化合物在制备抗盖塔病毒感染的药物中的应用

1.本发明涉及医药领域，具体涉及化合物在制备抗盖塔病毒感染的药物中的应用。


背景技术：

2.getah virus(getv)属于披膜病毒科甲病毒属塞姆利基森林病毒组(semliki forest virus,sfv)中的一种虫媒病毒，sfv组还包含基孔肯雅亚病毒(chikungunya virus,chikv)，塞姆利基森林病毒(semliki forest virus,sfv),玛亚罗病毒(mayaro virus,mayv),乌纳病毒(una virus,unav),比巴鲁病毒(bebaru virus,bebv)和欧尼恩病毒(o’nyong-nyong virus,onnv)，其中chikv,onnv和mayv对易感人群有极高发病率和致死率。
3.getv最初来源于蚊子，在1960-2000的40年间只局限于马和猪的病例，而进入本世纪仅仅20年时间已扩大至牛、羊、犬、袋鼠、狐狸、野鸟及兔、豚鼠、大鼠、仓鼠等多种动物，同时临床病例报道的频率也在加快。更为令人担忧的是，在发热病人甚至健康人群中检出了抗getv抗体。虽然迄今为止尚无人类感染发病的有关报道，但国内外多项血清流行病学调查显示人体内存在有getv抗体，预示该病毒可以感染人。由于多种动物感染发病以及蚊虫普遍带毒，在我国广大农村地区的猪等家畜与人群又接触紧密，getv极具可能在人群中流行，在未来的公共卫生事件中可能存在较大的潜在风险。
4.科学家使用冷冻电子显微镜来研究甲病毒属中各类病毒结构的脚步从未停止，分辨率从到所研究的病毒包含barmah forest virus(bfv)、eeev、weev、veev、chikv、sinv、mayv等。目前所解析出的甲病毒的冷冻电镜密度图表明：甲病毒具有相同结构组成。甲病毒rna以无序状态隐藏在由240个拷贝capsid(衣壳)组成的二十面体核心。向外突出的e1和e2结构蛋白形成异源二聚体(其中80个拷贝三聚体形成二十面体病毒外壳)，异源二聚体跨过磷脂膜与衣壳相连。而getv是一种带有囊膜的单股正链rna病毒。成熟的盖塔病毒是一个约70nm的球状颗粒，约11kb的基因组由2个开放阅读框(orf)组成，并含有一个编码和一个多聚蛋白，其中，n端的多聚蛋白包含4种非结构蛋白(non-structural proteins，即nsp1、nsp2、nsp3和nsp4)，c端的多聚蛋白是由5种结构蛋白组成(structural proteins,capsid-e3-e2-6k-e1)。现有技术对盖塔病毒的研究主要集中在加强getv的传播媒介以及猪、马和牛等动物感染的检测与监测、进口家畜及其成品的检疫等工作，目前所报道的文献中也均集中在盖塔病毒的检测和疫苗预防等方面，治疗盖塔病毒感染的药物方面的研究几乎没有，因此尚缺乏能够有效治疗盖塔病毒感染的药物。此外，现有技术中也存在利用分子对接软件和打分软件筛选药物的方法，但是现有的筛选方法筛选结果不准确，无法精确进行筛选，且现有的筛选法方法缺乏验证步骤。


技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术存在的问题，本发明的目的之一在于提供式i所示的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂化物在制备预防和/或治疗盖塔病毒感染的药物中
的应用；
[0006][0007]
本发明的目的之二在于提供一种预防和/或治疗盖塔病毒感染的药物组合物。
[0008]
本发明的目的之三在于提供一种筛选预防和/或治疗盖塔病毒感染的化合物的方法。
[0009]
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
[0010]
本发明的第一个方面在于提供式i所示的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂化物在制备预防和/或治疗盖塔病毒感染的药物中的应用，
[0011][0012]
其中，r1选自cl、f、br、h、c
1～5
烷基、c
1～5
烷氧基；
[0013]
r2选自h、cl、f、br、c
1～5
烷基；
[0014]
r3选自f、cl、br、c
1～5
烷基或c
1～5
烷氧基羰基；
[0015]
n为0，1，2，3，4或5；
[0016]
m为0，1，2，3，4或5。
[0017]
优选地，所述c
1～5
