1.本发明涉及生物和化学领域，特别是涉及一种从微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的方法。
背景技术：2.全国首次土壤污染状况调查公报显示，土壤多环芳烃类(pahs)点位超标率达1.4％，耕地土壤存在多环芳烃污染(环境保护部，2014)。荧蒽(fluoranthene，flu)是我国长三角地区主要的pahs，也是美国环境保护署(epa)优先控制的污染物，其疏水性强，性质稳定，易在环境中积累，也会在农作物中积累，给人类健康带来风险。准确定量植物对pahs的积累情况，不仅有利于评估pahs的积累风险，而且可为筛选修复植物提供基础数据。
3.目前国内外对植物中提取pahs均采用有机试剂浸提的提取方法，该方法需要较大的植物组织样本(0.5-2g)，需要反复超声才能有效提取出植物中的pahs，另外，常规方法中一般采用的层析柱(上层无水硫酸钠，下层硅胶)不能有效避免色素之类等杂质成分的干扰。同时现有技术中主要采用的液相色谱检测方法，检出时间较长且检出限较高，一般在114-153mg/kg。
4.植物组织中pahs的含量水平，可评价某地区植物受pahs污染的程度，叶片中pahs含量水平亦可间接评价空气中pahs的污染程度。所以，准确检测植物样品pahs的含量显得极为重要。而实际生活中pahs在植物中的含量极低，需要较多的植物组织量才能满足方法的定量检出限，因此，建立一种测定微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的方法是非常有必要的。本研究在常规基础上对样品的前处理过程进行优化，建立了一种简单、快速、低成本、提取检测植物微量组织样本中荧蒽残留量的方法。本发明的提取检测荧蒽的方法，检出荧蒽时间较短且检出限较低，前处理中所需植物样本量较少，提取荧蒽的过程简单；不需要反复离心等过程；显著节约时间和实验成本。
技术实现要素：5.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种从微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的方法，所述方法提取检测植物组织中荧蒽的方法，操作简单，节省时间，检出限低，重复性好，能有效去除植物组织中色素等杂质的干扰，适用于植物组织中荧蒽的痕量分析，为测定微量植物组织内荧蒽的含量提供了技术支撑。
6.一种从微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的方法，包括以下具体步骤：
7.步骤1，称取植物样本粉末，加入有机溶剂浸泡过夜，超声，离心，收集上清液，将上清液旋转蒸发浓缩至干，再加入前述有机溶剂复溶，得浓缩液；
8.步骤2，将步骤1的浓缩液过spe柱净化处理，再用甲醇溶解后得净化液；
9.步骤3，将步骤2的净化液采用液相色谱进行检测。
10.作为本技术的优选技术方案，所述植物样本为植物组织材料，可通过液氮研磨成粉末。
11.作为本技术的优选技术方案，所述植物为黑麦草、紫云英和油菜。
12.作为本技术的优选技术方案，所述步骤1中的有机溶剂选自二氯甲烷、正己烷中的一种或两者的混合。
13.作为本技术的优选技术方案，所述有机溶剂为二氯甲烷和正己烷按照体积比1:1混合而成。
14.作为本技术的优选技术方案，所述步骤1中，植物样本粉末的用量与有机溶剂用量比为0.1g：1ml。
15.作为本技术的优选技术方案，所述步骤1中的超声时间为15～60min，优选为30min。
16.作为本技术的优选技术方案，所述步骤2中，spe柱为waters，sep-pak florisil，柱筒尺寸6cc。
17.作为本技术的优选技术方案，所述spe柱活化溶剂选自正己烷、二氯甲烷或二者的混合；优选为正己烷和二氯甲烷按照体积比1:1混合形成的混合溶液。
18.作为本技术的优选技术方案，所述spe柱洗脱溶剂选自正己烷、二氯甲烷或二者的混合；优选为正己烷和二氯甲烷按照体积比1:1混合形成的混合溶液。
19.优选的，所述活化溶剂和洗脱溶剂均为正己烷和二氯甲烷按照体积比1:1混合形成的混合溶液。
20.处理时，选用前述活化溶剂分多次，活化spe柱；将步骤2的浓缩液转移到spe柱上，再用洗脱溶剂洗脱，收集洗脱液；将洗脱液旋转蒸发浓缩至干；然后加甲醇溶液进行溶解，涡旋混匀后，得净化液，即待测溶液。
21.作为本技术的优选技术方案，所述液相仪器为waters的acquity uplc。
22.作为本技术的优选技术方案，液相色谱条件如下：装备紫外/可见探测器，采用反相c18柱色谱柱，2.1mm
