一种壳聚糖-N-精氨酸纳米粒子、其制备方法及应用

一种壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子、其制备方法及应用
技术领域
1.本发明涉及高分子材料技术领域，尤其涉及一种壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子、其制备方法及应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒会对人体肺部造成攻击，其中15％～20％的患者会产生细胞因子风暴。大量的免疫细胞攻击肺部，使得肺部分泌大量粘液，且肺泡基质增厚，限制了肺泡的气体交换，从而造成病人的呼吸衰竭等多器官衰竭，最终导致了病人的死亡 (jama2020,324(8):782-793；int j immunol immunother 2020,7:050)。由此可见，气道粘液的异常分泌会严重影响正常的肺部功能和其余器官功能。这种气道粘液过多分泌的症状可以归结为粘液阻塞性疾病，其中包括哮喘，囊性纤维化，慢性阻塞性肺病，原发性睫状运动障碍和非囊性纤维化支气管扩张症等。根据who于2018年发布的全球前十位死亡原因显示，2016年慢性阻塞性肺病和下呼吸道感染造成了全球共600多万人死亡，分别位于全球死亡原因第3位和4位。根据文献预测，这两种疾病在未来20年仍会是造成死亡的前4名(the new england journal of medicine 2010,363:2233-47；plosmedicine 2006,3(11):2011-2030)。由此可见，治疗粘液阻塞性疾病，具有非常重要的医学意义。
3.造成肺部粘液阻塞的原因如下：cftr基因突变造成肺部氯离子分泌减少，钠离子摄取过多，细胞内外渗透压改变。细胞从粘液层摄取大量水分，导致粘液层浓度增大(science 1989,245:1066-1073；advanced drug deliveryreviews 2014,75:92
–
111)。粘液浓度的增加造成粘液粘弹性的急剧上升，从而难以被气道纤毛清除(the new england journal of medicine 2019,75: 1942
–
1953；science 2012,337:937-941)。粘液的异常积累造成肺部细菌定殖，形成生物膜，从而募集了大量的免疫细胞。这些免疫细胞释放的免疫因子又会促进粘液的分泌，从而形成粘液累积、细菌感染、慢性炎症、肺部损伤的恶性循环(clinical microbiology reviews 2010,23:299-323；advanced drugdelivery reviews 2014,75:92
–
111)。
4.目前针对粘液阻塞性疾病的临床药物及其缺点如下：阿米卡星和环丙沙星等抗生素容易产生耐药性；n-乙酰半胱氨酸和羧甲司坦等硫醇稀化剂被证明临床无效；糖皮质激素类强抗炎药物容易造成人体代谢异常和其他副作用；β受体激动剂、茶碱类支气管扩张剂对心脏有害。虽然近些年来上市了一些多肽制剂，如奥马珠单抗和美泊利单抗，这些药物需要严格的筛选才能使用，且非常昂贵。此外，近年有不少文献报道基因疗法治疗肺部囊性纤维化。但 cftr基因产生的突变高达上千种，且哮喘属于多基因遗传病，此外，这一类粘液阻塞性疾病与环境关系密切，采用基因疗法并不现实。新型的抗菌药物也被研发用于抑制囊性纤维化的细菌膜形成，但尚未进行粘液稀化方面的研究(angew.chem.int.ed.2020,59:20568-20576)。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子、其制备方法及应用，本发明制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子具有粘液稀化能力、抗菌性能和清除活性氧物质能力。
6.本发明提供了一种壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
7.将第一溶液与溶液b混合，在15～30℃下混匀，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液；所述第一溶液包括溶液a或溶液g；
8.所述溶液a按照以下方法制备得到：
9.将具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐和/或具有式ii所示结构的柠檬酸钠盐与水溶液混合，调节ph值为5～8，得到溶液a；
10.所述溶液b按照以下方法制备得到：
11.将具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸与水溶液混合，调节ph值为 5～7，得到溶液b；
12.所述溶液g按照以下方法制备得到：
13.将第二溶液与溶液a混匀，得到溶液g；所述第二溶液包括溶液d和/或溶液e；
14.所述溶液d按照以下方法制备得到：
15.将抗菌剂与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液d；
16.所述溶液e按照以下方法制备得到：
17.将过氧化氢还原酶与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液e；
[0018][0019]
式ⅲ中，40％≤x1《100％，0％《y1≤50％，0％《z1≤10％；且x1+y1+z1＝100％。
[0020]
优选的，所述溶液b的制备过程中，具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸上的精氨酸接枝率为0％～50％，且不为0％。
[0021]
本发明还提供了一种壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0022]
将溶液j与溶液a混合，在15～30℃下混匀，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液；
[0023]
所述溶液a按照以下方法制备得到：
[0024]
将具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐和/或具有式ii所示结构的柠檬酸钠盐与水溶液混合，调节ph值为5～8，得到溶液a；
[0025]
所述溶液j按照以下方法制备得到：
[0026]
将第三溶液与溶液c混匀，得到溶液j；所述第三溶液包括溶液h或溶液 i；
[0027]
所述溶液h按照以下方法制备得到：
[0028]
将溶液e和溶液f混匀，得到溶液h；
[0029]
所述溶液i按照以下方法制备得到：
[0030]
将溶液d、溶液e和溶液f混匀，得到溶液i；
[0031]
所述溶液c按照以下方法制备得到：
[0032]
将具有式ⅳ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸衍生物与水溶液混合，调节ph 值为5～7，得到溶液c；
[0033]
所述溶液d按照以下方法制备得到：
[0034]
将抗菌剂与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液d；
[0035]
所述溶液e按照以下方法制备得到：
[0036]
将过氧化氢还原酶与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液e；
[0037]
所述溶液f按照以下方法制备得到：
[0038]
将交联剂与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液f；
[0039][0040]
式ⅳ中，20％≤x2《100％，0％《y2≤50％，0％《z2≤10％，0《n≤20％；且 x2+y2+z2+n＝100％。
[0041]
优选的，所述溶液c的制备过程中，具有式ⅳ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸衍生物上的精氨酸接枝率为0％～50％，且不为0％；3-马来酰亚胺基丙酸基团接枝率为0％～20％，且不为0％；
[0042]
所述溶液f的制备过程中，所述交联剂为带两端巯基的高分子聚合物链。
[0043]
优选的，所述溶液d的制备过程中，所述抗菌剂为聚ε-赖氨酸；
[0044]
所述溶液e的制备过程中，所述过氧化氢还原酶为来自牛肝脏的过氧化氢还原酶冻干粉。
[0045]
优选的，在15～30℃下混匀中，所述混匀为超声混匀或搅拌混匀；
