一种重组嗜热中性蛋白酶及其在降解蛋白质中的应用

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种可在枯草芽孢杆菌宿主分泌表达的重组嗜热中性蛋白酶及该重组嗜热中性蛋白酶在降解蛋白质中的应用。


背景技术：

2.蛋白酶，是断裂大分子蛋白质中的肽键使之成为小分子蛋白质或多肽的一类水解酶。按活性中心氨基酸残基的种类可分成丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，按反应的ph值可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
3.蛋白酶在工业中有广泛的应用。在医药领域中，蛋白酶是临床上使用最早、用途最广的药用酶之一，可用于治疗消化不良、消炎、活化血管及高血压的治疗。在食品工业中，蛋白酶可用于肉软化、生产乳酪、啤酒去污及制备蛋白胨等。蛋白酶是加酶洗涤剂添加的主要酶类之一，用于清除蛋白污垢。除了可添加于日用洗涤剂中，蛋白酶还可用于医用多酶洗涤剂中，用于降解手术器械上的血红蛋白等。洗涤剂中添加的蛋白酶主要来自芽孢杆菌属，包括野生型酶及突变体，如novozymes公司生产的枯草溶菌素carlsberg枯草溶菌素147枯草溶菌素309和genencor的枯草溶菌素pb92等。诺维信公司在专利cn 101228343 b公布了枯草蛋白酶突变体；专利cn 1606626a公开了芽孢杆菌种(dsm 14390)的新型碱性蛋白酶以及包含该新型碱性蛋白酶的洗涤产品和清洁产品；cn 103305493a和cn 103305493 b公开了来自地芽孢杆菌嗜热蛋白酶及突变体的生产和在液体洗涤剂中的用途，该酶32℃下在中比从芽孢杆菌属物种上清液纯化的npre稳定68倍。目前国内市场的加酶洗涤剂中添加的蛋白酶主要依靠进口，价格较高，因此开发高活性和稳定性的蛋白酶具有重要的经济、社会和环境效益。
4.中性蛋白酶是最适反应ph在7.0左右的蛋白酶，已被应用于食品、洗涤剂及纺织等行业。但目前国内从事中性蛋白酶研发和销售的酶制剂企业很少，因此，中性蛋白酶的研发有较好的研究和应用前景。
5.中国专利cn 1446911a公布了一种人工基因生产嗜热菌蛋白酶的方法，构建大肠杆菌表达菌诱导表达嗜热菌蛋白酶，但表达产物为包涵体，需要使用高浓度尿素进行复性。这个酶在文献中以英文名thermolysin被熟知，该酶在ca
2+
存在时可在80℃稳定存在，但这个酶的切割位点有限，只在疏水性氨基酸残基的n端进行切割，包括甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸，有限的切割位点使其常被用于多肽图谱分析，其他用途很少见。cn 103667150公开了一种生产热稳定的中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌，所述中性蛋白酶最适反应温度70℃，最适反应ph为7.2，在60℃下，30min酶活力降低了5％，1h酶活力降低15％，稳定性有限。
6.酶在实际应用时条件复杂，而中性蛋白酶的缺点是稳定性差，限制了它的应用范围。来自嗜热和超嗜热微生物的嗜热酶与化学催化剂相比，具有催化效率高、底物专一性强及稳定性好等优点，是工业用酶非常有潜力的来源。所以，开发高活性、稳定性的嗜热中性蛋白酶，可为工业用蛋白酶提供优质候选酶。