烷基选自-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3、-ch2ch2ch2ch3、-ch2ch2ch2ch2ch3、-ch(ch3)2、-c(ch3)3、-ch2ch(ch3)2、-ch(ch3)ch2ch3、-ch(ch3)ch2ch2ch3、-ch2ch(ch3)ch2ch3、-ch2ch2ch(ch3)2、-ch(ch2ch3)2、-ch2c(ch3)3、-c(ch3)2ch2ch3、-ch(ch3)ch(ch3)2。
[0018]
优选地，所述c
1～5
烷氧基选自-och3、-och2ch3、-och2ch2ch3、-och2ch2ch2ch3、-och2ch2ch2ch2ch3、-och(ch3)2、-oc(ch3)3、-och2ch(ch3)2、-och(ch3)ch2ch3、-och(ch3)ch2ch2ch3、-och2ch(ch3)ch2ch3、-och2ch2ch(ch3)2、-och(ch2ch3)2、-och2c(ch3)3、-oc(ch3)2ch2ch3、-och(ch3)ch(ch3)2。
[0019]
优选地，所述c
1～5
烷氧基羰基选自-cooch3、-cooch2ch3、-cooch2ch2ch3、-cooch2ch2ch2ch3、-cooch2ch2ch2ch2ch3、-cooch(ch3)2、-cooc(ch3)3、-cooch2ch(ch3)2、-cooch(ch3)ch2ch3、-cooch(ch3)ch2ch2ch3、-cooch2ch(ch3)ch2ch3、-cooch2ch2ch(ch3)2、-cooch(ch2ch3)2、-cooch2c(ch3)3、-cooc(ch3)2ch2ch3、-cooch(ch3)ch(ch3)2。
[0020]
优选地，式i中，r1选自cl、f、br、h、c
1～3
烷基、c
1～3
烷氧基；进一步优选地，r1选自cl、f、h、甲基、甲氧基。
[0021]
优选地，式i中，r2选自h、cl、f、br、c
1～3
烷基；进一步优选地，r2选自h、cl、f、甲基。
[0022]
优选地，式i中，r3选自f、cl、c
1～3
烷基或c
1～3
烷氧基羰基；进一步优选地，r3选自cl、c
1～3
烷基或乙氧基羰基。
[0023]
优选地，式i中，n为0，1或2；进一步优选地，n为0或1。
[0024]
优选地，式i中，m为0，1或2。
[0025]
优选地，所述c
1～3
烷基选自-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3、-ch(ch3)2。
[0026]
优选地，所述c
1～3
烷氧基选自-och3、-och2ch3、-och2ch2ch3、-och(ch3)2。
[0027]
优选地，所述c
1～3
烷氧基羰基选自-cooch3、-cooch2ch3、-cooch2ch2ch3、-cooch(ch3)2。
[0028]
优选地，式i所示的化合物选自：优选地，式i所示的化合物选自：
[0029]
[0030][0031]
优选地，式i所示的化合物为
[0032]
优选地，上述式i中的化合物可以采用以下制备方法制得：包括以下步骤：
[0033]
s1：使与cs2、clch2co2me反应，制得使与clch2cocl反应，制得然后与r2基团取代的吲哚满二酮反应，制得
[0034]
s2：使混合反应，制得所述式i所示的化合物。
[0035]
优选地，所述药物包括治疗有效量的式i所示的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂化物。
[0036]
优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。
[0037]
优选地，所述药物的剂型为丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂或注射剂。
[0038]
本发明中的抗盖塔病毒感染是指可以预防或治疗盖塔病毒感染所引起的一系列疾病。
[0039]
本发明中的溶剂化物是指药物结晶含有溶剂分子。
[0040]
优选地，所述盖塔病毒来源于牛、羊、犬、袋鼠、狐狸、鸟、兔、豚鼠、大鼠或仓鼠。
[0041]
本发明的第二个方面在于提供一种预防和/或治疗盖塔病毒感染的药物组合物，包括治疗有效量的式i所示的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂化物，