[0046]
所述超声混匀的功率为65～195w；
[0047]
所述搅拌混匀的速率为200～600rpm。
[0048]
优选的，所述水溶液包括水、盐溶液、缓冲溶液、酸溶液、组织培养液或体液。
[0049]
本发明还提供了一种上文所述的制备方法制得的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子。
[0050]
优选的，所述壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子具有球形或扁形结构，粒径为 20～500nm。
[0051]
本发明还提供了一种上文所述的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子或其水溶液在制备粘液稀化药物和制备粘液阻塞性疾病药物方面的应用。
[0052]
优选的，所述粘液稀化药物和治疗粘液阻塞性疾病的药物是雾化制剂、口服液、滴注液或灌注液。
[0053]
优选的，给药部位为气道的粘液层、食道的粘液层、胃肠道的粘液层或阴道的粘液层。
[0054]
本发明提供了两种壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：将第一溶液与溶液b混合，在15～30℃下混匀，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液；所述第一溶液包括溶液a或溶液g；或包括以下步骤：将溶液j与溶液a混合，在15～30℃下混匀，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液。
[0055]
与现有技术相比，本发明提供了一种壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备方法，以壳聚糖-n-精氨酸或其衍生物为原料，三元羧酸中的三个羧酸基团与壳聚糖-n-精氨酸或其衍生物表面的游离氨基及胍基发生分子间或分子内静电作用交联而得到壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子，还可以通过添加抗菌剂、过氧化氢还原酶和交联剂等功能组分制备多功能纳米粒子。采用本发明的方法不需要使用有机溶剂，具有绿色、安全、无污染的特点。且原料价格低廉，制备过程简单，适合大批量生产。
[0056]
本发明提供了一种壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子，可以随原料种类、比例、及ph的变化形成不同尺寸的纳米粒子。采用本发明制备的纳米粒子成本低廉，对细胞无毒性，能抑制细菌的生长，能与粘液层中的粘蛋白发生静电相互作用，置换钙离子，还原粘蛋白中的二硫键，抵抗ros，稀化气道粘液，便于清除气道内积聚的粘液，减少气道周围的炎性细胞聚集。所述纳米粒子和纳米粒子水溶液可用于粘液的稀化和粘液阻塞类疾病的治疗，尤其是作为肺部粘液阻塞的药物使用。
附图说明
[0057]
图1为本发明实施例1制得的壳聚糖-n-精氨酸的核磁氢谱图；
[0058]
图2为本发明实施例2制得的壳聚糖-n-精氨酸的核磁氢谱图；
[0059]
图3为本发明实施例3制得的壳聚糖-n-精氨酸衍生物的核磁氢谱图；
[0060]
图4为本发明实施例4制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的tem图；
[0061]
图5为本发明实施例5制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的tem图；
[0062]
图6为本发明实施例8制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的tem图；
[0063]
图7为本发明实施例9制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的tem图；
[0064]
图8为本发明实施例12制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的tem图；
[0065]
图9为本发明实施例13制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的tem图；
[0066]
图10为壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子浓度对细胞存活率的影响图；
[0067]
图11为壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的抑菌曲线；
[0068]
图12为壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子与细菌共孵育后制备的细菌sem图；
[0069]
图13为壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的还原变色图；
[0070]
图14为壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的粘液稀化效果图；
[0071]
图15为实施例22的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子水溶液治疗哮喘小鼠后的肺ab-pas染色图；
[0072]
图16为实施例23所述的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子水溶液治疗哮喘小鼠后的肺h&e染色图。
具体实施方式
[0073]
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0074]
本发明提供了两种壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备方法：
[0075]
制备方法一：
[0076]
本发明提供了一种壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0077]
将第一溶液与溶液b混合，在15～30℃下混匀，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液；所述第一溶液包括溶液a或溶液g；
[0078]
所述溶液a按照以下方法制备得到：
[0079]
将具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐和/或具有式ii所示结构的柠檬酸钠盐与水溶液混合，调节ph值为5～8，得到溶液a；
[0080]
所述溶液b按照以下方法制备得到：
[0081]
将具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸与水溶液混合，调节ph值为 5～7，得到溶液b；
[0082]
所述溶液g按照以下方法制备得到：
[0083]
将第二溶液与溶液a混匀，得到溶液g；所述第二溶液包括溶液d和/或溶液e；
[0084]
所述溶液d按照以下方法制备得到：
[0085]
将抗菌剂与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液d；
[0086]
所述溶液e按照以下方法制备得到：
[0087]
将过氧化氢还原酶与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液e；
[0088][0089]
式ⅲ中，40％≤x1《100％，0％《y1≤50％，0％《z1≤10％；且x1+y1+z1＝100％；式ⅲ中x1、y1、z1表示重复单元的数量百分比。
[0090]
在本发明的某些实施例中，所述式ⅲ中，x1＝85.47％；y1＝11.3％；z1＝ 3.23％。在本发明的某些实施例中，所述式ⅲ中，x1＝74.07％；y1＝22.7％； z1＝3.23％。
[0091]
所述溶液a按照以下方法制备得到：
[0092]
将具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐和/或具有式ii所示结构的柠檬酸钠盐与水溶液混合，调节ph值为5～8，得到溶液a；
[0093]
在本发明的某些实施例中，所述水溶液包括水、盐溶液、缓冲溶液、酸溶液、组织培养液或体液；
[0094]