7.我们报道了来自嗜热古细菌thermus thermophilus hb8的嗜热蛋白酶在大肠杆菌宿主中的诱导表达(xie gq,shao zk,zong l,et al.heterologous expression and characterization of a noverl subtilisin-like protease from a thermophilic thermus thermophilus hb8,international journal of biological macromolecules,2019,138:528-535.)。这个酶属于类枯草溶菌素(subtilisin-like)蛋白酶家族，经相似性比对分析，序列中包含分泌信号肽(1～19)、前肽序列和成熟蛋白酶序列，在大肠杆菌中表达时需要去除这段序列，将带有前肽氨基酸序列的编码序列通过pcr扩增连接到大肠杆菌表达载体pet20b，经诱导表达、热处理及纯化后只获得了经自剪切后成熟的蛋白酶。成熟酶在65-80℃、ph 7.5条件下显示了最大的催化活性，酶在75℃的半衰期超过48h，85℃的半衰期也超过3h，具有非常高的稳定性。类枯草溶菌素家族蛋白酶没有特定的切割位点，更适合用于降解蛋白质的工业应用。


技术实现要素：

8.本发明的目的是提供一种可在枯草芽孢杆菌宿主分泌表达的重组嗜热中性蛋白酶及该嗜热中性蛋白酶在降解蛋白质中的应用，其包括带有分泌信号肽序列的重组嗜热中性蛋白酶(氨基酸序列如seq id no.1、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5和seq id no.6所示)和不带有分泌信号肽序列的重组嗜热中性蛋白酶(氨基酸序列如seq id no.2所示)。
9.本发明所述的重组嗜热中性蛋白酶来自嗜热细菌thermus thermophilus hb8，属于类枯草溶菌素家族的丝氨酸蛋白酶。本发明的重组嗜热中性蛋白酶以带有前肽序列的形式构建到枯草芽孢杆菌表达载体pbe-s上，与该载体上的分泌信号肽apre融合表达，融合蛋白的核苷酸序列和氨基酸序列见seq id no.1，其中1～87位核苷酸序列为分泌信号肽apre的编码序列(编码第1～29位氨基酸序列)，88～111位核苷酸序列为载体上限制酶的识别序列(编码第30-37位氨基酸序列)，112～390位核苷酸序列为前肽的编码序列(编码第38～130位氨基酸序列)，391～1353位核苷酸序列为成熟酶的编码序列(编码第131～451位氨基酸序列)，1354～1407位核苷酸序列为载体上限制酶识别序列和组氨酸his纯化标签的编码序列(编码第452～468位氨基酸序列)。分泌信号肽apre可以引导嗜热中性蛋白酶经枯草芽孢杆菌细胞膜的分泌通道进入培养基中，在这个过程中分泌信号肽apre被细胞膜上的信号肽酶切除，得到本发明所述的不带有分泌信号肽序列的重组嗜热中性蛋白酶，其氨基酸序列见seq id no.2所示。进一步将表达载体上的分泌信号肽apre替换成yoaw(序列见seq id no.3)、ykwd(序列见seq id no.4)、yuri(序列见seq id no.5)和yrrs(序列见seq id no.6)，可以提高嗜热中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达量。
10.丝氨酸蛋白酶一般以前体蛋白(pre-pro-protease)形式表达，包括信号肽序列、n端前肽和成熟酶三部分。信号肽的功能是保证蛋白质从生产细胞释放到胞质或胞外培养基中，在经过细胞膜运输到细胞外时被信号肽酶从前体蛋白上切下来。去除信号肽后的蛋白被称为酶原(pro-protease)，通常是没有活性的，其经过处理后去除n端前肽，成为有活性的成熟酶，这种剪切起因于丝氨酸蛋白酶的自消化或自催化剪切。但本发明的嗜热中性蛋白酶以带有前肽序列形式在枯草芽孢杆菌中分泌表达48h，在上清液中检测到蛋白酶活力，sds-page电泳于45kda处检测到本发明的嗜热中性蛋白酶。
11.本发明所述的一种重组嗜热中性蛋白酶，其是由如下步骤制备得到：