[0042][0043]
其中，r1、r2、r3、n、m如上述所定义。
[0044]
优选地，所述式i所示的化合物为
[0045]
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。
[0046]
优选地，所述药物组合物的剂型为丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂或注射剂。
[0047]
术语“治疗有效量”是指当给予盖塔病毒感染者本发明药物时足以产生有益的或所希望的效果；所述的效果可以是预防盖塔病毒的感染，和/或治疗盖塔病毒感染相关的临床症状或指标。但应认识到，本发明药物的总日用量须在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的感染者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的感染者的感染严重程度；所采用的具体药物的活性；所采用的具体药物或剂型；感染者的体重、一般健康状况、饮食量；所采用的药物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体药物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，药物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加
剂量，直到得到所需的效果。
[0048]
术语“药学上可接受的辅料”是无毒性、与活性成分相容且其他方面生物学性质上适用于生物体的物质。特定辅料的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。药学上可接受的辅料其实例包括但不限于药学领域常规的溶剂、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、粘合剂、润滑剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂、和抗氧化剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。
[0049]
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机氨或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氢根，磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸或甲磺酸等类似的酸；还包括氨基酸(如精氨酸等)的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐(参见berge et al.,"pharmaceutical salts",journal of pharmaceutical science 66:1-19(1977))。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。
[0050]
优选地，以常规方式使盐与碱或酸接触，再分离母体化合物，由此再生化合物的中性形式。化合物的母体形式与其各种盐的形式的不同之处在于某些物理性质，例如在极性溶剂中的溶解度不同。
[0051]
本文所用的“药学上可接受的盐”属于本发明化合物的衍生物，其中，通过与酸成盐或与碱成盐的方式修饰所述母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于：碱基比如胺的无机酸或有机酸盐、酸根比如羧酸的碱金属或有机盐等等。药学上可接受的盐包括常规的无毒性的盐或母体化合物的季铵盐，例如无毒的无机酸或有机酸所形成的盐。常规的无毒性的盐包括但不限于那些衍生自无机酸和有机酸的盐，所述的无机酸或有机酸选自2-乙酰氧基苯甲酸、2-羟基乙磺酸、乙酸、抗坏血酸、苯磺酸、苯甲酸、碳酸氢根、碳酸、柠檬酸、依地酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、富马酸、葡庚糖、葡糖酸、谷氨酸、乙醇酸、氢溴酸、盐酸、氢碘酸盐、羟基、羟萘、羟乙磺酸、乳酸、乳糖、十二烷基磺酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲烷磺酸、硝酸、草酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、多聚半乳糖醛、丙酸、水杨酸、硬脂酸、亚乙酸、琥珀酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、硫酸、单宁、酒石酸或对甲苯磺酸。
