1.本发明涉及环境微生物学领域，尤其涉及一种评价外源微生物在土壤中生长情况的方法。
背景技术：2.土壤是生命赖以生存的根基，农业是人类赖以生存的物质基础，但是目前，我国乃至全世界的土壤污染问题已相当严重，生物强化技术成为一种对受污染土壤进行原位修复的有效手段。生物强化技术是向目标土壤中施加对目标污染物具有一定处理能力的外源微生物，利用其新陈代谢反应进行修复。外源微生物能否正常的生长繁殖是微生物强化技术成败与否的关键。但是，目前，所添加的外源微生物究竟在所处理的土壤中是否能够长期存活并保持繁殖能力，尚未有一个明确的表征手段。
3.向土壤中添加功能性菌剂，使其降解土壤中的污染物、或促进植物生长，是极具潜力的土壤改良手段。但外源微生物进入土壤后，面临环境不适应、土著微生物竞争等问题，往往不易存活。为了开发适用于土壤的高效菌剂，就需要预先对外源微生物在土壤中的生长潜力进行评估。所有生命的生长都需要水。自然界水分子中的氧原子绝大多数为
16
o，自然丰度达99％以上，而重同位素
18
o的自然丰度仅为约0.2％。向干燥土壤中加入
18
o水，使微生物仅能摄入
18
o，将能使活跃生长微生物的dna被
18
o标记、密度变大。
4.目前，根据微生物生长对水的需求设计出来的氧-18(
18
o)同位素标记方法，已成为评估土壤微生物生长的重要技术。在现有方法中，对特定土壤样品，需要同时设立
18
o水和
16
o水的处理，经培养后提取土壤dna，经氯化铯密度梯度离心后，采用定量pcr等方法测定微生物16s rrna基因数量沿氯化铯密度梯度的分布。比较
18
o水处理组和
16
o处理组的分布，判断微生物是否被
18
o标记及其大致程度，从而定性微生物的生长情况。
5.现有
18
o标记技术中，(1)通常采用16s rrna基因拷贝数为评估手段，因为所有微生物(细菌)都含有16s rrna基因，所以无法区分外源微生物和土著微生物；(2)设立
18
o标记处理同时必须设立轻同位素
16
o标记的对照，通过对比
18
o标记dna和
16
o标记dna在氯化铯密度梯度上的位置，确认
18
o对微生物的标记效果。这一做法工作量大，测定成本高，当土壤样品较多时难以实行。(3)比较16s rrna基因沿氯化铯密度梯度的分布，只能进行定性分析，无法实现对微生物生长情况的定量评估。
技术实现要素：6.本发明要解决的技术问题是克服现有技术存在的缺陷，本发明提出了一种评价外源微生物在土壤中生长情况的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
7.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种评价外源微生物在土壤中生长动态的方法，包括如下步骤：
8.s1、向干燥的土壤中添加外源微生物以及h
218
o进行土壤培养试验，采集土壤样品并提取土壤dna；
9.s2、分别以h
216
o和h
218
o配制用于培养外源微生物的液体培养基，收集所得外源微生物并提取dna；
10.s3、分别将s1中所得土壤dna以及s2中
16
o及
18
o标记的菌体dna样品溶解于氯化铯溶液中并进行超高速密度梯度离心，得不同dna沿密度梯度的分布占比；
11.s4、依据s3中所得不同dna的分布占比得土壤中外源微生物dna的平均密度，从而实现外源微生物生长程度的定量评价；
12.所述外源微生物为sphingomonas wittichii dc-6，保藏于韩国农业微生物菌种保藏中心(korean agricultural culture collection,kacc)，保藏编号为kacc 16600。
13.进一步地，于s1-s3中，以定量pcr方法对所得dna样品进行基因定量，用于定量pcr方法中的引物序列具体如下：cndaf：catccagtgcccctatcacg；cndar：aatcgcagtcgagatgcagg。
14.进一步地，
15.于s1中，以定量pcr方法对经超高速离心分离后各密度层次dna样品进行基因定量，经加权平均计算后，所测得的为置于土壤之内的外源微生物的dna的平均密度；