12.(1)以大肠杆菌表达重组质粒pet20b-tth0724为模板，pcr扩增得到嗜热中性蛋白酶基因片段(编码21-434aa)，然后将该基因插入到表达载体pbe-s的分泌信号肽apre下游sac i和bamh i位点构建枯草芽孢杆菌重组表达质粒，通过转化大肠杆菌dh5α感受态细胞筛选重组表达质粒，再将筛选得到的重组表达质粒转化枯草芽孢杆菌感受态rik1285，在lb液体培养基于37℃振荡培养48h后于培养基中检测到嗜热中性蛋白酶，说明分泌信号肽apre能引导嗜热中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌rik1285中分泌表达；
13.(2)为了进一步提高嗜热中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达量，可以通过优化分泌信号肽实现：将步骤(1)筛选得到的重组表达质粒用mlu i与eco52 i双酶切，去除重组表达质粒上的apre分泌信号肽，再与含有173种枯草芽孢杆菌分泌信号肽的混合物sp dna连接，转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布于含有100μg/ml amp的lb固体培养基，37℃培养过夜；将得到的全部菌落转移至5ml lb液体培养基中，37℃、180rpm振荡培养过夜后提取连接了不同分泌信号肽的重组表达质粒混合物，再电转化枯草芽孢杆菌感受态rik1285，筛选酶活力提高的工程菌，优化得到分泌表达嗜热中性蛋白酶量提高的分泌信号肽包括yoaw、ykwd、yuri和yrrs，其中分泌信号肽yoaw提高嗜热中性蛋白酶的分泌表达量最明显，以该表达菌作为本发明的嗜热中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌的表达工程菌；
14.(3)将步骤(2)获得的表达工程菌接种于lb液体培养基，37℃、180rpm振荡培养48h，离心收集上清液即为粗酶液，经超滤获得嗜热中性蛋白酶；
15.上述步骤(2)中优化的分泌信号肽包括yoaw、ykwd、yuri和yrrs。与大肠杆菌表达的蛋白酶相比，本发明的嗜热中性蛋白酶表达主要以带有前肽序列形式存在，大肠杆菌中表达纯化后只获得了成熟酶。传统的枯草溶菌素只有成熟蛋白有酶活性，带有前肽序列的酶原是没有酶活力的，但本发明的嗜热中性蛋白酶带有前肽序列，且具有蛋白酶水解活力，不需要再自剪切，大大简化了生产过程，降低生产成本。
16.本发明的第二个技术方案：嗜热中性蛋白酶催化反应的最适温度、最适ph、热稳定性及ph稳定性的测定，具体操作如下；
17.(1)通过测定在65～95℃范围内嗜热中性蛋白酶的水解速率来探究嗜热中性蛋白酶的最适反应温度，在ph 6.0～10.0范围内测定了嗜热中性蛋白酶的最适ph；
18.(2)将嗜热中性蛋白酶在75℃孵育不同时间取样，测定嗜热中性蛋白酶的残余活力探究嗜热中性蛋白酶的热稳定性。
19.本发明的第三个技术方案：嗜热中性蛋白酶在降解蛋白质领域中的应用，包括以下三个方面：
20.(1)嗜热中性蛋白酶水解肠衣制备肝素钠：在10ml、50mmol/l磷酸盐缓冲液反应体系中加入2ml猪小肠中的肠衣液和10～240u的嗜中性热蛋白酶，于75℃、120rpm振荡反应2h，制备肝素钠；
21.(2)嗜热中性蛋白酶水解豆粕制备大豆生物活性肽：用破壁机将大颗粒豆粕粉碎后，过100目筛去除大颗粒，再继续破碎10min充分研磨，得到豆粕粉；酶解体系为50ml、50mmol/l磷酸盐缓冲液缓冲液，含有终浓度2.5％(m/v)的豆粕粉和100～1500u的嗜热中性蛋白酶，于75℃、150rpm振荡反应3h，制备大豆生物活性肽；
22.(3)嗜热中性蛋白在洗涤剂中的应用：先将奥妙洗涤剂在100℃条件下热处理1h，