在本发明的某些实施例中，可以采用盐酸和氢氧化钠水溶液调节ph值为 5～8。
[0095]
所述溶液b按照以下方法制备得到：
[0096]
将具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸与水溶液混合，调节ph值为 5～7，得到溶液b；
[0097]
在本发明的某些实施例中，所述水溶液包括水、盐溶液、缓冲溶液、酸溶液、组织培养液或体液；
[0098]
在本发明的某些实施例中，可以采用盐酸和氢氧化钠水溶液调节ph值为 5～7；
[0099]
在本发明的某些实施例中，具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸上的精氨酸接枝率为0％～50％，且不为0％；优选为0％～30％，且不为0％；具体的，可以为11.3％或22.7％。
[0100]
所述溶液g按照以下方法制备得到：
[0101]
将第二溶液与溶液a混匀，得到溶液g；所述第二溶液包括溶液d和/或溶液e。
[0102]
所述溶液d按照以下方法制备得到：
[0103]
将抗菌剂与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液d；
[0104]
在本发明的某些实施例中，所述抗菌剂为聚ε-赖氨酸；优选为微生物发酵得到的聚ε-赖氨酸；
[0105]
在本发明的某些实施例中，所述水溶液包括水、盐溶液、缓冲溶液、酸溶液、组织培养液或体液；
[0106]
在本发明的某些实施例中，采用盐酸和氢氧化钠水溶液调节ph值为5～7。
[0107]
所述溶液e按照以下方法制备得到：
[0108]
将过氧化氢还原酶与水溶液混合，采用盐酸和氢氧化钠水溶液调节ph值为5～7，得到溶液e；
[0109]
在本发明的某些实施例中，所述过氧化氢还原酶为来自牛肝脏的过氧化氢还原酶冻干粉；优选为活性》3000unit/mg蛋白的过氧化氢还原酶冻干粉；
[0110]
在本发明的某些实施例中，所述水溶液包括水、盐溶液、缓冲溶液、酸溶液、组织培养液或体液；
[0111]
在本发明的某些实施例中，采用盐酸和氢氧化钠水溶液调节ph值为5～7；具体的，可以为6.8。
[0112]
得到第一溶液与溶液b后，将第一溶液与溶液b混合，在15～30℃下混匀，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液；所述第一溶液包括溶液a 或溶液g。
[0113]
在本发明的某些实施例中，将第一溶液与溶液b混合包括：
[0114]
将第一溶液滴加至溶液b中。
[0115]
在本发明的某些实施例中，所述混匀为超声混匀或搅拌混匀；
[0116]
所述超声混匀的功率为65～195w；具体的，可以为130w。
[0117]
所述搅拌混匀的速率为200～600rpm；具体的，可以为300rpm。
[0118]
在本发明的某些实施例中，所述具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐和/或具有式ii所示结构的柠檬酸钠盐与具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸的质量比为1～3：1～3；具体的，可以为1：1。
[0119]
在本发明的某些实施例中，所述抗菌剂与具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n
‑ꢀ
精氨酸的质量比为1～3：1～3；具体的，可以为1：1。
[0120]
在本发明的某些实施例中，所述过氧化氢还原酶与具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸的质量比1～3：1～3；具体的，可以为1：1。
[0121]
制备方法二：
[0122]
本发明还提供了一种壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
[0123]
将溶液j与溶液a混合，在15～30℃下混匀，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液；
[0124]
所述溶液a按照以下方法制备得到：
[0125]
将具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐和/或具有式ii所示结构的柠檬酸钠盐与水溶液混合，调节ph值为5～8，得到溶液a；
[0126]
所述溶液j按照以下方法制备得到：
[0127]
将第三溶液与溶液c混匀，得到溶液j；所述第三溶液包括溶液h或溶液 i；
[0128]
所述溶液h按照以下方法制备得到：
[0129]
将溶液e和溶液f混匀，得到溶液h；
[0130]
所述溶液i按照以下方法制备得到：
[0131]
将溶液d、溶液e和溶液f混匀，得到溶液i；
[0132]
所述溶液c按照以下方法制备得到：
[0133]
将具有式ⅳ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸衍生物与水溶液混合，调节ph 值为5～7，得到溶液c；
[0134]
所述溶液d按照以下方法制备得到：
[0135]
将抗菌剂与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液d；
[0136]
所述溶液e按照以下方法制备得到：
[0137]
将过氧化氢还原酶与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液e；
[0138]
所述溶液f按照以下方法制备得到：
[0139]
将交联剂与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液f；
[0140][0141][0142]
式ⅳ中，20％≤x2《100％，0％《y2≤50％，0％《z2≤10％，0《n≤20％；且 x2+y2+z2+n＝100％；式ⅳ中x2、y2、z2和n表示重复单元的数量百分比。
[0143]
在本发明的某些实施例中，式ⅳ中，x2＝67.69％；y2＝22.7％；z2＝3.23％； n＝6.38％。
[0144]
所述溶液a按照以下方法制备得到：
[0145]
将具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐和/或具有式ii所示结构的柠檬酸钠盐与水溶液混合，调节ph值为5～8，得到溶液a；
[0146]
在本发明的某些实施例中，所述水溶液包括水、盐溶液、缓冲溶液、酸溶液、组织培养液或体液；
[0147]
在本发明的某些实施例中，采用盐酸和氢氧化钠水溶液调节ph值为5～8。
[0148]
所述溶液j按照以下方法制备得到：
[0149]
将第三溶液与溶液c混匀，得到溶液j；所述第三溶液包括溶液h或溶液 i。
[0150]
所述溶液c的制备中：
[0151]
将具有式ⅳ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸衍生物与水溶液混合，调节ph 值为5～7，得到溶液c；
[0152]
在本发明的某些实施例中，具有式ⅳ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸衍生物上的精
氨酸接枝率为0％～50％，且不为0％；优选为0％～30％，且不为0％；具体的，可以为22.7％；具有式ⅳ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸衍生物上的3
‑ꢀ
马来酰亚胺基丙酸基团接枝率为0％～20％，且不为0％；优选为0％～10％，且不为0％；具体的，可以为6.38％。
[0153]
在本发明的某些实施例中，所述水溶液包括水、盐溶液、缓冲溶液、酸溶液、组织培养液或体液；
[0154]
在本发明的某些实施例中，采用盐酸和氢氧化钠水溶液调节ph值为5～7；具体的，可以为5.5。
[0155]
所述溶液h按照以下方法制备得到：
[0156]
将溶液e和溶液f混匀，得到溶液h。
[0157]
所述溶液i按照以下方法制备得到：
[0158]
将溶液d、溶液e和溶液f混匀，得到溶液i。
[0159]
所述溶液d按照以下方法制备得到：
[0160]
将抗菌剂与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液d；
[0161]
在本发明的某些实施例中，所述抗菌剂为聚ε-赖氨酸；优选为微生物发酵得到的聚ε-赖氨酸；
[0162]
