1.本发明涉及嵌合抗原受体t(car-t)细胞的产品制备，尤其涉及一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞及其制备方法、应用。
背景技术：2.嵌合抗原受体t细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor t-cell therapy，car-t)是一种新型的免疫靶向治疗技术，通过基因工程修饰t淋巴细胞并嵌入car基因，使其在体内特异性地识别并攻击恶性肿瘤，被认为是最具临床应用前景的细胞免疫疗法。尽管疗效显著，但仍有10％-50％病人在治疗后疾病复发。这是由于患者体内car-t细胞的扩增效率、杀伤能力以及存活时间存在个体差异造成的。因此，提高car-t细胞持久性及杀伤功能成为了亟需解决的技术问题。
3.铁死亡最早被定义于2012年，是铁离子依赖性的调节性死亡，其本质是细胞膜磷脂发生脂质过氧化，造成膜破裂而导致的细胞死亡。形态上，铁死亡的细胞表现出典型的坏死性形态，并伴随同质异形的小线粒体：嵴减少、膜凝聚、外膜破裂。铁死亡的主要诱因这是细胞内游离二价铁的过渡积累。细胞内游离的二价铁离子氧化性极强,容易与h2o2发生芬顿反应(fenton reaction),产生能对dna、蛋白质和膜磷脂造成氧化损伤的羟基自由基,从而促进磷脂的组分—多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，引起膜破裂导致细胞死亡。
4.因此，亟需提供一种免疫细胞的制备方法，通过铁死亡抑制剂增加免疫细胞持续性及杀伤功能。
技术实现要素：5.本发明针对现有技术不足，提出了一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞及其制备方法、应用。
6.为实现上述技术目的，本发明的技术方案为：本发明实施例的第一方面提供了一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞的制备方法，具体为：分离培养免疫细胞，并在免疫细胞培养过程中添加浓度为0-4μm铁死亡抑制剂，其中免疫细胞的量为5*10e5/kg-4*10e6/kg。
7.进一步地，所述铁死亡抑制剂为包括ferrostatin-1、uamc-3203、liproxstatin-1在内的对铁死亡有抑制作用的抑制剂。
8.进一步地，铁死亡抑制剂ferrostatin-1的添加浓度为1-4μm，铁死亡抑制剂uamc-3203和铁死亡抑制剂lip-1的添加浓度为0-200nm。
9.进一步地，所述免疫细胞具有杀伤功能的免疫细胞；所述免疫细胞为t细胞、nk细胞、巨噬细胞中的一种或多种按任意比例混合。
10.进一步地，所述t细胞为car-t细胞或tcr-t细胞中的一种或两种按任意比例混合。。
11.进一步地，在免疫细胞培养过程中添加浓度为0-4μm铁死亡抑制剂具体为：在免疫细胞培养0-12天每天都加入铁死亡抑制剂、在免疫细胞培养0-12天过程中按单位时间间断
地加入铁死亡抑制剂或在免疫细胞培养0-12天后加入铁死亡抑制剂。
12.本发明实施例的第二方面提供了一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞，由上述的制备方法制得。
13.本发明实施例的第三方面提供了一种上述的免疫细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
14.进一步地，所述肿瘤为血液肿瘤、神经胶质细胞瘤中的一种。
15.本发明实施例的第四方面提供了一种抗肿瘤药物，包含上述的免疫细胞。
16.本发明的有益效果为：本发明提供了一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞及其制备方法、应用，该方法简单易行，通过在免疫细胞培养过程中添加铁死亡抑制剂能够明显的增加免疫细胞持续性及杀伤功能，很大程度上解决了细胞治疗过程中的复发问题，为延长病人的生存期提供保证。