把洗涤剂中原有的酶制剂灭活；在10ml、50mmol/l磷酸盐缓冲液体系中含有终浓度1％(v/v)的上述处理的洗涤剂和10～240u嗜热中性蛋白酶，将带有猪血的污布浸泡在液体中，于60℃、120rpm振荡洗涤20min。
23.本发明的嗜热中性蛋白酶由枯草芽孢杆菌分泌表达工程菌分泌表达，不限于特定的表达载体，优选的表达载体采用真核或原核表达载体，进一步优选为pbe-s载体；不限于特定的分泌信号肽，可以是枯草芽孢杆菌的各种分泌信号肽，进一步优选为apre、yoaw、ykwd、yuri和yrrs；不局限于任何特定的宿主细胞，只要能够表达上述表达载体，如枯草芽孢杆菌rik1285、bs168、wb600和wb800等，在优选实施方案中，使用枯草芽孢杆菌rik1285菌株。
24.以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照“分子克隆实验指南”(第三版，科学出版社，2002年)。
25.本发明中用到的表达载体pbe-s和枯草芽孢杆菌宿主菌rik2185是本技术领域人员常用载体和宿主菌，可购自宝日医生物技术(北京)公司，该公司的网址：http://www.takarabiomed.com.cn。可以通过公司给定的联系方式购买，或通过该公司在国内各省市的代理公司购买。
附图说明
26.图1：嗜热中性蛋白酶的分泌表达sds-page电泳图；m为标准分子量marker，泳道1为分泌信号肽apre，泳道2为分泌信号肽yoaw，泳道3为分泌信号肽ykwd。箭头所指为带有前肽序列的嗜热中性蛋白酶，分子量为45kda，说明嗜热中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌宿主rik1285中分泌表达，分泌信号肽为yoaw时嗜热中性蛋白酶的分泌表达量更高。
27.图2：嗜热中性蛋白酶的温度－活力曲线；横坐标是温度，纵坐标是相对活力。在65-95℃范围内嗜热中性蛋白酶活力保持在80％以上，在80℃表现出最大活力。
28.图3：嗜热中性蛋白酶的热稳定性曲线；横坐标是时间，纵坐标是剩余活力。嗜热中性蛋白酶在75℃孵育6h，酶活力只降低了约10％。
29.图4：嗜热中性蛋白酶的ph－活力曲线；横坐标是ph，纵坐标是相对活力，在ph 6.0～8.0范围内，嗜热中性蛋白酶保持了80％以上的活力，在ph 10.0时仍残余60％活力。
30.图5：嗜热中性蛋白酶降解肠衣液制备肝素钠效价图；横坐标是蛋白酶的种类，纵坐标是肝素钠效价。嗜热中性蛋白酶水解肠衣液2h产生的肝素钠效价为10.8u/ml，效果稍弱于商品酶枯草杆菌中性蛋白酶(南宁庞博生物工程有限公司)，好于p2000碱性蛋白酶(杰能科生物工程有限公司)。
31.图6：嗜热中性蛋白酶降解豆粕制备大豆多肽的抗氧化活性图；横坐标是蛋白酶种类，纵坐标是ddph清除率。嗜热中性蛋白酶降解豆粕获得的大豆多肽清除dpph的效果明显好于商品酶枯草杆菌中性蛋白酶(南宁庞博生物工程有限公司)和p2000碱性蛋白酶(杰能科生物工程有限公司)，说明抗氧化活性更好。
32.图7：嗜热中性蛋白酶降解豆粕制备的大豆多肽各组分的抗氧化活性图；横坐标是大豆多肽不同分子量的组分，纵坐标是dpph清除率。嗜热中性蛋白酶降解豆粕后将大豆多肽分成大于30kda、10～30kda、3～10kda和小于3kda四个组分，其中小于3kda的组分清除dpph的效果最好，即该组分抗氧化效果最好。
33.图8：嗜热中性蛋白酶与表面活性剂和漂白剂的相容性图；横坐标是表面活性剂和漂白剂的类型，纵坐标是相对活力，对照组不添加表面活性剂和漂白剂，以对照组的酶活力为100％。嗜热中性蛋白酶与洗涤剂中添加的表面活性剂和漂白剂相容性好，酶相对活力都保持在90％以上，在5％(v/v)的吐温20和80存在时酶活力提高了35％左右，说明嗜热中性蛋白酶在洗涤剂中能稳定发挥酶活力。
