1.本发明属于生物工程技术领域，涉及一种色氨酸合成酶突变体，具体地说是一种色氨酸合成酶突变体及其应用。
背景技术：2.大肠杆菌色氨酸合成酶(ts)是一种四聚体双功能酶，能够催化l-丝氨酸合成l-色氨酸，该酶的三级结构包括α和β两种亚基，按照αββα的线性方式排列，每个α亚基和β亚基二聚体单元的活性中心通过25a
°
长的通道相互连接。研究表明，ts的催化机理为：α亚基单独催化吲哚-3-甘油磷酸裂解为吲哚和甘油醛-3-磷酸酯；β亚基在磷酸吡哆醛(plp)的作用下，催化吲哚和l-丝氨酸合成l-色氨酸。进一步研究则发现，ts还具有催化l-丝氨酸生成l-半胱氨酸的能力。
3.近年来，l-半胱氨酸及其衍生物在制药、食品和化妆品中得到广泛应用。在制药领域，乙酰半胱氨酸广泛应用于呼吸系统疾病；在食品领域，l-半胱氨酸及其衍生物主要用于焙烤制品，包括面团改良、促进面筋形、改善风味等；此外，半胱氨酸产品还可作为抗氧化剂，用于美白祛斑。
4.随着l-半胱氨酸需求量的激增，以往直接利用毛发、羽毛等角蛋白进行酸水解生产l-半胱氨酸的方法，在产生废水、废渣的同时，产量也十分有限。目前，虽然生物工程技术的发展提供了更加高效环保的l-半胱氨酸生产方法，但仍然存在一些问题，例如，公开号为de19539952的德国发明专利申请，公开了在重组大肠杆菌细胞中利用葡萄糖直接合成l-半胱氨酸，但合成路径中o-乙酰丝氨酸巯基酶等一系列酶的参与，使反应受中间产物、终产物等反馈抑制严重，需要耦合敲入对产物不敏感的突变酶，且分离纯化较难。后续研究中，基于该原理的l-半胱氨酸生产方法，产量最高约为19.2g/l，仍有较大提升空间。公开号为cn102517352b的中国发明专利，公开了采用nahs为硫基供体，利用大肠杆菌色氨酸合成酶合成l-半胱氨酸的方法，其l-丝氨酸摩尔转化率为84.9～85.3％，该方法虽然提升了l-半胱氨酸的产量，但存在反应时间过长的缺点，耗时24h以上，导致生产效率低。
5.为满足市场对l-半胱氨酸的需求，需要构建一种稳定性更高、性能更好、反应时间更短，能够提高生产效率的色氨酸合成酶突变体，通过推广其应用，进一步提高l-半胱氨酸产量。
技术实现要素：6.本发明要解决的技术问题，是要提供一种色氨酸合成酶突变体，通过基因工程技术手段，构建酶突变体，以达到提高色氨酸合成酶的稳定性和催化活力，能够用于l-半胱氨酸高效合成的目的；
7.本发明的另外的目的，是要提供上述色氨酸合成酶突变体在合成l-胱氨酸及其衍生物中的应用，用于合成l-半胱氨酸、l-胱氨酸及l-半胱氨酸盐酸盐一水合物。
8.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
9.一种色氨酸合成酶突变体，它是将色氨酸合成酶α亚基的第51位氨基酸至第75位氨基酸连接于色氨酸合成酶β亚基的c端终止密码子之前，得色氨酸合成酶突变体；
10.其中，所述色氨酸合成酶来源于大肠杆菌k-12；
11.escherichia coli str.k-12substr.mg1655的色氨酸合成酶(ts)，ncbi登录号为nc_000913.3；其中，α亚基的第51位氨基酸至第75位氨基酸序列如seq id no.2所示，为：
12.gly ile pro phe ser asp pro leu ala asp gly pro thr ile gln asn ala thr leu arg ala phe ala ala gly。
13.所述连接的方式为直接连接或采用短连接序列linker间接连接。
14.作为本发明的一种限定，所述短连接序列linker的序列为gg、ggg或gga。间接连接可增加色氨酸合成酶突变体的灵活性。
15.作为本发明的另一种限定，该色氨酸合成酶突变体的核苷酸序列如seq id no.1所示，为：
