步的说明：39.本部分第一方面介绍：40.与胶质母细胞瘤预后显著相关的抗原，其中，所述抗原包括lrp1、tcf12、derl3、wipi2、tshz3抗原基因中至少一种。41.lrp1、tcf12、derl3、wipi2、tshz3抗原基因中至少一种的抗原在制备预防或治疗胶质母细胞瘤产品中的应用。42.所述抗原为lrp1抗原基因时。43.所述预防或治疗胶质母细胞瘤产品包括胶质母细胞瘤疫苗。可以依据抗原lrp1、tcf12、derl3、wipi2、tshz3制备胶质母细胞瘤的新抗原癌症疫苗，具体的制备方法则可采用现有的技术。44.所述胶质母细胞瘤疫苗为个体新抗原癌症疫苗。更进一步的，所述胶质母细胞瘤疫苗较为常见的形式为mrna新抗原癌症疫苗，如以lrp1为抗原制备疫苗，其具体的制备方法不多加赘述，可参考现有技术。45.本部分第二方面介绍：46.lrp1表达水平检测剂、tcf12表达水平检测剂、derl3表达水平检测剂、wipi2表达水平检测剂、tshz3表达水平检测剂中至少一种在制备胶质母细胞瘤治疗预后效果(包括生存期)检测分析产品中应用，当然该方案也包括联合检测试剂。胶质母细胞瘤患者的严重程度与lrp1表达水平也有着正相关的联系，随着胶质母细胞瘤患者病情减轻，lrp1表达水平也会降低，反之亦然。同时，通过lrp1、tcf12、derl3、wipi2、tshz3中任一或多个的表达情况也能得知患者生存期情况。47.本部分第三方面介绍：48.lrp1表达水平检测剂在制备胶质母细胞瘤免疫细胞浸润水平检测产品中的应用。随着胶质母细胞瘤免疫细胞浸润水平提升，也会伴随lrp1表达水平提升，反之降低亦然，两者正相关。由此，通过lrp1表达水平检测来实现反应胶质母细胞瘤免疫细胞浸润水平提升，甚至进一步的反应胶质母细胞瘤的严重程度。lrp1等表达水平检测剂均可采用现有技术。49.其中，所述免疫细胞为抗原呈递细胞；所述抗原呈递细胞包括cd8+t细胞、cd4+t细胞、树突状细胞、巨噬细胞、b细胞。50.本部分第四方面介绍：51.筛选适合接种新抗原癌症疫苗的胶质母细胞患者的方法，包括下述步骤52.针对胶质母细胞患者样本中的候选抗原基因的表达谱进行分析，构建一致性聚类；53.根据其累计的分布函数和增量区域图，选择免疫相关基因稳定聚类的k＝3，得三种免疫亚型；54.特征分析：55.(a)对三种免疫亚型间tmb及剪切的频率剪接事件分析，使用突变数据集计算每个样本的tmb，并在三种免疫亚型中对其进行分析，发现每个亚型中突变频率最高的基因，选择绝对g值大于0.4的拷贝数的样本，并可视化每个亚型中cnv的g值，分析不同亚型中异常可变剪接事件丰度的差异，比对每个亚型的异常上调可变剪接事件数量；56.(b)对三种免疫亚型间免疫治疗预后进行分析，依据tip数据库下载了tcga-胶质母细胞瘤样本的免疫活性评分，分析不同亚型中每个样本的免疫细胞活性(p《0.05)，比对三种免疫亚型之间免疫活性评分的明显差异，分析免疫检查点(icps)和免疫原性细胞死亡调节剂(icds)在调节宿主抗肿瘤免疫中的影响，评估每种免疫亚型中免疫细胞的比例；57.(c)将三种免疫亚型与肿瘤生物标志物和泛癌亚型进行比较，tcga-胶质母细胞瘤数据集中确定了多个肿瘤标志物，23个癌症生物标志物在三种免疫亚型之间差异比较；58.若(a)、(b)、(c)三者分析确定的免疫亚型相同，则确认该免疫亚型为适合接种人群。59.本部分第五方面结合具体的实例介绍：60.在这项研究中，探索了基于可变剪接的胶质母细胞瘤相关新抗原。发现lrp1与胶质母细胞瘤的不良预后、抗原呈递细胞(apc)浸润显著相关，表明lrp1是一种有效的胶质母细胞瘤治疗型新抗原。随后，为了确定适合接种疫苗的患者，根据候选抗原基因的表达谱，将160名胶质母细胞瘤患者分为三种不同的免疫亚型，分别为cluster1，cluster2，cluster3。cluster3亚型的胶质母细胞瘤患者接种此类新抗原癌症疫苗后，治疗效果最佳。本研究结果可为胶质母细胞瘤的治疗型新抗原癌症疫苗的开发和选择合适的疫苗接种患者提供有价值的信息和可靠的依据，同时也验证了其可行性。61.