34.图9：嗜热中性蛋白酶与商品化洗涤剂的相容性图；横坐标是洗涤剂的品牌，纵坐标是相对活力，对照组不添加洗涤剂，以对照组的酶活力为100％。嗜热中性蛋白酶在除碧浪洗涤剂外的各种洗涤剂中均能保留80％以上的酶活力，在奥妙洗涤剂中活力提高了6％。
35.图10：嗜热中性蛋白酶洗涤猪血污渍的效果图；1：洗涤前，2：100℃加热1h的奥妙洗涤剂洗涤效果，3：在第2组洗涤剂中添加240u嗜热中性蛋白酶的洗涤效果。说明嗜热中性蛋白酶能很好地降解血红蛋白，去除血渍。
具体实施方式
36.实施例1：嗜热中性蛋白酶枯草芽孢杆菌分泌表达工程菌的构建及蛋白表达，包括以下步骤：
37.1.嗜热中性蛋白酶基因的克隆
38.以实验室已构建的嗜热中性蛋白酶大肠杆菌重组质粒pet20b-tth0724(xie gq,shao zk,zong l,et al.heterologous expression and characterization of a noverl subtilisin-like protease from a thermophilic thermus thermophilus hb8,international journal of biological macromolecules,2019,138:528-535)为模板，pcr扩增得到嗜热中性蛋白酶基因，编码414aa，氨基酸序列如seq id no.1所示。嗜热中性蛋白酶的引物序列如下：
39.上游引物：agtaatgagctcccccagacccca，横线处为限制酶sac i识别位点；
40.下游引物：gatttgggatccggggaagcagta，横线处为限制酶bamh i识别位点。
41.pcr反应：在100μl反应体系中含1μl pet20b-tth0724质粒，2μl上游引物，2μl下游引物，45μl超纯水，50μl premixhs酶混合液(宝日医生物技术(北京)公司)。每个循环中98℃变性10s，62℃退火5s，72℃延伸85s，共35个循环。
42.利用sac i和bamh i切割位点将嗜热中性蛋白酶基因重组到表达载体pbe-s中，连接后成为重组表达质粒，转化大肠杆菌感受态细胞。重组质粒构建过程：将嗜热中性蛋白酶pcr产物和表达载体pbe-s分别用限制酶sac i和bamh i酶切，酶切体系中依次添加5μl限制酶切缓冲液k，pcr产物或表达载体pbe-s40μl，两个限制酶各2.5μl，混匀后于37℃反应3h。将得到的5μl酶切后嗜热中性蛋白酶pcr产物与1μl pbe-s载体片段、1μl10
×
t4 dna连接酶缓冲液、1μlt4 dna连接酶和2μl无菌水混匀，于25℃水浴连接4h。将连接混合物转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布于含终浓度为100μg/ml氨苄青霉素的lb固体培养基，于37℃倒置培养过夜。挑取单菌落接菌于含终浓度100μg/ml氨苄青霉素的5ml lb液体培养基，在37℃、180rpm下振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取重组表达质粒。
43.2.嗜热中性蛋白酶的表达
44.将步骤1的重组表达质粒转化枯草芽孢杆菌rik1285感受态细胞构建分泌表达工程菌。枯草芽孢杆菌rik1285感受态细胞的制备：将枯草芽孢杆菌rik1285接种于5ml lb液
体培养基，于37℃、180rpm振荡培养过夜；取2.5ml过夜培养液接种于40ml山梨醇液体培养基(100ml山梨醇液体培养基含有1g蛋白胨、0.5g酵母提取物、1g nacl和9g山梨醇，121℃高压蒸汽灭菌15min)，于37℃、180rpm振荡培养至od
600