在本发明的某些实施例中，所述水溶液包括水、盐溶液、缓冲溶液、酸溶液、组织培养液或体液；
[0163]
在本发明的某些实施例中，采用盐酸和氢氧化钠水溶液调节ph值为5～7。
[0164]
所述溶液e按照以下方法制备得到：
[0165]
将过氧化氢还原酶与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液e；
[0166]
在本发明的某些实施例中，所述过氧化氢还原酶为来自牛肝脏的过氧化氢还原酶冻干粉；优选为活性》3000unit/mg蛋白的过氧化氢还原酶冻干粉；
[0167]
在本发明的某些实施例中，所述水溶液包括水、盐溶液、缓冲溶液、酸溶液、组织培养液或体液；
[0168]
在本发明的某些实施例中，采用盐酸和氢氧化钠水溶液调节ph值为5～7；具体的，可以为6.8。
[0169]
所述溶液f按照以下方法制备得到：
[0170]
将交联剂与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液f；
[0171]
在本发明的某些实施例中，所述交联剂为带两端巯基的高分子聚合物链；优选为hs-peg-hs，或含两个以上巯基的肽链；具体的，所述含两个以上巯基的肽链可以为ac-gcrdvpmsmrggdrcg，购自于强耀生物科技有限公司。
[0172]
在本发明的某些实施例中，所述水溶液包括水、盐溶液、缓冲溶液、酸溶液、组织培养液或体液；
[0173]
在本发明的某些实施例中，采用盐酸和氢氧化钠水溶液调节ph值为5～7；具体的，可以为6.8。
[0174]
得到溶液j与溶液a后，将溶液j与溶液a混合，在15～30℃下混匀，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液。
[0175]
在本发明的某些实施例中，将溶液j与溶液a混合包括：
[0176]
将溶液j滴加至溶液a中。
[0177]
在本发明的某些实施例中，所述混匀为超声混匀或搅拌混匀；
[0178]
所述超声混匀的功率为65～195w；
[0179]
所述搅拌混匀的速率为200～600rpm。
[0180]
在本发明的某些实施例中，所述具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐和/或具有式ii所示结构的柠檬酸钠盐与具有式ⅳ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸衍生物的质量比为1～3：1～3；具体的，可以为1：1。
[0181]
在本发明的某些实施例中，所述抗菌剂与具有式ⅳ所示结构的壳聚糖-n
‑ꢀ
精氨酸衍生物的质量比为1～3：1～3；具体的，可以为1：1。
[0182]
在本发明的某些实施例中，所述过氧化氢还原酶与具有式ⅳ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸衍生物的质量比为1～3：1～3；具体的，可以为1：1。
[0183]
在本发明的某些实施例中，所述交联剂与具有式ⅳ所示结构的壳聚糖-n
‑ꢀ
精氨酸衍生物的质量比为1～3：1～3；具体的，可以为1：1。
[0184]
本发明还提供了一种上文所述的制备方法制得的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子。
[0185]
在本发明的某些实施例中，所述壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子具有球形或扁形结构，粒径均匀，粒径为20～500nm。
[0186]
当溶液b的ph值《6.5，溶液c的ph值《6.5，三元羧酸水溶液的ph《8 时，制备得到的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子可以溶于水，形成稳定透明的纳米粒子分散液。壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的形状为球形或扁球形结构，粒径为 20～500nm。当制备壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的过程中没有添加抗菌剂、过氧化氢还原酶和交联剂时，制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的尺寸为20～300 nm。当制备壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的过程中添加有抗菌剂和/或过氧化氢还原酶和/或交联剂时，制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的尺寸为20～500nm。
[0187]
本发明中的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子或壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水溶液可用于制备粘液稀化药物和制备粘液阻塞性疾病药物；具体的，可以为制备肺部粘液阻塞的药物。可以将壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子雾化，制成雾化制剂喷洒到黏膜或粘液层，或将壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子溶解在水、盐溶液、缓冲溶液、酸溶液、组织培养液、体液等液体中，制成口服液、滴注液或灌注液，通过雾化、口服、滴注、灌注的方式作用到黏膜或粘液层，以起到置换钙离子，还原粘蛋白中的二硫键，抑制细菌生长，抵抗ros，稀化气道粘液，清除气道内积聚的粘液，减少气道周围的炎性细胞聚集的作用。
[0188]
因而，本发明请求保护上文所述的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子或其水溶液在制备粘液稀化药物和制备治疗粘液阻塞性疾病药物方面的应用。在本发明的某些实施例中，所述粘液稀化药物和治疗粘液阻塞性疾病的药物是雾化制剂、口服液、滴注液或灌注液。在本发明的某些实施例中，给药部位为气道的粘液层、食道的粘液层、胃肠道的粘液层或阴道的粘液层。
[0189]
本发明制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子或其水溶液对细胞无毒性，且能稀化气道粘液、抑制细菌生长，清除气道活性氧，从而减轻气道炎症反应和粘液积累，可用于粘液的稀化和粘液阻塞类疾病的治疗，尤其是作为治疗肺部粘液阻塞的药物使用。
[0190]
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种壳聚糖-n
‑ꢀ
精氨酸纳米粒子、其制备方法及应用进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。
[0191]
以下实施例中所用的试剂均为市售。
[0192]
实施例1
[0193]
式ⅲ所示壳聚糖-n-精氨酸的制备：
[0194]
将1.77g吗啉乙磺酸一水合物(mes)装于500ml单口圆底烧瓶，加入 400ml水溶解。取出150ml mes水溶液装于250ml烧杯中，在剩余250ml 溶液中加入壳聚糖1.5g，加热到40℃搅拌，加入盐酸至壳聚糖(脱乙酰度 96.77％，粘度100～200mpa.s)完全溶解，之后用氢氧化钠溶液将ph值缓慢调至6，得1号溶液，在25℃下搅拌备用。
[0195]
将0.975g精氨酸加入先前取出的150ml mes水溶液中，溶解后调ph至 6；再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)5.35g，最后加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)1.95g，使ph值保持在6，在25℃下搅拌反应30min，得2号溶液。
[0196]
将所述2号溶液倒入1号溶液中，在25℃下搅拌反应2d，反应结束后，将产物溶液在ph值为6的水溶液(由水通过盐酸溶液调节ph＝6)中透析，透析后的产物冻干收集，精氨酸接枝率为11.3％。
[0197]
