17β-HSD7作为非酒精性脂肪性肝病的治疗靶标及其应用

hsd7酶活性的物质中筛选。
10.降低或抑制17β-hsd7基因和/或其编码的蛋白表达的物质在制备治疗非酒精性脂肪性肝病以及改善巨噬细胞极化失衡及相关疾病的药物中的应用。所述的降低或抑制17β-hsd7基因和/或其编码的蛋白表达的物质包括抑制或沉默17β-hsd7基因的rna(如shrna、sirna、mirna等)，或能表达或形成所述rna的载体。
11.抑制17β-hsd7酶活性的物质在制备治疗非酒精性脂肪性肝病以及改善巨噬细胞极化失衡及相关疾病的药物中的应用。所述的抑制17β-hsd7酶活性的物质包括芬维a胺(fenretinide)、单宁酸(tannic acid)、盐酸肼屈嗪(hydralazine hcl)、比拉斯汀(bialastine)、左旋乳酸(l-lactic acid)、氯法拉滨(clofarabine)、地拉罗司(deferasirox)七种药物。
12.本发明的优点和有益效果：本发明首次发现并证实抑制巨噬细胞17β-hsd7能有效遏制nafld的发生发展，通过对17β-hsd7的干预能够改善疾病。本发明为nafld以及巨噬细胞极化失衡相关疾病的临床治疗提供潜在靶标和药物研发方向。17β-hsd7作为nafld以及巨噬细胞极化失衡相关疾病的临床治疗靶标，具有良好的临床应用价值，可以带来巨大的社会经济利益。
附图说明
13.图1.nafld小鼠和急性肝损伤小鼠肝巨噬细胞17β-hsd7的表达变化。(a)高脂饮食(hfd)或对照饲料(control)饲喂2、4、6周，流式检测巨噬细胞内17β-hsd7表达。(b)蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(mcd)饮食或对照饲料(control)饲喂2、4、6周，流式检测巨噬细胞内17β-hsd7表达。(c)和(d)小鼠腹腔注射400mg/kg对乙酰氨基酚(apap)或生理盐水(c)24h后流式检测巨噬细胞内17β-hsd7表达。n＝3-4，**p《0.01，***p《0.001。
14.图2.巨噬细胞特异性敲除hsd17b7(hsd17b7
m-ko
)小鼠的鉴定。(a)鼠尾提取出的dna，经pcr仪扩增和琼脂糖凝胶电泳的分离得到的dna条带图，hsd17b7表示hsd17b7-flox基因，lyz表示巨噬细胞特异性表达重组酶的基因。(b)流式检测分离得到的小鼠bmdms细胞纯度。(c)wb检测hsd17b7
fl/fl
和hsd17b7
m-ko
小鼠bmdms中17β-hsd7的表达。
15.图3.巨噬细胞17β-hsd7敲除改善小鼠hfd诱导的nafld。hsd17b7
fl/fl
和hsd17b7
m-ko
小鼠hfd饮食或维持饮食(ncd)饲喂6周后(a)肝脏巨噬细胞m1和m2流式占比图。(b)m1和m2占比统计图。(c)肝脏he染色结果(比例尺＝100μm)。(d)肝脏油红o染色结果(比例尺＝100μm)。(e)和(f)葡萄糖耐量(gtt)和胰岛素耐量(itt)结果。(g)elisa检测肝组织炎性细胞因子tnf-α、il-1β结果。(h)血清ast和alt水平。n＝5-8，*p《0.05，**p《0.01。
16.图4.巨噬细胞17β-hsd7敲除改善apap诱导的肝损伤。(a)hsd17b7
fl/fl
和hsd17b7
m-ko
小鼠经腹腔注射400mg/kg的对乙酰氨基酚(apap)或相同剂量的生理盐水(saline)24h后(a)肝脏巨噬细胞m1和m2流式占比图。(b)m1、m2占比及m1/m2比值统计图。(c)肝脏石蜡切片he染色结果(100
×
，比例尺：100μm；200
×
，比例尺：50μm)。(d)肝脏石蜡切片tunel染色图(100
×
，比例尺100μm)(n＝3)；(e)：血清ast的水平；(f)：血清alt的水平。n＝8，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
