一种促进b.subtilis内血红素生物合成的方法
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，涉及基因修饰的应用及其获得的菌株，尤其涉及一种促进b.subtilis内血红素生物合成的方法。
背景技术：2.血红素是一类重要的含铁卟啉化合物，具有重要的生理功能和实用价值。血红素作为电子传递蛋白、血红蛋白、肌红蛋白、过氧化物酶、过氧化氢酶等的辅基，在生物体内参与电子转移、活性氧分解、底物氧化、基因表达调控等多种生化反应。血红素在食品行业常被用于着色剂，替代发色剂亚硝酸盐及人工合成色素，减少亚硝酸盐的致癌作用，保证食品的安全；在医学临床领域，是制备血卟啉衍生物药物的主要原料，也是半合成胆红素的原料。血红素还是现代医学公认的防治缺铁性贫血、吸收率高、效果好的生物铁源，是天然的人体补铁剂。血红素的生产方法包括：动物血液提取法、化学合成法和微生物发酵法，由于微生物发酵法具有生产工艺简单、生产成本低、环境污染小等特点而更具发展优势。
3.在微生物体内，谷氨酸经碳五(c5)途径或甘氨酸和琥珀酰coa碳四(c4)途径合成5-氨基乙酰丙酸(ala)；后者依次经ala脱水酶hemb、胆色素原脱氨酶hemc、尿卟啉原ⅲ合成酶hemd催化生成尿卟啉原ⅲ；尿卟啉原ⅲ经原卟啉依赖性(protoporphyrin-dependent，ppd)途径或粪卟啉依赖性(coproporphyrin-dependent，cpd)途径生成血红素。胞内游离血红素过多，会破坏蛋白质和核酸结构、膜通透性以及细胞的氧化还原平衡，因此，血红素在微生物体内的合成受到严格调控。另外，微生物体内也存在血红素的降解途径，即血红素经加氧酶催化降解为胆绿素ixα。
4.近些年，国内外科学家们对大肠杆菌(escherichia coli)和谷氨酸棒杆菌(corynebacterium glutamicum)内血红素的生物合成路径进行了详细研究，并通过阻断血红素的胞内降解、促进血红素的分泌来提高细胞合成血红素的能力。zhao等以e.coli为底盘，采用三质粒表达系统在强化c5途径、尿卟啉原ⅲ合成途径及ppd途径的同时，敲除血红素降解酶基因yfex，并表达血红素外运蛋白ccmabc，构建的重组菌血红素产量为239.2
±
7.2mg/l，其中胞外血红素产量为151.4
±
5.6mg/l。ko等以c.glutamicum为底盘，采用三质粒表达系统在表达异源c4途径、强化内源c5途径和cpd途径、阻断血红素胞内降解的同时，表达血红素外运蛋白hrtba和白喉毒素阻遏蛋白dtxr，缺陷结合血红素的膜蛋白hrrs、htaa、hmut，构建的重组菌血红素产量为309.18
±
16.43mg/l，其中胞外血红素产量为242.95
±
11.45mg/l，这是迄今为止微生物发酵生产血红素产量最高的报道。
5.e.coli分泌内毒素，不能应用于食品行业；c.glutamicum细胞内游离血红素的浓度受到两个双组份系统(hrrsa和chrsa)的调控，机制较复杂；而且相关研究均是采用质粒表达关键基因，发酵时需要加入抗生素，增加了工业化应用时的成本。而枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)是医药、食品行业常见的工程菌，通常被认为是安全的(generally recognized as safe，gras)，具有良好的表达和分泌系统、良好的环境相容性和基因工程适应性，可通过简单廉价的培养方法进行大规模发酵，广泛应用于医药、食品、农业及工业
领域，但到目前为止，还未见关于工程改造b.subtilis生产血红素的相关研究。因此，我们首次以b.subtilis为底盘，对其基因组进行改造，以期构建高产血红素的b.subtilis工程菌。本发明以实验室已构建的枯草芽孢杆菌重组菌bsh6为出发菌，通过强化尿卟啉原ⅲ合成途径，即过表达hemcdb操纵子，考察其对血红素合成的影响；通过改造下游合成路径，即过表达ccmabc，敲除nasf、hmoa和hmob，考察其对血红素合成的影响；最后通过分批补料发酵，提高血红素的发酵水平。
技术实现要素：6.本发明提供一种促进b.subtilis内血红素生物合成的方法，旨在解决现有技术存在的问题。
7.本发明是这样实现的，一种促进b.subtilis内血红素生物合成的方法，包括以下步骤：
8.s1、整合表达hemcdb：获得p
laps-hemcdb在gcvtp位点整合表达的重组菌株bsh7；
9.s2、摇瓶发酵培养及菌体生长情况的测定：培养并发酵活化的单菌落并测定发酵液去上清后的菌悬液的od
600
值；
10.s3、实时定量反转录pcr分析：取步骤s2中的发酵液，收集菌体，处理后并计算获得待测基因hema、hemd、hemh、hemq的相对表达量；
11.s4、血红素的荧光检测：取步骤s2中的发酵液，处理并计算获得血红素的总合成量；
12.s5、整合表达异源ccmabc：在b.subtilis基因组上的ywji位点整合表达e.coli的ccmabc；获得p
laps-ccmabc在ywji位点整合表达的重组菌株bsh8；
13.s6、敲除nasf：基于重组菌株bsh8获得nasf敲除菌株bsh9；
14.s7、敲除hmoa：基于菌株bsh9获得hmoa敲除菌株bsh10；
15.s8、敲除hmob：基于菌株bsh10获得hmob敲除菌株bsh11；