16.atgacaacattacttaacccctattttggtgagtttggcggcatgtacgtgccacaaatcctgatgcctgctctgcgccagctggaagaagcttttgtcagtgcgcaaaaagatcctgaatttcaggctcagttcaacgacctgctgaaaaactatgccgggcgtccaaccgcgctgaccaaatgccagaacattacagccgggacgaacaccacgctgtatctcaagcgtgaagatttgctgcacggcggcgcgcataaaactaaccaggtgctggggcaggcgttgctggcgaagcggatgggtaaaaccgaaatcatcgccgaaaccggtgccggtcagcatggcgtggcgtcggcccttgccagcgccctgctcggcctgaaatgccgtatttatatgggtgccaaagacgttgaacgccagtcgcctaacgtttttcgtatgcgcttaatgggtgcggaagtgatcccggtgcatagcggttccgcgacgctgaaagatgcctgtaacgaggcgctgcgcgactggtccggtagttacgaaaccgcgcactatatgctgggcaccgcagctggcccgcatccttatccgaccattgtgcgtgagtttcagcggatgattggcgaagaaaccaaagcgcagattctggaaagagaaggtcgcctgccggatgccgttatcgcctgtgttggcggcggttcgaatgccatcggcatgtttgctgatttcatcaatgaaaccaacgtcggcctgattggtgtggagccaggtggtcacggtatcgaaactggcgagcacggcgcaccgctaaaacatggtcgcgtgggtatctatttcggtatgaaagcgccgatgatgcaaaccgaagacgggcagattgaagaatcttactccatctccgccggactggatttcccgtctgtcggcccacaacacgcgtatcttaacagcactggacgcgctgattacgtgtctattaccgatgatgaagcccttgaagccttcaaaacgctgtgcctgcacgaagggatcatcccggcgctggaatcctcccacgccctggcccatgcgttgaaaatgatgcgcgaaaacccggataaagagcagctactggtggttaacctttccggtcgcggcgataaagacatcttcaccgttcacgatattttgaaagcacgaggggaaatcggtatccccttctccgacccactggcggatggcccgacgattcaaaacgccactctgcgcgcctttgcggcaggttaa。
17.序列seq id no.1即为下文tsmut3的核苷酸序列。
18.其中，色氨酸合成酶突变体的序列中还可以包括点突变、序列前后各种标签的添加、其它位置的保守取代及氨基酸截短等不影响色氨酸合成酶突变体活性中心的突变。
19.作为本发明的进一步限定，色氨酸合成酶突变体的表达宿主为用于基因表达的细菌或真菌；包括本领域常见的宿主，例如大肠杆菌bl21(de3)、大肠杆菌bl21、大肠杆菌m15、枯草芽孢杆菌、酵母菌、曲霉、链霉等；色氨酸合成酶突变体的表达载体除去原核生物常用的pet载体，还包括各宿主体系配套的载体，其载体与宿主的整合方式不仅包括宿主内游离存在，还包括在基因组特定位置整合、随机位置整合；色氨酸合成酶突变体的表达方式也不限于在宿主内部表达和分泌表达。
20.本发明还提供上述色氨酸合成酶突变体的一种应用，采用色氨酸合成酶突变体催
化l-丝氨酸合成l-半胱氨酸。
21.作为本发明的限定，所述催化的反应液包括l-丝氨酸53～125g/l、磷酸吡哆醛0.1～1g/l和质量浓度为8～10％的硫化铵；
22.所述色氨酸合成酶突变体的用量为5～35g/l；
23.所述催化的温度为35～38℃，催化的时间为2～8h。
24.本发明还提供上述色氨酸合成酶突变体在l-胱氨酸制备中的应用，采用色氨酸合成酶突变体催化l-丝氨酸合成l-半胱氨酸后，经氧化反应将l-半胱氨酸合成l-胱氨酸。
25.本发明也提供了上述色氨酸合成酶突变体在l-半胱氨酸盐酸盐一水合物制备中的应用。
26.作为本发明的限定，采用色氨酸合成酶突变体催化l-丝氨酸合成l-半胱氨酸后，采用树脂层析法制备l-半胱氨酸盐酸盐一水物。