17.图5.17β-hsd7蛋白的诱导和分离纯化以及抑制17β-hsd7酶活性体系的建立和药物筛选。(a)大肠杆菌在不同浓度iptg和不同诱导时间处理下17β-hsd7重组蛋白的表达。
(b)纯化前后相同质量总蛋白中17β-hsd7的表达。(c)抑制17β-hsd7酶活性体系。(d)从fda药物库中筛选药物的药物抑制率统计图，包括芬维a胺(fenretinide，46.1％)、单宁酸(tannic acid，43％)、盐酸肼屈嗪(hydralazine hcl，41.2％)、比拉斯汀(bialastine，39.6％)、左旋乳酸(l-lactic acid，35.8％)、氯法拉滨(clofarabine，31％)、地拉罗司(deferasirox，30.7％)共七种抑制率较高的药物。
18.图6.fen对脂质累积和肝损伤的作用。(a)raw 264.7给予等体积溶剂(ctrl)，100ng/ml脂多糖(lps)+250μm油酸(oa)+125μm棕榈酸(pa)(lop)，0.1、1、10μm fen和lop 12h后与aml-12细胞共培养，油红o检测肝细胞内脂质累积以及半定量。c57bl/6j小鼠经生理盐水(c)、400mg/kg apap(apap)及30mg/kg fen和apap(fen)处理后的(b)肝脏he染色(100
×
，比例尺：100μm；200
×
，比例尺：50μm)；(c)血清alt与ast水平；(d)肝脏il-1β和tnf-α水平；(e)肝脏sod水平和mda水平。n＝5，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
具体实施方式
19.以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
20.若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
21.实施例1
22.1.nafld小鼠和急性肝损伤小鼠肝巨噬细胞17β-hsd7表达上调。
23.c57bl/6j小鼠饲喂高脂饮食(hfd)或蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(mcd)2、4、6周构建nafld疾病模型，腹腔注射对乙酰氨基酚(acetaminophen,apap)构建急性肝损伤模型，分离肝脏非实质细胞，流式检测巨噬细胞内17β-hsd7表达，均呈上调趋势(图1)。
24.具体实验方法：
25.8周左右c57bl/6j小鼠(22-24g，购自三峡大学动物实验中心)，饲喂维持饲料或60％高脂饮食(hfd，f3282，购自北京科奥协力)或蛋氨酸-胆碱缺乏饮食(mcd，购自北京科奥协力)2、4、6周建立nafld模型；腹腔注射生理盐水或400mg/kg对乙酰氨基酚(购自武汉科瑞)24h建立急性肝损伤模型。造模成功后，流式细胞术检测巨噬细胞内17β-hsd7表达。
26.1)制备肝脏非实质细胞：肝脏灌注d-hanks液，去除肝内血细胞，采用体外消化法获得肝脏总细胞：组织置于消化液中(含0.05％胶原酶ⅳ，0.002％dnase酶和1％bsa的hanks液)37℃，160rpm，消化40min。然后，两次50g离心5min以去除肝实质细胞。上清再400g离心5min，沉淀裂红。
27.2)表面染色：细胞加入cd16/32(biolegend，156604)冰上孵育10min，封闭fc端。再加入1.2μl/t的f4/80-pecy7(biolegend，1231124)，冰上避光孵育30min后，加入500μlpbs，400g离心5min。
28.3)固定破膜：加入500μl的foxp3固定破膜液(ebioscience，00-5523-00)，避光室温孵育25min后，再加入1ml破膜缓冲液，400g离心5min，破膜缓冲液洗涤一次。
29.4)间接法染17β-hsd7：加入0.5μl/管的anti-mouse 17β-hsd7(santa cruz，sc-393936)，室温避光染色30min后，破膜缓冲液洗涤两次。再加入0.4μl/管羊抗鼠偶联pe的流式二抗，室温避光染色30min后，破膜缓冲液洗涤两次，pbs重悬。