[0052]
本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。一般地，优选醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等非水介质。
[0053]
本发明所述的“异构体”包括几何异构体以及立体异构体，例如顺反异构体、对映异构体、非对映异构体、互变异构体、及其外消旋混合物和其他混合物，所有这些混合物都
属于本发明的范围之内。术语“对映异构体”是指互为镜像关系的立体异构体。术语“互变异构体”是指官能团异构体的一种，其通过一个或多个双键位移而具有不同的氢的连接点，例如，酮和它的烯醇形式是酮-烯醇互变异构体。术语“非对映异构体”是指分子具有两个或多个手性中心，并且分子间为非镜像的关系的立体异构体。术语“顺反异构体”是指分子中双键或者成环碳原子单键不能自由旋转而存在的不同空间构型。
[0054]
本发明中，取代基r3在每一种情况下的定义都是独立的，取代基可以相同也可以不同；一般情况下，该变量可选自同一技术方案的相同或不同取代基团；例如，当通式(i)中m为2时，则苯环被两个r3基团取代，其中每个r3的定义是相互独立的。
[0055]
本发明的第三个方面在于提供一种筛选预防和/或治疗盖塔病毒感染的化合物的方法，括以下步骤：
[0056]
s1：获取抗病毒分子与抗病毒特性的映射关系，构建模型；
[0057]
s2：从数据库中筛选符合模型的化合物，得到初筛化合物；
[0058]
s3：以盖塔病毒的蛋白质为底物，以抗病毒药物瑞德西韦为分子探针，使用打分软件进行评估，从盖塔病毒的蛋白质中筛选出结合位点；
[0059]
s4：将初筛化合物与盖塔病毒的蛋白质中的结合位点进行分子对接，并基于结合参数进行筛选，得到目标化合物。
[0060]
优选地，所述结合参数包括结合能、构象。
[0061]
本发明中的构象是指一个分子中，不改变共价键结构，仅单键周围的原子放置所产生的空间排布。一种构象改变为另一种构象时，不要求共价键的断裂和重新形成。构象改变不会改变分子的光学活性。
[0062]
结合能的计算公式为：其中加和是对所有可以相对移动的原子对，通常不包括1-4相互作用，即被连续3个共价键隔开的原子。这里，每个原子i被分配一个类型ti，并且是定义原子间距离(r
ij
)的一组对称的相互作用函数。
[0063]
本发明的有益效果是：本发明中式i的化合物具有优异的预防或治疗盖塔病毒感染的效果，同时对正常细胞无明显的毒副作用，在较低的浓度即可达到抑制盖塔病毒的作用。此外，本发明中的式i的化合物通过结合盖塔病毒中的e2结构蛋白，破坏盖塔病毒的e1-e2相互作用，阻碍病毒颗粒的组装，进而干扰病毒感染和复制，在预防或治疗盖塔病毒感染时的疗效明显且不易产生抗药性。具体而言，本发明式i的化合物在12.5μmol/l左右的浓度下即具有明显的抗病毒活性，且在浓度为3.125～50μmol/l的范围内均不具有细胞毒性。
[0064]
本发明中的筛选方法简单，易操作，筛选准确度和效率高。此外，本发明中的筛选方法对初筛化合物进行了验证步骤，具体为以capsid-e2-e1结构为靶标，选用了抗病毒药物瑞德西韦为小分子探针，从盖塔病毒中筛选出一系列的结合位点，通过初筛化合物与结合位点的结合能和分子构象，从而筛选出预防和/或治疗盖塔病毒的化合物，筛选出的化合物的疗效好，结果准确。
附图说明
[0065]
图1为本发明中的盖塔病毒的cryo-em结构图。
[0066]
图2为本发明化合物1与盖塔病毒蛋白质结合的预测图。
[0067]
图3为图2中化合物1与盖塔病毒蛋白质结合位置处的局部放大图。
[0068]
图4为本发明化合物1的细胞毒性测试图。
[0069]
图5为本发明化合物1的抗病毒活性测试图。
具体实施方式
[0070]
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步详细说明，但本发明的实施和保护不限于此。需要指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