图1为本发明实施例1制得的壳聚糖-n-精氨酸的核磁氢谱图(500mhz, d2o+dcl)。从图1中可以看出，在3.28～3.43ppm、1.43～1.92ppm和2.25～2.55 ppm处产生的信号峰代表了精氨酸中的三个亚甲基，通过比较精氨酸亚甲基在2.25～2.55ppm处的质子峰积分与壳聚糖分子链上的乙酰基质子峰在 1.80～2.20的积分，可以计算出精氨酸取代度为11.3％。所述壳聚糖-n-精氨酸具有式ⅲ所示结构，式ⅲ中，x1＝85.47％；y1＝11.3％；z1＝3.23％。
[0198]
实施例2
[0199]
式ⅲ所示壳聚糖-n-精氨酸的制备：
[0200]
将1.77g吗啉乙磺酸一水合物(mes)装于500ml单口圆底烧瓶，加入 400ml水溶解。取出150ml mes水溶液装于250ml烧杯中，在剩余250ml 溶液中加入壳聚糖1.5g，加热到40℃搅拌，加入盐酸至壳聚糖(脱乙酰度 96.77％，粘度100～200mpa.s)完全溶解，之后用氢氧化钠溶液将ph值缓慢调至6，得1号溶液，在25℃下搅拌备用。
[0201]
将1.95g精氨酸加入先前取出的150ml mes水溶液中，溶解后调ph至6；再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc
·
hcl)10.7g，最后加入n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)3.9g，使ph值保持在6，在25℃下搅拌反应 30min，得2号溶液。
[0202]
将所述2号溶液倒入1号溶液中，在25℃下搅拌反应2d，反应结束后，将产物溶液在ph值为6的水溶液(由水通过盐酸溶液调节ph＝6)中透析，透析后的产物冻干收集，精氨酸接枝率为22.7％。
[0203]
图2为本发明实施例2制得的壳聚糖-n-精氨酸的核磁氢谱图(500mhz, d2o+dcl)。从图2中可以看出，在3.28～3.43ppm、1.43～1.92ppm和2.25～2.55 ppm处产生的信号峰代表了精氨酸中的三个亚甲基，通过比较精氨酸亚甲基在2.25～2.55ppm处的质子峰积分与壳聚糖分子链上的乙酰基质子峰在 1.80～2.20ppm处的积分，可以计算出精氨酸取代度为22.7％。所述壳聚糖-n
‑ꢀ
精氨酸具有式ⅲ所示结构，式ⅲ中，x1＝74.07％；y1＝22.7％；z1＝3.23％。
[0204]
实施例3
[0205]
具有式ⅳ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸衍生物的制备：
[0206]
将实施例2制备的壳聚糖-n-精氨酸取1.3g溶于150ml水中，调ph至5，得溶液a。将
3-马来酰亚胺丙酸-n-琥珀酰亚胺酯溶于150ml的dmso中，得溶液b。将溶液a与溶液b混匀，磁力搅拌1.5d。将所得溶液在ph为2～4 的水中透析，透析后产物冻干收集，3-马来酰亚胺基丙酸接枝率6.38％。
[0207]
图3为本发明实施例3制得的壳聚糖-n-精氨酸衍生物的核磁氢谱图(500 mhz,d2o+dcl)。从图3中可以看出，在3.28～3.43ppm、1.43～1.92ppm和 2.25～2.55ppm处产生的信号峰代表了精氨酸中的三个亚甲基，通过比较精氨酸亚甲基在2.25～2.55ppm处的质子峰积分与壳聚糖分子链上的乙酰基质子峰在1.80～2.20ppm处的积分，可以计算出精氨酸取代度为22.7％。在6.50～7.00 ppm处的信号峰代表了3-马来酰亚胺丙酸上双键处的质子峰，在2.50～2.75 ppm处的信号峰代表了3-马来酰亚胺丙酸上靠近酰胺键一侧的亚甲基处的质子峰。通过比较3-马来酰亚胺丙酸在2.50～2.75ppm处的质子峰积分与壳聚糖分子链上的乙酰基质子峰在1.80～2.20ppm处的积分，可以计算出3-马来酰亚胺丙酸取代度为6.38％。所述壳聚糖-n-精氨酸衍生物具有式ⅳ所示结构，式ⅳ中，x2＝67.69％；y2＝22.7％；z2＝3.23％；n＝6.38％。
[0208]
实施例4
[0209]
壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备：
[0210]
将7.2mg实施例1制备的具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸溶于4ml 水中，调ph至5.5，得溶液b。将7.2mg具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶于4ml水中，调ph至5.85，得溶液a。将溶液a滴加至溶液b中搅拌混匀(速率为300rpm)，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液。取0.5ml所述水性分散液加入0.5ml乙醇溶液(质量浓度为50％)中，分散均匀，滴到铜网上制备透射电镜样品，所得tem图如图4所示。图4为本发明实施例4制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的tem图。从图4可知，壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子形貌粒径均匀，处于20～500nm。其余纳米粒子水性分散液冻干收集。
[0211]
实施例5
[0212]
壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备：
[0213]
将7.2mg实施例2制备的具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸溶于4ml 水中，调ph至5.5，得溶液b。将7.2mg具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶于4ml水中，调ph至5.85，得溶液a。将溶液a滴加至溶液b中搅拌混匀(速率为300rpm)，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液。取0.5ml所述水性分散液加入0.5ml乙醇溶液(质量浓度为50％)中，分散均匀，滴到铜网上制备透射电镜样品，所得tem图如图5所示。图5为本发明实施例5制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的tem图。从图5可知，壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子形貌粒径均匀，处于20～500nm。其余纳米粒子水性分散液冻干收集。
[0214]
实施例6
[0215]
壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备：
[0216]
将7.2mg实施例1的具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸溶于4ml水中，调ph至5.5，得溶液b。将7.2mg具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶于2ml水中，调ph至6.8，得溶液b(a)。将7.2mg过氧化氢还原酶冻干粉(活性》3000unit/mg蛋白的过氧化氢还原酶冻干粉)溶于2ml水中，得溶液e。将溶液a与溶液e混合均匀，得溶液g。将溶液g滴加至溶液b中超声混匀(功率为130w)，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液。将纳米粒子水性分散液冻干收集。
[0217]
实施例7
[0218]
壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备：
[0219]
将7.2mg实施例2的具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸溶于4ml水中，调ph至5.5，得溶液b。将7.2mg具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶于2ml水中，调ph至6.8，得溶液b(a)。将7.2mg过氧化氢还原酶冻干粉(活性》3000unit/mg蛋白的过氧化氢还原酶冻干粉)溶于2ml水中，得溶液e。将溶液a与溶液e混合均匀，得溶液g。将溶液g滴加至溶液b中超声混匀(功率为130w)，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液。将纳米粒子水性分散液冻干收集。
[0220]
实施例8
[0221]
壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备：