16.s8、分批补料发酵：从平板上挑取新活化的单菌落接入装有5ml lb液体培养基的试管中，37℃、200r/min振荡培养12h；按1％接种量转接至装有100ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，37℃、200r/min振荡培养12h；按10％接种量转接至装有900ml发酵培养基的2l发酵罐中，发酵温度为37℃，初始通气量为3l/min，初始转速300rpm，开始关联转速与溶氧，溶氧控制在40％；当转速升到1000rpm以后，固定转速，关联通气、补料与溶氧，使溶氧控制在40％，整个发酵工程中用1mol/l的naoh控制ph维持在7.0附近；
17.生物量的测定：分别于发酵4h、8h、12h、24h、28h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h、168h取1ml发酵液，离心去上清，用水将细胞沉淀洗涤后重悬、稀释适当倍数，测定菌悬液的od
600
值；
18.s9、血红素的hplc检测：每间隔24h取样2ml，12000rpm离心5min，上清液稀释适当倍数后进行hplc检测，用于测定胞外血红素含量；细胞沉淀用10ml 1mol/l naoh溶解并振荡混匀，超声破碎10min，用hcl将ph调节至7.0左右后，离心取上清进行hplc检测，用于测定胞内血红素含量。
19.优选的，在步骤s1中，获得p
laps-hemcdb在gcvtp位点整合表达的重组菌株bsh7，具体包括：
u1/ywji-g2将片段upad、cr和g拼接成片段upadcrg；
34.将片段upadcrg转化受体菌bsh7的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得p
laps-ccmabc在ywji位点整合表达的重组菌株bsh8。
35.优选的，在步骤s6中，敲除nasf，具体包括：
36.在b.subtilis内，尿卟啉原ⅲ既可经脱羧酶heme催化生成粪卟啉原ⅲ，参与血红素的合成；也可经甲基转移酶nasf催化生成前咕啉-2，参与西罗血红素的合成；
37.以b.subtilis 168的基因组为模板，分别用引物nasf-u1/nasf-u2、nasf-d1q/nasf-d2、nasf-g1q/nasf-g2扩增片段u、d、g；以bs168num的基因组为模板，用引物nasf-cr1q/nasf-cr2扩增片段cr；
38.然后通过重叠pcr方法，利用引物nasf-u1/nasf-d2，将片段u和d拼接成片段ud；再利用引物nasf-u1/nasf-g2将片段ud、cr和g拼接成片段udcrg；
39.最后将片段udcrg转化受体菌bsh8的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得nasf敲除菌株bsh9。
40.优选的，在步骤s7中，敲除hmoa，具体包括：
41.以b.subtilis 168的基因组为模板，分别用引物hmoa-u1/hmoa-u2、hmoa-d1q/hmoa-d2、hmoa-g1q/hmoa-g2扩增片段u、d、g；以bs168num的基因组为模板，用引物hmoa-cr1q/hmoa-cr2扩增片段cr；然后通过重叠pcr方法，利用引物hmoa-u1/hmoa-d2，将片段u和d拼接成片段ud(2438bp)；再利用引物hmoa-u1/hmoa-g2将片段ud、cr和g拼接成片段udcrg；最后将片段udcrg转化受体菌bsh9的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得hmoa敲除菌株bsh10。
42.优选的，在步骤s8中，敲除hmob，具体包括：
43.以b.subtilis 168的基因组为模板，分别用引物hmob-u1/hmob-u2、hmob-d1q/hmob-d2、hmob-g1q/hmob-g2扩增片段u、d、g；以bs168num的基因组为模板，用引物hmob-cr1q/ywji-cr2扩增片段cr；然后通过重叠pcr方法，利用引物hmob-u1/hmob-d2，将片段u和d拼接成片段ud；再利用引物hmob-u1/hmob-g2将片段ud、cr和g拼接成片段udcrg；最后将片段udcrg转化受体菌bsh10的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得hmob敲除菌株bsh11。
44.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的一种促进b.subtilis内血红素生物合成的方法，首先通过整合表达hemcdb操纵子，考察工程改造尿卟啉原ⅲ合成途径对菌株生长和血红素合成的影响；然后通过表达异源ccmabc、敲除nasf、hmoa和hmob，考察工程改造下游合成途径对菌株生长和血红素合成的影响；最后分别以蔗糖和葡萄糖为碳源进行分批补料发酵，提高血红素的发酵水平，为将来工业上通过合成生物学手段构建高效合成血红素的枯草芽孢杆菌细胞工厂和血红素的高密度发酵提供基础研究和理论依据。
附图说明
45.图1为本发明的b.subtilis内血红素的生物合成途径及工程改造策略示意图。
具体实施方式
46.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并
不用于限定本发明。
47.本发明公开了一种工程改造尿卟啉原ⅲ合成途径和下游合成途径促进b.subtilis内血红素生物合成的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