方法：62.tcga-胶质母细胞瘤数据的采集和处理来自thecancergenomeatlas(tcga)的160个胶质母细胞瘤样本的标准化基因表达和临床随访数据；详细信息见表1和表2。63.表1tcga-胶质母细胞瘤中165个样本的样本类型[0064][0065][0066]表2tcga-胶质母细胞瘤中160例样本的临床信息[0067][0068]使用了ucscxena数据库获取rna-seq数据。(https://gdc-hub.s3.us-east-1.amazonaws.com/download/tcga-胶质母细胞瘤.htseq_fpkm.tsv.gz)。[0069]ensemblsymbol注释数据是从ucsc基因组浏览器数据库下载。(https://gdc-hub.s3.us-east-1.amazonaws.com/download/gencode.v22.annotation.gene.probemap；完整元数据)。[0070]生存数据和表型数据来自ucsc数据库：(https://gdc-hub.s3.us-east-1.amazonaws.com/download/tcga-胶质母细胞瘤.gdc_phenotype.tsv.gz)(https://gdc-hub.s3.us-east-1.amazonaws.com/download/tcga-胶质母细胞瘤.survival.tsv)。[0071]根据注释文件中的信息，将rna-seq数据的ensemblid转换为基因符号。首先，通过计算与同一符号相关的基因的平均值来分配基因的新表达值。接下来，删除至少30％样本中表达为0的基因。然后，提取存活时间超过30天的样本，记录rna-seq数据、表型数据和存活数据的交集。[0072]从国家癌症研究所的基因组数据共享(gdc)和cbioportal数据库中筛选了具有基因突变的胶质母细胞瘤样本：https://gdc.cancer.gov/about-data/publications/mc3-2017/mc3.v0.2.8.public。maf.gz和https://www.cbioportal.org/study/clinicaldata？id＝胶质母细胞瘤_tcga。胶质母细胞瘤-肿瘤突变负荷(胶质母细胞瘤-tmb)从gdc数据库中获得：https://gdc.cancer.gov/about-data/publications/pancan-celloforigin/mutation-loadꢀ‑updated.txt胶质母细胞瘤拷贝数变异(胶质母细胞瘤-cnv)数据来自ucsc数据库：https://gdc-hub.s3.us-east-1.amazonaws.com/download/tcga‑ꢀ胶质母细胞瘤.cnv.tsv.gz从tcgaspliceseq数据库中记录了选择性剪接：https://bioinformatics.mdanderson.org/tcgaspliceseq/psidownload.jsp。[0073]异常可变剪接事件的识别：首先，筛选tcga-胶质母细胞瘤中可变剪接事件的psi谱。分别计算了癌症样本和正常样本中可变剪接事件的百分比剪接(psi)的平均值，并过滤掉了癌症样本或正常样本中平均值为0或1的可变剪接事件。由于这些可变剪接事件的psi值在样本中是不连续的值，因此无法对癌症样本和正常样本中的psi值进行t检验。过滤后，剩余可变剪接事件38052个。接下来，分别计算了可变剪接事件的t检验和logfc。另外，对t检验的p值进行bh校正。筛选了fdr《0.05和|logfc|》1次选择性剪接为异常选择性剪接事件。[0074]抗原候选基因与免疫细胞浸润的相关性分析：肿瘤免疫估计资源(timer，https://cistrome.shinyapps.io/timer/)用于分析和可视化肿瘤免疫浸润细胞(tiic)和胶质母细胞瘤交叉新抗原候选基因之间的相关性。使用spearman分析，p《0.05被认为具有统计学意义。[0075]免疫基因组的获取和免疫亚型的鉴定：免疫分型可用于识别肿瘤及其微环境中的免疫状态，从而有助于识别适合治疗的患者。