1.本发明属于查尔酮衍生物的合成及抗癌药物技术领域，具体涉及一种治疗食管癌的新型查尔酮衍生物及其制备方法和医药用途。
背景技术：2.食管癌是对人类生命健康危害极大的消化道恶性肿瘤，其死亡率在各种恶性肿瘤中居第二位。由于早期食管癌的临床症状不明显，难于发现，大多数食管癌患者在确诊时已为局部晚期或存在远处转移。目前临床上，所采用的常规治疗方法，如放疗、化疗和手术治疗在很大程度可延缓肿瘤的进展，然而这些疗法的副作用及局限性仍然很大且疗效难以维持。
3.在过去的几十年里，大量预防和治疗癌症的研究显示，一些来源于植物的分子化合物，已被证实具有多种生物活性，尤其是在改善患者临床症状、提高生存质量、延长生存期、控制病情发展等方面起到了重要作用。近几年，国际医药行业一直致力于寻找有效的天然植物药替代化学药物，国际天然植物药市场迅猛发展。二苯基丙烯酮，又名查尔酮，是合成黄酮类化合物的重要中间体，其广泛地存在于甘草、红花等药用植物中，许多文献已报道从天然产物中分离提取查尔酮。由于其分子结构具有较大的柔韧性，可以与不同的受体结合，因此具有较为广泛的生物活性，主要包括：抗氧化活性、抗菌活性、抗炎活性、抗艾滋病作用、抗疟疾作用和抗肿瘤活性。查尔酮类化合物作为新起之秀，具有不闭合软亲电类烯酮式结构，容易与生物体中的巯基发生软亲核反应，但是并不与细胞核中dna或者核酸积极反应，所以会很大程度降低突变或者致癌的风险。以上这些能够保证查尔酮类化合物在不对人体正常细胞有损害的前提下，最大程度地发挥抗肿瘤作用，作为从天然药物中提取出来的小分子化合物，在对抗肿瘤的过程中起着较高的活性作用。
4.之前研究发现，很多查尔酮类化合物与trail联合应用抑制细胞的克隆增殖，在人类肺癌细胞a549中可以通过上调dr-5而显示出抑制细胞的生存能力，然而，它们对于抑制ec109细胞的增殖并不具有较好的作用。正是因为如此，查尔酮的衍生物才会不断地通过设计、合成和提取分离，使其在抗癌活性的研究中发挥出更大的作用。研究表明，与天然查尔酮提取物相较，查尔酮类衍生物的b环经过取代基取代，a环由较大的疏水基团取代，在α位引入甲基等，所合成的一系列查尔酮衍生物的抗肿瘤活性明显提高，选择性更高，表现出较好的高效低毒特性。然而，目前未见本查尔酮衍生物治疗食管癌的相关研究报道。
技术实现要素：5.本发明解决的技术问题是提供了一种治疗食管癌的新型查尔酮衍生物及其制备方法，该方法制备的新型查尔酮衍生物ch-19对食管鳞状细胞癌kyse-450细胞和eca-109 细胞均显示了强有力的抑瘤效果，故能够进一步用于制备治疗食管癌的新型药物。
6.本发明为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种治疗食管癌的新型查尔酮衍
生物，其特征在于该新型查尔酮衍生物的结构通式为：
[0007][0008]
其中r1为-och3，r2为h，r3为-och3，r4为h，r5为-och3，r1’
为h，r2’
为h， r3’
为-no2，r4’
为h，r5’
为h。
[0009]
本发明所述的治疗食管癌的新型查尔酮衍生物的制备方法，其特征在于具体步骤为：将芳香族苯乙酮类化合物和取代苯甲醛类化合物混合溶解在甲醇溶剂中，于室温搅拌后加入氢氧化钠溶液，继续搅拌反应直至反应完全，分离沉淀物，用水和冷甲醇洗涤，干燥，以无水乙醇重结晶得到新型查尔酮衍生物，制备过程中对应的反应方程式为：
[0010][0011]
其中r1为-och3，r2为h，r3为-och3，r4为h，r5为-och3，r1’
为h，r2’
为h， r3’
为-no2，r4’
为h，r5’
为h。
[0012]
进一步限定，所述芳香族苯乙酮类化合物、取代苯甲醛类化合物与氢氧化钠的投料摩尔比为1:1～1.2:2～4。
[0013]
本发明所述的治疗食管癌的新型查尔酮衍生物在制备治疗或/和预防食管癌药物中的应用。
[0014]
进一步限定，所述食管癌为食管鳞状细胞癌，食管鳞状细胞为kyse-450细胞或 eca-109细胞。
[0015]
本发明与现有技术相比具有以下优点和有益效果：本发明首次将合成的新型查尔酮衍生物ch-19用于治疗食管癌，特别是食管鳞状细胞癌。体外试验表明，该新型查尔酮衍生物ch-19对食管鳞状细胞癌kyse-450细胞和eca-109细胞均显示了强有力的抑瘤效果，其治疗效果呈剂量依赖性。体内试验表明，该新型查尔酮衍生物ch-19在食管癌 kyse-450细胞荷瘤小鼠模型上显示了显著的抑制肿瘤进展的效果。
附图说明
[0016]