48.ala是血红素合成的重要前体物，实验室前期以bs168n为出发菌，通过敲除负调控因子基因hemx、整合表达谷氨酰-trna还原酶基因hema、敲除编码主要的谷氨酸脱氢酶的基因rocg、整合表达慢生型大豆根瘤菌(bradyrhizobium japonicum，accession：abd39319)的ala合成酶基因alas，构建了重组菌bsh54。在b.subtilis内，ala依次经ala脱水酶hemb、胆色素原脱氨酶hemc、尿卟啉原ⅲ合成酶hemd催化生成尿卟啉原ⅲ；后者经尿卟啉原ⅲ脱羧酶heme催化生成粪卟啉原ⅲ，粪卟啉原ⅲ可以经粪卟啉依赖性(coproporphyrin-dependent，cpd)途径即依次经原卟啉原氧化酶hemy、原卟啉铁螯合酶hemh、粪血红素脱羧酶hemq催化生成血红素，也可以经原卟啉依赖性(protoporphyrin-dependent，ppd)即依次经原卟啉原ⅲ氧化酶hemf、原卟啉原氧化酶hemy、原卟啉铁螯合酶hemh催化生成血红素，其中，cpd途径是b.subtilis合成血红素的主要途径。尿卟啉原ⅲ除用于血红素的合成外，还可经甲基转移酶nasf催化生成前咕啉-2，进而生成西罗血红素。此外，b.subtilis内存在两种血红素单加氧酶hmoa(hmoa也称为yetg)和hmob(hmob也称为yhgc)，催化血红素的降解途径，即氧化血红素生成胆绿素ixα。然而，尚不清晰b.subtilis内血红素的分泌机制。
49.本发明以bsh54为出发菌，首先通过整合表达hemcdb操纵子，考察工程改造尿卟啉原ⅲ合成途径对菌株生长和血红素合成的影响；然后通过表达异源ccmabc、敲除nasf、hmoa和hmob，考察工程改造下游合成途径对菌株生长和血红素合成的影响；最后分别以蔗糖和葡萄糖为碳源进行分批补料发酵，提高血红素的发酵水平，为将来工业上通过合成生物学手段构建高效合成血红素的枯草芽孢杆菌细胞工厂和血红素的高密度发酵提供基础研究和理论依据。
50.本发明实施例所采用的实验材料如下：
51.菌株、质粒和培养基：
52.本发明涉及的所有菌株和质粒信息详见表1。引物由genscript公司合成。
53.lb培养基：胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l，用于b.subtilis或e.coli的一般培养。固体培养基添加15g/l琼脂粉，需要时加入新霉素16μg/ml，或氯霉素8μg/ml，或氨苄青霉素100μg/ml。
54.发酵培养基：蔗糖40g/l，胰蛋白胨4g/l，(nh4)2so
4 15g/l，kh2po
4 5g/l，na2hpo4·
12h2o 15g/l，mgso4·
7h2o 0.5g/l，feso4·
7h2o 7.5mg/l，ph自然。
55.表1实验中涉及的菌株和质粒
[0056][0057][0058]
涉及的试剂及仪器如下：
[0059]2×
phanta flash master mix(dye plus)、2
×
taq master mix(dye plus)、fastpure cell/tissue total rna isolation kit v2、hiscriptⅲrt supermix for qpcr(+gdna wiper)、chamq universal sybr qpcr master mix均购自南京诺唯赞(vazyme)生物科技股份有限公司；标准品ala和血红素购自sigma-aldrich(usa)；其余生化试剂为国产分析纯试剂。所用仪器：酶标仪(thermo)、高效液相色谱仪(agilent)、lightcycler 480(roche)。
[0060]
用于pcr的引物见表2。
[0061]
表2 pcr引物序列
[0062]
[0063][0064]
工程改造尿卟啉原ⅲ合成途径和下游合成途径促进b.subtilis内血红素生物合成的方法大致如下：
[0065]
dna操作：所有dna片段都来自pcr扩增；用于转化的dna片段均采用重叠pcr方法拼接而成。b.subtilis感受态细胞的制备及转化采用spizizen方法。本实验采用的无标记基因修饰原理详见专利10557890.4(宋浩；杨绍梅；曹英秀；张国银；蔡志刚；基因过表达及获得的菌株、应用,2021-3-9,中国,2018)。
[0066]
请参阅图1，其为b.subtilis内血红素的生物合成途径及工程改造策略示意图，其中，整合表达的酶：hema，谷氨酰trna还原酶；alas，5-氨基乙酰丙酸合成酶；hemb，5-氨基乙酰丙酸脱水酶；hemc，胆色素原脱氨酶；hemd，尿卟啉原ⅲ合成酶；ccmabc，血红素外运蛋白。缺陷的酶：rocg，谷氨酸脱氢酶；gcvtp，甘氨酸降解系统酶；nasf，尿卟啉原ⅲ甲基转移酶；hmoa、hmob，血红素单加氧酶
[0067]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0068]
实施例1整合表达hemcdb
[0069]
在b.subtilis内，八分子ala依次经hemb、hemc、hemd催化生成一分子尿卟啉原ⅲ，这三个酶的基因在基因组上串联在一起：hemc-hemd-hemb。本发明拟整合表达hemcdb操纵子，考察其对菌株生长和血红素合成的影响。本发明首先以b.subtilis 168的基因组为模板，分别用引物gcvtp-u1/gcvtp-hemcdb-u2、gcvtp-hemcdb-1q/gcvtp-hemcdb-2、gcvtp-hemcdb-t1q/gcvtp-hemcdb-t2扩增片段u(如seq id no.58所示，1474bp)、含有hemcdb操纵子片段b(如seq id no.60所示，2695bp)、含有pyre终止子的片段t(如seq id no.61所示，278bp)；以质粒puc57-1.8k-p1为模板，用引物gcvtp-hemcdb-p1q/gcvtp-hemcdb-p2扩增含有组成型强启动子p