30.5)流式细胞仪检测。
31.2.构建巨噬细胞hsd17b7敲除小鼠。
32.从鼠尾提取出dna进行鉴定，鼠尾dna经扩增后琼脂糖凝胶电泳进行基因鉴定(图2a)。另一方面，提取小鼠骨髓源性巨噬细胞(bmdms)，利用流式细胞术鉴定其纯度，结果显示，表达f4/80和cd11b的双阳的细胞率达95％以上(图2b)，说明bmdms纯度较高。进一步利用蛋白印迹技术，在蛋白水平证实了巨噬细胞内17β-hsd7成功敲除(图2c)。
33.具体实验方法：
34.hsd17b7
fl/fl
小鼠与巨噬细胞敲除工具鼠(lyz2cre)均购自江苏集萃药康生物科技公司。hsd17b7
fl/fl
小鼠在hsd17b7插入flox位点；lyz2cre小鼠在lyz基因的一端插入icre位点，基于cre-loxp重组酶系统构建巨噬细胞特异性hsd17b7敲除鼠(hsd17b
m-ko
)。icre重组酶具有位点间重组功能，能特异性识别flox位点，通过酪氨酸残基与flox共价结合，通过标定剪切位点裂解dna底物，使得flox位点之间的基因序列沉默。即hsd17b7
fl/fl
小鼠与lyz2cre小鼠交配产生f1代，f1代的hsd17b7
fl/wt lyz2cre
+
再与hsd17b7
fl/fl
小鼠交配产生的hsd17b7
fl/fl
lyz2cre
+
小鼠，即为巨噬细胞特异性敲除hsd17b7(hsd17b7
m-ko
)小鼠。
35.鼠尾dna鉴定：小鼠生长到3-4周后，剪鼠尾，放于50μl裂解液(含10％10
×
buffer，1％100
×
蛋白酶k，1％β-巯基乙醇的蒸馏水)中，56℃恒温箱裂解过夜。第二天，95℃金属浴10min以灭活蛋白酶k，13000rpm离心5min，吸出上清。pcr扩增(hsd17b7-flox反应体系：taq酶5μl，ddh2o 4μl，hsd17b7-f0.2μl，hsd17b7-r 0.2μl，dna模板0.6μl；lyz2扩增体系：taq酶6.5μl，ddh2o 4μl，lyz2cre-f 0.375μl，lyz2cre-r 0.375μl，lyz2wt-f 0.375μl，lyz2wt-r 0.375μl dna模板1μl；扩增条件：95℃5min；98℃30s，65℃30s；72℃45s循环20次；98℃30s，55℃30s；72℃45s；20个循环)，2％琼脂糖凝胶电泳后使用全自动凝胶成像系统获得结果。
36.所用引物序列：
[0037][0038]
分离小鼠骨髓源性巨噬细胞(bmdms)及纯度鉴定：l929细胞在含10％胎牛血清以及1％青-链霉素的1640培养基的t75瓶中培养，细胞增殖至第7天长满时，收集经过0.22μm滤器过滤的细胞上清。8周大的小鼠断颈处死后，取出小鼠后肢，除去皮毛和股骨所连接的肌肉组织，将骨放于培养基中，用1ml的注射器将骨头中的骨髓及细胞冲洗出来，1000rpm离心8min，裂红，通过70目的滤网；离心沉淀后，种于含30％l929细胞上清、10％fbs以及1％青-链霉素的1640培养基中，第五天换液，七天后可得到分化成熟的bmdm细胞。成熟bmdms刮至离心管，400g离心5min获得细胞沉淀，加入cd16/32冰上孵育10min，封闭fc端。再加入1.2μl/t的f4/80-pecy7和0.8μl/t的cd11b-fitc(bd,553310)，冰上避光孵育30min后，加入500μl pbs，400g离心5min，pbs重悬后流式细胞仪检测阳性率。
[0039]
蛋白印迹法鉴定17β-hsd7敲除：
[0040]
1)分离得到的bmdms加50μl的裂解液(含1％蛋白酶抑制剂的ripa溶液)冰上裂解
30min后，12000rpm 4℃离心5min，得到蛋白上清。蛋白上清稀释十倍后，每孔加入200μl的显色液(a液：b液＝50：1，碧云天)，放置于37℃恒温箱中孵育20min，于570nm处测定吸光度值。根据标准曲线计算出蛋白浓度，调整蛋白浓度为相同浓度后，加入5