27.作为本发明的进一步限定，采用色氨酸合成酶突变体催化l-丝氨酸合成l-半胱氨酸后，经氧化反应将l-半胱氨酸合成l-胱氨酸，再采用电解还原法制备l-半胱氨酸盐酸盐一水物。
28.由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
29.①
本发明的色氨酸合成酶突变体是在分析蛋白晶体结构后，通过pcr法缩短α亚基长度至25个氨基酸，再进行重新拼接至β亚基的c端终止密码子前所得；本发明改变了野生型中色氨酸合成酶的一级结构，上述基因编辑所得的色氨酸合成酶突变体在提高色氨酸合成酶色氨酸合成能力的基础上，还显著提升了对l-半胱氨酸合成的催化活力，色氨酸合成酶突变体的稳定性、底物专一性均适于工业化生产l-半胱氨酸及其衍生物；
30.②
本发明所得的色氨酸合成酶突变体tsmut3催化l-半胱氨酸合成的能力，超过野生型的3倍；同时，tsmut3还具有效率高、加热至50℃后稳定性保持好等特性，在硫化铵为硫基供体的l-半胱氨酸合成反应中，催化活力为野生型的6倍，最高l-半胱氨酸生成率大于98％；
31.③
本发明所得的色氨酸合成酶突变体应用范围广，能够用于高效生产l-半胱氨酸、l-胱氨酸及l-半胱氨酸盐酸盐一水合物，上述产品生产过程中收率均大于90％，l-半胱氨酸盐酸盐一水合物纯度最高达99％；
32.本发明适用于工业化生产l-半胱氨酸及其衍生物。
33.下面结合附图及具体实施例对本发明作详细说明。
附图说明
34.图1为本发明实施例1中色氨酸合成酶突变体的拼接过程示意图。
具体实施方式
35.下面通过具体实施例和附图对本发明做进一步详细说明。应当理解，所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
36.本发明实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
37.实施例1色氨酸合成酶突变体的构建与表达
38.本实施例包括依次进行的以下步骤：
39.(一)色氨酸合成酶突变体的构建
40.ts野生型表达菌株的构建：根据escherichia coli str.k-12 substr.mg1655的野生型色氨酸合成酶序列(1316416-1318415)，结合大肠杆菌表达载体pet-21a的特点，选择连接ecor1的单切位点，将如表1所示的引物p1和p2，经pcr，构建入pet-21a表达载体。将验证后的阳性质粒转化入e.coli bl21(de3)，获得ts野生型表达菌株。其中，pcr的程序为：95℃10min，1个循环；95℃30s，55℃15s，72℃1min，共计30循环；72℃5min，1个循环。
41.表1引物序列
42.引物名称序列编号序列p1seq id no.35
’‑
gggaattcatgacaacattacttaacc-3’p2seq id no.45
’‑
ccggaattcttaactgcgcgtcgccgctttc-3’43.ts突变体表达菌株的构建：如图1所示，随机截断野生型中α亚基序列，形成30种不同长度的α亚基片段，以野生型中α亚基与β亚基连接的位置为α1，对各α亚基片段分别设计引物，将各α亚基片段分别拼接组合至野生型β亚基的c端，获得30种ts突变体序列。其中，根据α亚基片段的长度选择不同的拼接组合方式，当α亚基片段的长度在不包括α1位置时，大于100aa，采用overlap pcr方式拼接组合；当α亚基片段的长度在不包括α1位置时，小于100bp，则采用引物退火方式进行拼接组合。参照ts野生型表达菌株的构建方法分别构建ts突变体表达菌株，标记为tsmut表达菌株。
44.(二)色氨酸合成酶突变体的培养与表达
45.分别将ts野生型及tsmut表达菌株置于含浓度为100mg/l氨苄青霉素(抗性标记)的lb液体培养基，于37℃、200rpm条件下震荡培养。在菌体密度od600为0.7时，加入终浓度为0.2mm的iptg，于20℃诱导18h后，以6000rpm离心10min收集菌体，配制成浓度为80g/l，经超声裂解获得酶液，用于性能检测，以筛选出l-半胱氨酸合成能力强的tsmut。
46.实施例2色氨酸合成酶突变体的性能检测及筛选