laps
的片段p(如seq id no.59所示，442bp)；以bsh54tpm的基因组为模板，用引物gcvtp-hemcdb-d1q/gcvtp-hemcdb-g2扩增片段dcrg(如seq id no.62所示，4448bp)。然后通过重叠pcr方法，利用引物gcvtp-hemcdb-p1q/gcvtp-hemcdb-t2，将片段p、b和t拼接成片段pbt(3396bp)；再利用引物gcvtp-u1/gcvtp-hemcdb-g2将片段u、pbt和dcrg拼接成片段upbtdcrg(如seq id no.63所示，9318bp)。最后将片段upbtdcrg转化受体菌bsh54的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得p
laps-hemcdb在gcvtp位点整合表达的重组菌株bsh7。利用引物cx-hemcdb-1/cx-hemcdb-2和cx-hemcdb-3/cx-hemcdb-4进行测序，无额外点突变。
[0070]
实施例2摇瓶发酵培养及菌体生长情况的测定
[0071]
摇瓶发酵：从平板上挑取新活化的单菌落接入装有5ml lb液体培养基的试管中，37℃、200r/min振荡培养12h；按1％接种量转接至装有30ml发酵培养基的250ml锥形瓶中，37℃、220r/min振荡培养36h。
[0072]
生物量的测定：分别于发酵6h、12h、24h、36h取0.5ml发酵液，离心去上清，用水将细胞沉淀洗涤后重悬、稀释适当倍数，测定菌悬液的od
600
值。
[0073]
表3发酵培养基及发酵条件
[0074]
参数范围蔗糖20～80g/l胰蛋白胨2～8g/l(nh4)2so410～20g/lkh2po
4 5g/l2～10g/lna2hpo4·
12h2o10～20g/l
mgso4·
7h2o0.2～1g/lfeso4
·
7h2o 7.5mg/l2.5～10mg/lph自然6.0～7.0发酵温度35～45℃转速100～250r/min发酵时间24-72h
[0075]
实施例3实时定量反转录pcr分析
[0076]
取24h的发酵液1ml，离心收集菌体。首先利用fastpure cell/tissue total rna isolation kit v2提取细菌总rna；然后根据hiscriptⅲrt supermix for qpcr(+gdna wiper)试剂盒说明加入反应体系进行反转录得到cdna；最后根据chamq universal sybr qpcr master mix说明加入反应体系进行荧光定量pcr，得到ct值，根据2
‑△△
ct
法分别计算待测基因hema、hemd、hemh、hemq的相对表达量，本发明以ccpa为内参基因。
[0077]
实施例4血红素的荧光检测
[0078]
取0.5ml发酵液(三个平行，同时取0.5ml初始发酵培养基作空白对照)，加入500μl 20mmol/l草酸，4℃条件下静置16h。然后加入500μl 2mol/l草酸，混匀后，取一半置于95℃条件下加热30min(用于卟啉和血红素总浓度荧光值的检测)；另一半置于常温(用于卟啉浓度荧光值的检测)。冷却至室温后，离心取上清加入黑色96孔板中，在激发波长为400nm、发射波长为662nm的荧光下检测。两组分别减去空白对照同样处理后的荧光值后，再相减的差值即为血红素浓度对应的荧光值，对照血红素标准曲线计算出血红素的总合成量。
[0079]
实施例5工程改造尿卟啉原ⅲ合成途径对菌株生长和血红素合成的影响
[0080]
八分子ala依次经hemb、hemc、hemd催化生成一分子尿卟啉原ⅲ，编码这三个酶的基因在基因组上串联在一起：hemc-hemd-hemb，并位于hemaxcdbl操纵子内。因此，本发明采用强启动子p
laps
和pyre的终止子在bsh54基因组上的gcvtp位点整合表达表达hemcdb，得到重组菌株bsh7。发酵结果显示hemcdb的过表达使得菌株生长较对照菌bsh6略有增加(表4)。提取对照菌bsh6和重组菌bsh7的总rna，反转录后进行荧光定量pcr，结果显示hemd的mrna转录水平提高约11.9倍(表5)，说明利用p
laps
启动子过表达hemd是有效的；另外，c5途径的基因hema及下游合成路径的基因hemh和hemq的转录水平较对照菌中分别提高约11.7倍、114.4倍和1.2倍，说明hemcdb操纵子的过表达，促进了尿卟啉原ⅲ的合成，既提高了上游途径关键基因的转录，又加速了下游尿卟啉原ⅲ到血红素的转化，进而促进了下游合成途径基因的转录。发酵36h后的血红素总合成量为12.10
±
0.70μmol/l，较对照菌仅提高38.6％(表6)。血红素产量增加不明显，分析可能是胞内血红素积累过多对细胞有毒，限制了血红素的过量合成。
[0081]
表4菌株生长情况
[0082]
发酵时间(h)od
600
(bsh6)od
600
(bsh7)63.53
±
0.594.28
±
0.66126.35
±
0.237.56
*
±
1.362411.55
±
0.2512.29
*
±
0.743612.22
±
0.7912.83