附图说明
17.图1中的a为car-t培养过程中添加20μm，50μm铁离子后细胞计数增殖曲线；图1中的b为cck8试剂盒在加铁离子后24小时、48小时细胞增殖能力检测；
18.图2中的a、b为加铁离子后t细胞亚群分化比例变化，图2中的c、d为比例变化统计图；
19.图3为car-t培养过程中添加20μm，50μm铁离子后细胞进行流式检测pd1、lag3、tim3耗竭指标的表达变化；
20.图4为car-t培养过程中添加20μm，50μm铁离子后细胞与肿瘤细胞按照1:2，1:4的比例混合，在6小时、12小时的细胞杀伤结果检测图；
21.图5中的a为nsg小鼠在低中高三种铁离子含量不同饲料喂养后的car-t体内治疗效果图；图5中的b为小鼠体内肿瘤细胞荧光值；c图5中的为小鼠生存曲线；
22.图6为图5的小鼠模型体内car-t亚群、耗竭功能指标检测；
23.图7中的a、b、c分别为三种铁死亡抑制剂在car-t细胞制备中的计数曲线；
24.图8中的a为铁死亡抑制剂fer-1对car-t细胞亚群分化的促进作用；图8中的b为统计结果。图8中的c、d、e为耗竭指标表达变化；
25.图9中的a为铁死亡抑制剂lip-1对car-t细胞亚群分化的促进作用；图9中的b为统计结果。图9中的c、d、e为耗竭指标表达变化；
26.图10中的a为铁死亡抑制剂uam对car-t细胞亚群分化的促进作用；图10中的b为统计结果。图10中的c、d、e为耗竭指标表达变化；
27.图11为三种铁死亡抑制剂添加car-t细胞后，铁死亡相关基因表达变化；
28.图12中的a为nsg小鼠在三种新型car-t治疗中的表现；图12中的b为生存曲线；图12中的c为肿瘤体内负荷荧光值。
具体实施方式
29.这里将详细地对示例性实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本发明相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附
权利要求书中所详述的、本发明的一些方面相一致的装置和方法的例子。
30.在本发明使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本发明。在本发明和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。
31.应当理解，尽管在本发明可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。例如，在不脱离本发明范围的情况下，第一信息也可以被称为第二信息，类似地，第二信息也可以被称为第一信息。取决于语境，如在此所使用的词语“如果”可以被解释成为“在
……
时”或“当
……
时”或“响应于确定”。
32.下面结合附图，对本发明的一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞的制备方法及应用进行详细说明。在不冲突的情况下，下述的实施例及实施方式中的特征可以相互组合。
33.本发明对白血病、多发性骨髓瘤病人进行非靶代谢组学测序及单细胞分析发现铁死亡相关代谢产物及信号通路在免疫细胞中高度富集。目前多数研究还集中于肿瘤细胞的铁死亡作用，尚没有铁死亡对免疫细胞功能阻碍的研究。本发明提出了铁死亡抑制免疫细胞治疗功能的关键科学问题。后续临床样本研究中发现血清铁离子浓度升高是诱发免疫细胞发生铁死亡的关键，因此，明确铁离子对免疫细胞的毒性作用及开发新型铁死亡抵抗型细胞免疫产品是本发明的研究目的。
34.本发明实施例筛选了有利于功能性免疫细胞制备的最佳铁死亡抑制剂及使用浓度。car-t细胞作为本发明的一个实际案例，通过添加铁死亡抑制剂的产品工艺优化，实现了对白血病(血液肿瘤)、神经胶质细胞瘤(实体肿瘤)治疗效果上的巨大突破，具备极大的临床应用前景。
35.实施例1：铁离子对car-t制备的影响