[0222]
将7.2mg实施例1的具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸溶于4ml水中，调ph至5.5，得溶液b。将7.2mg具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶于2ml水中，调ph至5.85，得溶液a。将7.2mg聚ε-赖氨酸溶于2ml 水中，调ph至5.85，得溶液d。将溶液d滴入溶液a混合均匀得溶液g。将溶液g滴加至溶液b中搅拌混匀(速率为300rpm)，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液。取0.5ml所得纳米粒子水性分散液加入0.5ml乙醇溶液(质量浓度为50％)中，分散均匀，滴到铜网上制备透射电镜样品，所得tem图如图6所示。图6为本发明实施例8制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的tem图。从图6可知，所述壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子形貌粒径均匀，处于20～500nm。其余纳米粒子水性分散液冻干收集。
[0223]
实施例9
[0224]
壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备：
[0225]
将7.2mg实施例2的具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸溶于4ml水中，调ph至5.5，得溶液b。将7.2mg具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶于2ml水中，调ph至5.85，得溶液a。将7.2mg聚ε-赖氨酸溶于2ml 水中，调ph至5.85，得溶液d。将溶液d滴入溶液a混合均匀得溶液g。将溶液g滴加至溶液b中搅拌混匀(速率为300rpm)，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液。取0.5ml所得水性分散液加入0.5ml乙醇溶液(质量浓度为50％)中，分散均匀，滴到铜网上制备透射电镜样品，所得tem图如图7所示。图7为本发明实施例9制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的tem 图。从图7可知，单个纳米粒子粒径均匀，处于20～500nm，虽然部分纳米粒子发生了聚集，但其聚集体尺寸远小于3μm。其余纳米粒子水性分散液冻干收集。
[0226]
实施例10
[0227]
壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备：
[0228]
将7.2mg实施例1的具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸溶于8ml水中，调ph至5.5，得溶液b。将7.2mg具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐溶于4ml水中，调ph至5.85，得溶液a。将7.2mg聚ε-赖氨酸溶于2ml 水中，调ph至6.8，得溶液d。将7.2mg过氧化氢还原酶冻干粉(活性》3000 unit/mg蛋白的过氧化氢还原酶冻干粉)溶于2ml水中，得溶液e。将溶液e 滴加至溶液d中混合均匀，混匀后的溶液再滴加至溶液a中混合均匀，得溶液g。将溶液g滴加至溶液b中，搅拌混匀(速率为300rpm)，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液。将纳米粒子水性分散液冻干收集。
[0229]
实施例11
与溶液d混合均匀，得溶液i。将溶液i滴加至溶液c中得溶液j。将7.2mg 具有式ii所示结构的柠檬酸钠溶于16ml中，调ph至6.8，得溶液a。将溶液j滴加至溶液a中，搅拌混匀(速率为300rpm)，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液。将含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液冻干收集。
[0241]
实施例15
[0242]
壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备：
[0243]
将7.2mg实施例3制备的具有式ⅳ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸衍生物溶于8ml水中，调ph至5.5，得溶液c。将7.2mg的ac-gcrdvpmsmrggdrcg 溶于2ml水中调ph至6.8，得溶液f。将7.2mg过氧化氢还原酶冻干粉(活性》3000unit/mg蛋白的过氧化氢还原酶冻干粉)溶于2ml水中，调ph至6.8，得溶液e。将7.2mg聚ε-赖氨酸溶于4ml水中，调ph至6.8，得溶液d。将溶液f、溶液e与溶液d混合均匀，得溶液i。将溶液i滴加至溶液c中得溶液 j。将7.2mg具有式ii所示结构的柠檬酸钠溶于16ml中，调ph至6.8，得溶液a。将溶液j滴加至溶液a中，搅拌混匀(速率为300rpm)，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液。将含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液冻干收集。
[0244]
实施例16
[0245]
壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的细胞毒性实验：
[0246]
在96孔板中加入l929细胞(购买自american tissue culture collection 官网)，密度为5000个/200μl/孔。将细胞培养1d后，吸去所有培养液，在样品组的孔中加入100μl不同浓度的本发明实施例4、和实施例5制备的壳聚糖
ꢀ‑
n-精氨酸纳米粒子的pbs(ph＝7.4)溶液(浓度依次为0.625g/l、1.25g/l、 2.5g/l、5g/l、10g/l)，再依次加入100μldmem溶液。所得纳米粒子的最终浓度分别为0.3125g/l、0.625g/l、1.25g/l、2.5g/l、5g/l。在对照组的孔中加入100μlpbs(ph＝7.4)溶液，再加入100μldmem溶液。培养24h 后，将dmem培养液移除，用pbs洗涤三次后，加入含有cck-8试剂的dmem 溶液(cck-8:dmem＝1:9)。孵育1h后，将培养液转移至新的培养板中，检测 492nm处的吸光度(absorbance)，细胞存活率(％)＝(a样品/a对照)
×
100％。所得细胞存活率如图10所示。图10为壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子浓度对细胞存活率的影响图。由图10可知，实施例4与实施例5所得纳米粒子在5mg/ml 的浓度下与细胞孵育24h后，仍然能保持80％以上的存活率，说明纳米粒子具有良好的细胞相容性。
[0247]
实施例17
[0248]
壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的最小抑菌浓度实验：
[0249]
在96孔板中样品组的孔中加入100μl不同浓度的本发明实施例8制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的pbs(ph＝7.4)溶液，再依次加入100μl
×
106/ml 大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的培养液。在对照组的孔中加入100μlpbs (ph＝7.4)溶液，再加入100μl
×
106/ml大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的培养液。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别培养20h或40h后，检测600nm处的od 值，od值发生突变的点即为纳米粒子的最小抑菌浓度。所得纳米粒子的抑菌曲线如图11所示。图11为壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的抑菌曲线。由图11可以看出，壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度分别为0.02mg/ml和0.4mg/ml。
