与缺血性脑卒中相关的shrna、慢病毒表达载体及应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种与缺血性脑卒中相关的shrna、慢病毒表达载体及应用。
背景技术：2.缺血性脑卒中（ischemic stroke，is）是由于大脑动脉狭窄或闭塞，出现短暂性血液供应不足而引起局灶性神经功能缺失发作的一类脑血管疾病，是导致残疾和死亡的主要原因之一。其中缺血性脑卒中占脑卒中发病率的70%-80%。缺血性脑卒中的发病率会随着年龄的增长而提高，尤其是65岁以上的老年人，而且正逐步向年轻人转移。尽管随着医疗水平和科技的发展，现在有很多治疗缺血性脑卒中的手段，如溶栓治疗、抗血小板聚集治疗、抗凝治疗、血管内介入治疗、神经保护治疗等等，但是由于缺血性脑卒中的病理机制复杂，这些方法的治疗效果目前看来还并不是特别有效和理想。因此深入分析病理机制，寻找有效的治疗药物和手段，是亟待解决的关键问题之一。神经血管单元（neurovascular unit，nvu）是由神经元、血管内皮细胞、星形胶质细胞、基底膜及细胞外基质等组成的大脑动态微环境结构。nvu维持着神经元的正常生理功能及受损神经元的修复，它在血脑屏障（bbb）调节、炎症免疫反应、细胞保存及缺血性脑卒中期间的修复这四个方面起着重要的作用。当发生缺血性脑卒中时，bbb功能障碍，nvu则会受到严重损伤。而缺血条件下脑血管内皮中的多个细胞信号通路和营养因子调节屏障组织，参与调控脑血流和血管损伤修复过程。因此提高神经功能保护是目前临床上需要解决的问题之一。
3.神经系统内环境的稳态是维持神经元功能正常的必要条件。s-亚硝基谷胱甘肽还原酶（gsnor）实质上是一类谷胱甘肽（gsh）依赖的甲醛脱氢酶（fdh）和ⅲ型乙醇脱氢酶（adh），而adh5则是编码gsnor的基因。gsnor通过代谢s-亚硝基谷胱甘肽（gsno）来调节细胞中no的可用性，并通过gsno介导的s-亚硝基化作用来调节s-亚硝基化硫醇（rsno），对呼吸系统，心脑血管疾病，神经退行性疾病等都具有重要的生理意义。
技术实现要素：4.本发明的目的在于提供一种与缺血性脑卒中相关的shrna、慢病毒表达载体及应用，用于干扰adh5基因表达，抑制gsnor蛋白活性，提升蛋白的整体亚硝基化水平，提升细胞应对氧化应激的抗逆性，特别是缓解缺血性脑卒中所造成的神经损伤。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种与缺血性脑卒中相关的shrna，所述shrna的上游序列为5
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gatcc gacgaatttgtgaccggcaatctcgagattgccggtcacaaattcgtcttttttg-3’，下游序列为5
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aattcaaaaaagacgaatttgtgaccggcaatctcgagattgccg gtcacaaattcgtcg-3’。
6.一种与缺血性脑卒中相关的shrna慢病毒表达载体，所述shrna慢病毒表达载体为phblv-u6-mcs-pgk-puro-shrna，所述shrna的上游序列为5
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gatcc gacgaatttgtgaccggcaatctcgagattgccggtcacaaattcgtcttttttg-3’，下游序列为5
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aattcaaaaaagacgaatttgt
安捷伦），rt-qpcr仪（罗氏）。
20.1.2细胞培养neuro-2a细胞培养于高糖dmem完全培养基中，放入37℃，含5%co2培养箱中培养过夜。
21.1.3引物设计和合成目的基因sirna序列和shrna序列：sirna序列（5
’‑3’
）：gacgaatttgtgaccggcaat（seqidno.3）；上游序列：5
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gatccgacgaatttgtgaccggcaatctcgagattgccggtcacaaattcgtcttttttg-3’（seqidno.1），下游序列：5
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aattcaaaaaagacgaatttgtgaccggcaatctcgagattgccggtcacaaattcgtcg-3’（seqidno.2）。
22.引物由汉恒生物（上海）公司设计，上海生工合成，引物浓度100um。
23.引物序列：正向：5
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agttcggattaagatccttgcca-3’（seqidno.4）反向：5
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ccttcatgtcccaagatcactg-3’（seqidno.5）1.4shrna慢病毒表达载体的制备shrna合成：10
×
oligobuffer（市售）：2μl，正向引物：1μl，反向引物：1μl，h2o：16μl，合计20μl。