达到0.85-0.95，于4℃、4000rpm离心10min收集菌体；用40ml电转化溶液(100ml电转化溶液含有山梨醇9g、甘露醇9.25g和甘油10ml)洗涤菌体，于4℃、4000rpm离心10min收集菌体，重复洗涤3次；用1ml电转化溶液重悬菌体制备枯草芽孢杆菌rik1285感受态细胞。将5μl步骤1的重组表达质粒加入到100μl上述感受态细胞，转入至预冷的0.2mm电转杯中，于电转仪中2kv电击2.5ms，立即加入1ml复苏培养基(100ml复苏培养基含有蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、nacl 1g、山梨醇9g和甘露醇7g，121℃高压蒸汽灭菌15min)，于37℃、180rpm振荡培养2h，涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb固体平板，37℃倒置过夜培养。挑取单菌落接种于含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，37℃、180rpm振荡培养48h，12000rpm离心15min，收集上清液，经sds-page电泳鉴定确认嗜热中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中分泌表达，结果见图1中泳道1。经上述步骤验证的单菌落即可作为表达嗜热中性蛋白酶的工程菌，表达载体上的分泌信号肽apre可以引导嗜热中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中分泌表达至培养基中，信号肽apre在经过分泌通道时被细胞膜上的信号肽酶切除，得到本发明的不带有分泌信号肽序列嗜热中性蛋白酶，氨基酸序列见seq id no.2。
45.3.信号肽的优化
46.分泌信号肽的氨基酸组成和性质是影响外源蛋白在枯草芽孢杆菌分泌表达量不同的重要因素，为了进一步提高嗜热中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌的分泌表达量，将步骤1重组表达质粒的分泌信号肽apre替换为其他枯草芽孢杆菌信号肽，筛选嗜热中性蛋白酶分泌表达量提高的表达工程菌。将步骤1的重组表达质粒用限制酶mlu i和eco52 i于37℃酶切3h，去除重组表达质粒上的apre分泌信号肽，使用dna回收试剂盒纯化去除信号肽的质粒dna片段，取4μl质粒dna片段、1.5μl含有173种枯草芽孢杆菌分泌信号肽sp dna混合物、2μl 5
×
连接酶in-fusion hd酶预混液及2.5μl超纯水，于50℃连接15min，转化大肠杆菌hst08感受态细胞，涂布于含有100μg/ml氨苄青霉素的5ml lb固体培养基，于37℃倒置培养过夜。将平板上全部菌落转移至含有100μg/ml氨苄青霉素的5ml lb液体培养基中，37℃培养过夜后提取质粒，将质粒转化枯草芽孢杆菌rik1285感受态细胞，筛选酶活力提高的工程菌。经dna测序验证使嗜热中性蛋白酶分泌表达量提高的信号肽包括yoaw、ykwd、yuri和yrrs(分泌信号肽编码基因在目标基因的上游，表达出带有分泌信号肽的融合蛋白，分泌信号肽引导目标蛋白过宿主细胞细胞膜分泌表达，在通过细胞膜通道时被切除，所以获得的蛋白只是seq id no.2的目标蛋白)，其中分泌信号肽yoaw和ykwd更有利于嗜热中性蛋白酶的分泌表达，结果见图1中泳道2和3。能使嗜热中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中进行分泌表达的分泌信号肽序列见seq id no.3-6。
47.在本实施例中使用枯草芽孢杆菌菌株为rik1285，但不局限于rik1285，可用于重组质粒表达的枯草芽孢杆菌菌株还包括bs168、wb600和wb800等宿主细胞。
