1.本发明涉及基因工程及肿瘤学技术领域，具体来说，涉及一种用于局部晚期食管鳞癌放疗疗效预测的标志物及其应用与试剂盒。
背景技术：2.globpcan2018数据显示，2018年有57.2万人新诊断为食管癌，50.9万人死于食管癌，在所有肿瘤中分别排在第七位和第六位。在我国，食管癌是发病率和死亡率均位居前四位的肿瘤。中国的食管癌有其特有的疾病谱，西方国家十几年来腺癌的发病率不断提高，而中国仍以鳞癌为主要的病理类型，占90％以上。
3.食管癌起病隐匿，且由于筛查普及性不足，65％的食管癌在诊断时往往已经发展到局部晚期(t3,t4/n+)甚至晚期。放射治疗在食管癌的综合治疗中占有重要地位。对于局部晚期不可手术食管癌，标准治疗是rtog-8501确立的50.4gy的同步放化疗，患者5年生存率仅为26％，随着三维适形调强放疗的应用，其5年生存提高到34％
–
45.6％。然而rtog-8501的长期随访结果显示，同步放化疗/放疗的失败模式均以局部失败为主(原发肿瘤：25-37％，区域淋巴结13-16％)，这说明50.4gy的放疗剂量并不可以使所有患者获得满意的局部区域控制率，在不增加副反应的情况下，原发灶可能需要接受更高的放疗剂量。因此，对于不同食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，escc)患者可能存在不同的放疗敏感性，在治疗开始前或治疗中获得可以预测放疗疗效的指标，将有助于将escc分为不同的敏感类型，优化临床治疗决策。
4.制定个体化治疗方案的前提是对不同预后的患者作出区分。对于接受新辅助治疗的食管癌患者，术后病理获得病理完全反应(pcr)或降期的患者无病生存及总生存率高于无治疗反应或大体肿瘤残留的患者，因此术前同步放化疗后如果临床完全缓解，非手术治疗也可作为一种选择，可减少手术创伤，提高患者生活质量。然而目前仍缺乏足够准确的方法定义“放化疗后完全缓解”，给临床治疗决策带来了困难。由于食管是软组织构成的空腔脏器，临床现有的主要手段中，ct受限于软组织分辨率不佳，mri受限于食管自身蠕动和心脏大血管搏动的影响，而食管镜对壁外病变观察不佳，食管造影在测量上精度不足，如何在放疗后准确判定临床完全缓解仍然面临巨大的挑战。虽然可以通过食管镜下“多点活检”的方式获得病理诊断，但其因预测效果灵敏度较差及有创操作的原因，在临床中难以得到广泛应用，因此患者往往需要接受创伤较大的手术，通过术后病理才能证实pcr。至少两项随机研究的结果显示同步放化疗后做或不做手术两种方式患者生存无差异，表明手术尽管提高了局部控制，并未提高患者生存。在功能影像方面，pet-ct尽管在肺癌、淋巴瘤的疗效评价中显示出较好的预测作用，但一项纳入了697例食管癌患者的系统性综述认为现有研究结果十分矛盾，不能将pet-ct作为食管癌疗效评价的标准方法。因此，临床上急需更加精准、便捷的放疗疗效判断“工具”，对患者的放疗疗效进行判断，为患者提供更加适合的治疗手段。
5.另一方面，对于不可切除的局部晚期escc，同步放化疗是标准治疗方式。对于这部分患者，大部分通过放化疗都无法获得r0手术的机会，而且，即使后续进行手术，两项前瞻性随机研究也显示根治性同步放化疗与同步放化疗加手术治疗在疗效和生活质量方面没有显著差异。但是，对于能够获得长期生存的患者，胸部放疗剂量过高容易带来心肺损伤，少数患者可能出现食管狭窄，远期治疗相关并发症成为不可忽视的问题。因此，如何提高放疗的个体化治疗水平，根据患者对放疗的敏感程度制定合理的剂量，使得这部分患者在取得长期生存的前提下，维持更好的生活质量，是临床上关注的热点。食管癌根治性放疗的剂量目前存在很大的争议，国际指南往往依据既往的int 0123研究将50.4gy设定为标准剂量，该研究在同步放化疗的治疗模式下开展，结果显示50.4gy与64.8gy相比，局部控制或总生存均无显著差异，2022年发表的一项前瞻性iii期研究也表明，同步放化疗60gy的放疗剂量与50gy相比，不可以改善疾病控制。但在其它类型的肿瘤中，有大量研究显示剂量提高有利于肿瘤控制并改善生存，而且针对escc也有大量回顾性研究显示提高剂量可以提高疗效。