[0071]
本发明利用cryo-em(冷冻电子显微镜)对一株可导致妊娠母鼠出现繁殖障碍的getv-v1毒株，进行结构解析，具体见图1，其中，图1(a)是盖塔病毒的外表面图，由图1(a)可以看出，盖塔病毒外表面具有指定的5次、3次和2次对称轴；图1(b)是盖塔病毒的截面图；图1(c)为盖塔病毒的电子密度图；图1(d)为盖塔病毒的原子模型图；图1(e)为e1-e2-衣壳异三聚体的原子模型。从原子分辨率map中，新鉴定19个相互作用力(氢键或盐桥)在维持病毒整体结构稳定中发挥重要作用，在颗粒表面发现并搭建原子模型的8个糖基化位点参与受体抗体识别和病毒免疫逃逸，在内层磷脂膜附近的e1/e2上搭建原子模型5个s-acylation位点(s-酰化位点)贡献于病毒组装和跨膜区稳定，而由e1的tm helix(跨膜螺旋区)、e2的tm helix和domain d(d区域)形成的疏水性口袋中及附近鉴定出的1个二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)和3个胆固醇对维持e1/e2结构稳定价值极大，尤其口袋中的dopc和胆固醇。
[0072]
getv病毒由capsid、e3、e2、6k和e1组成：
[0073]
capsid(衣壳)的氨基酸序列：
[0074]
mnyiptqtfygrrwrprpayrpwrvpmqpappmvipelqtpivqaqqmqqlisavsalttkqngkapkkpkkkpqkakakkneqqkknenkkpppkqknpakkkkpgkrermcmkiendcifevkldgkvtgyaclvgdkvmkpahvkgvidnpdlakltykksskydlecaqipvhmksdaskythekpeghynwhhgavqysggrftiptgagkpgdsgrpifdnkgrvvaivlgganegartalsvvtwtkdmvtrytpegteew
[0075]
e2的氨基酸序列：
[0076]
svtehfnvykatkpylaycadcgdgqfcyspvaiekirdeasdgmikiqvaaqiginkggthehnkiryiaghdmkeanrdslqvytsgvcairgtmghfivaycppgdelkvqfqdaeshtqackvqykhapapvgrekftvrphfgievpcttyqlttapteeeidmhtppdipditllsqqsgnvkitaggktirynctcgsgnvgttssdktinsckiaqchaavtnhdkwqytssfvpradqlsrkgkvhvpfpltnstcrvpvarapgvtygkreltvklhpdhptlltyrslgadprpyeewidryvertipvtedgieyrwgnnppvrlwaqlttegkphgwpheiilyyyglypaatiaavsaaglavvlsllascymfatarrkcltpyaltpgavvpvtlgvlccapraha
[0077]
e1的氨基酸序列：
[0078]
yehtatipnvvgfpykahierngfspmtlqlevlgtsleptlnleyitceyktvvpspyikccgtsecrsmerpdyqcqvytgvypfmwggaycfcdtentqlseayvdrsdvckhdhaaaykahtaamkatirisygnlnqtttafvngehtvtvggsrftfgpistawtpfdnkivvykndvynqdfppygsgqpgrfgdiqsrtveskdlyantalklsrpssgtvhvpytqtpsgfkywlkergtslndkapfgcviktnpvraencavgnipvsmdipdtaftrvidapavtnle
cqvavcthssdfggiatltfktdkpgkcavhshsnvatiqeaavdiktdgkitlhfstasaspafkvsvcsakttctaaceppkdhivpygashnnqvfpdmsgtamtwvqrvagglggltlaavavlilvtcvtmrr
[0079]
本发明利用cryo-em(冷冻电子显微镜)对getv-v1毒株进行结构解析，从而明确了盖塔病毒的结构。
[0080]
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细的陈述：
