1.本发明涉及天然药物化学技术领域，具体涉及一种梅片提取物及其制备方法与在制备抗菌制剂中的应用。
背景技术：2.南药梅片(天然冰片)，原名龙脑香，又称右旋龙脑，是粤东梅州的特色南药资源。中国药典记载，梅片树富含天然冰片，具有防腐、生肌、消炎、抗菌、促进皮肤吸收等功效。天然冰片是一种名贵药材、高级香料，被广泛应用于医药、化工、食品保健等领域，素有“植物黄金”的美誉。中草药提取成分以其独特的天然绿色、安全低敏、环境友好等特点，在中药制剂产品配方中的应用也越来越广泛。
3.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是临床上常见的毒性较强的细菌，其除了对甲氧西林耐药外，对其它所有与甲氧西林相同结构的β-内酰胺类和头孢类抗生素均耐药；同时对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药。因此，提供一种具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌制剂具有重要的应用价值。
4.然而，梅片树中富含的天然冰片虽然报道有抗菌作用；但现有技术并未有报道梅片树枝和树叶中含有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的有效成分；更没有现有技术公开了从梅片树枝和树叶中制备出具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的有效成分或提取物的报道。
技术实现要素：5.为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明首先提供了一种梅片提取物的制备方法。研究表明，由本发明所述方法制备得到的梅片提取物具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作用。
6.本发明所要解决上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
7.一种梅片提取物的制备方法，其包含如下步骤：
8.取新鲜的梅片树叶及树枝混合后切碎，然后放入超临界co2萃取仪中进行萃取，得梅片树叶及树枝超临界萃取物，即所述的梅片提取物。
9.发明人在研究中惊奇的发现，将梅片树叶及树枝混合后采用超临界co2萃取仪萃取得到的梅片树叶及树枝超临界萃取物，其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用。
10.优选地，新鲜的梅片树叶与树枝的重量比为1:1～5。
11.最优选地，新鲜的梅片树叶与树枝的重量比为1:2～3。
12.优选地，超临界co2萃取仪的萃取条件为：萃取温度为50～60℃，萃取压力为30～35mpa，流速为10～20l/h，萃取时间为2～3h。
13.优选地，超临界co2萃取仪的萃取条件为：萃取温度为55℃，萃取压力为35mpa，流速为15l/h，萃取时间为2.5h。
14.优选地，在采用超临界co2萃取仪萃取过程中还采用了夹带剂，所述的夹带剂选用
丙酮。
15.优选地，夹带剂的重量用量为新鲜的梅片树叶及树枝总重量的5％～15％。
16.最优选地，夹带剂的重量用量为新鲜的梅片树叶及树枝总重量的10％。
17.发明人在进一步研究中发现，在采用超临界co2萃取仪萃取过程中加入丙酮夹带剂萃取得到的梅片树叶及树枝超临界萃取物，其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用与不加入丙酮夹带剂制备得到的梅片树叶及树枝超临界萃取物相比，有着显著的提高。
18.优选地，进一步地，将梅片树叶及树枝超临界萃取物通过硅胶柱富集有效成分；
19.所述的通过硅胶柱富集有效成分的具体方法为：将梅片树叶及树枝超临界萃取物上硅胶柱，然后采用6～10倍柱体积的由环己烷和丙酮组成的有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液浓缩干燥后即得所述的梅片提取物。
20.优选地，有机溶剂中环己烷和丙酮的体积比9～10:1。
21.最优选地，有机溶剂中环己烷和丙酮的体积比9:1。
