1.本发明属生物检测领域，具体涉及铁基多孔碳免疫层析试纸条及其应用。
背景技术：2.试纸条免疫检测技术作为一种很有前景的便携式的即时快速检测平台，由于其成本低、操作简单和即时分析等优势获得了广泛的关注。目前，传统的试纸条检测技术主要存在三个难题：(1)灵敏度不足，成本高；(2)多重检测与分区段检测能力差，不能定量；(3)缺乏便携式用户友好的数据分析工具。最近，人工纳米酶在生物传感、治疗以及环境污染物降解领域广受关注。因原料资源丰富、优异的催化性能以及良好的生物相容性，铁基纳米酶在生物传感分析方法中作为信标探针的主要材料，但在即时检测分析技术中鲜有报道。
技术实现要素：3.本发明所要解决的技术问题是提供铁基多孔碳免疫层析试纸条及其应用。该试纸条具有灵敏度高、成本低廉、可定量、可调控的特点。
4.本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案为：
5.铁基多孔碳免疫层析试纸条，它包括层析试纸条、opd显色试剂和铁基多孔碳标记的识别待检测物的单克隆抗体反应试剂，其中：所述的层析试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有羊抗鼠多克隆抗体；所述检测线上包被有待检测物-牛血清白蛋白偶联物，所述的opd(邻苯二胺)显色试剂为含有opd和双氧水的ph为3-5的缓冲溶液。
6.按上述方案，所述opd显色试剂中双氧水浓度为0.3-0.4mm；opd浓度为0.3-0.4mm。
7.按上述方案，所述的铁基多孔碳免疫层析试纸条吸水垫长40～45mm，宽3～5mm，由吸水纸剪裁得到；检测垫选cn95,长22～28mm，宽3～5mm；样品垫选fusion 5，长12～16mm，宽3～5mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述检测垫上的检测线与样品垫上沿的间距为6～10mm，质控线和检测线的间距为8～10mm。
8.按上述方案，所述每厘米宽度试纸条检测垫的检测线上所需的待检测物-牛血清白蛋白偶联物的包被量为300～400ng；每厘米宽度试纸条质控线上所需的羊抗鼠多克隆抗体的包被量为120～160ng。
9.按上述方案，所述的待测物为伏马毒素，所述的抗伏马毒素单克隆抗体的ic50小于等于0.32ng/ml。具体可选择保藏编号为cctcc no.c201636的杂交瘤细胞株fm7a11分泌产生的抗伏马毒素单克隆抗体。
10.按上述方案，所述铁基多孔碳粒径30-100nm，具有多孔结构，碳颗粒表面有铁和铁氧化物的纳米簇，纳米尺寸10nm以下。
11.按上述方案，所述的铁基多孔碳是以硝酸锌和2-甲基咪唑作为有机金属框架zif-8的前驱物，血红素作为铁的前驱物，经过原位高温碳化制得，高温碳化温度为800-900℃，
碳化时间1-2h。
12.按上述方案，血红素按质量百分比计，为硝酸锌的1％—2％。
13.提供上述铁基多孔碳免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
14.层析试纸条的制备：
15.(1)检测垫的制备
16.检测线的包被：
17.将待检测物-牛血清白蛋白的偶联物配制成包被液；于距样品垫上沿6～10mm的位置，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线，然后于37℃条件下干燥60～120分钟；
18.质控线的包被：
19.将羊抗鼠多克隆抗体配制成包被液；于距检测线8～10mm的位置，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，然后于37℃条件下干燥60～120分钟；
20.(2)试纸条的组装
21.在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得层析试纸条；
