1.本发明属于化学生物材料技术领域，具体涉及一种线粒体靶向的粘度响应荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术：2.线粒体被称为调节细胞能量代谢、信号转导和细胞生长的大能量工厂。线粒体的任何损伤或功能障碍都可能会引起线粒体内的一些生理变化，如ph、极性和粘度等，其中线粒体粘度在维持生物大分子之间的相互作用、信号传递、细胞代谢的生理过程中起着至关重要的作用。线粒体中粘度异常与许多疾病有关，如帕金森病、炎症、癌症等。因此，开发一种检测线粒体粘度的有效方法，探索粘度与线粒体相关功能的关系，可以为线粒体相关疾病的发病机制提供深刻的见解。
3.尽管目前已经设计了许多用于线粒体粘度检测的小分子荧光探针，但用于追踪线粒体粘度并评估其与线粒体其他功能之间关系的探针却鲜有报道，开发一种新型的线粒体靶向用于追踪线粒体粘度变化的探针仍然具有挑战性。本发明设计了一种可线粒体靶向且具有红色荧光发射的粘度探针vp，该探针最大发射波长处于红光区615nm处，对粘度具有较强的特异性响应。此外，由于其独特的特性，vp已成功应用于小胶质细胞中线粒体粘度的靶向检测。构建此线粒体靶向的粘度探针在相关疾病的诊断中具有巨大的医学应用潜力。
技术实现要素：4.针对上述问题本发明提供一种线粒体靶向的粘度响应荧光探针及其制备方法和应用。该探针是由3-乙基-1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚-3-碘化鎓和4-二乙氨基苯甲醛在四氢吡咯催化下反应制得。由于苯环与吲哚环之间化学键的自由旋转，探针本身具有较弱的荧光；而随着粘度增加，苯环与吲哚环之间化学键的自由旋转可以被有效抑制，从而使得探针荧光强度急剧增强。此外，该探针具有较强的选择性和特异性、较好的稳定性及较优的线粒体靶向能力，可被应用于药物刺激前后细胞线粒体中粘度变化的检测。
[0005]
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0006]
一种线粒体靶向的粘度响应荧光探针，可以靶向检测线粒体中粘度变化，所述荧光探针的化学结构式为：
[0007][0008]
一种线粒体靶向的粘度响应荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0009]
(1)在氮气保护下，将1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚-碘化鎓用甲苯溶解，然后加
入碘乙烷回流反应；将反应液冷却过滤混合物，用正己烷洗涤，得到化合物3-乙基-1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚-3-碘化鎓vp-1。
[0010]
(2)在氮气保护下，将步骤(1)制备的3-乙基-1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚-3-碘化鎓和4-二乙氨基苯甲醛溶于乙醇中，加入四氢吡咯作为催化剂，回流反应，浓缩反应液并经柱层析分离得到荧光探针vp。
[0011]
进一步，所述步骤(2)中的3-乙基-1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚-3-碘化鎓、4-二乙氨基苯甲醛溶于乙醇中和四氢吡咯的摩尔比为1:1.1:0.01。
[0012]
进一步，所述步骤(2)中柱层析用洗脱剂是体积比为100～10:1的二氯甲烷与甲醇的混合物。二氯甲烷和甲醇体系的洗脱剂对产物的分离提纯效果更好，而且利用梯度洗脱法能够达到最好的分离效果，减少产物的损失。
[0013]
一种线粒体靶向的粘度响应荧光探针的应用，利用荧光探针法和荧光成像法检测细胞线粒体中粘度的变化。
[0014]
