1.本发明涉及医药化工技术领域，特别是一种检测磷酸奥司他韦关键中间体特定杂质的高效液相色谱方法。
背景技术：2.磷酸奥司他韦(oseltamivir phosphate)为吉里德科学公司(gilead sciences)和瑞士罗氏制药联合开发的一种神经氨酸酶特异性抑制剂，通过作用于流感病毒神经氨酸酶，抑制成熟的流感病毒脱离宿主细胞，从而抑制流感病毒在体内的传播，以起到预防和治疗流行性感冒的作用。(3r,4r,5s)-4,5-环氧基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-甲酸乙酯是合成奥司他韦的关键原料和中间体，结构式如下：
[0003][0004]
奥司他韦的多个手性中心和杂质均由(3r,4r,5s)-4,5-环氧基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-甲酸乙酯引入，控制(3r,4r,5s)-4,5-环氧基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-甲酸乙酯的杂质和异构体对控制磷酸奥司他韦的质量有重要意义。
技术实现要素：[0005]
发明目的：本发明的目的在于提供一种简单准确，能有效控制(3r,4r,5s)-4,5-环氧基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯相关杂质的方法：
[0006]
技术方案：本发明的检测方法包括以下步骤：
[0007]
(1)制备供试品溶液：取(3r,4r,5s)-4,5-环氧基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-甲酸乙酯适量，加溶剂[乙腈-水(20:80)]溶解并稀释，得到浓度为0.8～1.2mg/ml的供试品溶液。
[0008]
(2)制备自身对照溶液：取供试品溶液，用溶剂稀释，得到浓度为0.8～1.2μg/ml的自身对照溶液。
[0009]
(3)色谱柱固定相为十八烷基键合硅胶；采用紫外检测器；流动相a为磷酸水溶液，流动相b为乙腈；洗脱方式为梯度洗脱。
[0010]
(4)采用高效液相色谱法检测，梯度洗脱。
[0011]
(5)按主成分自身对照法计算各单个杂质和总杂质的含量。
[0012]
优选的，步骤(3)中，磷酸溶液浓度为0.05％～0.15％。
[0013]
优选的，步骤(3)中，色谱柱的规格：内径为3.0～5.0mm，长度为100～250mm，填料粒径为3～5μm。进一步的，色谱柱的规格：内径为4.6mm，长度为250mm，填料粒径为5μm。
[0014]
进一步的，色谱柱为shimadzu gl sciences c18 superb。
[0015]
优选的，色谱柱柱温为20～50℃，进一步的，色谱柱柱温为35℃。
[0016]
优选的，步骤(3)中，磷酸溶液浓度为0.05％～0.15％，进一步优选为0.1％。
[0017]
优选的，步骤(4)中，进样量为5～100μl，进一步优选为10μl。进一步的，流速为0.9～1.1ml/min，优选为1.0ml/min。
[0018]
优选的，紫外检测器的波长为202nm、207nm或212nm，优选为207nm。
[0019]
进一步的，梯度洗脱流动相的浓度配比如表1所示：
[0020]
表1梯度洗脱流动相的浓度配比：
[0021][0022]
有益效果：目前暂无(3r,4r,5s)-4,5-环氧基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-甲酸乙酯相关杂质检测方法的报道，本发明提供了一种准确、简便的检测方法，具有显著优点：能够分离样品中12个潜在杂质，操作简便，结果准确、稳定，灵敏度高，能更准确的控制奥司他韦中间体的杂质水平，从而提高药品质量的可控性。
附图说明
[0023]
图1为本发明空白溶剂的hplc色谱图；
[0024]
图2为本发明样品与各杂质混合溶液的hplc色谱图；
[0025]
图3为本发明供试品溶液的hplc色谱图；
[0026]
图4为本发明自身对照溶液的hplc色谱图。
具体实施方式
[0027]
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
[0028]
1、仪器与试剂。
[0029]
安捷伦1260infinity ii型高效液相色谱仪、赛托利斯bsa224s-cw型电子天平。
[0030]
磷酸(色谱级)、乙腈(色谱级)、纯化水。
[0031]
实施例1：专属性试验。
[0032]
溶剂：乙腈-水(20：80)。
[0033]
杂质贮备液：称取杂质004s1s1对照品、杂质004s1m1对照品、杂质004s1m2对照品、杂质004s1m3对照品、杂质004s1m4对照品、杂质004s1m4-z1对照品、杂质004s1m4-z2对照品、杂质004s1-z1对照品、杂质004s1-z2对照品、杂质004s1-z6对照品、杂质004s1-z8对照品、杂质004s1-z9对照品各约5mg，分别置不同50ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀(浓度均为0.1mg/ml)。