47.本实施例对实施例1制得的ts野生型及tsmut酶液分别进行l-色氨酸和l-半胱氨酸的合成活力测定、显色反应检测、稳定性测定以及底物谱测试，以筛选出l-半胱氨酸合成能力强的色氨酸合成酶突变体。具体过程如下：
48.(1)合成活力测定：以900ul反应液和100ul待测酶液，配制ph 8.0的1ml反应体系，其中，反应液由1mm吲哚、80mm的l-丝氨酸、1mm plp和200mm pbk缓冲液配制而成；将反应体系于37℃反应10min，稀释后利用hplc测试l-色氨酸合成情况；hplc检测条件如下：色谱柱选择ods-2.5，4.6
×
150mm；流动相a相为0.1％ph 2.0的磷酸溶液，流动相b相为甲醇，流动相a相和b相体积比＝4:1；上样量为10ul；流速为0.8ml/min；检测温度为30℃；检测波长为205nm；其中，酶活力定义为：上述反应条件下，每min生成1um l-色氨酸为1u。同理测定l-半胱氨酸合成活力，结果如表2所示。
49.(2)显色反应检测：以900ul反应液和100ul待测酶液，配制ph 8.0的1ml反应体系，其中，反应液中各组分浓度为nahs 5g/l、l-丝氨酸80mm、plp 1mm和pbk缓冲液100mm；于37℃反应10min，稀释后利用茚三酮进行显色反应测试，和标准曲线对比，以百分比计，获得l-半胱氨酸合成量。其中，酶活力定义为：上述反应条件下，每min生成1um l-半胱氨酸所需要酶的量，定义为1u。同理测定l-色氨酸，结果如表2所示。
50.(3)稳定性测定：将酶液加热至50℃处理10min，降至室温后再通过l-半胱氨酸显色反应检测稳定性。结果如表2所示。
51.对上述性能检测结果进行分析，发现实施例1制得的tsmut1～tsmut5的l-半胱氨酸合成能力强，其中各tsmut的一级结构如表2所示。
52.表2性能检测结果
[0053][0054]
表2表明，tsmut1～tsmut5的l-色氨酸的合成活力也较野生有提升，该现象与β亚基含有l-色氨酸合成功能相一致。其中，tsmut3与tsmut4明显增强l-半胱氨酸的合成能力，分别为野生型的4.07以及2.38倍，表明该2种设计选择的α亚基区段明显加强了该酶的l-半胱氨酸合成能力。在稳定性分析中，相较于野生型，tsmut3的稳定性明显增强，可保留60％以上的催化活力。tsmut3的基因序列如seq id no.1所示。
[0055]
(4)底物谱测试：为进一步探讨ts的一级结构改变是否能够带来更合适的硫基供体，参照(2)中的反应体系，将nahs分别替换为(na)2s和(nh4)2s两种常见硫基供体，再进行(na)2s组和(nh4)2s组两组显色反应，控制各组底物中s元素浓度相同，其中，以nahs组合成的l-半胱氨酸为100％，计算(na)2s组和(nh4)2s组的l-半胱氨酸合成量。结果如表3所示。
[0056]
表3底物谱测试结果
[0057][0058]
由表3可知，ts野生型及tsmut1～tsmut5六种酶，在底物含(na)2s的体系中，l-半胱氨酸合成能力都比以nahs为硫基供体的体系差。尤其，tsmut1～tsmut5中，tsmut1、tsmut3、tsmut4对(nh4)2s为硫基供体表现出更高的倾向，尤其tsmut3以(nh4)2s为硫基供体时，l-半胱氨酸合成能力约为ts野生型的50％以上。
[0059]
综上所述，通过分析l-色氨酸和l-半胱氨酸的合成活力测定、显色反应检测、稳定性测定以及底物谱测试的结果，实施例1制得的所有色氨酸合成酶突变体中，tsmut1～tsmut5综合表现强于野生型，尤其tsmut3的l-色氨酸和l-半胱氨酸合成能力均更强，且还
表现出高效利用(nh4)2s为硫基供体的能力。
[0060]
实施例3～8色氨酸合成酶突变体用于催化l-半胱氨酸合成的方法
[0061]
实施例3为一种色氨酸合成酶突变体用于催化l-半胱氨酸合成的方法，具体为，1l体系：取少量pbk缓冲液使l-丝氨酸53g完全溶解，再加入实施例1制得的tsmut3酶液、磷酸吡哆醛1g和质量浓度为16％的硫化铵，体系中，tsmut3酶的终浓度为10g/l，硫化铵终浓度为8％，pbk缓冲液终浓度200mm；以100rpm搅拌，利用ph电极监控补充硫化铵，维持ph在8.0～9.5，于37℃反应2h，反应结束后所得反应液进行显色反应检测，结果表明，成功合成l-半胱氨酸，l-半胱氨酸含量为60.70g/l，l-半胱氨酸生成率大于98％。