6.综上，在escc的综合治疗中，寻找更为有效的放疗疗效评价和预测标志物是解决放疗剂量个体化问题的关键所在。食管癌镜下活检取材量有限，且临床上反复进行难度较大，而液体活检技术在标本获取便捷、创伤性小方面有巨大优势，目前已在直肠癌、肺癌等瘤种中显示出良好的疗效评价和预测作用，是临床转化研究的热点。
7.mirna是一类长度很短的非编码单链小分子rna，由一段具有发夹环结构的长度为70-80nt的单链rna前体(pre-mirna)剪切后生成。它通过与其目标mrna分子的3’端非编码区域(3
’‑
untranslated region，3’utr)互补匹配导致该mrna分子的翻译受到抑制。超过50％的人类mirna基因定位在染色体的脆性位点，而这些区域在肿瘤的发生发展过程中容易扩增、缺失、或转位，这提示mirna的异常和肿瘤相关，mirna表达谱对肿瘤的诊断和预后有很好的应用价值。此外，越来越多的证据表明mirna在许多人类癌症中表达失调，并作为肿瘤抑制因子或促肿瘤因子参与肿瘤调节作用，这可能为癌症的诊断和治疗提供新的机会。
技术实现要素：8.针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种用于局部晚期食管鳞癌放疗疗效预测的标志物及其应用与试剂盒，能够克服现有技术的上述不足。
9.为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：
10.一种用于局部晚期食管鳞癌放疗疗效预测的标志物，包括mir-143-3p和mir-223-3p。
11.根据本发明的另一方面，提供了一种用于局部晚期食管鳞癌放疗疗效预测的试剂盒，包括mir-143-3p的引物和mir-223-3p的引物。
12.本发明还提供了一种所述标志物在制备用于局部晚期食管鳞癌放疗疗效预测的试剂盒中的应用。
13.进一步的，所述应用包括：
14.(1)提取待测样品的rna，进行逆转录反应，得到cdna；
15.(2)加入mir-143-3p、mir-223-3p及内参的引物，将步骤(1)得到的cdna分别进行
实时定量pcr反应；
16.(3)计算目的基因在待测样品中的相对含量，所述目的基因包括mir-143-3p、mir-223-3p。
17.进一步的，所述实时定量pcr反应的反应条件如下：
18.95℃dna聚合酶活化15min；94℃变性15s，55℃退火30s，70℃延伸30s，40个循环。
19.本发明的有益效果：本发明首次发现疗前、放疗中mir-143-3p和mir-223-3p的动态表达水平与食管癌患者接受放疗后的预后相关，可作为食管癌放疗中外周血动态监测指标，为mir-143-3p和mir-223-3p成为疗效预测的有效生物学标志物和潜在治疗靶点提供了依据，指导临床局部晚期食管鳞癌的个体化治疗；通过血标本预测疗效，具有无创性、准确性高等特点，mir-143-3p和mir-223-3p的联合预测准确性为82.5％。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
21.图1是根据本发明实施例所述的筛选食管癌放疗敏感性关键差异mirna的示意图；
22.图2是对放疗敏感与抵抗患者疗前、疗中外周血标本小rna测序结果得到4个候选基因的示意图；
23.图3是根据本发明实施例所述的全组患者总生存和无进展生存的示意图；
24.图4是根据本发明实施例所述的放疗敏感组及抵抗组的总生存(os)示意图；
25.图5是根据本发明实施例所述的放疗敏感组及抵抗组的无进展生存(pfs)示意图；
26.图6是根据本发明实施例所述的候选mirna动态变化对放疗敏感性的预测示意图之一；
27.图7是根据本发明实施例所述的候选mirna动态变化对放疗敏感性的预测示意图之二；
28.图8是根据本发明实施例所述的mir-143-3p&mir-223-3p联合预测效果的总生存示意图；