16.于s3中，以定量pcr方法对经超高速离心分离后各密度层次dna样品进行基因定量，经加权平均计算后，所测得的为被
16
o和
18
o标记的菌体dna的平均密度。
17.进一步地，土壤中新生长的外源微生物dna占比为s2至s3中以
18
o标记的dna量的差值与s1中外源微生物的dna总量之比。
18.进一步地，于s2中，所述液体培养基包括胰蛋白胨10mg/ml，酵母提取物5mg/ml以及nacl 10mg/ml。
19.与现有技术相比，本发明的有益效果包括：
20.(1)针对外源微生物独特基因片段进行定量pcr分析，不依赖16s rrna基因，因而能够排除土壤中其他微生物的干扰，对外源微生物进行高度特异的分析；
21.(2)将
16
o和
18
o预先标记的目标微生物dna制备成dna密度标准，不同土壤来源的dna经密度梯度离心后，与该密度标准进行比较即可，从而避免了对每个土壤样品同时设立
16
o和
18
o标记处理，将方法的样品处理量提高了一倍；
22.(3)同时提出了一种加权计算方法，通过计算微生物dna的平均密度，指示外源微生物的标记程度，从而实现了对微生物生长的定量评估。
附图说明
23.参照附图来说明本发明的公开内容。应当了解，附图仅仅用于说明目的，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。在附图中，相同的附图标记用于指代相同的部件。其中：
24.图1示意性显示了各浮力密度层中cnda的相对分布图。
具体实施方式
25.容易理解，根据本发明的技术方案，在不变更本发明实质精神下，本领域的一般技术人员可以提出可相互替换的多种结构方式以及实现方式。因此，以下具体实施方式仅是对本发明的技术方案的示例性说明，而不应当视为本发明的全部或者视为对本发明技术方案的限定或限制。
26.一种评价外源微生物在土壤中生长动态的方法，包括如下步骤：
27.s1、向干燥的土壤中添加外源微生物以及h
218
o进行土壤培养试验，采集土壤样品并提取土壤dna；
28.s2、分别以h
216
o和h
218
o配制用于培养外源微生物的液体培养基，收集所得外源微生物并提取dna；
29.s3、分别将s1中所得土壤dna以及s2中
16
o及
18
o标记的菌体dna样品溶解于氯化铯溶液中并进行超高速密度梯度离心，得不同dna沿密度梯度的分布占比；
30.s4、依据s3中所得不同dna的分布占比得土壤中外源微生物dna的平均密度，从而实现外源微生物生长程度的定量评价；
31.于s1-s3中，以定量pcr方法对所得dna样品进行基因定量，用于定量pcr方法中的引物序列具体如下：cndaf：catccagtgcccctatcacg；cndar：aatcgcagtcgagatgcagg。
32.于s1中，以定量pcr方法对经超高速离心分离后各密度层次dna样品进行基因定量，经加权平均计算后，所测得的为置于土壤之内的外源微生物的dna的平均密度；
33.于s3中，以定量pcr方法对经超高速离心分离后各密度层次dna样品进行基因定量，经加权平均计算后，所测得的为被
16
o和
18
o标记的菌体dna的平均密度。
34.记土壤中外源微生物dna占比为s，则其中，δ为于s3中以
18
o标记的dna量和s2中以
18
o标记的dna量的差值，a1+a2为s1中外源微生物的dna总量。
35.于s2中，液体培养基包括胰蛋白胨10mg/ml，酵母提取物5mg/ml，nacl 10mg/ml。
36.以下结合实施例对于本技术的技术效果作进一步说明。
37.实施例：测定sphingomonas wittichii dc-6在土壤中的生长
38.1.土壤接种培养试验
39.1.1土壤样品
40.土壤样品采自吉林省长春市梨树县农田。土壤风干后，磨细过2mm筛。
41.1.2培养基成分
42.lb培养基：胰蛋白胨10mg/ml，酵母提取物5mg/ml，nacl 10mg/ml，用水(h
216
o)溶解，制备成lb培养基。
43.1.3接种菌液制备
44.将sphingomonas wittichii dc-6接种于50ml 16
o-lb液体培养基中，28℃、160r/min摇床培养3天。将菌液在5000rpm下离心5min，收集菌体，使用无菌水洗涤两次，最后用500μl h