[0062]
实施例4～8分别为一种色氨酸合成酶突变体用于催化l-半胱氨酸合成的方法，具体方法与实施例3基本相同，不同之处仅在于参数设置不同，具体区别见表4：
[0063]
表4实施例4～8参数表
[0064][0065]
实施例4～8其它部分的内容与实施例3相同。
[0066]
对实施例3～8反应结束后所得反应液进行显色反应检测，结果表明，均成功合成l-半胱氨酸，l-半胱氨酸含量为53.13～117.60g/l。
[0067]
对比例ts野生型及tsmut3对不同浓度反应底物的催化能力
[0068]
本对比例用于对比在底物为不同浓度l-丝氨酸和plp的条件下，ts野生型及tsmut3对l-半胱氨酸合成的催化能力。本对比例的催化反应体系与实施例3基本相同，l-丝氨酸和plp浓度的不同之处如表5所示，其中，ts野生型组采用ts野生型代替tsmut3。通过显色反应检测不同浓度l-丝氨酸和plp的条件下，ts野生型组和tsmut3组的l-半胱氨酸生成率，结果如表5所示：
[0069]
表5底物浓度设置及l-半胱氨酸生成率
[0070][0071]
结果表明，ts野生型虽然具有一定转化l-丝氨酸生成l-半胱氨酸能力，但水平较低。tsmut3相对于野生型，在l-丝氨酸浓度53～125g/l时，生成率为84.31～98.35％，最高l-半胱氨酸生成率大于98％，表现更好的催化能力。
[0072]
实施例9色氨酸合成酶突变体用于l-胱氨酸的制备
[0073]
本实施例将实施例3反应所得l-半胱氨酸含量为55g/l的反应液用于制备l-胱氨酸。具体方法为：取2l反应液，调节ph至2.0，于100℃静置10min，使体系中无h2s气体，采用500nm陶瓷膜过滤除去变性蛋白等固体。再加入1.0％的活性炭，于60℃脱色30min，过滤除炭，回收滤液。向滤液中持续通入压缩空气，在氧气作用下l-半胱氨酸发生氧化反应生成l-胱氨酸，连续氧化24h，取上清检测l-半胱氨酸浓度，至l-半胱氨酸浓度小于0.1g/l，则认为l-半胱氨酸已完全氧化。氧化结束后，并继续搅拌2h，析出沉淀，真空抽滤，纯水洗涤沉淀，真空抽滤得到湿品，烘干得l-胱氨酸粗品。
[0074]
经检测，本实施例的收率达98％。
[0075]
实施例10树脂层析法制备l-半胱氨酸盐酸盐一水合物
[0076]
本实施例将实施例3反应所得l-半胱氨酸含量为55g/l的反应液用于树脂层析法制备l-半胱氨酸盐酸盐一水合物。
[0077]
具体方法为：取2l反应液，用6mol/l的盐酸溶液调节ph至2.0，于100℃静置10min，使体系中无h2s气体，采用500nm陶瓷膜过滤除去变性蛋白等固体。再加入1.0％的活性炭，于60℃脱色30min，过滤除炭，回收滤液。使用6mol/l的盐酸将滤液调节ph至5.0，滤除固体，所得滤液经限定分子量5000的膜超滤装置，超滤浓缩，所得滤液再进入强阳离子树脂lx160层析柱，以2mol/l的盐酸洗脱层析液，所得洗脱液再以限定分子量200的膜纳滤，纳滤液体经减压浓缩、低温冷却结晶、离心分离、干燥，得l-半胱氨酸盐酸盐一水物。
[0078]
经检测，本实施例的收率达95％。
[0079]
实施例11电解还原法制备l-半胱氨酸盐酸盐一水合物
[0080]
本实施例将实施例9所得l-胱氨酸用于电解还原法制备l-半胱氨酸盐酸盐一水合物。
[0081]
具体方法为：取l-胱氨酸100g和6mol/l盐酸加入至电解反应器，室温搅拌1.5h使其充分溶解，经过滤，将滤液转入电解槽阴极区；阳电解槽极区加入6mol/l盐酸，使液面与阴极区保持相平。在50℃条件下，通电，控制电流密度为5a/dm2，电解11h。电解过程中持续向阳极区补加6mol/l盐酸，维持原有体积。反应达到终点前，每隔15min，取阴极区电解液检测旋光度，直至阴极电解液的旋光值不再增高，即反应达到终点。电解结束后，将阴极电解液转入脱色反应器，维持温度为80℃，加入1％的活性炭，脱色30min后过滤，滤液经减压浓缩、低温冷却结晶、离心分离、干燥，得l-半胱氨酸盐酸盐一水物。