一种线粒体靶向的粘度响应荧光探针的应用，用于检测药物刺激前后细胞线粒体中粘度的变化。荧光探针响应粘度机理如图2所示，由于苯环与吲哚环之间化学键的自由旋转，将分子激发态能量消耗，导致探针以非辐射跃迁方式回到基态，使得探针本身具有较弱的荧光；而随着粘度增加，苯环与吲哚环之间化学键的自由旋转可以被有效抑制，降低了自由旋转导致的非辐射跃迁，从而使得探针荧光强度急剧增强。
[0015]
与现有技术相比本发明具有以下优点：
[0016]
1.本发明探针属于长波长(红光区域)荧光探针，组织穿透能力强且受生物组织自发荧光影响小，便于观察；而且对细胞或生物组织没有损伤。
[0017]
2.该探针的荧光性质不受活性氧、活性氮、溶剂极性和不同ph环境的影响，具有较好的特异性和稳定性。
[0018]
3.该探针分子中半花菁单元，能够实现探针的线粒体靶向性，从而实现靶向检测线粒体中粘度变化。
[0019]
4.该探针生物相容性好，可应用于活体动物模型中粘度的检测。
附图说明
[0020]
图1为本发明荧光探针vp的合成线路图；
[0021]
图2为本发明荧光探针vp对粘度响应机理图；
[0022]
图3为本发明所涉及化合物vp-1的1h nmr谱图；
[0023]
图4为本发明所涉及化合物vp-1的
13
c nmr谱图；
[0024]
图5为本发明所涉及的探针vp的1h nmr谱图；
[0025]
图6为本发明所涉及的探针vp的
13
c nmr谱图；
[0026]
图7为本发明所涉及的探针vp的hrms谱图；
[0027]
图8(a)为本发明荧光探针vp检测在水和甘油中的紫外吸收光谱图，(b)荧光探针在不同比例甘油-水混合体系中的荧光发射光谱图；
[0028]
图9(a)为本发明荧光探针vp分别在水和90％甘油-水体系中响应不同活性氧/活性氮的荧光强度图，(b)荧光探针在不同溶剂中的荧光发射光谱图，(c)荧光探针在不同ph的pbs溶液，以及不同比例甘油+不同ph溶液中的荧光强度变化图；
[0029]
图10为本发明荧光探针vp在bv2细胞中的线粒体定位荧光成像图；
[0030]
图11为本发明荧光探针vp对bv2细胞中粘度变化检测的荧光成像图；
[0031]
图12为本发明荧光探针vp对bv2细胞存活率影响图。
具体实施方式
[0032]
实施例1
[0033]
一种线粒体靶向的粘度响应荧光探针
[0034]
如图1的合成线路图所示，化合物vp的合成：
[0035]
(1)化合物vp-1的合成：氮气保护下，将1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚-碘化鎓(10.0g,47.8mmol)用甲苯溶解，然后加入碘乙烷(4.5ml,57.3mmol)回流反应。将反应液冷却过滤混合物，用正己烷洗涤，得到灰色固体vp-1(10.5g,60％yield)。
[0036]
如图3所示，化合物vp-1的1h nmr谱，1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.39
[0037]
(d,j＝8.3hz,1h),8.33(d,j＝8.9hz,1h),8.24(q,j＝8.0hz,2h),7.82
–
[0038]
7.78(m,1h),7.75-7.71(m,1h),4.69(q,j＝7.2hz,2h),2.99(s,3h),1.78(s,
[0039]
6h),1.55(t,j＝7.2hz,3h)；
[0040]
如图4所示，化合物vp-1的
13
c nmr谱，
13
c nmr(100mhz,cdcl3)δ196.43,138.69,137.53,133.53,131.21,130.21,128.91,127.76,127.72,123.92,113.74,55.97,43.98,22.02,14.44,13.47.