22.提供opd显色试剂，配制方法为：在opd试剂中加入双氧水溶液，加ph为3-5的缓冲溶液得到opd显色试剂。
23.提供铁基多孔碳标记的识别待检测物的单克隆抗体，获得方法：由铁基多孔碳溶液和识别待检测物的单克隆抗体溶液混合，室温搅拌离心得到的。
24.提供上述铁基多孔碳免疫层析试纸条的应用方法：提供待测样品液，加入检测缓冲液，混匀，再取铁基多孔碳标记的识别待检测物的单克隆抗体反应试剂，加入其中混匀，插入免疫层析试纸条，反应，待质控线的黑色条带出现后，在检测线处再加入opd显色试剂，一段时间后，测定获得检测线的rgb值，基于rgb值-待测物浓度标准曲线，进行待测物含量的定量分析。
25.按上述方案，所述的待测样品为农产品如玉米或小麦，所述的待测物为伏马毒素；所述的样品前处理方法为：待测样品加甲醇水溶液摇荡提取，离心获得上清液过滤得样品提取液。
26.按上述方案，待测样品液和检测缓冲液的体积比为1：2-3；所述的检测缓冲液为含有2％(v/v)tween-20，0.1％(w/v)蔗糖与0.5％(w/v)bsa的pbs缓冲溶液；所述铁基多孔碳标记的识别待检测物的单克隆抗体反应试剂的体积是待测样品溶液的15-25％。
27.按上述方案，所述rgb颜色值的定量方程为：强度＝0.3r+0.59g+0.11b,其中，r,g,b分别为检测线红色、黄色和蓝色的颜色强度值，可通过测色仪或相机拍照测得。
28.按上述方案，所述的标准曲线的获得方法为：
29.配制一系列梯度浓度的标准溶液；
30.以如上系列梯度浓度的标准溶液分别作待测液进行检测，待质控线的黑色条带出现后，加入opd显色试剂二次检测，获得各浓度标准溶液对应的检测线rgd值，基于rgd值和标准溶液的浓度，获得rgb值-待测物浓度标准曲线。
31.按上述方案，所述的待测物为伏马毒素b1，标准曲线制作中待测物伏马毒素b1的浓度为0.02-150ng.ml-1
。
32.本发明采用铁基多孔碳材料作为标记材料，铁基多孔碳粒径30-100nm，具有多孔结构，碳颗粒表面有铁和铁氧化物的纳米簇，纳米尺寸10nm以下，具有人工过氧化物酶活性，并易于结合抗体，可结合抗伏马毒素b1单克隆抗体，比纳米金材料显色度明显、价格低廉；基于h
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介质催化opd显色试剂显色，能够放大检测范围和提高灵敏度，实际应用价值大。
33.本发明的有益效果在于：
34.(1)本发明提供的试纸条检测灵敏度高。有两个检测区段，可以根据实际需求滴加opd二次检测，调控检测区段，操作简单、方便；滴加opd二次检测时，检测线由黑色或者无色变成黄色，测试获得rgb值，基于rgb值进行进一步的定量分析，灵敏度高。
35.(2)检测快速。全过程10min即可，用时短。
36.(3)检测成本低廉。本发明提供的铁基多孔碳免疫层析试纸条，采用具有人工过氧化物酶活性，且易于抗体结合的铁基多孔碳材料作为标记材料，比纳米金材料显色度明显、价格低廉，可以放大检测范围和提高灵敏度，实际应用价值大。
附图说明
37.图1为铁基多孔碳的sem图；
38.图2为铁基多孔碳的tem图(不同放大倍数)；
39.图3为铁基多孔碳的bet图。
具体实施方式
40.实施例1：铁基多孔碳标记的抗伏马毒素b1单克隆抗体反应试剂的制备方法
41.抗伏马毒素b1单克隆抗体选由保藏编号为cctcc no.c201636的杂交瘤细胞株fm7a11分泌产生的单克隆抗体，具体根据专利申请号为cn201710131166.0的专利中报道的方法制得。
42.铁基多孔碳的制备方法：
43.称取1.07g zn(no3)2·
6h2o溶解在40ml甲醇溶液，快速混匀，迅速加入另一个40ml甲醇分别含有2.35g 2-甲基咪唑与10mg的血红素，室温剧烈搅拌24h，离心收集灰色产物，用甲醇冲洗5次，然后在70℃下真空干燥过夜。将得到的灰色产物粉末转移入瓷舟，在n2条件下以5℃/min的加热速率从室温加热至900℃，持续2h，碾磨后制得颗粒尺寸在30-100nm之间、尺寸均一的铁基多孔碳。