22.为了进一步提高梅片树叶及树枝超临界萃取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用；发明人进一步采用了硅胶柱富集有效成分。而以梅片树叶及树枝超临界萃取物为对象富集有效成分的过程中，洗脱硅胶柱的有机溶剂组成对于能否进一步制备得到对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有更加优异的抑制作用的梅片提取物起着决定性作用。并不是采用任意组成的有机溶剂进行洗脱均能够得到具有更加优异的抑制作用的梅片提取物的。
23.发明人经大量的实验惊奇的发现，当采用由体积比8～10:1的环己烷和丙酮组成的有机溶剂进行洗脱，制备得到的梅片提取物具有十分优异的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作用，其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用与梅片树叶及树枝超临界萃取物相比，有着大幅的提高。然而，采用其它或其它组成的有机溶剂进行洗脱制备得到的梅片提取物，其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用与梅片树叶及树枝超临界萃取物相比，并不能得到大幅的提高，甚至还得不到提高。
24.本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的梅片提取物。
25.本发明还提供了一种梅片提取物在制备抗菌制剂中的应用。
26.优选地，所述的抗菌制剂为具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作用的抗菌制剂。
27.有益效果：本发明提供了一种全新方法制备得到的梅片提取物；研究表明，由本发明所述方法制备得到的梅片提取物具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作用；因此，将本发明所述的梅片提取物用于制备具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作用的抗菌制剂具有重要的应用前景。
具体实施方式
28.以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明并不做任何形式的限定。
29.实施例1梅片提取物的制备
30.取新鲜的梅片树叶及树枝按重量比1:3混合后切碎，然后放入超临界co2萃取仪中进行萃取，得梅片树叶及树枝超临界萃取物(即所述的梅片提取物)；
31.其中，超临界co2萃取仪的萃取条件为：萃取温度为55℃，萃取压力为35mpa，流速为15l/h，萃取时间为2.5h。
32.实施例2梅片提取物的制备
33.取新鲜的梅片树叶及树枝按重量比1:3混合后切碎，然后放入超临界co2萃取仪中进行萃取，得梅片树叶及树枝超临界萃取物(即所述的梅片提取物)；
34.其中，超临界co2萃取仪的萃取条件为：采用丙酮作为夹带剂，夹带剂的重量用量为新鲜的梅片树叶及树枝总重量的10％；萃取温度为55℃，萃取压力为35mpa，流速为15l/h，萃取时间为2.5h。
35.实施例3梅片提取物的制备
36.(1)取新鲜的梅片树叶及树枝按重量比1:3混合后切碎，然后放入超临界co2萃取仪中进行萃取，得梅片树叶及树枝超临界萃取物；
37.(2)将梅片树叶及树枝超临界萃取物上硅胶柱，然后采用8倍柱体积的由环己烷和丙酮组成的有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液浓缩干燥后即得所述的梅片提取物；
38.步骤(1)中超临界co2萃取仪的萃取条件为：采用丙酮作为夹带剂，夹带剂的重量用量为新鲜的梅片树叶及树枝总重量的10％；萃取温度为55℃，萃取压力为35mpa，流速为15l/h，萃取时间为2.5h；
39.步骤(2)中，硅胶柱中硅胶重量用量为梅片树叶及树枝超临界萃取物重量的30倍；所述的硅胶采用的是200-300目的硅胶；所述环己烷和丙酮的体积比为9:1。
40.实施例4梅片提取物的制备
41.(1)取新鲜的梅片树叶及树枝按重量比1:1混合后切碎，然后放入超临界co2萃取仪中进行萃取，得梅片树叶及树枝超临界萃取物；
42.(2)将梅片树叶及树枝超临界萃取物上硅胶柱，然后采用10倍柱体积的由环己烷和丙酮组成的有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液浓缩干燥后即得所述的梅片提取物；
