人参pgwrky2转录因子及其应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及人参pgwrky2转录因子及其应用。
背景技术：2.磷(p)是植物必需的大量营养元素，在植物中参与多种代谢过程，对其生长发育起着至关重要的作用。植物对磷环境的适应包括形态生理基础和基因表达调控。例如磷转运体(pts)的调控、氨基酸及衍生物、类黄酮、磷酸酶的分泌以及根结构的改变。磷的代谢途径受多种基因调控，在不同的磷条件下，这些基因的表达也不同。如在水稻中，低磷反应的主要转录调节因子osphr2通过激活磷饥饿诱导的基因pht1与基因启动子区域中的p1bs(phr1结合序列gnatatnc) 基序结合，以此来调控对磷环境的适应。
3.此外，也有研究在玉米、大豆、黑麦草、大麦和小麦等作物中分析了植物对磷胁迫反应的分子机制。目前在研究植物磷胁迫方面，主要集中于拟南芥、水稻、玉米等模式植物和大田作物中，在药用植物中的研究甚少，而在人参中仍未见报道，同时，wrky型转录因子在人参中的研究也较少，虽然有研究报道了人参中的几个wrky型转录因子受水杨酸、脱落酸、na cl等激素和盐诱导表达，但未有研究发现人参在磷胁迫诱导下特异性表达的wrky型转录因子，也未有一种从基因表达水平上去检测人参受磷胁迫的标志物及技术方法。
技术实现要素：4.针对现有技术所存在的上述缺点，本发明公开了人参pgwrky2 转录因子对磷营养的调控作用，通过揭示人参磷胁迫途径中关键酶的表达特异性，实现检测人参逆境胁迫中的磷营养胁迫，从而提出有效调控措施，具有重要的应用价值。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
6.人参pgwrky2转录因子，所述的人参pgwrky2转录因子的核苷酸序列如seq id no.1所示；
7.所述的人参pgwrky2转录因子的编码蛋白序列如seq id no.2所示。
8.进一步的，扩展所述的人参pgwrky2转录因子的cdna序列引物对为：上游引物序列如seqid no.3所示，下游引物序列如seqid no.4 所示。
9.进一步的，荧光检测所述的人参pgwrky2转录因子的引物对为：上游引物序列如seqid no.5所示，下游引物序列如seqid no.6所示。
10.本发明还提供了一种人参pgwrky2转录因子在人参器官组织中的应用，所述的人参pgwrky2转录因子在人参的主根、侧根、茎和叶中均有表达，且在侧根和主根中的表达量最高，在叶和茎中的表达量最低。
11.此外，本发明还提供了一种人参pgwrky2转录因子在不同外源磷浓度胁迫下提高人参抗逆性的应用，所述的人参pgwrky2转录因子在2.0mm浓度下表达量最高，在4.0mm浓度下次之，在0mm、 0.5mm和1.0mm浓度下表达量相对较低，且表达从0mm浓度至2.0 mm浓度随磷浓度的增加而上升，并呈正相关的趋势。
12.有益效果
13.采用本发明提供的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下有益效果：
14.本发明公开了人参pgwrky2转录因子对磷营养的调控作用，具体是人参pgwrky2转录因子响应磷胁迫表达，通过揭示人参磷胁迫途径中关键酶的表达特异性，实现检测人参逆境胁迫中的磷营养胁迫，从而提出有效调控措施，具有重要的应用价值。
附图说明
15.图1为本发明纯化回收得到目的条带的示意图；
16.图2为本发明人参pgwrky2转录因子在人参的主根、侧根、茎和叶中表达的示意图；
17.图3为本发明人参pgwrky2转录因子在不同磷浓度胁迫下的表达的示意图。
具体实施方式
18.本发明通过高通量测序从人参中鉴定到一个响应磷胁迫的wrky 型转录因子pgwrky2，基于转录组数据库，利用dnaman和primerpremier 6软件设计pgwrky2序列pcr扩增引物和实时荧光定量pcr (qrt-pcr)检测引物，通过研究pgwrky2转录因子在响应人参磷胁迫中的应用，为今后利用基因工程转化人参愈伤组织，从而提高人参抗逆性提供了一个新的策略。
19.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
20.实施例1：人参根茎组织的rna提取
21.采取人参主产区吉林省抚松县人参种植基地的二年生人参苗，置于实验室的智能人工气候室(温度20℃，光照2000lx)内使用不同磷浓度的霍格兰氏营养液进行水培，设置5个磷浓度水平：p0(0mm)、 p1(0.5mm)、p2(1.0mm)、p3(2.0mm)以及p4(4.0mm)，将人参苗水培至第八周一次性取样；利用rnasimple total rna kit试剂盒提取人参根茎组织的rna。
22.实施例2：pcr扩增
23.经fastking gdna dispelling rt supermix试剂盒反转录为cdna 后，使用2
×
trans taq fidelity(hifi)pcr supermixⅱ进行 pgwrky2序列扩增(反应体系为：12.5μl 2
×
trans taq fidelity (hifi)pcr supermixⅱ，上下游引物(10μmol/l)各1μl，模板1μl， 9.5μl的ddh2o；反应程序为：95℃预变性4min；95℃、30s，51℃、 30s，72℃、1min30s，进行35个循环；72℃、7min。)。