218
o重悬，制成菌悬液。
45.1.4土壤培养
46.利用4ml安瓿瓶培养，设置2个平行培养。每瓶中加入1.0g风干土壤，加入250μlh
218
o重悬的菌悬液。置于28℃恒温培养箱，培养7天后取样。
47.1.5土壤dna提取
48.采用fastdna spin kit for soil试剂盒提取安瓿瓶中全部土壤的dna，nanodrop检测dna浓度和纯度。土壤dna记为soil-dna。
49.2.h
218
o和h
216
o标记sphingomonas wittichii dc-6菌体dna
50.2.1培养基成分
51.lb培养基：胰蛋白胨10mg/ml，酵母提取物5mg/ml，nacl 10mg/ml，用h
218
o或h
216
o溶解，制备成
18
o-lb或
16
o-lb培养基。
52.2.2 sphingomonas wittichii dc-6培养
53.将sphingomonas wittichii dc-6接种到
18
o-lb或
16
o-lb培养基，28℃、160r/min摇床培养3天。
54.2.3提取sphingomonas wittichii dc-6的dna
55.5000rpm下离心5min收集两种培养基中的菌体，利用细菌基因组dna试剂盒提取dna，nanodrop检测dna浓度和纯度。
18
o-lb或
16
o-lb培养基获得的菌体dna分别记为
18
o-dna和
16
o-dna。
56.3.超高速离心
57.3.1准备实验药品与试剂
58.(1)琼脂糖(agarose)(helena,cat.no.8201
–
07)；
59.(2)氯化铯cscl(fisher scientific,c/0680/60)；
60.(3)乙二胺四乙酸(edta,0.5m andph 8.0)(fisher scientific,cat.no.bpe2482-500)；
61.(4)乙醇(ethanol,reagent grade)(sigma-aldrich,cat.no.r8382)；
62.(5)糖原(glycogen,20mg/ml)(roche,cat.no.10901393001)；
63.(6)盐酸(hcl)(fisher scientific,cat.no.h/1100/pb17)；
64.(7)氯化钾(kcl)(bdh,cat.no.101984l)；
65.(8)氯化钠(nacl)(fisher scientific,cat.no.s/3160/65)；
66.(9)聚乙二醇6000(polyethylene glycol 6000)(vwr,cat.no.295774b)；
67.(10)矿物油(mineral oil)(sigma-aldrich,cat.no.m3516-1l)；
68.(11)氢氧化钠(naoh,pellets)(fisher scientific,cat.no.bpe359-500)；
69.(12)三羟甲基氨基甲烷tris(fisher scientific,cat.no.t/p630/60)；
70.(13)tris-hcl(1.0m,ph＝8.0)，制备方法：溶解121.1g tris base于800ml超纯水中，盐酸调节ph至8.0，超纯水定容到1000ml，0.2μm filter过滤；
71.(14)te buffer(tris-edta)，制备方法：超纯水配置10mm tris-hcl(ph＝8)，1mm edta(ph＝8.0)的te缓冲液，高压灭菌；
72.(15)gradient buffer[gb缓冲液含0.1m tris-hcl(ph＝8.0)，0.1m kcl，1.0mm edta]，制备方法：取50ml tris-hcl(1m)，3.75g kcl和1.0ml 0.5m edta于400ml超纯水中，待kcl溶解后使用超纯水定容至500ml，0.2μm filter过滤并灭菌；
[0073]
(16)70％乙醇：加入350ml纯乙醇于150ml超纯水中；
[0074]