×
loading buffer，金属浴中95℃变性10min；
[0041]
2)电泳：制备10％的sds-page胶，每孔上样40μg的蛋白样，先以70v的恒定电压跑至浓缩胶与分离胶界面，再以110v电压分离；
[0042]
3)转膜：pvdf膜置于甲醇中活化5min，转膜夹泡于转膜液中，取出胶放于黑板上的滤纸上，再叠上膜，注意两者间紧密贴合无气泡。350ma恒流，4℃转膜90min；
[0043]
4)封闭：5％的脱脂奶粉(tbst配制)室温封闭2h；
[0044]
5)孵育抗体：孵育一抗：加入anti-mouse 17β-hsd7(1：1000)和anti-mouseβ-tubulin(1：1000)，4℃孵育过夜。孵育二抗：tbst洗涤3次后，加入羊抗鼠偶联hrp的lgg二抗(1：10000)室温孵育1h；
[0045]
6)检测：tbst洗涤3次后，使用全自动凝胶成像系统拍照。
[0046]
3.巨噬细胞17β-hsd7敲除改善hfd诱导的nafld。
[0047]
巨噬细胞17β-hsd7敲除后hfd诱导nafld小鼠的巨噬细胞极化失衡、胰岛素抵抗、脂质累积、肝损伤和炎症水平均改善。hfd饲喂6周后，与hsd17b7
fl/fl
小鼠相比，17β-hsd7敲除小鼠巨噬细胞m1极化减少(图3a和b)，肝组织he和油红o染色结果显示肝脏脂质累积减少(图3c和d)，gtt和itt结果显示胰岛素抵抗水平改善(图3e和f)，肝组织tnf-α和il-1β水平显示炎症(图3g)，alt和ast水平显示肝损伤减轻(图3h)，nafld症状得到改善。
[0048]
具体实验方法：
[0049]
m1型巨噬细胞表面标志分子cd11c和m2型巨噬细胞表面分子cd206的流式测定
[0050]
1)按照上述方法制备肝脏非实质细胞。
[0051]
2)表面染色：细胞加入cd16/32(biolegend，156604)冰上孵育10min，封闭fc端。再加入f4/80-pecy7(biolegend，1231124，1μl/t)，cd11c-pe(biolegend，117308，1.2μl/t)，cd206-apc(biolegend，141708，1μl/t)，冰上染色30min后，400g离心5min，pbs重悬。
[0052]
3)流式细胞仪检测。
[0053]
苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,he)检测肝脏组织病理情况
[0054]
1)取材：取肝脏右叶中间组织，浸泡于4％中性甲醛固定，静置过夜；
[0055]
2)脱水：酒精梯度(50％乙醇6h，70％乙醇3h，85％乙醇3h，95％乙醇1h两次，100％乙醇30min两次)脱水；
[0056]
3)透明：用二甲苯浸泡两次，每次20min；
[0057]
4)包埋：将组织浸蜡液3次，每次10min，再将蜡液倒入模具，室温静置冷却；
[0058]
5)切片：切片厚度约5μm，在48℃水浴中展片并放置于载玻片上，50℃烘干；
[0059]
6)脱腊：浸入二甲苯10-15min，两次；
[0060]
7)复水：按照100％乙醇5min两次，95％乙醇5min两次，85％乙醇5min，75％乙醇5min，蒸溜水5min的顺序水化；
[0061]
8)染色：苏木素染色10-15min，漂洗去除多余染料；伊红染色2-5min；
[0062]
9)封片：按照95％乙醇5min两次，无水乙醇5min两次顺序脱水。浸泡二甲苯10min两次洗涤，并用中性树胶封片；
[0063]
10)镜检：置于显微镜下，分别在20
×
和40
×
物镜下观察拍照。
[0064]
油红o染色检测肝脏脂滴累积
[0065]
1)取肝脏右叶中间组织，包埋于oct组织包埋剂中，浸入液氮约30s后，保存于-80℃；
[0066]
2)切片：将样本置于低温冰冻切片机内，在-20℃下进行切片，切片厚度约为8μm，切片于室温下放置30min；