36.检测不同浓度铁离子对car-t细胞增殖、亚群分化、耗竭、活化、杀伤的影响。正常人体内的血清铁浓度为10～30亚群分化，本项目设置浓度为0本项、20项目、50项目，探究低铁、标铁、高铁条件对car-t功能的抑制作用：
37.(1)将car-t培养至第七天时添加铁离子，浓度分别为0um、20um、50um，24、48小时后利用cck8试剂盒检测细胞增殖，继续培养7天，每天记录细胞数量，绘制细胞增殖曲线。结果显示：添加铁离子24小时和48小时后，car-t细胞的增殖能力会随着铁离子浓度的升高而降低(图1)。
38.(2)添加铁离子24、48小时后，利用多色流式分析car-t细胞的功能，其中cart-gfp,cd4-apc-cy7,cd8-bv605,cd45ro-bv510,cd62l-pe用于检测car-t细胞的亚群，其中cd62l+和cd45ro+用于表征tcm的比例，cd62l-cd45ro+用于表征tem的比例，结果显示：在car-t细胞培养过程,铁离子浓度越高，tcm的比例也越低，tem的比例越高，说明car-t细胞的分化程度越高，杀伤能力越弱，同时，用铁离子培养car-t细胞后，cd8+car-t细胞的比例逐渐减少，cd4+car-t细胞的比例逐渐增加，进一步说明铁离子对具有杀伤能力的car-t细胞具有抑制作用(图2，结果显示加铁离子后中央记忆t细胞比例显著下调，效应记忆t细胞比例增加。)。lag3-pc7，pd1-apc，tim3-af700用于检测car-t细胞的耗竭，结果显示在培养过程中随着铁离子浓度的增加car-t细胞的耗竭水平也逐渐增加(图3)。
39.(3)car-t杀伤功能检测：利用luciferase标记的nalm6肿瘤细胞进行car-t杀伤功能检测。不同浓度铁离子处理car-t细胞48小时后，设计肿瘤细胞与car-t细胞效靶比为1:1，1:2，1:4，1:8，1:16，1:32，二者混合于96孔板后培养箱孵育6h、12h、24h三个时间点后添加底物，利用酶标仪检测car-t细胞上杀伤肿瘤的效率。结果显示：在car-t杀伤6小时后，随着铁离子浓度的升高，car-t的杀伤能力逐渐减弱(图4)。
40.t细胞和其他的免疫细胞(nk或巨噬细胞)都是血液系统中可以发挥杀伤肿瘤细胞能力的免疫细胞，故t细胞、nk细胞、car-巨噬细胞和tcr-t细胞可以替代car-t细胞发挥抗肿瘤作用。
41.实施例2：铁离子对car-t体内杀伤肿瘤的作用
42.对3-4周龄的nsg小鼠喂养8-10周不同浓度的铁离子，以便于其体内形成稳定的铁离子浓度。模型构建完成后，取小鼠血清、肝脏、脾脏、小肠组织样本进行铁离子鉴定，确认模型构建成功，然后检测铁离子car-t细胞的功能影响：
43.(1)铁离子对car-t细胞体内杀伤肿瘤作用的影响。取低铁、中铁、高铁nsg小鼠各8只，每只小鼠尾静脉注射1百万个nalm6-luciferase肿瘤细胞，肿瘤负荷6天后进行活体成像；随后每只注射1百万个car-t细胞，在注射后第7、14、21、28、35天进行活体成像，观察小鼠体内肿瘤负荷荧光变化，并记录小鼠死亡时间，绘制生存曲线。结果表明在低铁环境下，小鼠的肿瘤负荷相对较低，小鼠的生存期相对较长,而随着铁离子浓度的增加，小鼠的肿瘤负荷相对较高，生存期明显缩短(图5，结果显示高浓度铁离子的小鼠模型明显肿瘤负荷更强，治疗效果不佳)。
44.(2)铁离子抑制car-t功能体内检测：模型在car-t细胞注射8天后，取出外周血、脾脏、骨髓分离单个细胞，检测不同铁离子浓度下小鼠中car-t细胞的数目，结果显示随着铁离子浓度的升高，小鼠体内car-t细胞的比例逐渐降低；通过检测cd45ro和cd62l两个标记物鉴定car-t细胞在不同铁离子浓度下的分化状态，结果表明tcm的比例也随着铁离子浓度的升高而降低；检测小鼠体内cd4、cd8+t细胞的比例发现cd8+t细胞的比例随着铁离子浓度的升高而降低，而cd4+t细胞则呈现相反的趋势，检测tim3、lag3、pd1等耗竭标志物发现car-t细胞的耗竭情况随着铁离子浓度的升高而增加(图6)。铁离子对car-t细胞的影响载体内外的结果一致，说明高浓度的铁离子对car-t细胞的功能有抑制作用。