48.实施例2：嗜热中性蛋白酶的最适温度、最适ph和热稳定性
49.1.最适反应温度和热稳定性
50.在65～95℃范围内测定本发明所述嗜热中性蛋白酶的活力，以酶的相对活力对温度作图，如图2所示，嗜热中性蛋白酶的最适反应温度为80℃，并且在65～95℃范围内，保持
80％以上的酶活力。
51.蛋白酶活力的检测：使用偶氮酪蛋白作为底物测定蛋白酶活性。用于该测定的偶氮酪蛋白底物的制备：将0.5g偶氮酪蛋白溶于100ml、0.2mol/l磷酸盐缓冲液(ph 7.0)中配置成含0.5％偶氮酪蛋白的底物溶液。取0.1ml底物溶液在75℃温育5min，之后加入0.3ml的酶溶液，于75℃反应30min。之后加入0.4ml 0.6mol/l三氯乙酸(tca)溶液终止反应，于5000rpm离心5min，取上清液用uv-1601分光光度计于335nm处测定吸光度值。对照组在加酶液前先加0.6mol/l tca，其余处理相同。在上述反应条件下，酶活力单位定义为1min水解偶氮酪蛋白吸光度值变化0.001所需的酶量为1个酶活力单位。
52.将浓度为0.1mg/ml的嗜热中性蛋白酶在75℃中保温不同时间，按上述蛋白酶活力的检测方法分别测定嗜热中性蛋白酶的残余活力。嗜热中性蛋白酶的热稳定性结果如图3所示，嗜热中性蛋白酶在75℃孵育6h后残余活力在90％以上，说明本发明的嗜热中性蛋白酶具有非常好的热稳定性。
53.2.最适反应ph
54.75℃下测定嗜热中性蛋白酶在ph 6.0～10.5范围内的活力，使用的缓冲液是50mmol/l na2hpo
4-nah2po4缓冲液(ph 6.0～8.0)，tris-hcl缓冲液(ph 8.0～9.0)，甘氨酸-naoh缓冲液(ph 9.0～11.0)。嗜热中性蛋白酶的活力-ph曲线如图4所示，嗜热中性蛋白酶在ph 6.0至10.0之间能够有效地催化酪蛋白的水解，最适ph为7.0，在ph 6.0～8.0范围内残余酶活力在80％以上。
55.实施例3：嗜热中性蛋白酶降解蛋白质的应用
56.1.嗜热中性蛋白酶降解肠衣液生产肝素钠
57.在10ml反应体系中含有50mmol/l磷酸盐缓冲液(ph 7.0)、2ml猪小肠的肠衣液及240u的嗜热中性蛋白酶(氨基酸序列如seq id no.2所示)，75℃、120rpm振荡反应0.5h和2h，取样使用天青a试剂盒检测肝素钠含量。对照组不添加酶，其他条件与实验组一致。商品酶中性蛋白酶和p2000碱性蛋白酶作为比较，其中，中性蛋白酶的反应体系和酶用量与嗜热中性蛋白酶的反应相同，于40℃反应；p2000使用的缓冲液为50mmol/l的甘氨酸-naoh(ph 10.0)，于50℃反应。以肝素钠效价对三种蛋白酶作图，结果见图5。
58.2.嗜热中性蛋白酶降解豆粕生产大豆多肽
59.嗜热中性蛋白酶降解豆粕生产大豆多肽的反应：用破壁机将大颗粒豆粕粉碎后，过100目筛去除大颗粒，再继续破碎10min充分研磨，得到豆粕粉。酶解体系为50ml磷酸盐缓冲液(ph 7.0)，含有终浓度2.5％(m/v)豆粕粉及1500u的嗜热中性蛋白酶(氨基酸序列如seq id no.2所示)，于75℃、150rpm振荡反应3h。酶解产生大豆多肽的抗氧化活性通过检测酶解产物对dpph(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，2,2-二苯基-1-苦基肼基)自由基的清除率，具体反应：取酶解产物200μl，加400μl 0.1mmol/l的dpph溶液，避光于室温反应30min，检测517nm的吸光度值。对照组除不添加酶，其他条件与实验组一致。商品酶中性蛋白酶和p2000碱性蛋白酶作为比较，其中，中性蛋白酶的反应体系和酶用量与嗜热中性蛋白酶的反应相同，于40℃反应；p2000使用的缓冲液为50mmol/l的甘氨酸-naoh(ph 10.0)，于50℃反应。以ddph对三种酶解产物作图见图6，结果显示嗜热中性蛋白酶降解豆粕产生的大豆多肽的抗氧化活性最强。