从immport数据库(https://s3.immport.org/release/genelists/genelistgoannotation.txt？download＝true)(1255)和charoentong的研究(782)共获得1894个免疫基因，形成一个胶质母细胞瘤免疫基因谱。从胶质母细胞瘤免疫基因谱中筛选出1451个预后基因。下载链接如下：[0076]https://s3.immport.org/release/genelists/genelistgoannotation.txt？download＝true，http://icbi.at/tcia/supplementarytables.pdf。[0077]然后，使用consensusclusterplus包对免疫基因表达谱进行一致的聚类。对验证集进行了相同的分析。[0078]免疫亚型中的免疫细胞分析：跟踪肿瘤免疫表型(tip)能够快速分析和直观地显示抗癌免疫的活性以及跨七步癌症免疫周期的肿瘤浸润免疫细胞的程度。为了观察亚型之间的免疫活性差异，从tip数据库(http://biocc.hrbmu.edu.cn/tip/pancancersearchaction？cancertype＝胶质母细胞瘤)下载了tcga-胶质母细胞瘤样本的免疫活性点。ggpubr包对不同亚型样本的免疫活性分布进行了表征(anova，p《0.05)。[0079]分析免疫亚型和确定的肿瘤生物标志物：现有的癌症肿瘤生物标志物和癌症基因取自thecancergenomeinterpreter(cgi；https://www.cancergenomeinterpreter.org/home)数据库。分析了tcga数据集中不同亚型中现有癌症生物标志物和癌症基因的差异分布。组间差异检验采用anova检验，组间比较采用t检验，阈值p《0.05。[0080]结果[0081]首先，从tcga数据库(tcga-胶质母细胞瘤)获得胶质母细胞瘤病例和健康对照的特征信息和基因表达谱。选择性剪接和胶质母细胞瘤肿瘤突变负荷(胶质母细胞瘤-tmb)数据分别从tcgaspliceseq数据库和gdc数据库下载。[0082]接下来，对异常可变剪接事件和突变基因分布进行了联合分析，以探索的胶质母细胞瘤相关新抗原。共鉴定出34个新抗原候选基因，其中lrp1是更合适新抗原候选基因。[0083]第三，为了筛选适合接种疫苗的合适患者，利用共识聚类根据候选新抗原基因的表达谱将160名胶质母细胞瘤患者分为三种免疫亚型，分别为cluster1，cluster2，cluster3。基于tmb、异常可变剪接事件、免疫活性和免疫细胞比例的联合分析，发现cluster3中的患者可能更适合个性化的基于新抗原的疫苗。[0084]鉴定新抗原候选基因[0085]获得性肿瘤突变负荷(tmb)可能会产生并增加免疫原性新抗原产生的机会。因此，首先尝试基于胶质母细胞瘤样本中的突变基因来探索新抗原。图1中a揭示了胶质母细胞瘤样本中突变基因的分布；突变率最高的基因是tp53。图1中d-e显示了每个样本中基因组分数和突变计数改变的部分中频繁突变基因的分布。这些结果表明tp53在基因组分数和突变计数改变的部分中是频繁突变的基因。图1中b-c表明大多数患者的基因组变化和突变计数比例较低。根据上述分析，推测如果仅基于胶质母细胞瘤中的突变基因来探索肿瘤相关抗原，则免疫原性可能较低。接下来，分析了胶质母细胞瘤样本中的异常可变剪接事件。在对来自tcga-胶质母细胞瘤队列的38052个选择性剪接事件的一般调查中，发现外显子跳跃(es)是最常见的，共18360个。最少发生的可变剪接事件是互斥外显子(me)，共184个(图2中a-b)。me主要发生在其他选择性剪接事件中。此外，ptk2基因还发生了7种可变剪接事件(图2中c)。筛选出3789个异常可变剪接事件(fdr《0.05and|logfc|》1)；上调的可变剪接事件总计1699个(包括1320个基因)，下调的可变剪接事件总计2090个(包括1706个基因)(图3中a-b)。图3中c-d显示了基因中异常可变剪接事件的分布。