[0067]
3)固定：在4℃下，将切片用丙酮固定8min，烘箱干燥20min；
[0068]
4)配制油红o工作液：6.0ml饱和油红o液体中加入4.0ml超纯水，用双层滤纸过滤；
[0069]
5)间化：pbs漂洗，再用60％异丙醇浸润切片；
[0070]
6)染色：弃去液体，稍晾干，加入油红o工作液，室温孵育10-15min；
[0071]
7)洗涤：弃去染液，再用60％异丙醇浸润切片，pbs漂洗；
[0072]
8)复染：苏木素过滤后复染3-5min，pbs漂洗并用甘油明胶封片；
[0073]
9)镜检：置于显微镜下，在20
×
物镜下观察拍照。
[0074]
gtt实验检测小鼠葡萄糖耐受水平
[0075]
1)禁食：高脂饮食造模6w时，小鼠于实验前一天晚上18时至第二天上午9时禁食15h，不禁水；
[0076]
2)根据小鼠体重，每只小鼠葡萄糖用量为2g/kg。取葡萄糖(规格20ml：10g)2ml，加6ml生理盐水，配制成20％葡萄糖。实验前称量小鼠体重，计算腹腔注射葡萄糖剂量，每只小鼠注射量为0.1ml/10g；
[0077]
3)尾静脉取血，使用血糖仪和血糖试纸测量给葡萄糖前的血糖，记为glu
0min
；
[0078]
4)腹腔注射葡萄糖，分别在15min、30min、60min、120min时尾静脉取血，检测并记录血糖；
[0079]
5)收集结果数据，以时间点为横坐标，血糖值为纵坐标做血糖随时间变化的折线图；
[0080]
6)计算折线下面积：
[0081]
auc：auc
gtt
＝[15
×
glu
0min
+30
×
glu
15min
+45
×
glu
30min
+90
×
glu
60min
+60
×
glu
120min
]/2。
[0082]
itt实验检测小鼠胰岛素耐受水平
[0083]
1)禁食：高脂饮食造模6w时，小鼠于实验当天8时至12时禁食5h，不禁水；
[0084]
2)根据小鼠体重，每只小鼠胰岛素用量为0.75u/kg。取胰岛素(规格：40u/ml)0.1ml，加39.9ml生理盐水，配制成0.1u/ml的胰岛素。实验前称量小鼠体重，计算腹腔注射胰岛素剂量，每只小鼠注射量为0.075ml/10g；
[0085]
3)后续实验步骤同gtt实验步骤3)到步骤6)。
[0086]
elisa检测肝脏细胞因子水平
[0087]
按照联科生物tnf-α、il-1β、il-10和tgf-β的elisa检测试剂盒说明书进行实验操作。
[0088]
1)肝脏匀浆制备：取小部分肝组织，按重量(g)：体积＝1:5的比例，加入5倍体积的pbs，4℃匀浆，2500rpm/min，离心10min，取上清分别检测tnf-α、il-1β、il-10和tgf-β水平；
[0089]
2)分别设置空白孔、标准品孔和样本孔，空白孔加入1
×
检测缓冲液100μl，标准品
孔加入梯度稀释的标准品100μl，样本孔加入用1
×
检测缓冲液稀释20倍的样本100μl；后续操作按照tnf-α检测试剂盒说明书进行；
[0090]
3)终止显色后，使用酶标仪检测各孔od
450nm
和od
570nm
值，根据标准曲线计算各组含量。
[0091]
血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,alt)和血清谷草氨酸(aspartate aminotransferase,ast)水平
[0092]
按照南京建成alt和ast检测试剂盒说明书进行实验操作。
[0093]
1)分别设置对照孔和样本孔，样本孔加入样本5μl，然后样本孔和对照孔均加入基质液20μl，震荡孔板混匀后，37℃气浴30min；
[0094]
2)样本孔与对照孔均加入苯肼液20μl后，再在对照孔加入超纯水5μl，37℃气浴20min；
[0095]
3)每孔加入氢氧化钠溶液200μl，轻轻混匀，室温放置15min，酶标仪检测各孔od
510nm
值；
[0096]
4)按照说明书制作标准曲线，根据曲线公式计算样本中的alt和ast活性。