44.铁基多孔碳的sem和tem如图1和2所示，图1，图2表明：颗粒尺寸在30-100nm之间，在颗粒上附着了铁和铁氧化物的纳米簇，纳米尺寸10nm以下；bet图如图3所示，bet测试结果表明，材料比表面积为890.0437m2/g，孔容为0.857657cm3/g，平均孔径3.85445nm，表明本发明为铁基多孔碳材料。
45.铁基多孔碳标记的抗伏马毒素b1单克隆抗体反应试剂的制备方法：
46.取10mg铁基多孔碳材料加入1ml10 mm pbs缓冲溶液混匀，取100μl上述溶液加入800μl10 mm pbs缓冲溶液(ph＝7.4)，混匀，然后逐滴加入100μl 0.25mg/ml抗fb1的单克隆抗体pbs缓冲溶液。在室温下将混合溶液轻轻搅拌4小时，4℃10000rpm 20min离心，将所得到的沉淀物用含1％(m/v)bsa的1ml 10mm pbs缓冲溶液进行复溶，得到铁基多孔碳标记的
抗伏马毒素b1单克隆抗体反应试剂，放置4℃备用。
47.实施例2：伏马毒素b1铁基多孔碳免疫层析试纸条的制备
48.(1)吸水垫的制备
49.将吸水纸剪裁成长45mm宽3mm的规格，即得吸水垫；
50.(2)检测垫的制备
51.将规格长25mm，宽3mm的cn95硝酸纤维素膜粘贴到纸板相应位置再分别喷涂检测线和质控线。
52.检测线的包被：
53.准确称取2.9g na2hpo4·
12h2o，0.2g kcl，0.2g kh2po4与8.0g nacl，加入超纯水用1l容量瓶定容，混匀，制备出pbs缓冲溶液。
54.准确称取伏马毒素b1-牛血清白蛋白的偶联物(fb1-bsa)1mg，用2ml10 mm pbs缓冲溶液配制成浓度为0.5mg/ml的包被液，划膜速度为0.6μl/cm于距样品垫上沿6mm的位置，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线，然后于37℃条件下干燥120分钟，所述每厘米宽度试纸条检测垫的检测线上所需的伏马毒素b1-牛血清白蛋白偶联物(fb1-bsa)的包被量为300ng；
55.质控线的包被：
56.准确称取羊抗鼠多克隆抗体1mg，用5ml 10mm pbs缓冲溶液配制成浓度为0.2mg/ml的包被液；划膜速度为0.6μl/cm于距检测线8mm的位置，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，每厘米宽度试纸条质控线上所需的羊抗鼠多克隆抗体的包被量为120ng，然后于37℃条件下干燥120分钟；
57.(3)试纸条的组装
58.在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为2mm，即得层析试纸条；
59.opd显色试剂的制备方法：100μl 10mm opd试剂加入100μl 10mm双氧水溶液，用ph＝4.0的200mm醋酸钠-醋酸缓冲溶液定容到3ml；所述10mm opd试剂配制通过称量opd10.8mg，溶解到10ml dmf中；所述醋酸钠-醋酸缓冲溶液(200mm，ph＝4.0)为每50ml水中含有32.8mg乙酸钠和120μl纯乙酸。
60.实施例3：伏马毒素b1铁基多孔碳免疫层析试纸条的应用
61.1.伏马毒素b1铁基多孔碳免疫层析试纸条检测线rgb值，通过强度＝0.3r+0.59g+0.11b(其中，r,g,b分别为检测线红色、黄色和蓝色的颜色强度值)与伏马毒素b1浓度的关系曲线的建立：
62.(1)对经高效液相色谱法(hplc)检测为伏马毒素为阴性的小麦进行样品前处理。称取小麦样品5g，加入体积浓度为70％的甲醇水溶液15ml，混匀，涡旋提取20分钟，在4000rmp离心10min，取上层清液，0.22μm滤膜过滤得到；