29.图9是根据本发明实施例所述的mir-143-3p&mir-223-3p联合预测效果的无进展生存示意图；
30.图10是根据本发明实施例所述的总生存roc曲线；
31.图11是根据本发明实施例所述的无进展生存roc曲线。
具体实施方式
32.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.如图1所示，本发明通过建立ec放疗敏感与抵抗患者回顾性队列，通过转录组测序
技(rna-seq)寻找2组患者放疗前、中外周血差异表达mirna，通过定量pcr进一步检测其在患者外周血中动态表达情况，预测患者的疗效及预后，结合患者长期随访的预后数据，综合评估mirna预后判断的准确性。
34.研究方法如下：
35.入选标准：
36.(1)≥18岁；
37.(2)卡氏评分(kps)≥70分；
38.(3)
ⅱ‑ⅳ
b期(非远转)食管鳞癌；
39.(4)根治性放疗/放化疗；
40.(5)无诱导化疗。
41.样本收集：
42.(1)采集疗前、疗中外周血；
43.(2)外周血标本离心，分离血清，置于-80℃冰箱保存；
44.(3)收集临床资料并随访；
45.(4)筛选候选mirna。
46.放疗抵抗定义：治疗结束后病变持续3个月以上或1年内复发。
47.具体的操作步骤如下：
48.(1)血浆rna的提取
49.a、0.25ml血浆加入0.75ml of trizol
tm
ls试剂(invitrogen
tm
货号：10296010)，样品混匀。
50.b、4℃10000
×
g离心10分钟，取上清。
51.c、加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15-30s，静置2-3min。
52.d、4℃离心，12000g
×
15min。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。rna主要在水相中，水相体积约为所用trizol试剂的60
℅
，即大约600μl。
53.e、小心吸取上清至新1.5ml ep管中，加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。
54.f、4℃离心，12000g
×
10min。
55.g、弃上清，于沉淀中加入75％乙醇(冰冷)1ml，振摇，充分洗涤沉淀。
56.h、4℃离心，12000g
×
5min。
57.i、弃上清，短暂离心，小心吸取弃去上清。
58.j、加入适量(20μl)rnasefree h20溶解rna。
59.k、nanodrop检测rna浓度。
60.(2)rt-pcr扩增
61.使用miscript ii rt kit(50)[miscript ii逆转录试剂盒(50)](qiagen货号：218161)。
[0062]
如表1所示，配制逆转录反应体系(以20μl反应体系为例，反应液的配制在冰上进行)。
[0063]
表1逆转录反应体系
[0064][0065]
将反应体系轻柔混匀后，进行逆转录反应，条件如下：37℃60min，95℃5min，4℃，-20℃保存cdna产物。
[0066]
(3)实时定量pcr(real-time pcr)
[0067]
使用miscriptgreen pcr kit(1000)[定量pcr试剂盒(1000)](qiagen货号：218075)。
[0068]
候选基因设计引物如表2所示。
[0069]
表2候选基因设计引物
[0070][0071]
qpcr结果证实引物为特异性引物。
[0072]
如表3所示，配制qpcr反应体系(以20μl反应体系为例，反应液的配制在冰上进行)。
[0073]
表3 qpcr反应体系
[0074][0075][0076]
进行pcr反应，程序如表4所示：
[0077]
表4 pcr反应程序
[0078][0079]