45.实施例3：铁死亡抑制剂对car-t产品制备的作用
46.(1)收集体外培养至第7天的car-t细胞，分别添加fer-1(0er-1添加第作用。果一致，)、uam(0nm,50nm,100nm,200nm)、lip-1(0nm,50nm,100nm,200nm)处理，每隔3天进行细胞计数，验证上述铁死亡抑制剂对car-t细胞的增殖作用。结果显示上述铁死亡抑制剂fer-1、uam、lip1均对car-t细胞有促增殖作用(图7)。1。有促的fer-1对car-t细胞的促增殖作用最强；uam、lip1对car-t细胞促增殖作用呈剂量依赖效应，即增殖的程度随着uam、lip1浓度的增加而增加。
47.(2)取体外培养至第7天的car-t细胞，计数后按2胞，计数后孔接种至6孔板中，并添加等体积的不同浓度的fer-1(0er-1添加等体积的不同浓度的)处理，实验分组为car-t+fe组、car-t+fer-1 1um+fe组、car-t+fer-1 2um+fe组、car-t+fer-1 4um+fe组。于37摄氏度、5％co2饱和湿度培养箱中培养。各组于加fer-1处理后72h进行流式细胞术检测car-t细胞耗竭、亚群和活化指标。结果显示fer-1可显著提高中央型记忆细胞的比例，且减少car-t
细胞耗竭相关抑制性分子(pd-1、tim-3、lag-3)的表达(图8)。
48.(3)取体外培养至第7天的car-t细胞，计数后按2胞，计数后孔接种至6孔板中，并添加等体积的不同浓度的lip-1(0nm,50nm,100nm,200nm)，实验分组：car-t+fe组、car-t+lip-1 50nm+fe组、car-t+lip-1 100nm+fe组、car-t+lip-1 200nm+fe组，37摄氏度、5％co2饱和湿度培养箱中培养。各组于加lip-1处理后72h进行流式细胞术检测car-t细胞耗竭、亚群和活化指标。结果显示lip-1可显著提高中央型记忆细胞的比例，且减少car-t细胞耗竭相关抑制性分子(pd-1、tim-3)的表达(图9)。
49.(4)取体外培养至第7天的car-t细胞，计数后按2胞，计数后孔接种至6孔板中，并添加等体积的不同浓度的uam(0nm,50nm,100nm,200nm)，实验分组为car-t+fe组、car-t+uam 50nm+fe组、car-t+uam 100nm+fe组、car-t+uam 200nm+fe组。于37摄氏度、5％co2饱和湿度培养箱中培养。各组于加uam处理后72h进行流式细胞术检测car-t细胞耗竭、亚群和活化指标。结果显示uam可显著提高中央型记忆细胞的比例，且减少car-t细胞耗竭相关抑制性分子(pd-1、tim-3)的表达(图10)。
50.(5)取体外培养至第7天的car-t细胞和t细胞，计数后按2胞，计数后孔接种至6孔板中，分别添加不同浓度fer-1(0er-1别添加不同浓度的比例)、lip-1(0nm,50nm,100nm,200nm)、uam(0nm,50nm,100nm,200nm)处理并加dmso作为对照，于37对、5％co2饱和湿度培养箱中培养。于处理后48h计数取各组car-t细胞1胞r-t养孔于六孔板中培养，并添加50um的铁离子处理。于铁离子处理后48h收集各组car-t细胞，利用trizol法提取各组car-t细胞总mrna,逆转录成cdna，通过实时荧光定量检测铁死亡相关基因转录水平。结果显示fer-1、lip-1和uam可显著降低铁死亡标记基因水平，并显著恢复还原性系统gpx4基因表达(图11)。
51.实施例4铁死亡抑制剂处理的car-t在小鼠体内治疗效果
52.(1)收集培养第7天car-t细胞，分别添加不同浓度的铁死亡抑制剂fer-1(1er-1剂加不同浓度)以及dmso作为对照，处理48h后收集各组car-t细胞离心并用pbs重悬。