[0081]
本发明提供一种筛选预防和/或治疗盖塔病毒感染的化合物的方法，具体步骤如下：
[0082]
我们采用了一种基于几何深度学习(geometric deep learning)的方法(苏州云昇医药科技有限公司研发的方法)，选取一些符合商业可得性，化学多样性的抗病毒分子，获得现有抗病毒分子与抗病毒特性的映射关系，并基于现有抗病毒分子与抗病毒特性的映射关系构建筛选模型，模型是基于图学习的深度学习网络(graph-based deep learning)，然后运用筛选模型去预测大规模分子库内的化合物的抗病毒特性，用以发现潜在的苗头化合物。最后根据预测分数进行分子排序，再根据预测理化性质来选择筛选出苗头化合物，最后通过分子对接交叉验证筛选出的化合物。
[0083]
分子对接交叉验证初筛出的化合物的方法具体为：
[0084]
首先，对盖塔病毒中的蛋白质(sub1，sub2，sub3，单体以及四聚物；其中，sub1，sub2，sub3是盖塔病毒蛋白质中e2结构蛋白的三个子域名，单体是e1-e2-衣壳，四聚体是由四个单体组装而成)进行了三维空间网格的划分，间距为20埃。然后以这些网格为中心，以15埃为半径，选用了抗病毒药物瑞德西韦为小分子探针，利用对接软件进行了打分，从而筛选出一系列的结合位点。对于每个网格点，选取了其中最好的结合姿态的打分作为该位点作为结合口袋的评估。接下来对这些结合位点逐个进行了考察，从而选出最终的结合位点，该结合位点为底物结合凹槽，可以用于下一步大规模小分子库筛选。
[0085]
然后筛选了包含10157个小分子的生命化学和lc抗病毒小分子库。对于更全面的小分子库zinc的700多万个分子，我们首先随机选取了100万个进行了分子对接，从lc抗病毒小分子库和zinc库中总共筛选出50个打分最高的小分子，再对剩余600万个zinc库中的小分子进行了相似性检查，在该检查中，与50个小分子中的任意一个相似性大于0.6者，即可被选出来与盖塔病毒的蛋白质中的结合位点进行对接。在这些分子对接中，为了增加计算效率，对于每个小分子，对接时考察了5个构像，使用打分软件进行打分，并根据结合能和分子构象进行筛选，从而筛选出了本发明中的预防和/或治疗盖塔病毒感染的化合物1。
[0086]
化合物1，分子式为：化学名称为：4-(2-{3-[(5z)-3-[(2-氯苯基)甲基]-4-氧代-2-磺胺基-1,3-噻唑烷-5-亚基]-2-氧代-2,3-二氢-1h-吲哚-1-基}乙酰胺)苯甲酸乙酯，分子式为：c
29h22
cln3o5s2，该化合物的cas号为：617696-38-5。
[0087]
对化合物1的分子结构进一步优化得到化合物2～化合物59，化合物2～化合物59的分子式如下：
[0088]
[0089]
[0090][0091]
然后将上述化合物1～化合物59分别与盖塔病毒的蛋白质进行结合预测，同时计算化合物1～化合物59的结合能，计算得到的化合物1～化合物59的结合能如下表1所示：
[0092]
表1化合物1～59的结合能
[0093]
[0094][0095]
由表1可知，化合物1～化合物59的结合能在-7.9～-9.8kcal/mol之间，由此可知，化合物1～化合物59均与盖塔病毒的蛋白质具有较好的结合力。
[0096]
化合物1至化合物59均是与盖塔病毒的位于e2蛋白的d子区域(subdomain d)的结合口袋，与由e2蛋白的tm helix(跨膜螺旋区)和d子区域、e1蛋白的tm helix形成的疏水性口袋相近。研究表明d子区域在维持疏水性口袋稳定性方面起重要作用，还影响疏水性口袋中脂质释放和e1-e2-capsid整体结构的大幅度构象变化。依此推测上述化合物1～化合物59是通过破坏e1-e2相互作用，阻碍病毒颗粒的组装，进而干扰病毒感染和复制。
[0097]
本发明将化合物1～化合物59与盖塔病毒的蛋白质进行结合，并对结合位置进行预测，我们对预测的最优结合构象进行相互作用的分析已明确蛋白上的作用位点，即结合口袋的具体位置。其中，以化合物1为例，化合物1与盖塔病毒的蛋白质结合预测最优结合构象如图2和图3所示。具体不同种类的相互作用如下表2～4所示：
[0098]
表2蛋白质与化合物产生疏水相互作用位点
[0099]
序号蛋白质残基aa(氨基酸简称)1277tyr2279lys
3320val4337leu5338trp6340gln
[0100]
表3蛋白质与化合物产生氢键相互作用的位点
