al.bioconjugate chem.2015,26(7):1198-1211。所以，需要从表面化学结构方面研究，开发一种简单的方法用于合成具备高效肿瘤渗透能力的纳米药物载体。
技术实现要素：3.本发明目的在于提供一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，该方法操作简单同时快速高通量的筛选出了具备高效肿瘤渗透能力的纳米药物载体。
4.本发明提供如下技术方案：
5.一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，包括如下步骤：
6.(3)表面氨基酸功能化树状大分子g5-aa的制备：将二异丙基乙二胺dipea和五氟苯酚活化的20种n-叔丁氧羰基-l-氨基酸boc-aa-opfp加入到第五代对称五甲炔花青染料树状大分子cy5-pll-g5的有机溶液中作为反应液，室温反应，再用三氟乙酸tfa脱保护得到20种表面氨基酸功能化的树枝状大分子；
7.(4)用无水乙醚对氨基酸功能化树状大分子进行纯化，得到20种纯化后的氨基酸功能化树状大分子g5-aa；
8.(3)将20种g5-aa分散在缓冲溶液中，并分别加入到96孔板的细胞中，在培养箱孵育，去上清加入新鲜的培养基，用酶标仪测试测试细胞的荧光强度，筛选出内吞能力最强的g5-aa为精氨酸功能化树枝大分子g5-r；
9.(4)将步骤(3)的96孔板中的细胞在培养箱继续孵育，去上清加入新鲜的培养基，用酶标仪测试测试细胞的荧光强度，筛选出外排能力最强的g5-aa为精氨酸功能化树枝大分子g5-r；
10.(5)将20种g5-aa分散在缓冲溶液中，并分别加入到96孔板的肿瘤球中，在培养箱孵育，用激光共聚焦显微镜成像观察并筛选出渗透能力最强的g5-aa为精氨酸功能化树枝大分子g5-r；
11.(6)将20种g5-aa分散在缓冲溶液中，分别通过瘤内注射直接注射到实体瘤中，用激光共聚焦显微镜实时观察瘤内渗透情况，进一步筛选出瘤内渗透能力最强的g5-aa为精氨酸功能化树枝大分子g5-r。
12.本发明以第五代对称五甲炔花青染料树状大分子(cy5-pll-g5)为载体，通过微量反应法在其表面分别修饰20种必需氨基酸构建分子库，并同时通过细胞的内吞和外排，肿瘤球及实体瘤的体内外高通量筛选法对其瘤内渗透能力进行了系统的研究从而筛选出了具备高效肿瘤渗透能力的精氨酸修饰的树状大分子(g5-r)。
13.优选地，在步骤(1)中，所述dipea、boc-aa-opfp、cy5-pll-g5的用量比为：6-10μl：20mg：2mg。
14.在步骤(1)中，所述20种boc-aa-opfp分别为：n-叔丁氧羰基-l-甘氨酸、n-叔丁氧羰基-l-丙氨酸、n-叔丁氧羰基-l-缬氨酸、n-叔丁氧羰基-l-亮氨酸、n-叔丁氧羰基-l-异亮氨酸、n-叔丁氧羰基-l-苯丙氨酸、n-叔丁氧羰基-l-色氨酸、n-叔丁氧羰基-l-酪氨酸、n-叔丁氧羰基-l-天冬氨酸、n-叔丁氧羰基-l-组氨酸、n-叔丁氧羰基-l-天冬酰胺、n-叔丁氧羰基-l-谷氨酸、n-叔丁氧羰基-l-赖氨酸、n-叔丁氧羰基-l-谷氨酰胺、n-叔丁氧羰基-l-甲硫氨酸、n-叔丁氧羰基-l-精氨酸、n-叔丁氧羰基-l-丝氨酸、n-叔丁氧羰基-l-苏氨酸、n-叔丁氧羰基-l-半胱氨酸、n-叔丁氧羰基-l-脯氨酸。
15.优选地，在步骤(1)中，室温反应2-12h。
16.优选地，在步骤(2)中，将冰浴的无水乙醚加入到步骤(1)的反应液中，无水乙醚与反应液体积比例为：1.5-1.8ml：100μl。
17.优选地，在步骤(3)中，96孔板中的细胞为mcf-7、hela、a549、bxpc-3、hepg2、nih3t3或者huvec。
18.优选地，在步骤(3)-(6)中，96孔板中细胞数量与g5-aa用量比为：4000-6000/孔：4μg的g5-aa/孔。
19.在步骤(6)中，所述实体瘤为裸鼠的耳朵肿瘤。
20.与现有技术相比，本发明的优点和有益效果：
21.1)瘤内渗透难是限制纳米药物疗效的关键难题，开展表面化学结构与肿瘤渗透能力相关性的研究，对于攻克重大疾病癌症具有极其重要的意义；
22.2)以结构精准型cy5-pll-g5树状大分子为研究载体，在实现对生物体荧光实时追踪的同时充分发挥了树状大分子相对于其它纳米载体的结构优势，即它精准的分子结构、以及高度的单分散性，同时规避了表面多功能化可控性差的弊端。结构明确的功能化树状大分子预期具有良好的批次可重复性、稳定的药动学性质，是一种更有前景且适合临床转化的方法；
23.3)该方法操作简单，构建了表面化学结构不同的树状大分子分子库，同时快速高通量的筛选出了具备高效肿瘤渗透能力的树状大分子，开发一种简单的方法用于合成具备高效肿瘤渗透能力的纳米药物载体。
附图说明
24.图1g5-r的制备方法。
25.图2cy5-pll-g5的化学结构式。
26.图3 20种必需氨基酸(aa)的化学结构式。
27.图4是不同的g5-aa与不同细胞共培养后的相对外排量(g5-g:g5-甘氨酸；g5-a:g5-丙氨酸；g5-v:g5-缬氨酸；g5-l:g5-亮氨酸；g5-i:g5-异亮氨酸；g5-f:g5-苯丙氨酸；g5-w:g5-色氨酸；g5-y:g5-酪氨酸；g5-d:g5-天冬氨酸；g5-h:g5-组氨酸；g5-n:g5-天冬酰胺；g5-e:g5-谷氨酸；g5-k:g5-赖氨酸；g5-q:g5-谷氨酰胺；g5-m:g5-甲硫氨酸；g5-r:g5-精氨酸；g5-s:g5-丝氨酸；g5-t:g5-苏氨酸；g5-c:g5-半胱氨酸；g5-p:g5-脯氨酸)。