图1为实施例1中合成的20种新型查尔酮衍生物的ic
50
值的测定图。
[0017]
图2为实施例2中kyse-450细胞(a)和eca-109细胞(b)凋亡水平测定图。
[0018]
图3为实施例2中kyse-450细胞(a)和eca-109细胞(b)凋亡比例分析图。
[0019]
图4为实施例3中kyse-450细胞(a)和eca-109细胞(b)周期变化测定图。
[0020]
图5为实施例3中kyse-450细胞(a)和eca-109细胞(b)周期比例分析图。
[0021]
图6为本发明实施例4中高、低剂量查尔酮衍生物ch-19对接种有kyse-450细胞的荷瘤小鼠的体内抑制效应曲线。
[0022]
图7为本发明实施例5中接受了高、低剂量查尔酮衍生物ch-19治疗后，从食管癌
kyse-450细胞荷瘤小鼠中取出肿瘤称重分析。
[0023]
图8为本发明实施例6中不同剂量查尔酮衍生物ch-19用药的毒性测试实验结果。
[0024]
图3、图5～图8中，*、**和***表示不同处理组之间的差异具有统计学意义，*表示p《0.05，**表示p《0.01，***表示p《0.001。
具体实施方式
[0025]
以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。
[0026]
实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。本发明中涉及的术语：escc：食管鳞状细胞癌细胞；cck-8：活细胞计数试剂盒8。以下实施例中使用的cck-8试剂购自dojindo公司。
[0027]
实施例1
[0028]
新型查尔酮衍生物的设计、合成及筛选
[0029][0030]
用芳香醛和相应的苯乙酮在甲醇中通过碱催化的claisen schmidt缩合反应制备了 20种新的查尔酮衍生物(表s1)。具体过程为：将芳香族苯乙酮类化合物(10mmol) 和不同取代苯甲醛类化合物(10mmol)混合溶解在甲醇溶剂(20ml)中，在室温下搅拌，再缓慢加入40％(w(g)/v(ml))氢氧化钠水溶液(3ml)。反应混合物搅拌过夜，用薄层色谱(tlc)监测，反应完成后分离沉淀物，用水和冷甲醇洗涤，干燥，以无水乙醇重结晶得到查尔酮衍生物1-20，收率为70％-90％。查尔酮衍生物1-20的结构经1h 和
13
c核磁共振(nmr)确证。
[0031]
表s1
[0032][0033]
取生长状态良好的kyse-450细胞和eca-109细胞，以每孔5
×
103个均匀铺于96 孔细胞培养板中，于37℃、体积分数为5％co2孵箱中培养24h；设置20种不同查尔酮衍生物处理组。每孔加入一种不同的查尔酮衍生物，并作三次重复；待药物处理后，加入cck-8试剂显色。于imark酶标仪450nm波长下读值，计算细胞生长抑制率ic
50
。
[0034]
实验结果如图1所示，图1为20种新型查尔酮衍生物的ic
50
。图中纵坐标为不同衍生物的ic
50
值，横坐标为20种不同的查尔酮衍生物。实验结果表明，衍生物ch-19 治疗食管癌kyse-450细胞和eca-109细胞较之其它19种衍生物组显示了更显著的抑制生长效果。
[0035]
实施例2
[0036]
新型查尔酮衍生物ch-19诱导食管癌细胞发生凋亡
[0037]
取生长状态良好的kyse-450细胞和eca-109细胞以5
×
106个/孔均匀铺到6孔板中。对各孔中的细胞分别进行以下四种处理：(1)0.1wt％dmso(control)；(2)5μm 的查尔酮衍生物ch-19；(3)10μm的查尔酮衍生物ch-19；(4)20μm的查尔酮衍生物ch-19。处理条件为37℃、体积分数5％co2孵育48小时。然后用膜联蛋白(annexinv)和碘化丙啶(pi)进行染色，利用流式细胞仪测定凋亡细胞比例。
[0038]
实验结果如图2和图3所示，图2为kyse-450细胞(a)和eca-109细胞(b) 凋亡水平测定图，图3为kyse-450和eca-109细胞凋亡比例分析图。查尔酮衍生物 ch-19处理组凋亡细胞的比例明显高于空白对照组。因此，经查尔酮衍生物ch-19处理后导致细胞凋亡比例的提升进一步解释了该新型查尔酮衍生物ch-19抑制食管癌 kyse-450细胞和eca-109细胞生长的作用机理。
[0039]
实施例3
[0040]
新型查尔酮衍生物ch-19促进食管癌细胞周期阻滞在g2/m期
[0041]
取生长状态良好的kyse-450细胞和eca-109细胞以5