±
1.06
[0083]
注：
*
示与bsh6相比具有显著差异(p＜0.05)。
[0084]
表5基因的相对转录水平
[0085][0086]
注：
*
示与bsh6相比具有显著差异(p＜0.05)；
#
示与bsh6相比具有极显著差异(p＜0.01)。
[0087]
表6发酵36h后的血红素总合成量
[0088]
菌株c(血红素的总合成量)(μmol/l)bsh68.73
±
0.33bsh712.10
*
±
0.70
[0089]
注：*示与bsh6相比具有显著差异(p＜0.05)。
[0090]
实施例6整合表达异源ccmabc
[0091]
胞内血红素积累过多对细胞有毒，因此如何促进血红素的分泌成为提高细胞血红素合成能力的关键。zhao的研究表明e.coli的ccmabc具有血红素分泌功能，因此，本发明拟在b.subtilis基因组上的ywji位点整合表达e.coli的ccmabc。首先以b.subtilis 168的基因组为模板，分别用引物ywji-u1/ywji-ccm-u2q、ywji-ccm-d1q/ywji-d2、ywji-g1q/ywji-g2扩增片段u(如seq id no.64所示，1230bp)、d(如seq id no.66所示，1064bp)、g(如seq id no.68所示，603bp)。以质粒puc57-1.8k-p1为模板，用引物ywji-ccm-p1/gcvtp-hemcdb-p2扩增含有组成型强启动子p
laps
的片段p(如seq id no.59所示，442bp)。以e.coli的基因组为模板，用引物ywji-ccm-1q/ywji-ccm-2扩增含有ccma-ccmb-ccmc基因的片段a(如seq id no.65所示，2160bp)，并将ccma的起始密码子由gug变成aug；由于要连接在ccmabc基因后面的片段d中含有ywji基因的终止子序列，故本研究中不再加入终止子序列。以bs168num的基因组为模板，用引物ywji-cr1q/ywji-cr2扩增片段cr(如seq id no.67所示，2089bp)。然后通过重叠pcr方法，利用引物ywji-ccm-p1/ywji-ccm-2，将片段p和a拼接成片段pa(2602bp)；再利用引物ywji-u1/ywji-d2将片段u、pa和d拼接成片段upad(4896bp)；最后利用引物ywji-u1/ywji-g2将片段upad、cr和g拼接成片段upadcrg(如seq id no.69所示，7588bp)。将片段upadcrg转化受体菌bsh7的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得p
laps-ccmabc在ywji位点整合表达的重组菌株bsh8。利用引物cx-hemcdb-1/cx-ccm-2/ywji-ccm-2进行测序，无额外点突变。
[0092]
实施例7敲除nasf
[0093]
在b.subtilis内，尿卟啉原ⅲ既可经脱羧酶heme催化生成粪卟啉原ⅲ，参与血红素的合成；也可经甲基转移酶nasf催化生成前咕啉-2，参与西罗血红素的合成。因此，本发明拟敲除nasf基因，阻断尿卟啉原ⅲ的竞争性消耗途径，以促进血红素的合成。本发明首先以b.subtilis 168的基因组为模板，分别用引物nasf-u1/nasf-u2、nasf-d1q/nasf-d2、nasf-g1q/nasf-g2扩增片段u(如seq id no.70所示，1155bp)、d(如seq id no.71所示，1487bp)、g(如seq id no.73所示，990bp)；以bs168num的基因组为模板，用引物nasf-cr1q/nasf-cr2扩增片段cr(如seq id no.72所示，2136bp)。然后通过重叠pcr方法，利用引物nasf-u1/nasf-d2，将片段u和d拼接成片段ud(2642bp)；再利用引物nasf-u1/nasf-g2将片
段ud、cr和g拼接成片段udcrg(如seq id no.74所示，5768bp)。最后将片段udcrg转化受体菌bsh8的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得nasf敲除菌株bsh9。
[0094]
实施例8敲除hmoa
[0095]
b.subtilis内存在两种血红素单加氧酶hmoa(也称为yetg)和hmob(也称为yhgc)，催化血红素的降解途径，即氧化血红素生成胆绿素ixα。为减少血红素的胞内降解，本发明选择敲除hmoa基因。首先以b.subtilis 168的基因组为模板，分别用引物hmoa-u1/hmoa-u2、hmoa-d1q/hmoa-d2、hmoa-g1q/hmoa-g2扩增片段u(如seq id no.75所示，1254bp)、d(如seq id no.76所示，1184bp)、g(如seq id no.78所示，646bp)；以bs168num的基因组为模板，用引物hmoa-cr1q/hmoa-cr2扩增片段cr(如seq id no.77所示，2136bp)。然后通过重叠pcr方法，利用引物hmoa-u1/hmoa-d2，将片段u和d拼接成片段ud(2438bp)；再利用引物hmoa-u1/hmoa-g2将片段ud、cr和g拼接成片段udcrg(如seq id no.79所示，5220bp)。最后将片段udcrg转化受体菌bsh9的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得hmoa敲除菌株bsh10。