[0097]
4.巨噬细胞17β-hsd7敲除改善apap诱导的急性肝损伤。
[0098]
对hsd17b7
fl/fl
小鼠和hsd17b7
m-ko
小鼠腹腔注射400mg/kg apap或生理盐水(saline)处理24h。与hsd17b7
fl/fl
+apap组相比，hsd17b7
m-ko
+apap组小鼠肝脏的巨噬细胞极化失衡得到改善(图4a和b)，he病理切片显示排列不规则的肝细胞大量减少，肝脏坏死面积明显降低(图4c)。tunel染色说明apap诱导的肝细胞凋亡在hsd17b7
m-ko
小鼠中显著改善(图4d)。同时，血清alt和ast水平说明巨噬细胞17β-hsd7敲除可改善apap诱导的肝损伤(图4e和f)。
[0099]
具体实验方法：
[0100]
m1型巨噬细胞表面标志分子cd11c和m2型巨噬细胞表面分子cd206的流式测定：方法同上。
[0101]
he检测肝脏组织病理情况：方法同上。
[0102]
肝脏末端dna转移酶dutp缺口末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,tunel)染色
[0103]
1)石蜡脱蜡液置于60℃中温热30min，将石蜡切片放于其中静止30min脱蜡；
[0104]
2)切片于自来水下冲洗5min，至无泡沫漂浮。用滤纸吸干组织周围的水后，画圈，每个样本上滴加100μl 1
×
蛋白酶k工作液，37℃反应20min，浸入pbs洗3次，每次5min；
[0105]
3)每个样本滴加100μl染色缓冲液，37℃反应30min后，吸水纸吸去染色缓冲液；
[0106]
4)每个样本滴加50μl标记工作液，放入湿盒中37℃避光反应60min，pbs洗三次；
[0107]
5)滴加dapi工作液，复染细胞核5min后，pbs洗4次，最后用含抗荧光淬灭剂的封片剂封片，置于荧光显微镜下观察拍照。
[0108]
血清谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,alt)和血清谷草氨酸(aspartate aminotransferase,ast)水平：方法同上。
[0109]
5.筛选17β-hsd7酶活性抑制药物。
[0110]
利用重组表达带有his标签的17β-hsd7的大肠杆菌以及通过itpg诱导获得该蛋白。使用不同浓度的iptg以及不同诱导时间下，利用sds-page分离不同分子量的蛋白，考马
斯亮蓝显示表达情况。如图5a显示，当iptg浓度为200μmol/l、处理5h时，17β-hsd7的诱导效率最佳。进一步，利用该诱导条件分离纯化的17β-hsd7蛋白(图5b)，建立了17β-hsd7酶活性的反应体系(图5c)，筛选得到能够抑制17β-hsd7酶活性的药物-包括芬维a胺(fenretinide，fen，46.1％)，以及单宁酸(tannic acid，43％)、盐酸肼屈嗪(hydralazine hcl，41.2％)、比拉斯汀(bialastine，39.6％)、左旋乳酸(l-lactic acid，35.8％)、氯法拉滨(clofarabine，31％)、地拉罗司(deferasirox，30.7％)其他六种抑制率较高的药物(图5c和d)。
[0111]
具体实验方法：
[0112]
诱导17β-hsd7在大肠杆菌中的表达
[0113]
1)50μl的带his标签的hsd17b7基因的大肠杆菌(购自隆仟生物，上海)菌液中加入4ml的lb培养基，37℃、200rpm/min，摇晃培养6-8h；
[0114]
2)当600nm处的od值为0.4-0.6时，取3ml的菌液加入到1l的lb培养基中，37℃、180rpm/min下摇晃培养4h；
[0115]
3)当600nm处的od值为0.5-0.8时，加入200μm的iptg，37℃摇晃培养5h；
[0116]
4)收集菌液，4℃、8000rpm离心10min，沉淀细菌；
[0117]
5)沉淀加入30ml的裂解液重悬，冰浴超声1h(200w，6s开，6s停)破碎菌体；