[0086]第三，具有异常可变剪接事件(上调)和移码突变的基因被确定为胶质母细胞瘤新抗原候选基因。研究结果共发现了1320个上调的可变剪接异常和319个移码突变基因。被归类为上调可变剪接异常和移码突变的基因被认为是新抗原候选基因；共鉴定了34个新抗原候选基因(图4中a)。clusterprofiler软件包用于对已识别新抗原候选基因进行功能富集分析(p.adj《0.05)。发现新抗原候选基因富集到16个生物过程、4个分子功能(图4中b-c)。这些基因富含对gtpase活性的调节、突触可塑性的调节和细胞-基质粘附的负调节(图4中b)。分子功能结果表明，新抗原候选基因主要针对gtpase调节活性和核苷-三磷酸酶调节活性(图4中c)。[0087]新抗原候选基因与无义介导的mrna衰变(nmd)因子之间的关联[0088]无义介导的mrna衰变(nmd)是一种存在于所有真核生物中的转录监测途径，可以通过消除含有提前终止密码子的mrna转录物来减少异常转录物。从已发表的研究中获得了四个已证实的nmd调节因子，即upf1、upf2、upf3a和upf3b。根据这四种nmd因子在胶质母细胞瘤样本中的中位表达水平，将所有胶质母细胞瘤样本分为两组——高表达组和低表达组。ggpubr包用于分析抗原候选基因的表达水平以及两组间可变剪接事件的差异(t检验，p《0.05)。[0089]新抗原候选基因浸润与apc之间的关联[0090]上述候选新抗原基因的生存相关性有助于进一步筛选可能具有免疫刺激或抑制作用的预后抗原作为候选抗原。使用单变量cox比例风险回归模型分析了34个新抗原候选基因，并筛选出5个与生存相关的基因(lrp1、tcf12、derl3、wipi2、tshz3)。lrp1、tcf12、derl3和wipi2是保护基因(hr《1)。然而，tshz3被鉴定为风险基因(hr》1)。图5中a显示了这五个基因的预后功效。图6中b显示了可变剪接异常上调基因、移码突变基因和预后抗原候选基因的数量。然后，对与预后相关的五个新抗原候选基因进行多变量cox回归分析。根据中位基因表达值(p《0.05)将患者分为低危组和高危组，并分析生存期。图5中c显示低风险组的生存期较长。因此，上述五种预后抗原候选基因具有的免疫刺激作用。[0091]timer是系统分析不同癌症类型的免疫浸润的综合资源。timer用于观察已识别的抗原候选基因表达谱与抗原呈递细胞浸润之间的关系(p《0.05)。发现lrp1的表达水平与免疫浸润细胞的水平呈显着正相关，尤其是巨噬细胞、b细胞和树突状细胞(图6中d)。这些结果表明lrp1可以被抗原呈递细胞处理和呈递以触发更敏感的免疫反应。因此，lrp1可能具有的免疫刺激作用，是作为胶质母细胞瘤的相关新抗原，进而用于免疫治疗的有效候选基因。[0092]鉴定免疫亚型[0093]免疫亚型可以用来反映恶性肿瘤的免疫状态，从而有助于筛选适合接种疫苗的患者。基于五个预后候选新抗原基因(lrp1、tcf12、derl3、wipi2、tshz3)的表达谱，对来自tcga-胶质母细胞瘤数据库的160个胶质母细胞瘤样本进行了共识聚类并确定了免疫亚型。[0094]根据累积分布函数和函数delta区域，选择了k＝3的免疫相关基因稳定簇(图6中a-c)，得到了三个免疫亚型，分别命名为cluster1、cluster2和cluster3。接下来，通过主成分分析(pca)对三种亚型进行验证，结果发现三种免疫亚型可以很好地分离(图6中d)。图7中e显示了cluster1、cluster2和cluster3中免疫基因的表达谱。生存分析结果表明，这三种亚型的总体预后存在显着差异。cluster3中的患者预后较好，而cluster2患者的存活率较低(图7f)。总之，定义了三种与临床结果相关并能够预测胶质母细胞瘤患者预后的免疫亚型。[0095]免疫亚型间tmb及异常可变剪接事件分析[0096]tmb和异常可变剪接事件的组合可以准确预测免疫治疗应答者的准确性。较高的tmb和体细胞突变率与较强的抗癌免疫力相关。[0097]因此，首先，使用突变数据集计算每个样本的tmb，并在三种免疫亚型中对其进行分析。