28.图5是不同的g5-aa与bxpc-3肿瘤球共培养后的激光共聚焦成像结果。
29.图6是g5-r(g5-精氨酸)、g5-f(g5-苯丙氨酸)和g5-d(g5-天冬氨酸)小鼠耳朵模型瘤内渗透激光共聚焦成像结果。
具体实施方式
30.为了更为具体地描述本发明，下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案进行详细说明。但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
31.实施例1
32.一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，具体包括如下步骤：
33.1)表面氨基酸功能化树状大分子的制备，将(6μl)二异丙基乙二胺(dipea)和(20mg)五氟苯酚活化的20种n-叔丁氧羰基-l-氨基酸(boc-aa-opfp)加入到(2mg)第五代对称五甲炔花青染料树状大分子(cy5-pll-g5)的dmf溶液中，室温震荡反应2h；
34.2)表面氨基酸功能化树状大分子的纯化，将冰浴的无水乙醚(1.5ml)加入上述反应液中，离心沉淀，重复清洗三次，得到纯化的氨基酸功能化树状大分子(g5-aa)；
35.3)将纯化的g5-aa分散在ph＝7.4的磷酸缓冲溶液中，取4μg分别加入到96孔板(4000/孔)的细胞(细胞可以为mcf-7、hela、a549、bxpc-3、hepg2、nih3t3或者huvec)中，在培养箱孵育4h，去上清，加入新鲜的培养基，用酶标仪测试细胞的荧光强度，筛选出内吞能力最强的氨基酸功能化树状大分子；
36.4)将上述96孔板中的细胞在培养箱继续孵育12h，去上清加入新鲜的培养基，用酶标仪测试细胞的荧光强度，筛选出外排能力最强的氨基酸功能化树状大分子；
37.5)肿瘤球的制备：bxpc-3肿瘤球使用悬滴法制备。简而言之，将bxpc-3细胞悬液加入到200μl的1.2％甲基纤维素/rpmi-1640培养基中，以获得每毫升4
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106个细胞的细胞悬浮液。接下来，将25μl的上述细胞悬浮液轻轻接种到100mm细胞培养皿的盖子上，并重复共80-100个液滴。然后，将盖子慢慢翻过来放在培养皿上，加入10ml pbs以保持培养皿内的湿度。培养3天后，肿瘤球形成并转移到96孔板中，每孔用,60μl的1％琼脂糖预处理。最后，在每孔中加入150μl的rpmi-1640培养基以培养肿瘤球两天开展进一步实验。
38.将纯化的g5-aa分散在ph＝7.4的缓冲溶液中，6μl(1μm)分别加入到96孔板的肿瘤球中，在培养箱孵育4-6h，用激光共聚焦显微镜成像观察并筛选出渗透能力最强的氨基酸功能化树状大分子；
39.6)裸鼠耳朵肿瘤的构建：将1
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106个4t1-luc细胞皮下移植到balb/c小鼠耳朵上。待肿瘤长到肉眼可见大小，即可开展下一步实验。
40.将纯化的g5-aa分散在ph＝7.4的缓冲溶液中，取5μl(1μm)分别通过瘤内注射直接注射到裸鼠的耳朵肿瘤中，用激光共聚焦显微镜实时观察瘤内渗透情况，进一步筛选出瘤内渗透能力最强的氨基酸功能化树状大分子。
41.实施例2
42.一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，合成及筛选步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤1)将(7μl)二异丙基乙二胺(dipea)和(20mg)五氟苯酚活化的20种n-叔丁氧羰基-l-氨基酸(boc-aa-opfp)加入到(2mg)第五代对称五甲炔花青染料树状大分子(cy5-pll-g5)的dmf溶液。
43.最终制备的表面氨基酸功能化树状大分子的化学结构以及对具备高效肿瘤渗透能力树状大分子的高通量筛选结果与实施例1类同。
44.实施例3
45.一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，合成及筛选步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤1)将(8μl)二异丙基乙二胺(dipea)和(20mg)五氟苯酚活化的20种n-叔丁氧羰基-l-氨基酸(boc-aa-opfp)加入到(2mg)第五代对称五甲炔花青染料树状大分子(cy5-pll-g5)的dmf溶液。
46.最终制备的表面氨基酸功能化树状大分子的化学结构以及对具备高效肿瘤渗透能力树状大分子的高通量筛选结果与实施例1类同。
47.实施例4