将各样品目的mirna和内参基因(mir-191-5p)分别进行real-time pcr反应，每个样品设置3个复孔。前期研究已表明在细胞、组织水平常用的内参u6并不适合作为血样样本的内参。基于我们rna-seq结果分析以及前期小样本验证，发现mir-191-5p为食管癌患者血样高丰度mirna，且在样本间的表达水平波动幅度较小，另外，已有研究表明mir-191-5p可作为血样样本的内参mirna(hu z,dong j,wang le,ma h,liu j,zhao y,tang j,chen x,dai j,wei q,zhang c,shen h.serum microrna profiling and breast cancer risk:the use of mir-484/191as endogenous controls.carcinogenesis.2012apr；33(4):828-34.doi:10.1093/carcin/bgs030.pmid:22298638.)。
[0080]
(4)相对含量计算
[0081]
计算目的基因在待测样品中的相对含量。
[0082]
同一位患者；
[0083]
疗前待测样品(a)：δcta＝cta(目的基因)-cta(内参基因)
[0084]
疗中待测样品(b)：δctb＝ctb(目的基因)-ctb(内参基因)
[0085]
δδct＝δct
b-δcta[0086]
相对定量r＝2-δδct
。
[0087]
实施例1
[0088]
筛选放疗敏感与抵抗escc患者各3例，进行疗前(基线)、疗中外周血转录组测序(rna-seq)；
[0089]
测序平台：外周血清小rna测序(bgiseq-500)；
[0090]
候选mirna筛选标准：6例标本中均表达且tpm均在500以上的mirna纳入分析，共计79个。
[0091]
筛选组内、组间差异明显(fold change≥2，p＜0.05)的4个mirna纳入后续验证。
[0092]
患者基线特征如表5所示。
[0093]
表5转录组测序患者基线特征
[0094][0095]
组间比较：基线水平(疗前)未发现差异表达基因；
[0096]
组内组间比较：治疗前后动态变化发现4个候选mirna：mir-143-3p，mir-181a-5p，mir-223-3p，mir-337-3p，如图2所示。mir-337-3p后续小样本q-pcr验证时发现表达量极低故在后续样本检验时剔除。
[0097]
实施例2
[0098]
回顾性分析2013-2019既往接受放疗的40例escc患者，其中包括放疗敏感组21例，放疗抵抗组19例，全组中位随访时间：26.3(5.7-74.4)月。
[0099]
总生存被定义为：从患者接受放疗开始，至因任何原因引起死亡的时间。无进展生存被定义为：从患者接受放疗开始，到观察到疾病进展或者发生因为任何原因的死亡之间的时间。
[0100]
全组患者总生存和无进展发生存情况如图3及表6所示。
[0101]
表6全组患者总生存和无进展生存
[0102][0103]
全组患者的基线特征及影响患者预后的单因素分析如表7所示，p值《0.05被定义为统计学差异显著。
[0104]
表7患者基线特征及单因素分析
[0105]
[0106][0107]
*将“≤1.5”定义为预测放疗敏感，“》1.5”定义为预测放疗抵抗。
[0108]
+将“均≤1.5”定义为预测放疗敏感，“任意＞1.5&均＞1.5”定义为预测放疗抵抗。
[0109]
na:未行疗中评价。
[0110]
单因素分析结果显示：卡氏评分、原发肿瘤长度、原发灶和淋巴结体积、疗中mir-143-3p&mir-223-3p表达水平变化倍数、疗中mir-181a-5p&mir-223-3p表达水平变化倍数是影响总生存的预后因素，年龄、卡氏评分、分期、原发肿瘤长度、原发灶和淋巴结体积、疗中mir-143-3p&mir-223-3p表达水平变化倍数是影响无进展生存的预后因素。其中，通过影像学评价的放疗疗效不能较好的预测患者的预后，不是影响预后的因素。
[0111]
影响患者预后的多因素分析如表8所示。