×
100mm，柱温30℃；以甲醇和水为流动相，流动速率为0.3ml/min；样品的进样量设定为10μl，flu的检测波长设定为232nm。
23.优选的，甲醇和水的体积比为90:10。
24.有益效果
25.本发明一种从微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的方法，与现有技术相比，具有如下优点：
26.本发明采用超声辅助加spe柱净化的前处理，再利用液相色谱法对常见植物组织样本中痕量荧蒽进行分析检测；由于实验室实验培养的小型植物的组织样本中荧蒽含量较少，而现行技术所需的取样量大(0.5-2g)，而有许多小型植物如草本植物组织培养中无法满足如此大的取样量，而本发明中所需植物组织样本仅需微量0.05-0.1g，取样量降低至现有技术的十分之一左右。本发明选择spe柱净化的前处理方式，spe柱能有效去除复杂的杂质，只需要过一遍柱子，不需要再过硅胶柱等，操作简单，极大地节省了时间。
27.本发明的液相色谱方法，检出荧蒽时间较短且检出限较低。
附图说明
28.图1为本发明中流动相甲醇：水＝80:20的条件下荧蒽的液相色谱图；
29.图2为本发明中标准溶液中荧蒽的液相色谱图；
30.图3为本发明中黑麦草叶片中荧蒽的液相色谱图；
31.图4为本发明中黑麦草根中荧蒽的液相色谱图。
32.图5为平板培养紫云英(5a)、油菜(5b)和黑麦草(5c)照片。
具体实施方式
33.以下结合实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。
34.本发明建立了超声提取-spe柱净化-液相色谱检测的方法测定微量植物组织样本中荧蒽的方法，植物组织样本(叶片或根系)中的荧蒽经二氯甲烷-正己烷(体积比1:1)溶液超声辅助提取，提取液采用spe柱净化后，进行液相色谱(hplc)测定，根据标准品的保留时间进行定性，采用外标法定量；植物实际样品中加标回收率为89.6％-95.8％，方法检出限为60mg/kg；本发明所述方法能有效的提取检测植物组织中荧蒽，操作简单，节省时间，检出限低，重复性好，能有效去除植物组织中色素等杂质的干扰，适用于植物组织中荧蒽的痕量分析，为测定微量植物组织样本内荧蒽的含量提供了技术支撑。
35.主要仪器与试剂
36.超高效液相色谱(waters,acquity uplc)；旋转蒸发仪(buchi,r-220ex)；spe柱(waters,sep-pak florisil 6cc)；正己烷、二氯甲烷等均为分析纯(hplc级)。
37.实施例1.超高效液相色谱条件的确立
38.在现有技术的基础上，首先确立液相基础检测条件：装备紫外/可见探测器，采用反相c18柱色谱柱，2.1mm
×
100mm，柱温30℃；甲醇和水为流动相比例为(80:20)，流动速率为0.5ml/min；样品的进样量设定为10μl，flu的检测波长设定为254nm。在这个基础上，本发明对液相条件进行了优化。
39.1.1检测波长的确定
40.研究表明，荧蒽在254nm与232nm波长附近具有强烈的紫外吸收，而在本实验中，232nm与254nm波长检测时发现，232nm时荧蒽的响应较强，且分布相对均匀，因此，本研究选择以232nm作为检测波长。
41.1.2流动相比例的选择
42.本实验选择甲醇作为有机流动相，纯水作为无机流动相，分别比较了不同流动相比例(80:20；90:10)下荧蒽在色谱图下的响应值。在本实验中发现，当体积比为甲醇：水＝80:20的条件下，对样品的洗脱能力较慢，样品的出峰时间较慢且响应值较低(图1)，而当体积比为甲醇：水＝90:10的条件下荧蒽的分离效果较好，响应值最高(图2)。
43.1.3流速的选择
44.本实验在确定流动相比例为90/10的前提下，由于0.5ml/min的流速对机器造成的压力过大，不予考虑。因此在压力允许范围内选择三种不同的流速(0.2ml/min、0.3ml/min和0.4ml/min)对荧蒽在液相色谱上的出峰时间进行对比，在流速为0.4ml/min的条件下，出峰时间最短，但是此流速下出峰时间仅为1.1min，影响出峰的效果且有杂峰的干扰。而在流速为0.2ml/min的条件下，出峰时间较长，影响检测效率。在0.3ml/min的流速，出峰时间相对0.2ml/min较短且排除了杂峰的干扰。效果最优，因此最终选择流速为0.3ml/min。
45.1.4方法线性范围、定量下限及精密度
46.经优化的液相检测条件为：装备紫外/可见探测器，采用反相c18柱色谱柱，2.1mm
×