48.一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，合成及筛选步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤1)将(9μl)二异丙基乙二胺(dipea)和(20mg)五氟苯酚活化的20种n-叔丁氧羰基-l-氨基酸(boc-aa-opfp)加入到(2mg)第五代对称五甲炔花青染料树状大分子(cy5-pll-g5)的dmf溶液。
49.最终制备的表面氨基酸功能化树状大分子的化学结构以及对具备高效肿瘤渗透能力树状大分子的高通量筛选结果与实施例1类同。
50.实施例5
51.一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，合成及筛选步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤1)将(10μl)二异丙基乙二胺(dipea)和(20mg)五氟苯酚活化的20种n-叔丁氧羰基-l-氨基酸(boc-aa-opfp)加入到(2mg)第五代对称五甲炔花青染料树状大分子(cy5-pll-g5)的dmf溶液。
52.最终制备的表面氨基酸功能化树状大分子的化学结构以及对具备高效肿瘤渗透能力树状大分子的高通量筛选结果与实施例1类同。
53.实施例6
54.一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，合成及筛选步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤1)室温震荡反应4h。
55.最终制备的表面氨基酸功能化树状大分子的化学结构以及对具备高效肿瘤渗透能力树状大分子的高通量筛选结果与实施例1类同。
56.实施例7
57.一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，合成及筛选步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤1)室温震荡反应6h。
58.最终制备的表面氨基酸功能化树状大分子的化学结构以及对具备高效肿瘤渗透能力树状大分子的高通量筛选结果与实施例1类同。
59.实施例8
60.一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，合成及筛选步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤1)室温震荡反应8h。
61.最终制备的表面氨基酸功能化树状大分子的化学结构以及对具备高效肿瘤渗透能力树状大分子的高通量筛选结果与实施例1类同。
62.实施例9
63.一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，合成及筛选步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤1)室温震荡反应12h。
64.最终制备的表面氨基酸功能化树状大分子的化学结构以及对具备高效肿瘤渗透能力树状大分子的高通量筛选结果与实施例1类同。
65.实施例10
66.一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，合成及筛选步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤2)将冰浴的无水乙醚(1.6ml)加入上述反应液中。
67.最终制备的表面氨基酸功能化树状大分子的化学结构以及对具备高效肿瘤渗透能力树状大分子的高通量筛选结果与实施例1类同。
68.实施例11
69.一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，合成及筛选步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤2)将冰浴的无水乙醚(1.7ml)加入上述反应液中。
70.最终制备的表面氨基酸功能化树状大分子的化学结构以及对具备高效肿瘤渗透能力树状大分子的高通量筛选结果与实施例1类同。
71.实施例12
72.一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，合成及筛选步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤2)将冰浴的无水乙醚(1.8ml)加入上述反应液中。
73.最终制备的表面氨基酸功能化树状大分子的化学结构以及对具备高效肿瘤渗透能力树状大分子的高通量筛选结果与实施例1类同。
74.实施例13
75.一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，合成及筛选步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤3)取4μg分别加入到96孔板(5000/孔)的细胞(mcf-7)中。
76.最终制备的表面氨基酸功能化树状大分子的化学结构以及对具备高效肿瘤渗透能力树状大分子的高通量筛选结果与实施例1类同。
77.实施例14