53.(2)4-6周龄ncg小鼠饲养于spf级动物研究中心。取对数生长期luciferase(+)nalm-6细胞株，配制细胞浓度至5胞株，配制细胞，按1按株，配制鼠尾静脉注射，每只鼠注射总体积200体积。6天后小动物活体成像仪检测肿瘤负荷，按荧光强度随机分为3组，调整3组平均荧光强度无显著差异，次日尾静脉注射不同处理的car-t细胞。
54.car-t细胞注射后第3、7、14、21、28、35天进行动物活体成像，观测肿瘤负荷情况，并绘制小鼠生存曲线。结果显示处理后的car-t细胞在all-nsg小鼠模型体内抗肿瘤作用增强，且随fer-1浓度增加而增强(图12)。
55.综上，在car-t细胞治疗肿瘤过程中，铁离子抑制剂fer-1的浓度为1-4为1最佳。
56.以上实施例仅用于说明本发明的设计思想和特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，本发明的保护范围不限于上述实施例。所以，凡依据本发明所揭示的原理、设计思路所作的等同变化或修饰，均在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞的制备方法，其特征在于，具体为：分离培养免疫细胞，并在免疫细胞培养过程中添加浓度为0-4μm铁死亡抑制剂，其中免疫细胞的量为5*10e5/kg-4*10e6/kg。2.根据权利要求1所述的基于铁死亡抑制剂的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述铁死亡抑制剂为包括ferrostatin-1、uamc-3203、liproxstatin-1在内的对铁死亡有抑制作用的抑制剂。3.根据权利要求2所述的基于铁死亡抑制剂的免疫细胞的制备方法，其特征在于，铁死亡抑制剂ferrostatin-1的添加浓度为1-4μm，铁死亡抑制剂uamc-3203和铁死亡抑制剂lip-1的添加浓度为0-200nm。4.根据权利要求1所述的基于铁死亡抑制剂的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述免疫细胞具有杀伤功能的免疫细胞；所述免疫细胞为t细胞、nk细胞、巨噬细胞中的一种或多种按任意比例混合。5.根据权利要求1所述的基于铁死亡抑制剂的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述t细胞为car-t细胞或tcr-t细胞中的一种或两种按任意比例混合。6.根据权利要求1所述的基于铁死亡抑制剂的免疫细胞的制备方法，其特征在于，在免疫细胞培养过程中添加浓度为0-4μm铁死亡抑制剂具体为：在免疫细胞培养0-12天每天都加入铁死亡抑制剂、在免疫细胞培养0-12天过程中按单位时间间断地加入铁死亡抑制剂或在免疫细胞培养0-12天后加入铁死亡抑制剂。7.一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞，其特征在于，由权利要求1～6任一项所述的制备方法制得。8.一种权利要求7所述的免疫细胞或由权利要求1～6任一项所述的制备方法制得的免疫细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为血液肿瘤、神经胶质细胞瘤中的一种。10.一种抗肿瘤药物，其特征在于，其包含如权利要求7所述的基于铁死亡抑制剂的免疫细胞或由权利要求1～6任一项所述的制备方法制得的免疫细胞。
技术总结本发明公开了一种基于铁死亡抑制剂的免疫细胞及其制备方法、应用，本发明提出血清铁离子能够诱发免疫细胞发生铁死亡，并进一步在免疫细胞制备工艺中证实铁离子对免疫细胞的毒性作用；因此，在免疫细胞产品制备中添加铁死亡抑制剂，增加了其对铁离子毒性的抵抗作用，并促进了免疫细胞在体内对肿瘤的治疗效果，延长了荷瘤小鼠的生存时间。本发明提出铁死亡对免疫细胞的胁迫作用，优化了免疫细胞产品的制备工艺。品的制备工艺。品的制备工艺。
技术研发人员：黄河 孔德麟 荆瑞瑞 杨婷婷 赵梦雨 张琪琦 杨琳
受保护的技术使用者：浙江大学医学院附属第一医院
技术研发日：2022.06.22
技术公布日：2022/11/1