在图8中a-b中发现了不同亚型中tmb和突变基因的数量。图8中c-e揭示了不同亚型中突变基因的频率。发现tp53、egfr、pten和ttn是每个亚型中突变频率最高的基因，其中cluster3是突变频率最高的亚型。[0098]然后，选择绝对g值大于0.4的拷贝数的样本，并可视化每个亚型中cnv的g值。cnv在cluster1、cluster2和cluster3中的染色体分布如图7中g-i所示。总之，每个亚型和cluster3之间的显着差异具有更高的tmb。[0099]随后，观察发现不同亚型中异常可变剪接事件丰度的差异，并展示了前20个异常可变剪接事件(上调；p《0.05)。在三种免疫亚型中共鉴定出51个异常可变剪接事件，分别在cluster1、cluster2和cluster3中发现9、20和22个异常上调可变剪接事件(图8中a-c)。[0100]cluster3出现更高的tmb和更多的异常可变剪接事件，因此cluster3中的患者可能更适合接种疫苗。[0101]免疫活性分析，免疫细胞在免疫亚型中的比例[0102]免疫活性和免疫细胞比例是与免疫治疗预后密切相关的主要成分，因此，探索每种免疫亚型中免疫活性和免疫细胞比例的特征。[0103]首先，为了分析3种免疫亚型之间的免疫活性差异，从tip数据库下载了tcga-胶质母细胞瘤样本的免疫活性评分，观察了不同亚型中每个样本的免疫细胞活性(p《0.05)。图10中a揭示了三种免疫亚型之间免疫活性评分的明显差异。尤其是cluster3中自然杀伤(nk)细胞、t细胞、巨噬细胞、t辅助1型(th1)细胞和树突状细胞募集的得分显着低于其他两个亚型，表明接种疫苗后，cluster3中的患者可能会增强最大的免疫反应。[0104]其次，认为免疫检查点(icps)和免疫原性细胞死亡调节剂(icds)在调节宿主抗肿瘤免疫中起重要作用，并可能影响免疫治疗的疗效。因此，从之前的研究中获得了icps和icds，并计算了它们在三个亚型中表达水平的差异。检测到47个icp在三种免疫亚型中差异表达(图9中b)。在tcga-胶质母细胞瘤队列中，肿瘤中的主要免疫检查点ctla4、pdcd1(pd-1)和cd274(pd-l1)在cluster3中的表达水平最低。同样，图9中c显示共有17个icd在三种免疫亚型中差异表达。calr、fpr1、hgf、ifnar1、ifnar2、met、tlr4、eif2ak4、anxa1、panx1和p2ry2在cluster3中显着下调，表明胶质母细胞瘤相关新抗原可能对cluster3中的患者更有效。[0105]第三，评估每种免疫亚型中免疫细胞的比例。利用ssgsea来检查三种免疫亚型中28个免疫浸润细胞的丰度差异(图9中d)。图10中e发现cluster3中的9个免疫浸润细胞，如记忆b细胞、cd4记忆激活t细胞、单核细胞、m2巨噬细胞和中性粒细胞的丰度显著下降，说明cluster3中的患者可能更适合接种疫苗，患者接种疫苗后能够产生强烈的免疫浸润细胞。[0106]将免疫亚型与肿瘤生物标志物和泛癌亚型进行比较[0107]肿瘤标志物可以预测癌症的进展、预后和复发。从tcga-胶质母细胞瘤数据集中确定了多个肿瘤标志物，23个癌症生物标志物在三种免疫亚型之间显示出显着差异。如图10中a所示，23种癌症生物标志物的表达丰度在三种亚型之间存在显着差异。多个致癌基因在cluster2胶质母细胞瘤样本中上调，而cluster3中存在更多肿瘤抑制基因。已经确定了六种泛癌亚型，包括c1(伤口愈合)、c2(ifn-γ显性)、c3、c4(淋巴细胞)、c5(免疫安静)和c6(tgf-β显性)。然后评估这六种类型在三种免疫亚型中的分布。如图10中b所示，c4在cluster1、cluster2和cluster3中所占比例最大。[0108]该结果进一步说明cluster3患者可能更适合接种疫苗，并且给予新抗原会刺激cluster3患者更强的免疫反应。[0109]综上[0110]疫苗传统上被用于预防传染病，近年来，基于个性化新抗原的癌症疫苗是目前可用的癌症疫苗策略中一种很有前途的新型免疫疗法。在这项研究中，构建了一个同时具有异常可变剪接事件(上调)和移码突变的基因谱，从中鉴定了34个可靶向抗原。