[0250]
实施例18
[0251]
壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的抑菌图：
[0252]
在96孔板中样品组的孔中加入100μl 0.5mg/ml的本发明实施例9制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的pbs(ph＝7.4)溶液，再依次加入100μl
×
106/ml 大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的培养液。在对照组的孔中加入100μlpbs(7.4) 溶液，再加入100μl
×
106/ml大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的培养液。将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别培养20h或30h后，离心收集细菌培养液，并用不同浓度的乙醇水溶液对细菌进行梯度脱水。最后将细菌分散在乙醇水溶液中，滴在硅片上，拍摄sem电镜照片。采用pbs处理的细菌作对照。所得纳米粒子的抑菌sem图如图12所示。图12为壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子与细菌共孵育后制备的细菌sem图。从图12中可以看出，pbs处理后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均保持了完整的形态和膜结构，而纳米粒子处理后的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均发生了膜破碎，细菌形态已经无法被辨认，说明纳米粒子具有良好的抗菌性能。
[0253]
实施例19
[0254]
壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的还原变色实验：
[0255]
将本发明实施例4和实施例5制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子分别溶解在pbs水溶液(ph＝7.4)中，稀释至终浓度为0.04mg/ml。采用pbs和同等还原剂浓度的三(2-羧乙基)膦纯溶液作对照。取3ml任意一种上述溶液，加入0.02ml的5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)溶液(0.2mol/l磷酸盐缓冲液，3.96 mg/ml，ph＝7.4)。1min后观察纳米粒子溶液的颜色变化，如图13所示。图 13为壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的还原变色图。从图13中可以看出，纳米粒子溶液和三(2-羧乙基)膦溶液均变为了黄色，说明他们均可以还原5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)。而pbs不能将其还原，所以不能发生变色反应。
[0256]
实施例20
[0257]
壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的粘液稀化实验：
[0258]
将粘蛋白以0.1mg/ml的浓度溶解在纯水中并搅拌2h。将实施例8制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子溶解在纯水中(浓度为1mg/ml、0.1mg/ml、0.01 mg/ml、0.001mg/ml、0.0001mg/ml)然后，将粘蛋白溶液与等体积的各种浓度的纳米粒子溶液混合，并在室温下搅拌2h。将混合物滴在300目铜网格上并自然干燥，并使用jeoljem-1011tem(日本)检查形态。所得纳米粒子的粘液稀化图如图14所示。图14为壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的粘液稀化效果图。从图14中可以看出，单一的粘蛋白溶液会发生聚集，而随着加入的纳米粒子浓度的增加，粘蛋白聚集体会逐渐减小，说明纳米粒子具有破坏粘蛋白聚集的功能。
[0259]
实施例21
[0260]
壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的过氧化氢还原酶活性测试实验：
[0261]
将本发明实施例12或实施例13制备的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子水溶液稀释到酶含量为0.09mg/ml的浓度，配制同浓度的纯过氧化氢还原酶水溶液。通过过氧化氢还原酶活性测试法测量制备刚完成时纳米粒子水溶液的初始酶活性。用0.25wt％的胰酶溶液将纳米粒子水溶液和纯过氧化氢还原酶水溶液稀释到原浓度的4/5，并在37℃下孵育3h。通过过氧化氢还原酶活性测试观察胰酶作用后不同溶液的酶活性保留情况。过氧化氢还原酶活性测试法操作如下：配置ph为7.8的磷酸盐缓冲液，30wt％的过氧化氢溶液和8wt％的硫酸溶液。在对照管里加1.5ml磷酸盐缓冲液、0.1ml壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子溶液或等浓度纯过氧化氢还原酶溶液，0.2ml蒸馏水，1ml 8wt％的硫酸溶液，和0.2ml过氧化氢溶液，混合均匀
后，加1ml蒸馏水。采用紫外分光光度计，以蒸馏水调零，测量对照溶液在240nm的吸光值。在实验管里加1.5ml 磷酸盐缓冲液，0.1ml壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子溶液或等浓度纯过氧化氢还原酶，1.2ml蒸馏水和0.2ml过氧化氢溶液，混合均匀反应4min，立即加1ml 8wt％的硫酸溶液，并立即测240nm的吸光值。通过对照组减去实验组吸光值，即为纳米粒子溶液或等浓度纯过氧化氢还原酶溶液所还原的过氧化氢量。将纳米粒子溶液或等浓度纯过氧化氢还原酶溶液所还原的过氧化氢量进行互相比较，可得纳米粒子溶液中过氧化氢还原酶的活性保留情况。所得纳米粒子的酶活性保留如表1所示。
[0262]
表1壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的过氧化氢还原酶活性测试结果
[0263][0264][0265]
从表1中可以看出，壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备过程并不会损失过氧化氢还原酶活性，且壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子包裹可以减轻胰酶造成的过氧化氢还原酶的失活。
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实施例22
[0267]
壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子水溶液治疗哮喘小鼠后的肺ab-pas染色实验：
[0268]
采用ova诱导哮喘小鼠模型，将本发明实施例4或实施例5制备的10ml 纳米粒子的pbs(ph＝7.4)溶液加入雾化杯中，采用雾化给药的方式雾化给哮喘小鼠，每天30min，连续5d。治疗48h后，将小鼠麻醉处死，将oct/ 生理盐水混合物(体积比1:1)注射到气管内，摘除小鼠肺部后，采用4％多聚甲醛固定，之后进行ab-pas染色。所得纳米粒子的pbs水溶液治疗后哮喘小鼠的肺ab-pas染色图如图15所示。图15为实施例22的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子水溶液治疗哮喘小鼠后的肺ab-pas染色图；箭头所指的蓝紫色部分为肺泡和支气管内积累的粘液。从图15中可以看出，pbs治疗组的小鼠肺泡和支气管内仍然存在大量的粘液积聚，而纳米粒子治疗后的小鼠肺泡和支气管内已经没有明显的粘液积聚症状，说明纳米粒子可以有效地稀化哮喘小鼠的气道粘液。
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实施例23