43.步骤(1)中超临界co2萃取仪的萃取条件为：采用丙酮作为夹带剂，夹带剂的重量用量为新鲜的梅片树叶及树枝总重量的15％；萃取温度为50℃，萃取压力为30mpa，流速为20l/h，萃取时间为2h；
44.步骤(2)中，硅胶柱中硅胶重量用量为梅片树叶及树枝超临界萃取物重量的30倍；所述的硅胶采用的是200-300目的硅胶；所述环己烷和丙酮的体积比为10:1。
45.实施例5梅片提取物的制备
46.(1)取新鲜的梅片树叶及树枝按重量比1:5混合后切碎，然后放入超临界co2萃取仪中进行萃取，得梅片树叶及树枝超临界萃取物；
47.(2)将梅片树叶及树枝超临界萃取物上硅胶柱，然后采用6倍柱体积的由环己烷和丙酮组成的有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液浓缩干燥后即得所述的梅片提取物；
48.步骤(1)中超临界co2萃取仪的萃取条件为：采用丙酮作为夹带剂，夹带剂的重量用量为新鲜的梅片树叶及树枝总重量的5％；萃取温度为60℃，萃取压力为35mpa，流速为10l/h，萃取时间为3h；
49.步骤(2)中，硅胶柱中硅胶重量用量为梅片树叶及树枝超临界萃取物重量的30倍；所述的硅胶采用的是200-300目的硅胶；所述环己烷和丙酮的体积比为10:1。
50.对比例1梅片提取物的制备
51.(1)取新鲜的梅片树叶及树枝按重量比1:3混合后切碎，然后放入超临界co2萃取仪中进行萃取，得梅片树叶及树枝超临界萃取物；
52.(2)将梅片树叶及树枝超临界萃取物上硅胶柱，然后采用8倍柱体积的环己烷进行洗脱，收集洗脱液浓缩干燥后即得所述的梅片提取物；
53.步骤(1)中超临界co2萃取仪的萃取条件为：采用丙酮作为夹带剂，夹带剂的重量用量为新鲜的梅片树叶及树枝总重量的10％；萃取温度为55℃，萃取压力为35mpa，流速为15l/h，萃取时间为2.5h；
54.步骤(2)中，硅胶柱中硅胶重量用量为梅片树叶及树枝超临界萃取物重量的30倍；所述的硅胶采用的是200-300目的硅胶。
55.对比例1与实施例3的区别在于，硅胶柱洗脱步骤中，采用的有机溶剂不同；对比例1采用环己烷进行洗脱；而实施例3则是采用由体积比为9:1的环己烷和丙酮组成的有机溶剂进行洗脱。
56.对比例2梅片提取物的制备
57.(1)取新鲜的梅片树叶及树枝按重量比1:3混合后切碎，然后放入超临界co2萃取仪中进行萃取，得梅片树叶及树枝超临界萃取物；
58.(2)将梅片树叶及树枝超临界萃取物上硅胶柱，然后采用8倍柱体积的丙酮进行洗脱，收集洗脱液浓缩干燥后即得所述的梅片提取物；
59.步骤(1)中超临界co2萃取仪的萃取条件为：采用丙酮作为夹带剂，夹带剂的重量用量为新鲜的梅片树叶及树枝总重量的10％；萃取温度为55℃，萃取压力为35mpa，流速为15l/h，萃取时间为2.5h；
60.步骤(2)中，硅胶柱中硅胶重量用量为梅片树叶及树枝超临界萃取物重量的30倍；所述的硅胶采用的是200-300目的硅胶。
61.对比例2与实施例3的区别在于，硅胶柱洗脱步骤中，采用的有机溶剂不同；对比例2采用丙酮进行洗脱；而实施例3则是采用由体积比为9:1的环己烷和丙酮组成的有机溶剂进行洗脱。
62.对比例3梅片提取物的制备
63.(1)取新鲜的梅片树叶及树枝按重量比1:3混合后切碎，然后放入超临界co2萃取仪中进行萃取，得梅片树叶及树枝超临界萃取物；
64.(2)将梅片树叶及树枝超临界萃取物上硅胶柱，然后采用8倍柱体积的由环己烷和乙酸乙酯组成的有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液浓缩干燥后即得所述的梅片提取物；
65.步骤(1)中超临界co2萃取仪的萃取条件为：采用丙酮作为夹带剂，夹带剂的重量用量为新鲜的梅片树叶及树枝总重量的10％；萃取温度为55℃，萃取压力为35mpa，流速为15l/h，萃取时间为2.5h；
66.步骤(2)中，硅胶柱中硅胶重量用量为梅片树叶及树枝超临界萃取物重量的30倍；所述的硅胶采用的是200-300目的硅胶；所述环己烷和乙酸乙酯的体积比为9:1。
67.对比例3与实施例3的区别在于，硅胶柱洗脱步骤中，有机溶剂的组成不同；对比例3采用由体积比为9:1的环己烷和乙酸乙酯组成的有机溶剂进行洗脱；而实施例3则是采用由体积比为9:1的环己烷和丙酮组成的有机溶剂进行洗脱。