×
106个/孔均匀铺到6孔板
中。对各孔中的细胞分别进行以下四种处理：(1)0.1wt％dmso(control)；(2)5μm 的查尔酮衍生物ch-19；(3)10μm的查尔酮衍生物ch-19；(4)20μm的查尔酮衍生物ch-19。处理条件为37℃、体积分数为5％co2孵育48小时。然后用膜联蛋白(annexinv)和碘化丙啶(pi)进行染色，利用流式细胞仪测定细胞周期变化。
[0042]
实验结果如图4和图5所示，图4为kyse-450细胞(a)和eca-109细胞(b) 周期变化测定图，图5为kyse-450细胞和eca-109细胞周期比例分析图。经查尔酮衍生物ch-19处理后，药物处理组较之空白对照组g2/m期细胞比例呈剂量依赖性增加。因此，经查尔酮衍生物ch-19处理后导致细胞周期比例的提升进一步解释了该新型查尔酮衍生物ch-19抑制食管癌kyse-450细胞和eca-109细胞生长的作用机理。
[0043]
实施例4
[0044]
新型查尔酮衍生物ch-19用于体内抑制肿瘤细胞生长
[0045]
以食管癌kyse-450细胞腋下接种balb/c nude雌性裸鼠，在接种肿瘤细胞后待肿瘤组织达到100mm3大小，静脉注射以下3组小鼠，每组5只小鼠：(1)空白对照组 (control)(15mg/kg)；(2)低剂量查尔酮衍生物ch-19组(50mg/kg)；(3)高剂量查尔酮衍生物ch-19组(100mg/kg)。其中高、低剂量查尔酮衍生物ch-19的给药方式均为每周给药三次，共给药四周。给药过程中，每隔两日观察肿瘤生长情况，测量肿瘤大小和重量以评价药物的抑瘤作用。实验结果如图6和图7所示，图6中纵坐标为肿瘤体积，横坐标为天数。图7中纵坐标为给药结束后取出肿瘤称重后的重量，横坐标为不同处理组。实验结果表明，新型查尔酮衍生物ch-19的高、低剂量组均较之空白对照组在食管癌kyse-450细胞荷瘤小鼠模型上显示了更显著的抑制肿瘤进展的效果，其差异皆有统计学意义。
[0046]
实施例5
[0047]
新型查尔酮衍生物ch-19的毒性测试实验
[0048]
在对荷瘤裸鼠进行给药过程中，我们对三个处理组的荷瘤小鼠的体重变化情况进行了监测以评估联合用药的非特异性毒性，包括以下三个处理组：(1)空白对照组 (control)(15mg/kg)；(2)低剂量查尔酮衍生物ch-19组(50mg/kg)；(3)高剂量查尔酮衍生物ch-19组(100mg/kg)。实验结果如图8所示，结果表明，高、低剂量查尔酮衍生物ch-19组小鼠平均体重较之空白对照组均未有明显减轻，即两种药物的联合用药并不存在潜在毒性。
[0049]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
技术特征：1.一种治疗食管癌的新型查尔酮衍生物，其特征在于该新型查尔酮衍生物的结构通式为：其中r1为-och3，r2为h，r3为-och3，r4为h，r5为-och3，r1’
为h，r2’
为h，r3’
为-no2，r4’
为h，r5’
为h。2.一种权利要求1所述的治疗食管癌的新型查尔酮衍生物的制备方法，其特征在于具体步骤为：将芳香族苯乙酮类化合物和取代苯甲醛类化合物混合溶解在甲醇溶剂中，于室温搅拌后加入氢氧化钠溶液，继续搅拌反应直至反应完全，分离沉淀物，用水和冷甲醇洗涤，干燥，以无水乙醇重结晶得到新型查尔酮衍生物，制备过程中对应的反应方程式为：其中r1为-och3，r2为h，r3为-och3，r4为h，r5为-och3，r1’
为h，r2’
为h，r3’
为-no2，r4’
为h，r5’
为h。3.根据权利要求2所述的治疗食管癌的新型查尔酮衍生物的制备方法，其特征在于：所述芳香族苯乙酮类化合物、取代苯甲醛类化合物与氢氧化钠的投料摩尔比为1:1～1.2:2～4。4.权利要求1所述的治疗食管癌的新型查尔酮衍生物在制备治疗或/和预防食管癌药物中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述食管癌为食管鳞状细胞癌，食管鳞状细胞为kyse-450细胞或eca-109细胞。
技术总结本发明公开了一种治疗食管癌的新型查尔酮衍生物及其制备方法和应用，该新型查尔酮衍生物的结构通式为：，其中R1为-OCH3，R2为H，R3为-OCH3，R4为H，R5为-OCH3，R1’
技术研发人员：杨赟 杨妍 葛春坡 周贝 武贺 康言
受保护的技术使用者：新乡医学院
技术研发日：2022.07.18
技术公布日：2022/11/1