[0096]
实施例9敲除hmob
[0097]
为减少血红素的胞内降解，本发明选择敲除hmob基因。首先以b.subtilis168的基因组为模板，分别用引物hmob-u1/hmob-u2、hmob-d1q/hmob-d2、hmob-g1q/hmob-g2扩增片段u(如seq id no.80所示，1126bp)、d(如seq id no.81所示，1289bp)、g(如seq id no.83所示，741bp)；以bs168num的基因组为模板，用引物hmob-cr1q/ywji-cr2扩增片段cr(如seq id no.82所示，2089bp)。然后通过重叠pcr方法，利用引物hmob-u1/hmob-d2，将片段u和d拼接成片段ud(2415bp)；再利用引物hmob-u1/hmob-g2将片段ud、cr和g拼接成片段udcrg(如seq id no.84所示，5245bp)。最后将片段udcrg转化受体菌bsh10的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得hmob敲除菌株bsh11。
[0098]
实施例10工程改造下游合成途径对菌株生长和血红素合成的影响
[0099]
为促进胞内游离血红素的分泌，本发明在重组菌bsh7基因组上的ywji位点利用强启动子p
laps
整合表达e.coli的具有血红素分泌功能的ccmabc，得到重组菌株bsh8，结果表明菌株生长有所下降(表7)，且血红素合成量下降约27％(表8)。分析可能是表达的异源膜蛋白ccmabc参与呼吸链的电子传递，破坏了细胞的氧化还原平衡，从而影响菌株生长及血红素合成，也可能是采用250ml锥形瓶进行发酵，体积太小、溶氧受限导致其发酵效果不佳。
[0100]
尿卟啉原ⅲ除用于血红素的合成外，还可经甲基转移酶nasf催化生成前咕啉-2，进而生成西罗血红素。因此，本发明选择敲除nasf基因，以期阻断尿卟啉原ⅲ的竞争性消耗途径，得到菌株bsh9，发酵结果表明血红素产量增加约11％(表8)。b.subtilis内存在两种血红素单加氧酶hmoa(也称为yetg)和hmob(也称为yhgc)，催化血红素的降解途径，即氧化血红素生成胆绿素ixα。为减少血红素的胞内降解，本发明又依次敲除hmoa和hmob基因，分别得到单基因敲除菌株bsh10和双基因敲除菌株bsh11。结果表明菌株生长稍微有所改善(表7)；血红素总合成量分别增加26和34％，分别为12.49
±
1.12μmol/l和13.54
±
1.11μmol/l(表8)。以上结果表明阻断尿卟啉原ⅲ的竞争性消耗和血红素的胞内降解均有利于血红素的合成。
[0101]
表7菌株生长情况
[0102][0103]
注：*示与bsh7相比具有显著差异(p＜0.05)。
[0104]
表8发酵36h后的血红素总合成量
[0105]
菌株c(血红素的总合成量)(μmol/l)bsh712.10
±
0.70bsh88.87
±
0.78
#
bsh99.89
±
0.87
*
bsh1012.49
±
1.12bsh1113.54
±
1.11
[0106]
注：*示与bsh7相比具有显著差异(p＜0.05)；#示与bsh7相比具有极显著差异(p＜0.01)。
[0107]
实施例11分批补料发酵培养及菌体生长情况的测定
[0108]
分批补料发酵：从平板上挑取新活化的单菌落接入装有5ml lb液体培养基的试管中，37℃、200r/min振荡培养12h。按1％接种量转接至装有100ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，37℃、200r/min振荡培养12h。按10％接种量转接至装有900ml发酵培养基的2l发酵罐中，发酵温度为37℃，初始通气量为3l/min，初始转速300rpm，开始关联转速与溶氧，溶氧控制在40％；当转速升到1000rpm以后，固定转速，关联通气、补料与溶氧，使溶氧控制在40％，整个发酵工程中用1mol/l的naoh控制ph维持在7.0附近。
[0109]
生物量的测定：分别于发酵4h、8h、12h、24h、28h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h、168h取1ml发酵液，离心去上清，用水将细胞沉淀洗涤后重悬、稀释适当倍数，测定菌悬液的od
600
值。
[0110]
表9发酵培养基及发酵条件
[0111]
参数范围蔗糖(或葡萄糖)20～80g/l胰蛋白胨2～8g/l(nh4)2so410～20g/lkh2po
4 5g/l2～10g/lna2hpo4·
12h2o10～20g/lmgso4·
7h2o0.2～1g/lfeso4
·
7h2o 7.5mg/l2.5～10mg/lph自然6.5～7.5发酵温度35～45℃转速200～1000r/min发酵时间72-192h溶氧30～60％
通气量2～5l/min
[0112]
表10补料培养基
[0113]
参数范围蔗糖(或葡萄糖)200～800g/l胰蛋白胨20～80g/l
[0114]
实施例12血红素的hplc检测
[0115]
每间隔24h取样2ml，12000rpm离心5min，上清液稀释适当倍数后进行hplc检测，用于测定胞外血红素含量；细胞沉淀用10ml 1mol/l naoh溶解并振荡混匀，超声破碎(开5s；关5s)10min，用hcl将ph调节至7.0左右后，离心取上清进行hplc检测，用于测定胞内血红素含量。
[0116]
hplc检测条件：zorbax sb-c18色谱柱(250mm