[0041]
(2)在氮气保护下，将3-乙基-1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚-3-碘化鎓(1.0g,2.8mmol)和4-二乙氨基苯甲醛(0.5g,3.1mmol)溶于乙醇中，加入四氢吡咯(2.0mg,0.028mmol)作为催化剂，回流反应，浓缩反应液并经柱层析(二氯甲烷：甲醇＝100:1
～
10:1)分离得到荧光探针vp为紫色固体(0.5g,33％yield)。
[0042]
如图5所示，化合物vp的1h nmr谱，1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.46(d,j＝15.6hz,1h),8.37(d,j＝8.5hz,1h),8.25(d,j＝8.8hz,1h),1.18(m,3h),8.02(d,j＝8.9hz,1h),7.79(t,j＝7.1hz,1h),7.67(t,j＝7.6hz,1h),7.32(d,j＝15.6hz,1h),6.91(d,j＝8.6hz,2h),4.71(d,j＝7.1hz,2h),3.58(d,j＝7.1hz,4h),2.01(s,6h),1.47(t,j＝7.0hz,3h),1.20(t,j＝6.0hz,6h).
[0043]
如图6所示，化合物vp的
13
c nmr谱，
13
c nmr(100mhz,dmso-d6)δ180.11,153.84,152.94,138.86,136.84,132.90,131.23,130.46,128.63,127.52,126.67,123.13,122.45,112.95,112.44,104.07,55.44,53.00,44.93,26.71,13.89,13.05.
[0044]
如图7所示，化合物vp的质谱(maldi-tof),m/z calcd.for c
28h33
in2:525.1767,found:525.1761[m+h]
+
.
[0045]
实施例2
[0046]
荧光探针对不同粘度的识别：
[0047]
将实施例1中制备的荧光探针vp配制成dmso母液，分别加入不同比例水-甘油体系中，稀释至待测浓度1μm，进行紫外和荧光光谱测定。如图8所示，随着溶液粘度的增大，探针的可见光吸收值和荧光强度具有明显增强。
[0048]
实施例3
[0049]
荧光探针对不同活性氧/活性氮的选择性：
[0050]
将实施例1中制备的荧光探针配制成dmso母液，分别加入100当量的
·o2-,clo-,h2o2,so23-,cys,gsh,no-2,onoo-,vc，分别用水和90％甘油-水混合液稀释至待测浓度4μm，对其荧光光谱测定(λ
ex
＝584nm)；根据其荧光强度，评估不同离子对荧光探针荧光强度的影响。结果如图9(a)所示，可知本发明的荧光探针vp在615nm处对活性氧或活性氮几乎不响应，而荧光强度只受粘度变化的影响。
[0051]
此外，将实施例1中制备的荧光探针配制成dmso母液，分别用不同溶剂稀释成浓度4μm的待测液，测定其荧光光谱，如图9(b)所示，探针只有在甘油中的荧光强度最强，而在其他溶剂中荧光强度很弱。以上实验证明，该探针对粘度具有明显的特异性。
[0052]
实施例4
[0053]
荧光探针在不同ph环境的性质：
[0054]
将实施例1中制备的荧光探针配制成dmso母液，分别用不同ph的pbs、40％甘油-不同ph的pbs、80％甘油-不同ph的pbs混合液稀释至待测浓度4μm，分别对其荧光光谱进行测定；根据其在615nm处的荧光强度变化，评估不同ph环境对其荧光强度的影响，结果如图9(c)所示。在ph为4-10范围内，探针荧光强度变化几乎不受ph环境的影响，说明该探针具有较好的稳定性。
[0055]
实施例5
[0056]
荧光探针线粒体定位实验：
[0057]
小胶质细胞(bv2细胞)用含10％fbs、1％青霉素-链霉素的高糖dmem培养基培养。实验前，将细胞接种于共聚焦培养皿中，于37℃、5％co2培养箱中培养24h，待其贴壁。移去培养基，用pbs洗涤3次后，加入mito-tracker green染料(10μm)和探针溶液(1μm)共同孵育1h。移去培养液，用pbs洗涤3次后，用4％多聚甲醛固定细胞后，进行共聚焦荧光成像。如图10所示，探针与线粒体染料具有较高的重合度，皮尔森系数达0.97，说明实施例1中制备的荧光探针vp具有线粒体特异的靶向能力。
[0058]
实施例6
[0059]
荧光探针在细胞中荧光成像实验：