(17)氯化铯溶液(层级分离不同密度梯度核酸dna)：取603.0g cscl溶解于超纯水中，总体积为500ml(加热到30℃有利于cscl的溶解)，0.2μm filter过滤,室温20℃下其密度约为1.88～1.89g/ml。(1,4171，482.4g/终体积400ml)
[0075]
(18)polyethylene glycol 6000(peg6000)溶液:去离子水溶解150g peg 6000和46.8g nacl，并定容于500ml；并灭菌，该溶液为30％peg 6000和1.6m nacl；
[0076]
3.2仪器与设备：
[0077]
(1)荧光投射仪(clare chemical,cat.no.dr45m)；
[0078]
(2)5.1-ml polyallomer超高速离心试管(beckman,cat.no.342412)；
[0079]
(3)固定流速泵high-performance liquid chromatography(hplc)pump(sykam,cat.no.s1000)；
[0080]
(4)微型离心机(eppendorf,cat.no.5415d)；
[0081]
(5)19号和23号针头；10ml和20ml注射器；橡皮管(1.5mm直径，1.5mm壁厚)；
[0082]
(6)蠕动泵(watson marlow ltd,cat.no.101u/r)；
[0083]
(7)折射计,ar200 digital(reichert,cat.no.13950000)；
[0084]
(8)螺旋帽离心管,15ml(greiner bio-one,cat.no.188271)；
[0085]
(9)注射器滤头,0.2mm(whatman,cat.no.10462200)；
[0086]
(10)超高速离心试管密封仪，tube sealer(beckman coulter,cat.no.349646)；
[0087]
(11)超高速离心机(beckman coulter,cat.no.392049)；
[0088]
(12)超高速离心机转子,vti 65.2(beckman coulter,cat.no.362754)；
[0089]
3.3具体操作步骤
[0090]
(1)将氯化铯溶液调至密度为1.85g/ml，标准温度模式(nd-tc)下，折光率为1.4153
±
0.0002；
[0091]
(2)采用gradient buffer(gb)与5μg土壤dna混合定容到1.2ml；
[0092]
(3)在15ml的离心管中，依次加入4.8ml cscl，1.2ml gb+dna溶液；
[0093]
(4)轻轻的上下颠倒将氯化铯溶液、gb缓冲液和dna溶液完全混合；
[0094]
(5)采用折光仪测定离心前混合液的折光率为1.4029
±
0.0002；
[0095]
(6)采用10ml注射器将步骤(5)的混合液转移至超高速离心试管中；
[0096]
(7)将对应配对的离心试管称重，确保两个离心管重量相等；
[0097]
(8)密封管子；
[0098]
(9)将调过平衡的离心管两两对称放入转子中；
[0099]
(10)超高速离心基本参数：离心速度(44100rpm，约177000
×
g)、离心时间40小时、离心温度20℃；
[0100]
(11)超高速离心结束后，将离心液分为13层；
[0101]
(12)利用折光仪测定不同浮力密度梯度液体(共计15层)的折光率。采用离心溶液密度计算的经验公式(ρ＝-75.9318+99.2031x-31.2551x2，ρ表示浮力密度，x表示折光值)计算各层液体的浮力密度；
[0102]
(13)加入2体积的peg6000溶液，沉淀dna；
[0103]
(14)13000
×
g离心30min，除去上清液；
[0104]
(15)加入500μl 70％乙醇，13000g离心10min，除去上清液；
[0105]
(16)加入30μl te缓冲液溶解，获得各浮力密度层dna。
[0106]
4.鉴定菌体dna和土壤dna中sphingomonas wittichii dc-6的平均浮力密度
[0107]
4.1定量pcr分析
[0108]
进行cnda基因的定量pcr测定。扩增引物为：
[0109]
cndaf：catccagtgcccctatcacg