[0082]
本实施例所得l-半胱氨酸盐酸盐一水物的收率大于99％，纯度大于99％。
[0083]
在另外的实施方式中，l-胱氨酸的用量为100～500g之间的任意数值，均得到纯度超过99％的l-半胱氨酸盐酸盐一水物。
[0084]
上述结果表明，本发明成功构建了能够用于合成l-半胱氨酸及其衍生物的色氨酸合成酶突变体，显著增强ts催化色氨酸合成的能力。此外，酶突变体中的tsmut3催化l-半胱氨酸合成的能力，超过野生型的3倍。同时，tsmut3还具有稳定性好、效率高等特性，在硫化铵为硫基供体的l-半胱氨酸合成反应中，催化活力为野生型的6倍，最高l-半胱氨酸生成率大于98％。
[0085]
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限定本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对
上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明权利要求保护的范围之内。
技术特征：1.一种色氨酸合成酶突变体，其特征在于，它是将色氨酸合成酶α亚基的第51位氨基酸至第75位氨基酸连接于色氨酸合成酶β亚基的c端终止密码子之前，即得所述的色氨酸合成酶突变体；其中，所述色氨酸合成酶来源于大肠杆菌k-12；所述连接的方式为直接连接或采用短连接序列linker间接连接。2.根据权利要求1所述的色氨酸合成酶突变体，其特征在于，所述短连接序列linker的序列为gg、ggg或gga。3.根据权利要求1所述的色氨酸合成酶突变体，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.1所示。4.根据权利要求1～3中任一项所述的色氨酸合成酶突变体，其特征在于，所述色氨酸合成酶突变体的表达宿主为用于基因表达的细菌或真菌。5.权利要求1～4中任一项所述的色氨酸合成酶突变体的一种应用，其特征在于，采用色氨酸合成酶突变体催化l-丝氨酸合成l-半胱氨酸。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述催化的反应液包括l-丝氨酸53～125g/l、磷酸吡哆醛0.1～1g/l和质量浓度为8～10％的硫化铵；所述色氨酸合成酶突变体的用量为5～35g/l；所述催化的温度为35～38℃，时间为2～8h，ph为8.0～9.5。7.权利要求1～4中任一项所述的色氨酸合成酶突变体在l-胱氨酸制备中的应用，其特征在于，采用色氨酸合成酶突变体催化l-丝氨酸合成l-半胱氨酸后，经氧化反应将l-半胱氨酸合成l-胱氨酸。8.权利要求1～4中任一项所述的色氨酸合成酶突变体在l-半胱氨酸盐酸盐一水合物制备中的应用。9.根据权利要求8所述的色氨酸合成酶突变体的应用，其特征在于，采用色氨酸合成酶突变体催化l-丝氨酸合成l-半胱氨酸后，采用树脂层析法制备l-半胱氨酸盐酸盐一水物。10.根据权利要求8所述的色氨酸合成酶突变体的应用，其特征在于，采用色氨酸合成酶突变体催化l-丝氨酸合成l-半胱氨酸后，经氧化反应将l-半胱氨酸合成l-胱氨酸，再采用电解还原法制备l-半胱氨酸盐酸盐一水物。
技术总结本发明公开了一种色氨酸合成酶突变体及其应用，本发明是利用基因工程手段，将色氨酸合成酶α亚基的第51位氨基酸至第75位氨基酸采用直接或短连接序列Linker间接连接的方式，连接于色氨酸合成酶β亚基的C端终止密码子之前，即得色氨酸合成酶突变体；本发明将色氨酸合成酶突变体用于工业合成L-半胱氨酸及其衍生物能够显著提高生产效率及产品产量，酶突变体中的TsMUT3催化L-半胱氨酸合成的能力，超过野生型的3倍；另外，TsMUT3在50℃条件下稳定性好，更加倾向硫化铵为硫基供体的L-半胱氨酸合成反应，L-半胱氨酸生成率能够大于98％。本发明适用于工业化生产L-半胱氨酸及其衍生物。半胱氨酸及其衍生物。半胱氨酸及其衍生物。
技术研发人员：秦成 任丽梅 张礼 汤燕 靳杰
受保护的技术使用者：南通紫琅生物医药科技有限公司
技术研发日：2022.06.22
技术公布日：2022/11/1