100mm，柱温30℃；以甲醇和水为流动相，流动速率为0.3ml/min；样品的进样量设定为10μl，flu的检测波长设定为232nm。
47.在最佳的测定条件下，以质量浓度(c)为横坐标，相应峰面积(s)为纵坐标，计算荧蒽的线性范围，结果见表1。荧蒽在0.01-10mg/l范围内与其峰面积呈良好的线性关系，r2均大于0.999。以3倍信噪比(s/n＝3)所对应的浓度为方法检出限，荧蒽的检出限范围为0.6ug/l。本方法检出限能满足要求。选定10mg/l的混合标准样品，在最适宜条件下选定0.01、1和10mg/l三种浓度连续进样10次测定，荧蒽的峰面积的相对标准偏差(rsd)不高于2.5％。
48.表1目标化合物的回归方程、相关系数、方法检出限及精密度(n＝10)
[0049][0050]
实施例2植物体内荧蒽提取方法及条件确立
[0051]
2.1植物样品的提取方法
[0052]
称取植物样本粉末(0.1g)，加入1ml的二氯甲烷和正己烷(体积比1:1)的混合液浸泡过夜12h，超声水浴30min，之后离心5min(12000rpm)，收集上清液，将上清液旋转蒸发浓缩，温度控制在45℃以下浓缩至干，加入前述混合液5ml继续旋蒸，浓缩至2ml左右，得浓缩液，准备进行净化处理。
[0053]
2.2浸提液的spe净化过程优化
[0054]
首先将spe柱用二氯甲烷和正己烷的混合溶液3ml分三次，每次1ml(体积比1:1)活化，之后将待净化的浓缩液转移到spe柱上，用2ml的混合溶液进行洗脱，弃去，再用2ml去离子水洗脱，弃去，最后用5ml的混合溶液洗脱，
[0055]
2.2.1洗脱液的影响
[0056]
将标准溶液用超纯水稀释，使荧蒽以1mg/l浓度过spe小柱，每个样品重复3次，分别选用正己烷、二氯甲烷及二者混合液作为洗脱剂。结果表明，二氯甲烷和正己烷(体积比1:1)的混合液作为洗脱液时荧蒽的回收率均高于分别用正己烷和二氯甲烷时的回收率，所以在本研究中选用二氯甲烷和正己烷(体积比1:1)的混合液作为洗脱液对植物样品进行洗脱。
[0057]
2.2.2洗脱体积的影响
[0058]
比较二氯甲烷：正己烷(1:1)洗脱体积对洗脱率的影响，得到当洗脱量为5ml时对荧蒽的洗脱率达最高值，6ml基本保持稳定，所以确定最佳洗脱体积为5ml。
[0059]
2.3提取方法的精密度及加标回收率
[0060]
取黑麦草植物样品，分别制得浓度为0.1、1和10mg/l的加标样品，按照上述的提取方法和色谱条件进行前处理和测定，外标法定量，每个浓度水平重复测定3次。黑麦草中荧蒽的平均回收率在89.6％-95.8％之间，相对标准偏差(rsd)小于6％。表2为黑麦草中荧蒽的加标回收率；图2为10mg/l加标水平样品的色谱图。由图2可见，荧蒽的色谱峰得到较好的响应。
[0061]
表2目标化合物的回收率和相对标准偏差精密度(n＝3)
[0062][0063]
实施例3平板培养黑麦草、油菜和紫云英不同组织中荧蒽检测
[0064]
在无菌培养基体系下，平板中荧蒽浓度设定为10mg/l，将黑麦草、油菜和紫云英种子接种到培养基上，为保证无菌，此操作全部在超净台中完成。每个处理设置三个重复，将培养瓶转移至光温可控的植物培养箱中进行培养，无菌培养14天之后，将实际采集的黑麦草、油菜和紫云英的根和叶片，照上述预处理方法和色谱条件进行提取检测分析，其中以黑麦草为代表的色谱图见图3和图4，平板培养黑麦草、油菜和紫云英照片见图5。结果表明，黑麦草中的荧蒽含量范围为81.97-98.28mg/kg，小麦中的荧蒽含量范围为38.02-49.58mg/kg，紫云英中荧蒽含量范围为62.02-68.56mg/kg。其中黑麦草对荧蒽的吸收积累量最高。
[0065]
表3不同植物组织中荧蒽含量的测定结果
[0066][0067]
实施例4微量提取方法与常规提取方法比较
[0068]
将实际采集在培养在10mg/l的黑麦草的根和叶片，分别用微量提取方法和常规提取方法进行提取检测分析(表4)。
[0069]
表4不同提取荧蒽的方法比较
[0070][0071]
结果发现，常规提取方法中黑麦草中的荧蒽含量范围为78.64-92.78mg/kg。微量提取方法中黑麦草中的荧蒽含量范围为81.97-98.28mg/kg。
[0072]
本发明建立了微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的测定方法，超声辅助固相萃取可以有效的提取样品中的荧蒽，spe柱可以有效的净化提取物中的色素等其他杂质，满足超高效液相色谱的分析要求。该方法操作简单，节省时间，检出限低，重复性好，能有效去除杂质的干扰，适用于植物组织中荧蒽的痕量分析，为今后测定微量植物组织样本内荧蒽的含量提供了技术支撑，具有应用价值。