×
4.6mm,5μm,agilent)，紫外检测波长400nm，进样量20μl，柱温40℃。流动相a：含有0.1％的三氟乙酸；流动相b，甲醇。流速0.4ml/min，梯度洗脱：0～1min，30％b；2～19min，从30％b上升到100％b；20～21min，从100％b下降到30％b；21～35min，30％b。
[0117]
实施例13分批补料发酵对菌株生长、血红素合成及分泌的影响
[0118]
在2l发酵罐中对最终重组菌bsh11进行补料分批发酵，发酵过程中逐渐加入400g/l蔗糖和40g/l胰蛋白胨进行补料，菌株生长情况见表11。由于血红素是初级代谢产物，随着菌株的生长，血红素产量逐渐增加，发酵液的颜色随着发酵时间的延长逐渐变红。hplc测定发酵144h和168h后的血红素总合成量分别为163.93
±
0.46μmol/l(106.87
±
0.30mg/l)和231.26
±
0.91μmol/l(150.77
±
0.59mg/l)，其中分泌到胞外的血红素含量分别为148.09
±
0.01μmol/l(96.55
±
0.01mg/l)和212.30
±
0.79μmol/l(138.41
±
0.51mg/l)，分别占总合成量的90％和92％。zhao等构建的e.coli重组菌的血红素产量为239.2
±
7.2mg/l，其中胞外血红素产量为151.4
±
5.6mg/l，占总合成量的63％；ko等构建的c.glutamicum重组菌的血红素产量为309.18
±
16.43mg/l，其中胞外血红素产量为242.95
±
11.45mg/l，占总合成量的79％。虽然本发明的血红素总合成量低于上述研究构建的重组菌，但是血红素分泌率高达90％。
[0119]
由于zhao和ko的研究均是以葡萄糖为碳源进行分批补料发酵，因此本发明也用葡萄糖代替蔗糖进行发酵，补料培养基为400g/l葡萄糖和40g/l胰蛋白胨。在整个发酵过程中，菌株bsh11的生长速度高于以蔗糖为碳源时的发酵(表11)，而且胞内血红素含量差异不大(表12)。在发酵120h内，分泌到胞外的血红素含量明显高于以蔗糖为碳源时的发酵；但是发酵144h和168h后胞外血红素的含量分别为89.98
±
5.76μmol/l和118.72
±
0.48μmol/l(表12)，分别比以蔗糖为碳源时低39％和44％。上述结果表明，葡萄糖和蔗糖作为发酵碳源时均能促进血红素的合成和分泌，而蔗糖的效果更好。
[0120]
表11分别以蔗糖和葡萄糖为碳源进行分批补料发酵时菌株bsh11的生长情况
[0121]
发酵时间(h)od
600
(蔗糖为碳源)od
600
(葡萄糖为碳源)43.22
±
0.052.72
±
0.1685.31
±
0.037.40
±
0.031210.76
±
0.2817.55
±
0.132417.66
±
0.1427.80
±
0.17
2820.49
±
0.2130.29
±
0.113629.10
±
0.3041.80
±
0.994837.50
±
1.6236.54
±
0.366032.13
±
1.0643.50
±
0.177233.90
±
0.1740.71
±
1.238432.82
±
1.8734.83
±
2.169643.02
±
0.6844.79
±
0.9810836.66
±
1.0248.18
±
2.2912046.30
±
2.8851.53
±
1.2913245.75
±
1.7452.20
±
2.4614451.57
±
1.4858.62
±
2.4216862.88
±
0.2552.80
±
2.55
[0122]
表12发酵36h后的血红素总合成量
[0123][0124]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种促进b.subtilis内血红素生物合成的方法，其特征在于：包括以下步骤：s1、整合表达hemcdb：获得p
laps-hemcdb在gcvtp位点整合表达的重组菌株bsh7；s2、摇瓶发酵培养及菌体生长情况的测定：培养并发酵活化的单菌落并测定发酵液去上清后的菌悬液的od
600
值；s3、实时定量反转录pcr分析：取步骤s2中的发酵液，收集菌体，处理后并计算获得待测基因hema、hemd、hemh、hemq的相对表达量；s4、血红素的荧光检测：取步骤s2中的发酵液，处理并计算获得血红素的总合成量；s5、整合表达异源ccmabc：在b.subtilis基因组上的ywji位点整合表达e.coli的ccmabc；获得p
laps-ccmabc在ywji位点整合表达的重组菌株bsh8；s6、敲除nasf：基于重组菌株bsh8获得nasf敲除菌株bsh9；s7、敲除hmoa：基于菌株bsh9获得hmoa敲除菌株bsh10；s8、敲除hmob：基于菌株bsh10获得hmob敲除菌株bsh11；s8、分批补料发酵：从平板上挑取新活化的单菌落接入装有5ml lb液体培养基的试管中，37℃、200r/min振荡培养12h；按1％接种量转接至装有100ml发酵培养基的500ml锥形瓶中，37℃、200r/min振荡培养12h；按10％接种量转接至装有900ml发酵培养基的2l发酵罐中，发酵温度为37℃，初始通气量为3l/min，初始转速300rpm，开始关联转速与溶氧，溶氧控制在40％；当转速升到1000rpm以后，固定转速，关联通气、补料与溶氧，使溶氧控制在40％，整个发酵工程中用1mol/l的naoh控制ph维持在7.0附近；生物量的测定：分别于发酵4h、8h、12h、24h、28h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h、168h取1ml发酵液，离心去上清，用水将细胞沉淀洗涤后重悬、稀释适当倍数，测定菌悬液的od