78.一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，合成及筛选步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤3)取4μg分别加入到96孔板(6000/孔)的细胞(mcf-7)中。
79.最终制备的表面氨基酸功能化树状大分子的化学结构以及对具备高效肿瘤渗透能力树状大分子的高通量筛选结果与实施例1类同。
技术特征：1.一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)表面氨基酸功能化树状大分子g5-aa的制备：将二异丙基乙二胺dipea和五氟苯酚活化的20种n-叔丁氧羰基-l-氨基酸boc-aa-opfp加入到第五代对称五甲炔花青染料树状大分子cy5-pll-g5的有机溶液中作为反应液，室温反应，再用三氟乙酸tfa脱保护得到20种表面氨基酸功能化的树枝状大分子；(2)用无水乙醚对氨基酸功能化树状大分子进行纯化，得到20种纯化后的氨基酸功能化树状大分子g5-aa；(3)将20种g5-aa分散在缓冲溶液中，并分别加入到96孔板的细胞中，在培养箱孵育，去上清加入新鲜的培养基，用酶标仪测试测试细胞的荧光强度，筛选出内吞能力最强的g5-aa为精氨酸功能化树枝大分子g5-r；(4)将步骤(3)的96孔板中的细胞在培养箱继续孵育，去上清加入新鲜的培养基，用酶标仪测试测试细胞的荧光强度，筛选出外排能力最强的g5-aa为精氨酸功能化树枝大分子g5-r；(5)将20种g5-aa分散在缓冲溶液中，并分别加入到96孔板的肿瘤球中，在培养箱孵育，用激光共聚焦显微镜成像观察并筛选出渗透能力最强的g5-aa为精氨酸功能化树枝大分子g5-r；(6)将20种g5-aa分散在缓冲溶液中，分别通过瘤内注射直接注射到实体瘤中，用激光共聚焦显微镜实时观察瘤内渗透情况，进一步筛选出瘤内渗透能力最强的g5-aa为精氨酸功能化树枝大分子g5-r。2.根据权利要求1所述的具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述dipea、boc-aa-opfp、cy5-pll-g5的用量比为：6-10μl：20mg：2mg。3.根据权利要求1所述的具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述20种boc-aa-opfp分别为：n-叔丁氧羰基-l-甘氨酸、n-叔丁氧羰基-l-丙氨酸、n-叔丁氧羰基-l-缬氨酸、n-叔丁氧羰基-l-亮氨酸、n-叔丁氧羰基-l-异亮氨酸、n-叔丁氧羰基-l-苯丙氨酸、n-叔丁氧羰基-l-色氨酸、n-叔丁氧羰基-l-酪氨酸、n-叔丁氧羰基-l-天冬氨酸、n-叔丁氧羰基-l-组氨酸、n-叔丁氧羰基-l-天冬酰胺、n-叔丁氧羰基-l-谷氨酸、n-叔丁氧羰基-l-赖氨酸、n-叔丁氧羰基-l-谷氨酰胺、n-叔丁氧羰基-l-甲硫氨酸、n-叔丁氧羰基-l-精氨酸、n-叔丁氧羰基-l-丝氨酸、n-叔丁氧羰基-l-苏氨酸、n-叔丁氧羰基-l-半胱氨酸、n-叔丁氧羰基-l-脯氨酸。4.根据权利要求1所述的具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，室温反应2-12h。5.根据权利要求2所述的具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，将冰浴的无水乙醚加入到步骤(1)的反应液中，无水乙醚与反应液体积比例为：1.5-1.8ml：100μl。6.根据权利要求1所述的具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，96孔板中的细胞为mcf-7、hela、a549、bxpc-3、hepg2、nih3t3或者huvec。
7.根据权利要求1所述的具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，其特征在于，在步骤(3)-(6)中，96孔板中细胞数量与g5-aa用量比为：4000-6000/孔：4μg的g5-aa/孔。8.根据权利要求1所述的具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体g5-r的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述实体瘤为裸鼠的耳朵肿瘤。
技术总结本发明公开了一种具备高效肿瘤渗透能力纳米药物载体G5-R的制备方法：以第五代对称五甲炔花青染料树状大分子Cy5-PLL-G5为载体，通过微量反应法在其表面分别修饰20种必需氨基酸构建分子库，并通过细胞的内吞和外排，肿瘤球及实体瘤的体内外高通量筛选法对其瘤内渗透能力进行了系统的研究从而筛选出了具备高效肿瘤渗透能力的精氨酸修饰的树状大分子G5-R。该方法操作简单，构建了表面化学结构不同的树状大分子分子库，同时快速高通量的筛选出了具备高效肿瘤渗透能力的树状大分子，解决了纳米药物载体瘤内渗透难的大难题。米药物载体瘤内渗透难的大难题。米药物载体瘤内渗透难的大难题。
技术研发人员：周珠贤 秦亚婷 王国伟 申有青
受保护的技术使用者：浙江大学杭州国际科创中心
技术研发日：2022.07.01
技术公布日：2022/11/1