[0073]
以上所述的实施案例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
技术特征：1.一种从微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：步骤1，称取植物样本粉末，加入有机溶剂浸泡过夜，超声，离心，收集上清液，将上清液旋转蒸发浓缩至干，再加入前述有机溶剂复溶，得浓缩液；步骤2，将步骤1的浓缩液过spe柱净化处理，甲醇溶解之后得净化液；步骤3，将步骤2的净化液采用液相色谱进行检测。2.根据权利要求1所述的一种从微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的方法，其特征在于，所述植物为黑麦草、油菜和紫云英。3.根据权利要求1所述的一种从微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的方法，其特征在于，所述步骤1中的有机溶剂选自二氯甲烷、正己烷中的一种或两者的混合；优选的，所述有机溶剂为二氯甲烷和正己烷按照体积比1：1混合而成。4.根据权利要求3所述的一种从微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的方法，其特征在于，所述步骤1中，植物样本粉末的用量与有机溶剂用量比为0.1g：1ml。5.根据权利要求1所述的一种从微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的方法，其特征在于，所述步骤1中的超声时间为15~60min，优选为30min。6.根据权利要求1所述的一种从微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的方法，其特征在于，所述步骤2中，spe柱为waters，sep-pak florisil，柱筒尺寸6cc 。7.根据权利要求1所述的一种从微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的方法，其特征在于，所述spe柱活化溶剂选自正己烷、二氯甲烷或二者的混合；优选为正己烷和二氯甲烷按照体积比1:1混合形成的混合溶液；所述spe柱洗脱溶剂选自正己烷、二氯甲烷或二者的混合；优选为正己烷和二氯甲烷按照体积比1:1混合形成的混合溶液；更优选的，所述活化溶剂和洗脱溶剂均为正己烷和二氯甲烷按照体积比1:1混合形成的混合溶液。8.根据权利要求7所述的一种从微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的方法，其特征在于，处理时，选用活化溶剂分多次，活化spe柱；将步骤2的浓缩液转移到spe柱上，再用洗脱溶剂洗脱，收集洗脱液；将洗脱液旋转蒸发浓缩至干；然后加甲醇溶液进行溶解，涡旋混匀后，得净化液，即待测溶液。9.根据权利要求1所述的一种从微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的方法，其特征在于，所述液相仪器为waters的acquity uplc。10.根据权利要求9所述的一种从微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的方法，其特征在于，液相色谱条件如下：装备紫外/可见探测器，采用反相c18柱色谱柱，2.1mm
×
100 mm，柱温30℃；以甲醇和水为流动相，流动速率为0.3ml/min；样品的进样量设定为10μl，flu的检测波长设定为232nm。
技术总结本发明公开了一种从微量植物组织样本中提取和检测荧蒽的方法，包括以下具体步骤：步骤1，称取植物样本粉末，加入有机溶剂浸泡过夜，超声，离心，收集上清液，将上清液旋转蒸发浓缩至干，再加入前述有机溶剂复溶，得浓缩液；步骤2，将步骤1的浓缩液过SPE柱净化处理，用甲醇溶解之后得净化液；步骤3，将步骤2的净化液采用液相色谱进行检测。本发明所述方法能有效的提取检测植物组织中荧蒽，操作简单，节省时间，检出限低，重复性好，能有效去除植物组织中色素等杂质的干扰，适用于植物组织中荧蒽的痕量分析，为测定微量植物组织样本内荧蒽的含量提供了技术支撑。提供了技术支撑。提供了技术支撑。
技术研发人员：徐莉 徐源洲 栗云云 车婷 李娅娟 肖卓亮 张馨月 张力浩 李辉信 胡锋
受保护的技术使用者：南京农业大学
技术研发日：2022.05.11
技术公布日：2022/11/1