[0112]
表8多因素分析
[0113][0114]
多因素分析结果显示：卡氏评分、原发灶和淋巴结体积，疗中mir-143-3p&mir-223-3p表达水平变化倍数是影响总生存、无进展生存的独立预后因素。
[0115]
根据患者治疗结束后病变是否持续3个月以上或1年内复发，分为放疗敏感组、抵抗组，其生存分析如图4-5所示。
[0116]
候选mirna疗前-疗中变化对放疗敏感性的预测准确性如图6-7所示，mir-143-3p&mir-223-3p联合对escc患者放疗敏感性的预测效果最佳，准确性为82.5％。
[0117]
疗中mir-143-3p&mir-223-3p联合预测效果与escc患者放疗敏感性的相关性分析如表9所示，escc放疗患者疗中mir-143-3p&mir-223-3p表达水平变化倍数与放疗敏感性相关。
[0118]
表9疗中mir-143-3p&mir-223-3p表达水平变化倍数与放疗敏感性的相关性分析
[0119][0120]
mir-143-3p&mir-223-3p联合预测效果生存分析如图8-9所示，mir-143-3p&mir-223-3p预测的放疗敏感组(疗中mir-143-3p&mir-223-3p表达水平变化倍数均≤1.5)相较于放疗抵抗组(疗中mir-143-3p&mir-223-3p表达水平变化倍数任意＞1.5&均＞1.5)有更好的总生存和无进展生存。
[0121]
将影响患者生存的卡氏评分、原发灶和淋巴结体积、疗中mir-143-3p&mir-223-3p表达水平变化倍数纳入分析进行建模，roc曲线如图10-11所示，总生存roc曲线auc值0.703，无进展生存roc曲线auc值0.751，均具有较好的预测效果。
[0122]
综上所述，escc患者放疗前-中mir-143-3p&mir-223-3p的动态变化情况对于患者的放疗敏感性具有较好的预测效果，其联合患者卡氏评分、原发灶和淋巴结体积可较好的预测患者的总生存和无进展生存情况。
[0123]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种用于局部晚期食管鳞癌放疗疗效预测的标志物，其特征在于，包括mir-143-3p和mir-223-3p。2.一种用于局部晚期食管鳞癌放疗疗效预测的试剂盒，其特征在于，包括mir-143-3p的引物和mir-223-3p的引物。3.一种如权利要求1所述的标志物在制备用于局部晚期食管鳞癌放疗疗效预测的试剂盒中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：（1）提取待测样品的rna，进行逆转录反应，得到cdna；（2）加入mir-143-3p、mir-223-3p及内参的引物，将步骤（1）得到的cdna分别进行实时定量pcr反应；（3）计算目的基因在待测样品中的相对含量，所述目的基因包括mir-143-3p、mir-223-3p。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，所述实时定量pcr反应的反应条件如下：95℃dna聚合酶活化15min；94℃变性15s，55℃退火30s，70℃延伸30s，40个循环。
技术总结本发明公开了一种用于局部晚期食管鳞癌放疗疗效预测的标志物及其应用与试剂盒，所述标志物包括miR-143-3p和miR-223-3p。本发明中用于局部晚期食管鳞癌放疗疗效预测的标志物的动态表达水平与食管癌患者接受放疗后的预后相关，可作为食管癌放疗中外周血动态监测指标，为miR-143-3p和miR-223-3p成为疗效预测的有效生物学标志物和潜在治疗靶点提供了依据，指导临床局部晚期食管鳞癌的个体化治疗。miR-143-3p和miR-223-3p的联合预测准确性为82.5%。82.5%。82.5%。
技术研发人员：刘梅 高麟芮 肖泽芬
受保护的技术使用者：中国医学科学院肿瘤医院
技术研发日：2022.07.18
技术公布日：2022/11/1