[0034]
杂质定位溶液：移取上述杂质贮备液各1ml，分别置不同10ml量瓶中，加溶剂溶解
并稀释至刻度，摇匀(浓度均为0.01mg/ml)。
[0035]
供试品溶液：称取(3r,4r,5s)-4,5-环氧基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-甲酸乙酯供试品约20mg，精密称定，置20ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀(浓度为1mg/ml)。
[0036]
自身对照溶液：精密量取1ml供试品溶液，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀(浓度为1μg/ml)。
[0037]
混合溶液：称取(3r,4r,5s)-4,5-环氧基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-甲酸乙酯供试品约20mg，精密称定，置20ml量瓶中，分别加入各杂质准备液0.2ml，加溶剂溶解并稀释至刻度(供试品浓度1mg/ml，各杂质浓度1μg/ml)。
[0038]
表2专属性试验
[0039][0040][0041]
按上述色谱条件分别精密量取空白溶液、供试品溶液、自身对照溶液、混合溶液和各杂质定位溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0042]
试验结果见表3和图1～4。
[0043]
表3、专属性试验结果
[0044]
杂质名称定位溶液rt(min)混合溶液rt(min)rrt分离度004s1s13.4863.4980.09/004s1m114.07914.1470.3869.9004s1-z118.74118.8170.5026.3004s1m4-z221.00621.0580.5613.2004s1-z828.14728.2260.7539.8004s1-z930.99231.0680.835.1
004s1m231.76931.8150.853.6004s1-z234.53334.6010.9213.3004s1m4-z135.19235.2000.942.9004s1m436.08236.0850.964.4主峰37.51437.5151.006.9004s1m338.13738.1701.023.1004s1-z638.63338.7011.032.5
[0045]
由表3和图1～4可知，空白溶剂对供试品杂质检测无干扰；杂质与主成分之间的分离度均大于1.5，说明本发明的检测方法专属性符合要求。
[0046]
实施例2：灵敏度试验
[0047]
杂质定量限溶液：精密量取“专属性”项下004s1s1、004s1m1、004s1m2、004s1m4-z2、004s1-z1、004s1-z2、004s1-z8、004s1-z9定位溶液各1ml和004s1m3、004s1m4、004s1m4-z1定位溶液各2ml和004s1-z6定位溶液3ml，置同一100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀。杂质检测限溶液：精密量取上述定量限溶液5ml，加入10ml溶剂中，摇匀。
[0048]
分别精密量取上述溶液各10μl，注入液相色谱仪，定量限溶液连续进样6针，检测限溶液进样一针，记录色谱图，结果见表4和表5。
[0049]
表4定量限结果
[0050][0051]
表5检测限结果
[0052]
名称峰面积信噪比s/n004s1s11.487004s1m11.184
004s1-z11.325004s1m4-z20.923004s1-z81.133004s1-z91.183004s1m21.043004s1-z21.083004s1m4-z11.204004s1m41.324004s11.223004s1m31.635004s1-z61.754
[0053]
实施例3：线性实验线性溶液：分别量取“专属性”项下不同体积的主成分及各杂质对照品贮备溶液制得loq、50％(各组分约0.5μg/ml)、100％(各组分约1.0μg/ml)、150％(各组分约1.5μg/ml)、200％(各组分约2.0μg/ml)限度浓度水平的线性溶液。
[0054]
精密量取上述线性溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，试验结果见6。
[0055]
表6线性结果
[0056]
组分线性方程相关系数r004s1y＝21.9068x+0.21021.0000004s1s1y＝28.5271x+0.05491.0000004s1m1y＝24.3225x-0.01711.0000004s1m2y＝19.3480x-0.04131.0000004s1m3y＝16.2965x+0.11490.9999004s1m4y＝15.1751x-0.19600.9999004s1m4-z1y＝13.2609x-0.00211.0000004s1m4-z2y＝19.2929x-0.04251.0000004s1-z1y＝30.6280x-0.34320.9999004s1-z2y＝22.4565x+0.02131.0000004s1-z6y＝11.5202x+0.09850.9999004s1-z8y＝24.1715x-0.07441.0000004s1-z9y＝24.2269x+0.23960.9999