[0060]
使用bv2细胞进行药物诱导实验。如图11(a)所示加探针vp(1μm)培养30min，可以看到红色荧光通道只有很弱的荧光；而当加入鱼藤酮(10μm)作用12h后，再加入探针vp(1μm)培养30min，如图11(b)，可以看到红色荧光通道荧光增强，由此说明鱼藤酮刺激细胞并导致细胞线粒体粘度增大，导致探针的荧光增强；在低温条件下，细胞的粘度也会增加，因此将细胞置于4℃下培养30min后，再加入探针vp(1μm)培养30min，如图11(c)，可以看到红色通道的荧光增强，同样证实了探针对粘度具有特异响应。
[0061]
实施例7
[0062]
荧光探针对细胞存活率的影响：
[0063]
将bv2细胞接种于96孔板中，加入不同浓度的探针溶液(其中设置对照组和空白组)，作用12h。移去探针溶液，加入mtt溶液继续培养4h。弃去mtt溶液，加入dmso，震荡15min。于酶标仪上测定490nm处的吸光度值，进而计算细胞存活率。如图12所示，实施例1中制备的荧光探针vp具有明显的低毒性。
[0064]
本发明说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领的技术人员理解本
发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
技术特征：1.一种线粒体靶向的粘度响应荧光探针，其特征在于：可以靶向检测线粒体中粘度变化，所述荧光探针的化学结构式为：2.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向的粘度响应荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤(1)在氮气保护下，将1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚-碘化鎓用甲苯溶解，然后加入碘乙烷回流反应；将反应液冷却过滤混合物，用正己烷洗涤，得到化合物3-乙基-1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚-3-碘化鎓。(2)在氮气保护下，将步骤(1)制备的3-乙基-1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚-3-碘化鎓和4-二乙氨基苯甲醛溶于乙醇中，加入四氢吡咯作为催化剂，回流反应，浓缩反应液并经柱层析分离得到荧光探针。3.根据权利要求2所述的一种线粒体靶向的粘度响应荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的3-乙基-1,1,2-三甲基-1h-苯并[e]吲哚-3-碘化鎓、4-二乙氨基苯甲醛溶于乙醇中和四氢吡咯的摩尔比为1:1.1:0.01。4.根据权利要求2所述的一种线粒体靶向的粘度响应荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中柱层析用洗脱剂是体积比为100～10:1的二氯甲烷与甲醇的混合物。5.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向的粘度响应荧光探针的应用，其特征在于：利用荧光探针法和荧光成像法检测细胞线粒体中粘度的变化。6.根据权利要求1所述的一种线粒体靶向的粘度响应荧光探针的应用，其特征在于：用于检测药物刺激前后细胞线粒体中粘度的变化。
技术总结本申请公开了一种线粒体靶向的粘度响应荧光探针的制备方法及应用，属于化学生物材料技术领域。针对大多数的探针缺乏生物靶向性的问题，本发明构建荧光探针由3-乙基-1,1,2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-碘化鎓和4-二乙氨基苯甲醛偶联制得，所制备探针能够靶向检测线粒体中粘度变化。该探针发射波长已到达红光区，不仅具有较强的生物穿透深度，还可以有效的消除细胞自荧光的干扰；对粘度变化具有较好的特异性，而且探针本身受pH环境影响较小，具有较好的稳定性；探针生物相容性好，具有高效检测溶液或生物体中粘度的潜力。溶液或生物体中粘度的潜力。溶液或生物体中粘度的潜力。
技术研发人员：刘文 任国栋 弓辉 温诞宁 马素芳 刁海鹏 张承武 王浩江 王斌 李丽红 郭丽霞 闫丽丽 武志芳
受保护的技术使用者：山西医科大学
技术研发日：2022.07.01
技术公布日：2022/11/1