63.(2)对上述谷物样品稀释液进行标准品物质加标，浓度分别为0.02ng/ml、0.1ng/ml、0.5ng/ml、2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml；
64.(3)称量2ml tween-20,0.1g蔗糖和0.5g bsa用pbs缓冲溶液定容到100ml，配成检测缓冲液。
65.(4)称量opd 10.8mg，溶解到10ml dmf中配成10mm opd试剂。称量32.8mg乙酸钠和
120μl纯乙酸，用50ml水定容，配成醋酸钠-醋酸缓冲溶液。取100μl 10mm opd试剂加入100μl市售30％双氧水溶液，用ph＝4.0的200mm醋酸钠-醋酸缓冲溶液定容到3ml，配成opd显色试剂。
66.(5)取标准品溶液50μl加入120μl检测缓冲液，混匀，再取铁基多孔碳标记的抗伏马毒素b1单克隆抗体反应试剂10μl加入其中，混匀，插入免疫层析试纸条，待反应9min后，待质控线的黑色条带出现后，在检测线处再加入1μl opd显色试剂，检测线由黑色或者无色变成黄色，约1min后，用手机拍照检测线后，获得检测线条带的rgb值。
67.(6)分别以伏马毒素标准品浓度为横坐标，各浓度标准品溶液相应的检测线的强度(强度＝0.3r+0.59g+0.11b，其中，r,g,b分别为检测线红色、黄色和蓝色的颜色强度值)为纵坐标，拟合得到关系曲线。该方法的有效检测范围为伏马毒素0.02-150ng/ml。
68.2.小麦样品中伏马毒素含量的加标回收实验：
69.取经高效液相色谱法(hplc)检测为伏马毒素为阴性的小麦样品5g，添加70％甲醇水溶液15ml，混匀，涡旋提取20分钟，在4000rmp离心10min，取上层清液，0.22μm滤膜过滤得到。向其中分别准确添加伏马毒素标准品0.1ng/ml、0.5ng/ml和0.8ng/ml，取上述待测样品检测液50μl加入120μl检测缓冲液，混匀，再取铁基多孔碳标记的抗伏马毒素b1单克隆抗体反应试剂10μl加入其中，混匀，插入免疫层析试纸条，待反应9min后，待质控线的黑色条带出现后，在检测线处再加入1μl opd显色试剂，检测线由黑色或者无色变成黄色，约1min后，用手机拍照检测线后，获得检测线条带的rgb值。通过公式强度＝0.3r+0.59g+0.11b，其中，r,g,b分别为检测线红色、黄色和蓝色的颜色强度值，计算强度值，将其代入上述得到的伏马毒素b1铁基多孔碳免疫层析试纸条检测线强度与标准品物质浓度的关系曲线，获得伏马毒素含量，经分析测得样品中的伏马毒素加标回收率依次为：99.5％，89.2％，106.1％。
技术特征：1.铁基多孔碳免疫层析试纸条，其特征在于：它包括层析试纸条、opd显色试剂和铁基多孔碳标记的抗识别待检测物的单克隆抗体反应试剂，其中：所述的层析试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有羊抗鼠多克隆抗体；所述检测线上包被有待检测物-牛血清白蛋白偶联物，所述的opd显色试剂为含有opd和双氧水的ph为3-5的缓冲溶液。2.根据权利要求1所述的铁基多孔碳免疫层析试纸条，其特征在于：所述opd显色试剂中双氧水浓度为0.3-0.4mm；opd浓度为0.3-0.4mm。3.根据权利要求1所述的铁基多孔碳免疫层析试纸条，其特征在于：所述的铁基多孔碳免疫层析试纸条吸水垫长40～45mm，宽3～5mm，由吸水纸剪裁得到；检测垫长22～28mm，宽3～5mm；样品垫长12～16mm，宽3～5mm，相邻各垫的交叠长度为1～3mm；所述检测垫上的检测线与样品垫上沿的间距为6～10mm，质控线和检测线的间距为8～10mm。4.根据权利要求1所述的铁基多孔碳免疫层析试纸条，其特征在于：所述每厘米宽度试纸条检测垫的检测线上所需的待检测物-牛血清白蛋白偶联物的包被量为300～400ng；每厘米宽度试纸条质控线上所需的羊抗鼠多克隆抗体的包被量为120～160ng。