尤其是lrp1不仅与胶质母细胞瘤预后不良密切相关，而且与抗原呈递细胞，特别是b细胞浸润密切有关。因此，lrp1可能具有较强的免疫刺激潜力，有望成为一种有效新抗原候选基因。然后，通过构建三个强大的免疫亚型，确定cluster3中的患者最适合接种新抗原个性化癌症疫苗。[0111]早期治疗性疫苗接种策略侧重于肿瘤中异常表达或过度表达的自身抗原，称为肿瘤相关抗原(taa)，但由于taa特异性t细胞受中枢和/或外周耐受性的影响，此类策略在临床上基本上不成功。此外，这种taas在非恶性组织中也有一定程度的表达，增加了疫苗诱导的自身免疫毒性的风险。[0112]选择性剪接涉及许多癌症基因的调控，涉及癌细胞生物学行为的各个方面，尤其是细胞增殖、细胞凋亡、血管生成和免疫逃逸。越来越多的证据表明，剪接变体的不平衡表达或错误表达的异构体是癌症的重要特征。已经在许多癌症中研究了特异性和不准确的剪接变体作为诊断、预后和治疗目标。受到这一证据的启发，筛选了具有异常可变剪接事件(上调)和移码突变的基因，希望它们能成为强新抗原并导致个性化疫苗的开发。本研究选择lrp1、tcf12、derl3、wipi2和tshz3作为候选因子。[0113]转录因子12(tcf12)与结直肠癌、膀胱癌和乳腺癌的侵袭转移显着相关。derl3属于derlin家族(derl1、derl2和derl3)。derl1在非小细胞肺癌、乳腺癌和结肠癌中过度表达。wd重复结构域磷酸肌醇相互作用蛋白2(wipi2)在hcc组织中的表达显着升高，并且与低存活率相关。teashirt锌指家族成员3(tshz3)在胶质瘤组织和细胞系中显着下调。tshz3的过表达抑制u87和u251胶质母细胞瘤细胞的侵袭性。[0114]低密度脂蛋白受体(ldlr)相关蛋白-1(lrp1)是一种大型多功能内吞细胞表面受体。lrp1的低表达与肝癌的低生存率密切相关。然而，lrp1的高表达与子宫内膜癌、乳腺癌和前列腺癌的晚期肿瘤分期相关。因此，lrp1对肿瘤细胞的确切作用可能取决于肿瘤细胞类型。[0115]肿瘤新抗原是否具有很强的免疫原性和靶向杀伤肿瘤细胞的能力，取决于它们是否能诱导t细胞反应，尤其是最大限度地激活和扩增cd8+t细胞的能力。实现这一目标的一种方法是使用自体抗原呈递细胞(apc)，特别是dc，来刺激对肿瘤新抗原的免疫反应。此外，疫苗还可以利用dcs作为疫苗递送系统，使疫苗能够快速有效地发挥作用。因此，评估了五种新抗原候选基因与抗原呈递细胞之间的关系。发现lrp1与抗原呈递细胞，尤其是cd8+t细胞、cd4+t细胞和dcs密切相关，说明lrp1可以直接被抗原呈递细胞加工，然后呈递给t细胞，并被b细胞识别到引发免疫反应。因此，推测lrp1可能具有较强的免疫原性，可以利用dcs作为递送系统，快速靶向杀伤肿瘤细胞。因此，lrp1是开发针对胶质母细胞瘤新抗原癌症疫苗的有希望的候选者。[0116]先前的研究已经根据体细胞突变的基因谱确定了新抗原癌症疫苗的多个新抗原候选基因。然而，研究表明，对于许多类型的癌症，肿瘤突变负荷的预测准确性不足。异常的可变剪接和移码突变具有产生大量新抗原的巨大潜力。因此，建议这些具有异常可变剪接事件(上调)和移码突变的生物标志物可以更有效地作为胶质母细胞瘤个性化新抗原疫苗的肿瘤相关抗原。尽管已经预测到这些基因在胶质母细胞瘤疫苗中的潜力，但仍需要进一步的临床评估和验证。[0117]由于疫苗对患者的治疗效果不同，根据候选新抗原基因谱确定了三种免疫亚型，以选择合适的患者进行疫苗接种。所有三种免疫相关亚型都表现出不同的分子、细胞和临床特征。cluster3中的患者表现出高水平的tmb，以及更多异常的可变剪接事件。据报道，无义介导的mrna衰变和肿瘤突变负荷的结合显着提高了免疫治疗应答者的预测准确性，这表明cluster3患者是最适合接种疫苗的候选者。此外，由于cluster3中的记忆b细胞、t.cells.cd4记忆激活t细胞、单核细胞、m2巨噬细胞和中性粒细胞最低，表明cluster3中的患者接种疫苗可能会产生免疫浸润细胞，从而使免疫治疗更加有效。有效的。