60.将上述嗜热中性蛋白酶降解豆粕的产物使用截留分子量为30kda的超滤管于
4000rpm离心10min，上层液为》30kda多肽组分；将滤过液用截留分子量为10kda的超滤管离心，上层液为10-30kda多肽组分；再将滤过液使用截留分子量为3kda的超滤管离心，上层液为3-10kda多肽组分，滤过液为《3kda多肽组分。使用如上所述的方法测定四个组分对ddph的清除率，分析不同多肽组分的抗氧化活力，如图7所示，《3kda的多肽组分抗氧化活性最强。
61.3.嗜热中性蛋白酶在洗涤剂中的应用
62.(1)嗜热中性蛋白酶与表面活性剂和漂白剂的相容性
63.洗涤剂中常添加表面活性剂和漂白剂增强洗涤效果，嗜热中性蛋白酶与表面活性剂和漂白剂的相容性实验：在嗜热中性蛋白酶(氨基酸序列如seq id no.2所示)中分别添加1％或5％(v/v)的表面活性剂sds、dmso、吐温20、吐温80和曲拉通x-100，漂白剂如双氧水和过硼酸钠，混匀于室温静置0.5h，检测嗜热中性蛋白酶的残余活力，结果见图8。酶活力测定方法见实施例1。
64.(2)嗜热中性蛋白酶与洗涤剂的相容性
65.将奥妙、超能、蓝月亮、立白、汰渍、碧浪六种液体洗涤剂分别在100℃热处理1h，把洗涤剂中原有的酶制剂彻底灭活。在嗜热中性蛋白酶中添加1％(v/v)处理后的洗涤剂，混匀后于室温静置0.5h，检测嗜热中性蛋白酶的残余活力，结果见图9。酶活力测定方法见实施例1。
66.(3)嗜热中性蛋白酶洗涤血渍的效果
67.将白布剪成3cm
×
3cm的正方形布块备用。取300μl猪血，每次点100μl于白布块中心，置于37℃恒温箱静置20min烘干，重复三次，制成血渍污布。将奥妙洗涤剂在100℃条件下热处理1h，把洗涤剂中原有的酶制剂灭活。在10ml、50mmol/l磷酸盐缓冲液(ph 7.0)中含有终浓度1％(v/v)上述处理后的奥妙洗涤剂和240u嗜热中性蛋白酶(氨基酸序列如seq id no.2所示)，将血渍污布浸入其中，于60℃、120rpm振荡洗涤20min，观察洗涤效果，结果见图10。对照组除不添加嗜热中性蛋白酶，其他成份与实验组相同。
68.本发明所公开的内容，相信本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限定本发明的范围。

技术特征：
1.一种带有分泌信号肽序列的重组嗜热中性蛋白酶，其氨基酸序列如seq id no.1、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5或seq id no.6所示。2.一种不带有分泌信号肽序列的重组嗜热中性蛋白酶，其氨基酸序列如seq id no.2所示。3.权利要求2所述的一种不带有前肽序列的重组嗜热中性蛋白酶在分解蛋白质中的应用。

技术总结
一种重组嗜热中性蛋白酶及其在降解蛋白质中的应用，属于生物工程技术领域。本发明提供了一种可在枯草芽孢杆菌宿主分泌表达的重组嗜热中性蛋白酶，其包括如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的带有分泌信号肽序列的重组嗜热中性蛋白酶，及如SEQ ID No.2所示的不带有分泌信号肽序列的重组嗜热中性蛋白酶。本发明所述的嗜热中性蛋白酶以带有前肽序列形式在枯草芽孢杆菌中分泌表达，实验结果表明具有较高的酶活力，可降解豆粕得到高抗氧化活性的小分子多肽，且在多种洗涤剂中能够稳定发挥酶活力，能够很好地降解血红蛋白，去除血渍。去除血渍。去除血渍。


技术研发人员：解桂秋 高仁钧 轩小然
受保护的技术使用者：吉林大学
技术研发日：2022.05.10
技术公布日：2022/11/1