24.退火程序：95℃10min，75℃10min，55℃10min，35℃10min，15℃10min；引物退火后形成带粘性末端的双链片段（shrna）。
25.载体酶切限制性内切酶（bamhi和miuⅰ）对载体进行酶切，并用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段。
26.将退火产物与酶切后的phblv-u6-mcs-pgk-puro载体按照同源重组或者t4连接的方法在22℃连接1-2h，将连接产物转化到感受态dh5a细胞中，菌液涂板，培养12-16h。随后挑选单克隆进行菌落pcr验证，将正确的阳性克隆送到汉恒生物（上海）公司进行测序，测序结果与目的序列一致，并将测序正确的克隆样品进行质粒抽提，获得shrna慢病毒表达载体（phblv-u6-mcs-pgk-puro-shrna）。
27.1.5慢病毒包装与质量检测采用三质粒慢病毒系统进行病毒包装：将shrna慢病毒表达载体（携带目的基因shrna的载体质粒）、pspax2载体（病毒包装辅助质粒，汉恒生物（上海）公司）和pmd2g载体（病毒包装辅助质粒，汉恒生物（上海）公司）用lipofiter
tm
转染试剂共转染293t细胞，转染后16h更换含10%胎牛血清fbs的新鲜完全培养基，随后分别在48h和72h后收集病毒上清液，并将病毒超速离心，得到最终的慢病毒保存液，于-80℃冰箱保存。用嘌呤霉素测定慢病毒滴度，滴度（tu/ml）=细胞数
×
阳性克隆百分比
×
moi（1）
×
病毒稀释倍数
×
103tu/ml。
28.1.6shrna-gsnor（慢病毒）转染neuro-2a细胞1.6.1慢病毒感染细胞预实验moi（multiplicityofinfection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，moi越高，则病毒整合到染色体的数量及目的蛋白的表达量就越高。使用96孔板摸索moi步骤如下
所示：1）细胞准备：将生长状态良好的neuro-2a细胞消化计数后稀释至1
×
105/ml，96孔板铺板，100 μl/孔（1
×
104个细胞），放入37 ℃，5% co2培养箱中培养过夜。使第二天细胞汇合率为30-50%。
29.2）病毒感染：使用1/2小体积法感染，步骤如下：在感染前，从冰箱中取出病毒并放在冰上慢慢融化，吸去细胞原有培养基，加入50μl新鲜培养基；取值moi=3，10，30，100，将0.15 μl，0.5 μl，1.5 μl，5 μl病毒原液分别加入相对应的细胞中，轻轻混匀。
30.换液：感染后第二天（约24h），吸去含有病毒的培养液，换上100 μl新鲜培养液，继续37 ℃培养；观察荧光：感染72h后，发现moi=100时的细胞生长状态良好且感染效率在80%左右，则moi=100是我们后续实验所需的最佳值。
31.1.6.2慢病毒感染贴壁细胞细胞准备：将生长状态良好的neuro-2a细胞接种到12孔板，使细胞浓度为3
×
105/ml，500 μl/孔，每孔的细胞数量约为1
×
105个，放入37 ℃，5% co2培养箱中培养过夜。使第二天细胞汇合率为30-50%。
32.病毒感染（1/2小体积感染法）：感染前，从冰箱取出病毒并在冰上慢慢融化，吸去细胞原有培养基，加入0.5 ml新鲜培养基，加入50 μl病毒进行感染；设置对照组，加入33.3 μl病毒进行感染。慢病毒感染4h后补足至1 ml。
33.换液：感染后第二天（约24h），吸去含有病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37 ℃培养。
34.观察荧光：感染后48h，待细胞状态稳定，换上适当浓度嘌呤霉素的新鲜完全培养基，筛选稳定细胞株。
35.1.6.3用嘌呤霉素筛选shrna-gsnor neuro-2a细胞株构建慢病毒稳转株确定嘌呤霉素的最适浓度：将细胞铺12孔板，使第二天融合率约为50-60%，24h后更换不同浓度嘌呤霉素的完全培养基。设置嘌呤霉素梯度为0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 gl/ml处理48h。发现嘌呤霉素浓度为4.0 μg/ml时，可杀死90%以上未经转染的细胞。
36.进行嘌呤霉素筛选：设置未感染病毒的空细胞为对照组，并加入4.0 μg/ml的嘌呤霉素；慢病毒感染48-72h后，感染效率约在80%左右，且细胞状态稳定，汇合度在60-70%时，加入4.0 μg/ml的嘌呤霉素进行处理。
37.加药约48h后观察对照组空细胞的死亡情况，若空细胞组细胞死亡率在90%以上，撤掉嘌呤霉素换新鲜的培养基培养。
38.筛选细胞的放大培养：嘌呤霉素筛选完成后，待细胞长满可按适当比例传代培养，等到扩增到一定的细胞数量后即可进行混合克隆稳定株筛选。
39.1.6.4实时荧光定量pcr（real-time fluorescence quantification pcr，qrt-pcr）检测gsnor mrna水平
有a至d共4个细胞样本组别，每组有2种引物：a1:对照细胞nc/内参引物；a2：对照细胞nc/gsnor引物;b1：稳转细胞kd2/内参引物b2：稳转细胞kd2/gsnor引物c1：稳转细胞kd/内参引物c2：稳转细胞kd4/gsnor引物d1：稳转细胞kd6/内参引物d2：稳转细胞kd6/gsnor引物。每组3个复孔。
40.设计引物、用试剂盒提rna，测浓度，逆转录得到cdna。
41.加40μldepc水（即浓度为10ng/μl）于cdna，取2μl加入白色八联管中,再加上下游引物各0.5μl，sybrgreen5μl，depc水2μl。