68.对比例4梅片提取物的制备
69.(1)取新鲜的梅片树叶及树枝按重量比1:3混合后切碎，然后放入超临界co2萃取仪中进行萃取，得梅片树叶及树枝超临界萃取物；
70.(2)将梅片树叶及树枝超临界萃取物上硅胶柱，然后采用8倍柱体积的由环己烷和丙酮组成的有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液浓缩干燥后即得所述的梅片提取物；
71.步骤(1)中超临界co2萃取仪的萃取条件为：采用丙酮作为夹带剂，夹带剂的重量用量为新鲜的梅片树叶及树枝总重量的10％；萃取温度为55℃，萃取压力为35mpa，流速为15l/h，萃取时间为2.5h；
72.步骤(2)中，硅胶柱中硅胶重量用量为梅片树叶及树枝超临界萃取物重量的30倍；所述的硅胶采用的是200-300目的硅胶；所述环己烷和丙酮的体积比为8:1。
73.对比例4与实施例3的区别在于，硅胶柱洗脱步骤中，有机溶剂中环己烷和丙酮的体积比不同；对比例4采用由体积比为8:1的环己烷和丙酮组成的有机溶剂进行洗脱；而实施例3则是采用由体积比为9:1的环己烷和丙酮组成的有机溶剂进行洗脱。
74.实验例耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑菌试验
75.实验药物：实施例1～5以及对比例1～4制备得到的梅片提取物；测试过程中，将各提取物制成20mg/ml的待测药液。
76.测试方法：取0.2ml含有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的菌液(浓度为1
×
107个/ml)加入到无菌培养基中涂抹均匀，待干燥后在培养基上放置牛津杯，接着在牛津杯中添加300μl各待测药液；药液添加完毕后放入37℃的培养箱中培养24h；最后测量各待测药液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌圈的直径大小；各待测药液重复测试10次，取平均值，结果见表1。
77.表1.各梅片提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径
[0078][0079][0080]
表1实验数据中，实施例1梅片提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌圈的直径为11.3mm；这表明，以梅片树叶及树枝为原料，采用本法所述的超临界co2萃取方法萃取得到的梅片树叶及树枝超临界萃取物(即梅片提取物)，其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有一定的抑制作用。
[0081]
表1实验数据中，实施例2梅片提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌圈的直径为14.4mm；显著大于实施例1；这表明，在采用超临界co2萃取仪萃取过程中加入丙酮夹带
剂萃取得到的梅片树叶及树枝超临界萃取物(即梅片提取物)，其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用与不加入丙酮夹带剂制备得到的梅片树叶及树枝超临界萃取物相比，有着显著的提高。
[0082]
表1实验数据中，实施例3～5制备得到的梅片提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌圈的直径大幅的大于实施例2的14.4mm；这表明：将梅片树叶及树枝超临界萃取物采用硅胶柱富集有效成分，采用由体积比8～10:1的环己烷和丙酮组成的有机溶剂进行洗脱，制备得到的梅片提取物具有十分优异的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作用，其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用与梅片树叶及树枝超临界萃取物相比，有着大幅的提高。
[0083]