这些结果表明，cluster3患者是疫苗接种的受益者，这使得基于新抗原的个性化癌症疫苗治疗更加敏感和有效。[0118]通过选择具有异常可变剪接(上调)和基因移码突变的基因，在胶质母细胞瘤中鉴定出五种潜在的肿瘤新抗原(lrp1、tcf12、derl3、wipi2和tshz3)，其中lrp1与抗原呈递细胞显著相关。根据5种潜在肿瘤新抗原的表达情况，将160例胶质母细胞瘤患者分为3种免疫亚型。cluster3中的患者预后良好。此外，包括tmb、异常可变剪接事件、免疫活性、免疫细胞比例以及与肿瘤生物标志物的关联在内的特征在每个免疫亚型中都是独一无二的。cluster3的特征说明cluster3中的患者更适合接种疫苗。[0119]总体而言，lrp1是胶质母细胞瘤是个性化新抗原癌症疫苗开发的新抗原，并且此疫苗可能对cluster3中的患者有益，为针对胶质母细胞瘤的基于新抗原的个性化癌症疫苗提供了有价值的分析，并确定了适合接种疫苗的患者。[0120]本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。当前第1页12当前第1页12
技术特征：1.与胶质母细胞瘤预后显著相关的抗原，其中，所述抗原包括lrp1、tcf12、derl3、wipi2、tshz3抗原基因中至少一种。2.权利要求1中所述的抗原在制备治疗型胶质母细胞瘤产品中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述抗原为lrp1抗原基因。4.根据权利要求2或3所述的应用，其中，所述治疗型胶质母细胞瘤产品包括胶质母细胞瘤疫苗。5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述胶质母细胞瘤疫苗为个体新抗原癌症疫苗。6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述胶质母细胞瘤疫苗为mrna新抗原癌症疫苗。7.lrp1、tcf12、derl3、wipi2、tshz3中至少一种表达水平检测剂在制备胶质母细胞瘤治疗预后效果检测分析产品中应用。8.lrp1表达水平检测剂在制备胶质母细胞瘤免疫细胞浸润水平检测产品中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其中，所述免疫细胞为抗原呈递细胞；所述抗原呈递细胞包括cd8+t细胞、cd4+t细胞、树突状细胞、巨噬细胞、b细胞。10.筛选适合接种权利要求2中新抗原癌症疫苗的胶质母细胞患者的方法，其特征在于，针对胶质母细胞患者样本中的候选抗原基因的表达谱进行分析，构建一致性聚类；根据其累计的分布函数和增量区域图，选择免疫相关基因稳定聚类的k＝3，得三种免疫亚型；特征分析：(a)对三种免疫亚型间tmb及异常可变剪切事件出现频率进行分析，(b)对三种免疫亚型中免疫治疗预后的生存率进行分析，(c)将三种免疫亚型与肿瘤生物标志物和泛癌亚型进行比较；若(a)、(b)、(c)三者分析确定的免疫亚型相同，则确认该免疫亚型为适合接种人群。
技术总结本发明属于生物技术领域，具体公开了与胶质母细胞瘤预后显著相关的抗原及其应用，包括与胶质母细胞瘤预后显著相关的抗原，其中，抗原包括LRP1、TCF12、DERL3、WIPI2、TSHZ3抗原基因中至少一种。LRP1、TCF12、DERL3、WIPI2、TSHZ3抗原基因中至少一种抗原在制备胶质母细胞瘤治疗型新抗原癌症疫苗产品中的应用。LRP1表达水平检测剂在制备胶质母细胞瘤治疗预后效果检测分析产品中应用。LRP1表达水平检测剂在制备胶质母细胞瘤免疫细胞浸润水平检测产品中的应用。本发明为胶质母细胞瘤患者开发治疗型新抗原癌症疫苗提供了指导。LRP1等被证实为胶质母细胞瘤免疫治疗型疫苗的潜在新抗原，其中cluster3中的胶质母细胞瘤患者更适合接种该疫苗。同时也提供了用于筛选适合接种相应抗原疫苗人群的方法。疫苗人群的方法。疫苗人群的方法。
技术研发人员：高雯琪 邓志芳 肖晗 蔡晓楠 刘珏
受保护的技术使用者：武汉儿童医院
技术研发日：2022.07.18
技术公布日：2022/11/1