5.根据权利要求1所述的铁基多孔碳免疫层析试纸条，其特征在于：所述的待测物为伏马毒素，所述的抗伏马毒素单克隆抗体的ic50小于等于0.32ng/ml。6.根据权利要求1所述的铁基多孔碳免疫层析试纸条，其特征在于：所述铁基多孔碳具有多孔结构，粒径30-100nm，碳颗粒表面有铁和铁氧化物的纳米簇，纳米尺寸10nm以下。7.根据权利要求6所述的铁基多孔碳免疫层析试纸条，其特征在于：所述的铁基多孔碳是以硝酸锌和2-甲基咪唑作为有机金属框架zif-8的前驱物，血红素作为铁的前驱物，经过原位高温碳化制得，高温碳化温度为800-900℃，碳化时间1-2h，血红素按质量百分比计，为硝酸锌的1％-2％。8.权利要求1所述的铁基多孔碳免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：层析试纸条的制备：(1)检测垫的制备检测线的包被：将待检测物-牛血清白蛋白的偶联物配制成包被液；于距样品垫上沿6～10mm的位置，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上得到检测线，然后于37℃条件下干燥60～120分钟；质控线的包被：将羊抗鼠多克隆抗体配制成包被液；于距检测线8～10mm的位置，用划膜方式将其横向包被于硝酸纤维素膜上，得到质控线，然后于37℃条件下干燥60～120分钟；(2)试纸条的组装在纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，交叠长度为1～3mm，即得层析试纸条；提供opd显色试剂；提供铁基多孔碳标记的抗识别待检测物的单克隆抗体反应试剂。
9.权利要求1所述的铁基多孔碳免疫层析试纸条的应用，其特征在于：应用方法：提供待测样品液，加入检测缓冲液，混匀，再取铁基多孔碳标记的识别待检测物的单克隆抗体的反应试剂，加入其中混匀，插入免疫层析试纸条，反应，待质控线的黑色条带出现后，在检测线处再加入opd显色试剂，一段时间后，测定获得检测线的rgb值，基于rgb值-待测物浓度标准曲线，进行待测物含量的定量分析。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的待测样品为农产品，所述的待测物为伏马毒素；所述的样品前处理方法为：待测样品加甲醇水溶液摇荡提取，离心获得上清液过滤得样品提取液；所述的检测缓冲液为含有2％(v/v)tween-20，0.1％(w/v)蔗糖与0.5％(w/v)bsa的pbs缓冲溶液；所述rgb颜色值的定量方程为：强度＝0.3r+0.59g+0.11b,其中，r,g,b分别为检测线红色、黄色和蓝色的颜色强度值，可通过测色仪或相机拍照测得；所述rgb值-待测物浓度标准曲线的获得方法为：配制一系列梯度浓度的标准溶液；以如上系列梯度浓度的标准溶液分别作待测液进行检测，待质控线的黑色条带出现后，加入opd二次检测，获得各浓度标准溶液对应的检测线的rgd值，基于rgd值和标准溶液的浓度，获得rgb值-待测物浓度标准曲线。
技术总结本发明涉及铁基多孔碳免疫层析试纸条及其应用。铁基多孔碳免疫层析试纸条，包括层析试纸条、OPD显色试剂和铁基多孔碳标记的抗识别待检测物的单克隆抗体反应试剂，其中：所述的层析试纸条包括纸板，纸板的一面从上到下依次粘贴吸水垫、检测垫和样品垫，相邻各垫在连接处交叠连接，所述检测垫以硝酸纤维素膜为基垫，硝酸纤维素膜上自上而下设置横向质控线和检测线，所述质控线包被有羊抗鼠多克隆抗体；所述检测线上包被待检测物-牛血清白蛋白偶联物。其采用铁基多孔碳作标记材料，比纳米金材料显色度明显、价格低廉，且可以催化显色，放大检测范围和提高灵敏度。操作方便，简单，快速。快速。
技术研发人员：喻理 李培武 王督 张兆威
受保护的技术使用者：中国农业科学院油料作物研究所
技术研发日：2022.07.18
技术公布日：2022/11/1