[0118]
6)4℃、15000rpm离心20min，收集蛋白上清。
[0119]
17β-hsd7蛋白的分离和纯化
[0120]
1)平衡液清洗镍树脂两次，去除乙醇，加入待分离上清，4℃孵育1h；
[0121]
2)4℃、2000g离心3min，沉淀树脂，洗涤树脂3次；
[0122]
3)洗脱蛋白：用含50mm咪唑的缓冲液清洗树脂，去除杂蛋白；再用250mm的咪唑缓冲液洗脱后，收集洗脱液。
[0123]
17β-hsd7酶活性抑制药物筛选体系：17β-hsd7脱氢酶活性反应体系为：0.12mm雌酮、1.8mg/ml17β-hsd7蛋白、0.4mm nadph和pbs(ph＝7.5)以及10mm的受试药物(dmso或水培养作为对照)。37℃孵育30min后，用酶标仪通过nadph在340nm处的吸光度变化测定17β-hsd7的酶活性。
[0124]
6.巨噬细胞17β-hsd7抑制药物——芬维a胺(fen)能够改善肝细胞脂质累积和肝损伤。
[0125]
小鼠巨噬细胞raw 264.7给予17β-hsd7抑制药物——芬维a胺(fen)后与小鼠肝细胞aml-12共培养，油红o结果显示与对照组(ctrl)相比，lop处理组脂质累积增加，而0.1μm(fen-0.1)、1μm(fen-1)、10μm(fen-10)fen处理后肝细胞脂质累积减少(图6a)。动物(c57bl/6j小鼠)水平，对照组(ctrl)给予生理盐水24h，apap组腹腔注射400mg/kg apap 24h，fen组提前三天腹腔注射30mg/kg fen预处理，再腹腔注射400mg/kg apap处理小鼠24h，观察肝损伤相关指标的差异。结果显示，与apap组相比，fen组小鼠he染色的肝脏病理切片显示出肝脏坏死面积极大减少(图6b)，血清中的ast与alt水平显著下降(图6c)，肝内促炎型细胞因子il-1β和tnf-α(图6d)以及脂质过氧化产物mda水平显著下降(图6e)，以及超氧化物歧化酶sod上升(图6e)。此外，这些指标基本恢复到正常小鼠的水平，这些结果说明fen能够显著减轻apap诱导的肝损伤，对肝损伤的治疗效果较强。
[0126]
具体实验方法：
[0127]
细胞油红o检测脂质累积
[0128]
1)药物处理：在lop(100ng/ml脂多糖(lps)+250μm油酸(oa)+125μm棕榈酸(pa))存在的情况下，用不同浓度fen(0.1、1、10μm)处理小鼠巨噬细胞系raw 264.7 12h，换无药物和lop的培养基12h，收集上清给予小鼠肝细胞系aml-12共培养24h；
[0129]
2)去除肝实质细胞培养上清，加入足量4％多聚甲醛覆盖细胞，室温下静置20分钟左右；
[0130]
3)用pbs漂洗细胞1-2次。用60％异丙醇快速清洗1次，弃去异丙醇，稍晾干；
[0131]
4)加入油红o工作液，覆盖细胞，室温孵育20分钟；
[0132]
5)除去染液，60％异丙醇迅速漂洗1次；
[0133]
6)核染：加入过滤后苏木素，覆盖细胞，室温孵育20分钟；
[0134]
7)漂洗拍照：pbs漂洗2次，放置于显微镜下观察；
[0135]
8)定量分析：接步骤5)加入异丙醇200μl，放置于摇床上，室温70rpm/min晃动10min，每个样吸取100μl至96孔板中，检测od
570nm
值。
[0136]
he检测肝脏组织病理情况：方法同上。
[0137]
血清alt和ast水平：方法同上。
[0138]
elisa检测肝脏细胞因子水平：方法同上。
[0139]
肝脏超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,sod)的测定
[0140]
按照南京建成sod检测试剂盒说明书进行实验操作。
[0141]
1)制备10％肝脏匀浆：按照肝组织重量(g):体积(ml)＝1:9的比例加入生理盐水，利用组织匀浆仪将制备匀浆，2500-3000rpm/min，离心10min，获得肝匀浆上清。
[0142]