42.设置程序为在94℃变性10分钟，然后进行40个循环依次做94℃变性10秒、60℃退火15秒和72℃延伸20秒，最后在72℃延伸90秒，并根据产物的溶解曲线，得到c(t)值。
43.二、结果2.1shrna慢病毒表达载体质粒鉴定将质粒送去汉恒生物公司进行测序，发现所得的测序结果与目的序列一致，表明目的质粒已经成功构建（图2）。并且将抽提的质粒经qc验证后，发现浓度大于200ng/ul，260-280在1.8-2.0之间，表明该质粒合格，可用于后续细胞的转染。
44.2.2慢病毒包装和滴度检测用lipofiter
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转染试剂将shrna慢病毒表达载体（m-adh5shrna）、pspax2载体、pmd2g载体三质粒共转染293t细胞，用嘌呤霉素对293t细胞进行滴度检测，经检测，hblv-m-adh5shrna1-puro的滴度为2*10^8tu/ml，hblv-puronc的滴度为3*10^8tu/ml。puro滴度检测证明慢病毒的滴度是达到转染要求的，并且合成的片段是有效的，它所携带的嘌呤霉素抗性基因片段可以使被转染的细胞获得对嘌呤霉素的抗性。利用嘌呤霉素检测所产生病毒的滴度，结果如图3-6所示。
45.2.3慢病毒对细胞形态的影响慢病毒感染neuro-2a细胞后，细胞形态未见影响，没有受到损伤，说明慢病毒对细胞的生存没有影响（图7）。
46.2.4实时荧光定量pcr检测gsnor的表达水平采用adh5敲低效果，检测gsnorshrnaneuro-2a稳转株中gsnormrna水平。结果显示，与对照组相比，实验组gsnormrna的表达水平都显著降低，adh5表达量约为空载病毒组的35%（图8），（p《0.01）。
47.2.5cck-8法检测敲低adh5对于神经细胞在氧糖剥夺模型（ogd）下的保护作用氧糖剥夺模型（ogd）是模拟病理性缺血对组织损伤所采用的经典实验模型。cellcountingkit-8，简称cck-8试剂盒，是一种基于wst-8而广泛应用于细胞毒性的快速、高灵敏度、无放射性的比色检测方法。在电子耦合试剂（也就是细胞是活的，有呼吸，有能量代谢）存在的情况下，可被nad+氧化还原成为水溶性的黄色甲瓒产物。活细胞越多，产生的甲瓒就越多，颜色也会越深。ogd损伤3-6小时后通过cck-8法测定细胞活力（viability）百分比，发现adh5表达被抑制的组受损伤细胞的比例显著低于未处理的组（图9）。以上实验结果表明，在神经细胞中敲低adh5可以减轻缺氧缺糖所带来的损伤，提示抑制gsnor的表达可能是治疗缺血性脑卒中的潜在靶点。通过敲低adh5，对shrna-neuro-2a神经细胞株进行稳转构建，结果显示，稳定gsnorshrnaneuro-2a细胞系构建成功，且稳转细胞系中gsnormrna表达水平明显降低。
48.以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
技术特征：1.一种与缺血性脑卒中相关的shrna，其特征在于，所述shrna的上游序列为5
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gatcc gacgaatttgtgaccggcaatctcgagattgccggtcacaaattcgtcttttttg-3’，下游序列为5
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aattcaaaaaagacgaatttgtgaccggcaatctcgagattgccg gtcacaaattcgtcg-3’。2.一种与缺血性脑卒中相关的shrna慢病毒表达载体，其特征在于，所述shrna慢病毒表达载体为phblv-u6-mcs-pgk-puro-shrna，所述shrna的上游序列为5
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gatcc gacgaatttgtgaccggcaatctcgagattgccggtcacaaattcgtcttttttg-3’，下游序列为5
’‑
aattcaaaaaagacgaatttgtgaccggcaatctcgagattgccg gtcacaaattcgtcg-3’。3.根据权利要求2所述的shrna慢病毒表达载体，其特征在于，所述shrna慢病毒表达载体是将合成的shrna克隆入干扰载体phblv-u6-mcs-pgk-puro中而得。4.如权利要求1所述的shrna作为制备抑制adh5基因表达药物的应用。5.如权利要求2所述的shrna慢病毒表达载体作为制备抑制adh5基因表达药物的应用。6.如权利要求1所述的shrna作为制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。7.如权利要求2所述的shrna慢病毒表达载体作为制备治疗缺血性脑卒中药物中的应用。
技术总结本发明公开了一种与缺血性脑卒中相关的shRNA、慢病毒表达载体及应用，本发明用于干扰ADH5基因表达，抑制GSNOR蛋白活性，提升整体的蛋白亚硝基化水平，提升细胞应对氧化应激的抗逆性，特别是缓解缺血性脑卒中所造成的神经损伤。伤。伤。
技术研发人员：严洁萍 韩臻平 李婷婷 王思懿 高立
受保护的技术使用者：浙江省人民医院
技术研发日：2022.06.09
技术公布日：2022/11/1