24.其中，扩增时：
25.上游引物为：pgwrky2-f：5
’‑
atgggagaatttgttagtatggag-3
’ꢀ
(seqid no.3)
26.下游引物为：pgwrky2-r：5
’‑
ttacctaaaatgttccgtagagca-3
’ꢀ
(seqid no.4)；
27.pcr扩增反应结束后利用tiangel midi purfication kit试剂盒纯化回收得到目的条带(如图1所示)；将目的条带使用-t5 zerocloning kit试剂盒连接到t5载体上，转化大肠杆菌涂板挑取单克隆摇菌，使用tianprep mini plasmid kit试剂盒提取质粒并送上海生工公司测序；测序结果使用dnaman分析。
28.实施例3：pgwrky2转录因子
29.使用rnasimple total rna kit试剂盒提取人参主根、侧根、茎和叶组织的rna，并
反转录为cdna作为模板进行qrt-pcr检测分析(反应体系为：faststart universal 2
×
sybr green 12.5μl，上下游引物各 0.5μl(10μmol/l)，cdna模板1μl，10.5μl的dd h2o，同时以 1μl的dd h2o代替模板作为阴性对照；反应程序为：94℃、2min； 94℃、15s，55℃、20s，72℃、30s，进行40个循环；72℃、7min。)。
30.其中，人参pgwrky2转录因子实时荧光定量检测引物对如下：
31.上游引物：pgwrky2q-f：5
’‑
tcattcggttcactggattaca-3’(seqid no.5)
32.下游引物：pgwrky2q-r：5
’‑
gctcatctaactcatccacaag-3’(seqid no.6)；
33.每个样品设置3次技术性和生物学重复，采用2-δδct
法计算相对表达水平。
34.实验结果发现，pgwrky2转录因子的全长为975bp(seqid no.1)，编码324个氨基酸(seqid no.2)；该转录因子在人参的根中显著表达，且在一定外源磷浓度范围内，pgwrky2的表达量与磷浓度之间呈正相关的趋势，即外源磷浓度越高，pgwrky2转录因子的表达量越高，据此可初步检测人参受磷胁迫的情况。
35.实施例4：检测出的pgwrky2转录因子在人参器官组织中的表达模式
36.如图2所示，人参pgwrky2转录因子在人参的主根、侧根、茎和叶中均有表达，但表达存在明显的差异，在侧根和主根中的表达量最高，其次是叶，茎中的表达量最低。
37.实施例5：参pgwrky2转录因子在不同磷浓度胁迫下的表达模式
38.如图3所示，在外源磷处理下，pgwrky2转录因子在p3(2.0mm) 浓度下表达量最高，p4(4.0mm)浓度下次之，在p0(0mm)、p1 (0.5mm)和p2(1.0mm)浓度下表达量相对较低，且表达从p0(0mm) 浓度至p3(2.0mm)浓度随磷浓度的增加而上升，呈正相关的趋势。
39.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不会使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
技术特征：1.人参pgwrky2转录因子，其特征在于，所述的人参pgwrky2转录因子的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述的人参pgwrky2转录因子的编码蛋白序列如seq id no.2所示。2.根据权利要求1所述的人参pgwrky2转录因子，其特征在于，扩展所述的人参pgwrky2转录因子的cdna序列引物对为：上游引物序列如seq id no.3所示，下游引物序列如seq id no.4所示。3.根据权利要求1所述的人参pgwrky2转录因子，其特征在于，荧光检测所述的人参pgwrky2转录因子的引物对为：上游引物序列如seq id no.5所示，下游引物序列如seq id no.6所示。4.一种人参pgwrky2转录因子在人参器官组织中的应用，其特征在于，所述的人参pgwrky2转录因子在人参的主根、侧根、茎和叶中均有表达，且在侧根和主根中的表达量最高，在叶和茎中的表达量最低。5.一种人参pgwrky2转录因子在不同外源磷浓度胁迫下提高人参抗逆性的应用，其特征在于，所述的人参pgwrky2转录因子在2.0mm浓度下表达量最高，在4.0mm浓度下次之，在0mm、0.5mm和1.0mm浓度下表达量相对较低，且表达从0mm浓度至2.0mm浓度随磷浓度的增加而上升，并呈正相关的趋势。
技术总结本发明涉及生物技术领域，具体涉及人参PgWRKY2转录因子及其应用；本发明公开了人参PgWRKY2转录因子对磷营养的调控作用，通过揭示人参磷胁迫途径中关键酶的表达特异性，实现检测人参逆境胁迫中的磷营养胁迫，从而提出有效调控措施，具有重要的应用价值。具有重要的应用价值。具有重要的应用价值。
技术研发人员：张亚玉 梁浩 孙海 周季欣 付育臣
受保护的技术使用者：成都大学
技术研发日：2022.05.12
技术公布日：2022/11/1