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壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子水溶液治疗哮喘小鼠后的肺h&e染色实验：
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采用ova诱导哮喘小鼠模型，将本发明实施例4或实施例5制备的10ml 纳米粒子的pbs(ph＝7.4)溶液加入雾化杯中，采用雾化给药的方式雾化给哮喘小鼠，每天30min，连续5d。治疗48h后，将小鼠麻醉处死，采用生理盐水冲洗小鼠肺部。摘除小鼠肺部，采用4％多聚甲醛固定，之后进行h&e 染色。纳米粒子的pbs水溶液治疗后哮喘小鼠的肺h&e染色图如图16所示。图16为实施例23所述的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子水溶液治疗哮喘小鼠后的肺h&e染色图；箭头指向炎症细胞聚集部位。从图16中可以看出，pbs治疗后的小鼠支气管周围仍然有明显的炎性细胞聚集，而壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子水溶液治疗后的小鼠气道周围未发现明显的炎症细胞聚集，说明壳聚糖
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n-精氨酸纳米粒子的使用可以有效地减轻哮喘小鼠的气道炎症。
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对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明
将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

技术特征：
1.一种壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：将第一溶液与溶液b混合，在15～30℃下混匀，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液；所述第一溶液包括溶液a或溶液g；所述溶液a按照以下方法制备得到：将具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐和/或具有式ii所示结构的柠檬酸钠盐与水溶液混合，调节ph值为5～8，得到溶液a；所述溶液b按照以下方法制备得到：将具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液b；所述溶液g按照以下方法制备得到：将第二溶液与溶液a混匀，得到溶液g；所述第二溶液包括溶液d和/或溶液e；所述溶液d按照以下方法制备得到：将抗菌剂与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液d；所述溶液e按照以下方法制备得到：将过氧化氢还原酶与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液e；式ⅲ中，40％≤x1<100％，0％<y1≤50％，0％<z1≤10％；且x1+y1+z1＝100％。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述溶液b的制备过程中，具有式ⅲ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸上的精氨酸接枝率为0％～50％，且不为0％。3.一种壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：将溶液j与溶液a混合，在15～30℃下混匀，得到含有壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子的水性分散液；所述溶液a按照以下方法制备得到：将具有式i所示结构的三(2-羧乙基)膦盐酸盐和/或具有式ii所示结构的柠檬酸钠盐与水溶液混合，调节ph值为5～8，得到溶液a；所述溶液j按照以下方法制备得到：将第三溶液与溶液c混匀，得到溶液j；所述第三溶液包括溶液h或溶液i；
所述溶液h按照以下方法制备得到：将溶液e和溶液f混匀，得到溶液h；所述溶液i按照以下方法制备得到：将溶液d、溶液e和溶液f混匀，得到溶液i；所述溶液c按照以下方法制备得到：将具有式ⅳ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸衍生物与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液c；所述溶液d按照以下方法制备得到：将抗菌剂与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液d；所述溶液e按照以下方法制备得到：将过氧化氢还原酶与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液e；所述溶液f按照以下方法制备得到：将交联剂与水溶液混合，调节ph值为5～7，得到溶液f；得到溶液f；式ⅳ中，20％≤x2<100％，0％<y2≤50％，0％<z2≤10％，0<n≤20％；且x2+y2+z2+n＝100％。4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述溶液c的制备过程中，具有式ⅳ所示结构的壳聚糖-n-精氨酸衍生物上的精氨酸接枝率为0％～50％，且不为0％；3-马来酰亚胺基丙酸基团接枝率为0％～20％，且不为0％；所述溶液f的制备过程中，所述交联剂为带两端巯基的高分子聚合物链。5.根据权利要求1～4任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述溶液d的制备过程中，所述抗菌剂为聚ε-赖氨酸；所述溶液e的制备过程中，所述过氧化氢还原酶为来自牛肝脏的过氧化氢还原酶冻干粉。6.根据权利要求1～4任意一项所述的制备方法，其特征在于，在15～30℃下混匀中，所述混匀为超声混匀或搅拌混匀；
所述超声混匀的功率为65～195w；所述搅拌混匀的速率为200～600rpm。7.根据权利要求1～6任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述水溶液包括水、盐溶液、缓冲溶液、酸溶液、组织培养液或体液。8.权利要求1～7任意一项所述的制备方法制得的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子。9.根据权利要求8所述的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子，其特征在于，所述壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子具有球形或扁形结构，粒径为20～500nm。10.权利要求8～9任意一项所述的壳聚糖-n-精氨酸纳米粒子或其水溶液在制备粘液稀化药物和制备粘液阻塞性疾病药物方面的应用。11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述粘液稀化药物和治疗粘液阻塞性疾病的药物是雾化制剂、口服液、滴注液或灌注液。12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，给药部位为气道的粘液层、食道的粘液层、胃肠道的粘液层或阴道的粘液层。

技术总结
本发明涉及高分子材料技术领域，尤其涉及一种壳聚糖-N-精氨酸纳米粒子、其制备方法及应用。本发明提供的壳聚糖-N-精氨酸纳米粒子的制备方法中，以壳聚糖-N-精氨酸或其衍生物为原料，三元羧酸中的三个羧酸基团与壳聚糖-N-精氨酸或其衍生物表面的游离氨基及胍基发生分子间或分子内静电作用交联而得到壳聚糖-N-精氨酸纳米粒子，还可以通过添加抗菌剂、过氧化氢还原酶和交联剂等功能组分制备多功能纳米粒子。本发明制备的壳聚糖-N-精氨酸纳米粒子或其水溶液对细胞无毒性，且能稀化气道粘液、抑制细菌生长，清除气道活性氧，从而减轻气道炎症反应和粘液积累，可用于制备粘液稀化药物和制备粘液阻塞性疾病药物。物和制备粘液阻塞性疾病药物。


技术研发人员：贺超良 赵丹 李冬 陈学思
受保护的技术使用者：中国科学院长春应用化学研究所
技术研发日：2022.06.23
技术公布日：2022/11/1