表1实验数据中，对比例1～2制备得到的梅片提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌圈的直径与实施例2相比，并未显著得到增大，甚至还有所减小；对比例3和4制备得到的梅片提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑菌圈的直径与实施例2相比，同样也未得到大幅的增大；均远远小于实施例3制备得到的梅片提取物。这表明：以梅片树叶及树枝超临界萃取物为对象富集有效成分的过程中，洗脱硅胶柱的有机溶剂组成对于能否进一步制备得到对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有更加优异的抑制作用的梅片提取物起着决定性作用。并不是采用任意组成的有机溶剂进行洗脱均能够得到具有更加优异的抑制作用的梅片提取物的。只有当采用由体积比8～10:1的环己烷和丙酮组成的有机溶剂进行洗脱，制备得到的梅片提取物才具有十分优异的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作用，其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用与梅片树叶及树枝超临界萃取物相比，才有着大幅的提高。然而，采用其它有机溶剂或其它组成或其它体积比的有机溶剂进行洗脱制备得到的梅片提取物，其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抑制作用与梅片树叶及树枝超临界萃取物相比，并不能得到进一步地提高或大幅的提高。
技术特征：1.一种梅片提取物的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：取新鲜的梅片树叶及树枝混合后切碎，然后放入超临界co2萃取仪中进行萃取，得梅片树叶及树枝超临界萃取物，即所述的梅片提取物。2.根据权利要求1所述的梅片提取物的制备方法，其特征在于，新鲜的梅片树叶与树枝的重量比为1:1～5；最优选地，新鲜的梅片树叶与树枝的重量比为1:2～3。3.根据权利要求1所述的梅片提取物的制备方法，其特征在于，超临界co2萃取仪的萃取条件为：萃取温度为50～60℃，萃取压力为30～35mpa，流速为10～20l/h，萃取时间为2～3h。4.根据权利要求1所述的梅片提取物的制备方法，其特征在于，超临界co2萃取仪的萃取条件为：萃取温度为55℃，萃取压力为35mpa，流速为15l/h，萃取时间为2.5h。5.根据权利要求1所述的梅片提取物的制备方法，其特征在于，在采用超临界co2萃取仪萃取过程中还采用了夹带剂，所述的夹带剂选用丙酮。6.根据权利要求5所述的梅片提取物的制备方法，其特征在于，夹带剂的重量用量为新鲜的梅片树叶及树枝总重量的5％～15％；最优选地，夹带剂的重量用量为新鲜的梅片树叶及树枝总重量的10％。7.根据权利要求1所述的梅片提取物的制备方法，其特征在于，进一步地，将梅片树叶及树枝超临界萃取物通过硅胶柱富集有效成分；所述的通过硅胶柱富集有效成分的具体方法为：将梅片树叶及树枝超临界萃取物上硅胶柱，然后采用6～10倍柱体积的由环己烷和丙酮组成的有机溶剂进行洗脱，收集洗脱液浓缩干燥后即得所述的梅片提取物。8.根据权利要求7所述的梅片提取物的制备方法，其特征在于，有机溶剂中环己烷和丙酮的体积比9～10:1；最优选地，有机溶剂中环己烷和丙酮的体积比9:1。9.权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到的梅片提取物。10.权利要求9所述的梅片提取物在制备抗菌制剂中的应用。
技术总结本发明涉及天然药物化学技术领域，具体公开了一种梅片提取物及其制备方法与在制备抗菌制剂中的应用。所述的梅片提取物的制备方法，其包含如下步骤：取新鲜的梅片树叶及树枝混合后切碎，然后放入超临界CO2萃取仪中进行萃取，所得的梅片树叶及树枝超临界萃取物即所述的梅片提取物。研究表明，由本发明所述方法制备得到的梅片提取物具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作用；因此，将本发明所述的梅片提取物用于制备具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌作用的抗菌制剂具有重要的应用前景。菌作用的抗菌制剂具有重要的应用前景。
技术研发人员：王楠 凌凯豪 张声源 廖富林 郭玲 仝盼盼 张雅玲
受保护的技术使用者：广东华清园生物科技有限公司
技术研发日：2022.07.19
技术公布日：2022/11/1