[0101]
序号蛋白质残基aa(氨基酸简称)1338trp
[0102]
表4蛋白质与化合物产生π-π堆叠相互作用的位点
[0103]
序号蛋白质残基aa(氨基酸简称)1277tyr
[0104]
由图2～3和表2～4可知，化合物1分别与277tyr,279lys,320val,337leu,338trp和340gln有疏水相互作用；化合物1和338trp有氢键相互作用；化合物1和277tyr形成π-π堆叠相互作用；因此，本发明中的化合物1与盖塔病毒的蛋白质中的结合位点具有较好的结合性能。
[0105]
然后对化合物1进行细胞毒性测试和抗盖塔病毒活性测试，具体如下：
[0106]
首先使用cck-8试剂盒来评价上述化合物对体外培养的细胞的毒性。cck-8试剂盒购买于donjindo公司，根据提供的协议测量上述化合物处理的bhk21细胞的细胞活力。将bhk21细胞接种到96孔板中并培养至80％密度的单层细胞，然后向不同的孔内加入不同浓度的上述化合物(化合物的浓度分别为：50μmol/l，25μmol/l，12.5μmol/l，6.25μmol/l，3.125μmol/l)作为实验组，对照组加入0.1％dmso，空白组不添加任何化合物或溶剂，分别处理实验组、对照组和空白组的细胞24h之后，将cck-8溶液加入到每个孔中，并在37℃下进一步培养2h。使用spark 10m(多功能微孔板检测仪)测量450nm处的吸光度，测试结果如图4所示。从图4可以看出，添加不同浓度(3.125～50μmol/l)的c
29h22
cln3o5s2药物组和不添加药物组在450nm处的吸光度相差很小，表明本发明中的化合物c
29h22
cln3o5s2在浓度为3.125～50μmol/l时均对细胞无明显的毒性。
[0107]
随后，在细胞水平上检测上述化合物的抗病毒活性，采用固定病毒量与等量系列倍比稀释的化合物混合的方法。将bhk21细胞接种到96孔板中并培养至80％密度的单层细胞。按照100tcid
50
接种的getah virus至每孔细胞，孵育0.5h后弃掉病毒液后快速添加100μl的浓度分别为50μm，25μm，12.5μm，6.25μm，3.125μm(此处出现的μm是指μmol/l)的上述化合物至每孔细胞，在5％co2，37℃下孵育48h后，使用reed-muench计算公式(reed-muench计算公式为：距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)；logtcid
50
＝距离比例
×
稀释度对数之间的差+高于50％病变率的稀释度的对数，稀释度是指化合物浓度分别为50μm，25μm，12.5μm，6.25μm，3.125μm)来测量不同浓度的上述化合物作用后getv的tcid
50
相对定量，测试结果如图5所示，由图5可知，本发明中的化合物c
29h22
cln3o5s2具有抑制病毒活性效果，符合作为药物的基本使用要求，通过计算上述化合物作用后，getv的100tcid
50
值，可以确定c
29h22
cln3o5s2分子在12.5μmol/l的浓度下即具有明显的抗病毒活性。此外，使用spss软件中one-way anova对数据进行处理分析，***,p《0.01代表差异极显著，具体为：与对照组0.1％dmso柱状图对比，标记横线和***是指有显著性差异，即50μm、25μm和12.5μm都有显著性差异。
[0108]
采用本发明中的筛选方法筛选出的化合物2至化合物59与盖塔病毒的蛋白质上的结合位点的结合力与化合物1(c
29h22
cln3o5s2)的结合力相当，因此，化合物2至化合物59在细胞毒性和抗盖塔病毒活性方面的效果也与化合物1处于基本相同的水平。
[0109]
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

技术特征：
1.式i所示的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂化物在制备预防和/或治疗盖塔病毒感染的药物中的应用，其中，r1选自cl、f、br、h、c
1～5
烷基、c
1～5
烷氧基；r2选自h、cl、f、br、c
1～5
烷基；r3选自f、cl、br、c
1～5
烷基或c
1～5
烷氧基羰基；n为0，1，2，3，4或5；m为0，1，2，3，4或5。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：式i中，r1选自cl、f、br、h、c