[0110]
cndar：aatcgcagtcgagatgcagg
[0111]
qpcr反应条件：94℃预变性5min；94℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 20s，30个循环；72℃
10min。
[0112]
对照外标，计算获得各浮力密度层dna中cnda基因的拷贝数。进行归一化计算后，作出各浮力密度层中cnda的相对分布图，如下图1所示。
[0113]
4.2计算平均密度
[0114]
采用加权平均法，计算
18
o-dna、
16
o-dna、soil-dna的平均浮力密度。公式为：
[0115][0116]
式中，为平均浮力密度；ρi为每一层的浮力密度(g/ml)；ai指对应每层cnda基因的相对丰度(％)。
[0117]
经计算获得
18
o-dna、
16
o-dna、soil-dna中sphingomonas wittichii dc-6的平均密度为：1.7391、1.7183、1.7251g/ml。
[0118]
4.3计算土壤dna中
18
o标记占比
[0119]
根据公式计算：
[0120][0121]
即：经7天培养后，该土壤中新生长sphingomonas wittichii dc-6占土壤中sphingomonas wittichii dc-6总数的32.77％。
[0122]
本发明的技术范围不仅仅局限于上述说明中的内容，本领域技术人员可以在不脱离本发明技术思想的前提下，对上述实施例进行多种变形和修改，而这些变形和修改均应当属于本发明的保护范围内。
技术特征：1.一种评价外源微生物在土壤中生长动态的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1、向干燥的土壤中添加外源微生物以及h
218
o进行土壤培养试验，采集土壤样品并提取土壤dna；s2、分别以h
216
o和h
218
o配制用于培养外源微生物的液体培养基，收集所得外源微生物并提取dna；s3、分别将s1中所得土壤dna以及s2中
16
o及
18
o标记的菌体dna样品溶解于氯化铯溶液中并进行超高速密度梯度离心，得不同dna沿密度梯度的分布占比；s4、依据s3中所得不同dna的分布占比得土壤中外源微生物dna的平均密度，从而实现外源微生物生长程度的定量评价；所述外源微生物为sphingomonas wittichii dc-6，保藏于韩国农业微生物菌种保藏中心(koreanagricultural culture collection,kacc)，保藏编号为kacc 16600。2.根据权利要求1所述的评价外源微生物在土壤中生长情况的方法，其特征在于，于s1-s3中，以定量pcr方法对所得dna样品进行基因定量，用于定量pcr方法中的引物序列具体如下：cndaf：catccagtgcccctatcacg；cndar：2aatcgcagtcgagatgcagg。3.根据权利要求2所述的评价外源微生物在土壤中生长情况的方法，其特征在于，于s1中，以定量pcr方法对经超高速离心分离后各密度层次dna样品进行基因定量，经加权平均计算后，所测得的为置于土壤之内的外源微生物的dna的平均密度；于s3中，以定量pcr方法对经超高速离心分离后各密度层次dna样品进行基因定量，经加权平均计算后，所测得的为被
16
o和
18
o标记的菌体dna的平均密度。4.根据权利要求3所述的评价外源微生物在土壤中生长情况的方法，其特征在于，土壤中新生长的外源微生物dna占比为s2至s3中以
18
o标记的dna量的差值与s1中外源微生物的dna总量之比。5.根据权利要求1所述的评价外源微生物在土壤中生长情况的方法，其特征在于，于s2中，所述液体培养基包括胰蛋白胨10mg/ml，酵母提取物5mg/ml以及nacl 10mg/ml。
技术总结本发明提出了一种评价外源微生物在土壤中生长情况的方法，包括如下步骤：S1、于干燥土壤中添加外源微生物以及H
技术研发人员：吴宇澄 陈禹竹 何健 曾军 林先贵
受保护的技术使用者：中国科学院南京土壤研究所
技术研发日：2022.07.04
技术公布日：2022/11/1