2)预实验：将10％匀浆稀释成不同浓度，以保证其od值位于0.2-0.8之间。
[0143]
3)加样：对照孔中加入20μl的蒸馏水+20μl的酶工作液，对照空白孔中加入20μl的蒸馏水+20μl的稀释液，测定孔中加入20μl的样品匀浆+20μl的酶工作液，测定空白孔中20μl的样品匀浆+20μl的稀释液；再往以上孔中加入20μl底物液，37℃孵育20min，450nm处测定吸光度值。
[0144]
4)bca法测定样品中的蛋白浓度。
[0145]
5)sod抑制率和活力计算：
[0146]
活力＝抑制率
×
24
÷
蛋白浓度
[0147]
肝脏丙二醛(malondialdehyde,mda)的测定
[0148]
1)制备10％的肝脏匀浆
[0149]
2)加样：对照孔和测定孔中加入100μl的测试样品+100μl的蛋白分解液，标准孔中加入100μl的标准样品+100μl的蛋白分解液，空白孔中加入100μl的标准样品+100μl的蛋白分解液；混匀后，空白孔、标准孔和测定孔中加入3ml的缓冲液以及1ml的tba显色液；而对照孔中加入3ml的缓冲液以及1ml的50％冰醋酸。
[0150]
3)离心管盖上盖后，扎一小孔，混匀后，置于95℃恒温水浴锅中40min，流水冲洗冷却后，3500-4000rpm/min离心10min。取上清于532nm处，测定吸光度值。
[0151]
4)

技术特征：
1.17β-hsd7作为非酒精性脂肪性肝病的治疗靶标在筛选治疗非酒精性脂肪性肝病的药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的筛选治疗非酒精性脂肪性肝病的药物为从降低或抑制17β-hsd7基因和/或其编码的蛋白表达的物质、抑制17β-hsd7酶活性的物质中筛选。3.17β-hsd7作为巨噬细胞极化调控因子在筛选改善巨噬细胞极化失衡及相关疾病的药物中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的筛选改善巨噬细胞极化失衡及相关疾病的药物为从降低或抑制17β-hsd7基因和/或其编码的蛋白表达的物质、抑制17β-hsd7酶活性的物质中筛选。5.降低或抑制17β-hsd7基因和/或其编码的蛋白表达的物质在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物或改善巨噬细胞极化失衡及相关疾病的药物中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的降低或抑制17β-hsd7基因和/或其编码的蛋白表达的物质包括抑制或沉默17β-hsd7基因的rna，或能表达或形成所述rna的载体。7.抑制17β-hsd7酶活性的物质在制备治疗非酒精性脂肪性肝病的药物或改善巨噬细胞极化失衡及相关疾病的药物中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的抑制17β-hsd7酶活性的物质包括芬维a胺、单宁酸、盐酸肼屈嗪、比拉斯汀、左旋乳酸、氯法拉滨、地拉罗司。

技术总结
本发明公开了17β-HSD7作为非酒精性脂肪性肝病的治疗靶标及其应用，属于生物医药领域。本发明发现17β-HSD7是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的致病基因靶标，敲除17β-HSD7能够改善巨噬细胞极化失衡，以及NAFLD小鼠的胰岛素抵抗、肝脂肪变性和炎症等症状。降低或抑制17β-HSD7基因和/或其编码的蛋白表达的物质或抑制17β-HSD7酶活性的物质可用于制备治疗NAFLD的药物、改善巨噬细胞极化失衡及相关疾病的药物。本发明为NAFLD以及巨噬细胞极化失衡相关疾病的临床治疗提供潜在靶标和药物研发方向。发方向。发方向。


技术研发人员：平洁 董晓玉 冯毅婷 徐冬琴 文笑 张孟娅 胡秦僮 张钦勇
受保护的技术使用者：武汉大学
技术研发日：2022.07.01
技术公布日：2022/11/1