[0057]
由表6可知，各杂质在loq～限度浓度的150％范围内线性良好，表明分析方法线性良好。
[0058]
实施例4：重复性试验
[0059]
加标供试品溶液：取供试品约20mg，置20ml量瓶中，精密加入各杂质贮备液各0.2ml，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0060]
自身对照溶液(1μg/ml)：精密量取1ml加标供试品溶液，置100ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀；精密量取上述溶液1ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀。
[0061]
平行配制6份加标供试品溶液和自身对照溶液，注入色谱仪，记录色谱图，计算各杂质及总杂质的含量，结果见表7。
[0062]
表7重复性检测结果
[0063]
加标供试品123456004s1s1(％)0.100.100.110.100.100.11004s1m1(％)0.110.120.120.120.120.12004s1-z1(％)0.100.100.100.100.100.01004s1m4-z2(％)0.100.100.100.100.100.10004s1-z8(％)0.110.110.120.110.110.12rrt0.800(％)0.060.060.060.060.060.06004s1-z9(％)0.110.110.120.110.110.12004s1m2(％)0.100.110.110.110.110.11004s1-z2(％)0.100.100.100.100.100.10004s1m4-z1(％)0.100.100.100.100.100.10004s1m4(％)0.100.100.100.100.100.10004s1m3(％)0.100.100.100.100.100.10004s1-z6(％)0.090.090.100.090.090.10
[0064]
由表7可知，平行配制的6份溶液，各杂质含量波动均在
±
0.01％以内，说明本方法的重复性良好。
技术特征：1.一种检测磷酸奥司他韦关键中间体特定杂质的高效液相色谱方法，其特征在于：该方法包括如下步骤；(1)制备供试品溶液；取(3r,4r,5s)-4,5-环氧基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-甲酸乙酯适量，加20％乙腈溶解并稀释，得到浓度为0.8～1.2mg/ml的供试品溶液；(2)制备自身对照溶液：取供试品溶液，用20％乙腈稀释，得到浓度为0.8～1.2μg/ml的自身对照溶液；(3)色谱柱固定相为十八烷基键合硅胶，流动相a为磷酸水溶液，流动相b为乙腈，检测器为紫外检测器；(4)取供试品溶液和自身对照溶液，进样，梯度洗脱，按主成分自身对照法计算杂质含量；所述特定杂质结构如下所示：2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)所述流动相a中磷酸溶液浓度为0.05％～0.15％。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)所述色谱柱柱温为30～40℃。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)所述紫外检测器波长为202nm、207nm或212nm中的一种。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(5)所述进样，其进样量为5～50μl。6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，步骤(5)所述梯度洗脱流动相的浓度配比为：
技术总结本发明涉及一种检测磷酸奥司他韦关键中间体特定杂质的高效液相色谱方法，磷酸奥司他韦是一种治疗流感的特效药物，而(3R,4R,5S)-4,5-环氧基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-甲酸乙酯是合成磷酸奥司他韦过程中的的关键中间体。本发明涉及一种检测磷酸奥司他韦关键中间体特定杂质的高效液相色谱方法。该方法采用十八烷基键合硅胶柱，该方法能同时分离和检测(3R,4R,5S)-4,5-环氧基-3-(1-乙基丙氧基)-1-环己烯-1-甲酸乙酯相关的工艺杂质和异构体，具有准确度高、重现性好、操作简便等优点，对提高药物质量控制具有非常重要的意义。高药物质量控制具有非常重要的意义。高药物质量控制具有非常重要的意义。
技术研发人员：祁芳芳 王鲜
受保护的技术使用者：苏州博研医药科技有限公司
技术研发日：2022.07.01
技术公布日：2022/11/1