600
值；s9、血红素的hplc检测：每间隔24h取样2ml，12000rpm离心5min，上清液稀释适当倍数后进行hplc检测，用于测定胞外血红素含量；细胞沉淀用10ml 1mol/l naoh溶解并振荡混匀，超声破碎10min，用hcl将ph调节至7.0左右后，离心取上清进行hplc检测，用于测定胞内血红素含量。2.如权利要求1所述的一种促进b.subtilis内血红素生物合成的方法，其特征在于：在步骤s1中，获得p
laps-hemcdb在gcvtp位点整合表达的重组菌株bsh7，具体包括：以b.subtilis168的基因组为模板，分别用引物gcvtp-u1/gcvtp-hemcdb-u2、gcvtp-hemcdb-1q/gcvtp-hemcdb-2、gcvtp-hemcdb-t1q/gcvtp-hemcdb-t2扩增片段u、含有hemcdb操纵子片段b、含有pyre终止子的片段t；以质粒puc57-1.8k-p1为模板，用引物gcvtp-hemcdb-p1q/gcvtp-hemcdb-p2扩增含有组成型强启动子p
laps
的片段p；以bsh54tpm的基因组为模板，用引物gcvtp-hemcdb-d1q/gcvtp-hemcdb-g2扩增片段dcrg；然后通过重叠pcr方法，利用引物gcvtp-hemcdb-p1q/gcvtp-hemcdb-t2，将片段p、b和t拼接成片段pbt；再利用引物gcvtp-u1/gcvtp-hemcdb-g2将片段u、pbt和dcrg拼接成片段upbtdcrg；最后将片段upbtdcrg转化受体菌bsh54的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得p
laps-hemcdb在gcvtp位点整合表达的重组菌株bsh7。3.如权利要求1所述的一种促进b.subtilis内血红素生物合成的方法，其特征在于：在步骤s2中，摇瓶发酵培养及菌体生长情况的测定，具体包括；摇瓶发酵：从平板上挑取新活化的单菌落接入装有5mllb液体培养基的试管中，37℃、
d2、nasf-g1q/nasf-g2扩增片段u、d、g；以bs168num的基因组为模板，用引物nasf-cr1q/nasf-cr2扩增片段cr；然后通过重叠pcr方法，利用引物nasf-u1/nasf-d2，将片段u和d拼接成片段ud；再利用引物nasf-u1/nasf-g2将片段ud、cr和g拼接成片段udcrg；最后将片段udcrg转化受体菌bsh8的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得nasf敲除菌株bsh9。8.如权利要求1所述的一种促进b.subtilis内血红素生物合成的方法，其特征在于：在步骤s7中，敲除hmoa，具体包括：以b.subtilis 168的基因组为模板，分别用引物hmoa-u1/hmoa-u2、hmoa-d1q/hmoa-d2、hmoa-g1q/hmoa-g2扩增片段u、d、g；以bs168num的基因组为模板，用引物hmoa-cr1q/hmoa-cr2扩增片段cr；然后通过重叠pcr方法，利用引物hmoa-u1/hmoa-d2，将片段u和d拼接成片段ud(2438bp)；再利用引物hmoa-u1/hmoa-g2将片段ud、cr和g拼接成片段udcrg；最后将片段udcrg转化受体菌bsh9的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得hmoa敲除菌株bsh10。9.如权利要求1所述的一种促进b.subtilis内血红素生物合成的方法，其特征在于：在步骤s8中，敲除hmob，具体包括：以b.subtilis 168的基因组为模板，分别用引物hmob-u1/hmob-u2、hmob-d1q/hmob-d2、hmob-g1q/hmob-g2扩增片段u、d、g；以bs168num的基因组为模板，用引物hmob-cr1q/ywji-cr2扩增片段cr；然后通过重叠pcr方法，利用引物hmob-u1/hmob-d2，将片段u和d拼接成片段ud；再利用引物hmob-u1/hmob-g2将片段ud、cr和g拼接成片段udcrg；最后将片段udcrg转化受体菌bsh10的感受态细胞，经过两步筛选，最终获得hmob敲除菌株bsh11。
技术总结本发明适用于生物技术领域，提供了一种促进B.subtilis内血红素生物合成的方法，以实验室已构建的产血红素的B.subtilis BSH6为出发菌，首先对尿卟啉原Ⅲ合成途径进行工程改造；即整合表达hemCDB操纵子，考察其对菌株生长和血红素合成的影响；然后对血红素下游合成途径进行改造，即整合表达异源的血红素分泌蛋白基因ccmABC、敲除尿卟啉原Ⅲ甲基转移酶基因nasF、血红素单加氧酶基因hmoA和hmoB，考察其对菌株生长和血红素合成的影响；最后分别以蔗糖和葡萄糖为碳源进行分批补料发酵，提高血红素的发酵水平。本发明为将来工业上通过合成生物学手段构建高效合成血红素的枯草芽孢杆菌细胞工厂和血红素的高密度发酵提供了基础研究和理论依据。究和理论依据。究和理论依据。
技术研发人员：杨绍梅 王安龙 李佳昌 邵云航
受保护的技术使用者：山东理工大学
技术研发日：2022.07.15
技术公布日：2022/11/1