1～3
烷基、c
1～3
烷氧基；优选地，r1选自cl、f、h、甲基、甲氧基。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：式i中，r2选自h、cl、f、br、c
1～3
烷基；优选地，r2选自h、cl、f、甲基。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：式i中，r3选自f、cl、c
1～3
烷基或c
1～3
烷氧基羰基；优选地，r3选自cl、c
1～3
烷基、乙氧基羰基。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：式i中，n为0，1或2；优选地，n为0或1。6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：式i中，m为0，1或2。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：式i所示的化合物选自：
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：式i所示的化合物为9.根据权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于：所述药物包括治疗有效量的式i所示的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂化物。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述药物还包括药学上可接受的辅料。11.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂或注射剂。12.根据权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于：所述盖塔病毒来源于牛、羊、犬、袋鼠、狐狸、鸟、兔、豚鼠、大鼠或仓鼠。13.根据权利要求1～8任一项所述的应用，其特征在于：所述式i所示的化合物与盖塔病毒中的e2结构蛋白结合。14.一种预防和/或治疗盖塔病毒感染的药物组合物，其特征在于：包括治疗有效量的式i所示的化合物或其药学上可接受的盐、异构体、溶剂化物，
其中，r1、r2、r3、n、m如权利要求1～6任一项所定义。15.根据权利要求14所述的预防和/或治疗盖塔病毒感染的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物还包括药学上可接受的辅料。16.根据权利要求14所述的预防和/或治疗盖塔病毒感染的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的剂型为丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、糖浆剂或注射剂。17.一种筛选预防和/或治疗盖塔病毒感染的化合物的方法，其特征在于：包括以下步骤：s1：获取抗病毒分子与抗病毒特性的映射关系，构建模型；s2：从数据库中筛选符合模型的化合物，得到初筛化合物；s3：以盖塔病毒的蛋白质为底物，以抗病毒药物瑞德西韦为分子探针，使用打分软件进行评估，从盖塔病毒的蛋白质中筛选出结合位点；s4：将初筛化合物与盖塔病毒的蛋白质中的结合位点进行分子对接，并基于结合参数进行筛选，得到目标化合物。18.根据权利要求17所述的方法，其特征在于：所述结合参数包括结合能、构象。

技术总结
本发明公开了化合物在制备抗盖塔病毒感染的药物中的应用，该药物中包括治疗有效量的式I所示的化合物或其药学上可接受的盐、其异构体、其溶剂化物，本发明式I的化合物具有优异的预防或治疗盖塔病毒感染的效果，同时对正常细胞无明显的毒副作用，在较低的浓度即可达到抑制盖塔病毒的作用。此外，本发明中式I的化合物通过结合盖塔病毒中的E2结构蛋白，破坏盖塔病毒的E1-E2相互作用，阻碍病毒颗粒的组装，进而干扰病毒感染和复制，在预防或治疗盖塔病毒感染时的疗效明显且不易产生抗药性。感染时的疗效明显且不易产生抗药性。


技术研发人员：刘铮 王川庆 车兴 王傲杰 陈陆 甘世杰 闫安 刘聪聪 高东生 王永生
受保护的技术使用者：南方科技大学
技术研发日：2022.07.11
技术公布日：2022/11/1