1.本发明属于中药检测技术领域，具体涉及一种紫苏梗药物制剂的特征图谱的构建方法。
背景技术：2.紫苏梗为唇形科紫苏属植物紫苏(perilla frutescens(l.)brit)的干燥茎，梗性温，味辛，气味芳香，具有理气宽中、止痛、安胎等功效。紫苏的地上部分主要含挥发油类，黄酮及其苷类，萜类，类脂等多种化学成分。其中，黄酮是植物中普遍含有的一类成分，紫苏黄酮具有抗炎、抗氧化、降血脂、抗血栓、抗菌等药理作用。研究表明紫苏茎中黄酮类化合物与叶中成分相似，均含有黄酮类、二氢黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮醇类等多种黄酮类化合物。紫苏梗为《中国药典》(2020年版一部)收载品种，但质量标准中仅规定性状项和含量测定。
3.紫苏梗制剂常见的制剂类型有粉末剂、配方颗粒等，例如配方颗粒是由紫苏梗饮片经过提取、浓缩、干燥、制剂等步骤得到的配方颗粒，其物质基础与药材的物质基础存在较大的差异。目前，关于紫苏梗配方颗粒的特征图谱的研究未见报道。文献研究报道《紫苏梗的高效液相色谱指纹图谱研究》，作者王凤云，韩亮等。该文献主要侧重于对紫苏梗药材的研究。从多批次对比图谱可以直观看出，其所建立的图谱的特征峰出峰时间靠后，较为密集。且大部分色谱峰分离度欠佳，没有有效分离。此外由于中药配方颗粒已经不具备药材性状鉴别的特征，上述方法也不适于紫苏梗配方颗粒等由紫苏梗药物制得的制剂的质量检测，存在特征峰个数少，分离效果差，检测分析时间长的缺陷。
技术实现要素：4.因此，本发明的目的在于提供一种紫苏梗药物制剂特征图谱的构建方法，该方法根据紫苏梗药物制剂的特点，建立该品种的特征图谱，实现各特征峰的有效分离，提高特征峰的个数，同时缩短检测分析时间，提高分离效果，为全面建立紫苏梗配方颗粒的质量控制标准提供科学依据。
5.为此，本发明提供了一种紫苏梗药物制剂的特征图谱的构建方法，包括以下步骤，
6.(1)供试品溶液的制备；
7.(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，采用waters cortec uplc t3色谱柱，流动相包括含酸的水溶液和乙腈，梯度洗脱程序包括：0
→
3min
→
10min
→
16min
→
26min
→
35min
→
40min
→
45-48min，流动相中乙腈的体积百分数为：2％
→
5％
→
12％
→
14％
→
16％
→
16％
→
18％
→
18％。
8.进一步地，步骤(2)还满足如下1)-5)中的至少一项：
9.1)检测波长为325-335nm，流速为0.24-0.26ml/min，柱温为20-30℃，进样体积为1-10μl；
10.2)流动相为乙腈和含酸的水溶液的混合液；
11.3)所述梯度洗脱程序还包括：45-48min
→
50min，流动相中乙腈的体积百分数为：
18％
→
20％；
12.4)所述含酸的水溶液为含体积百分数为0.1-0.3％的磷酸或0.1-0.3％的甲酸的水溶液；
13.5)所述waters cortec uplc t3色谱柱为waters cortec uplc t3(2.1mm
×
150mm，1.6μm)色谱柱。
14.进一步地，步骤(1)包括，称取供试品，加溶剂提取，得到提取液，固液分离，取液体，即为供试品溶液。
15.进一步地，所述步骤(1)还满足如下a-e中的任意一项或者多项：
16.a、供试品的质量与溶剂的体积之比为0.25-3.0：5-20；质量与体积的关系为g/ml；
17.b、提取方式为回流提取或者超声提取；
18.c、提取时间为≥10min，优选为15-40min；
19.d、所述固液分离选自离心或者滤膜过滤；
20.e、溶剂选自体积百分数为40-80％的甲醇水溶液或者体积百分数为40-80％的丙酮水溶液。
21.进一步地，步骤(1)包括，称取紫苏梗配方颗粒0.25-1.0g，置具塞锥形瓶中，精密加入体积百分数为40-80％的甲醇水溶液或者体积百分数为40-80％的丙酮水溶液5-20ml，密塞，称定重量，超声处理15-40min，再称定重量，用体积百分数为40-80％的甲醇水溶液或者体积百分数为40-80％的丙酮水溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，即得到供试品溶液。
22.进一步地，所述的构建方法还包括采用咖啡酸、迷迭香酸、维采宁-ii和芹菜素-7-o-二葡萄糖醛酸苷中的至少一种加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照上述任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品图谱的步骤。
23.进一步地，每1ml对照品溶液中含1-100μg咖啡酸、1-100μg迷迭香酸、1-100μg维采宁-ii和1-100μg芹菜素-7-o-二葡萄糖醛酸苷中的至少一种；和/或，对照品溶液制备中所采用的溶剂选自甲醇或甲醇水溶液。
24.进一步地，所述的构建方法还包括采用紫苏梗对照药材加水提取后得到的提取物按照上述任一所述的构建方法中的供试品溶液的制备方法制备对照药材参照物溶液，以及按照上述任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照药材参照物溶液得到对照品药材参照图谱的步骤。
25.优选地，紫苏梗对照药材水提取后经滤过、取液体干燥处理再按照权利要求1-4中任一所述的构建方法中的供试品溶液的制备方法制备对照药材参照物溶液。
26.进一步地，取紫苏梗对照药材1.0-3.0g，置具塞锥形瓶中，加水20-100ml，加热回流10-60分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加入体积百分数为40-80％的甲醇水溶液或者体积百分数为40-80％的丙酮水溶液5-20ml，超声处理15-40min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。
27.进一步地，所述紫苏梗药物制剂的特征图谱具有11个共有特征峰，与咖啡酸对照品参照物峰相应的峰为s峰，各特征峰与s峰的相对保留时间在规定值的
±
10％的范围之内；规定值为：0.32(峰1)、0.86(峰2)、1.00(峰3)、1.29(峰4)、1.40(峰5)、1.48(峰6)、1.76(峰7)、1.81(峰8)、2.06(峰9)、2.85(峰10)、3.22(峰11)。
28.本发明中，紫苏梗药物制剂可以是紫苏梗配方颗粒，或者紫苏梗标准汤剂冻干粉
等由紫苏梗水提取制得的常见制剂。
29.某些实施方式中，还包括紫苏梗药物制剂的对照特征图谱的构建，对多批紫苏梗药物制剂供试品检测得到的特征图谱，利用中药色谱特征图谱相似度评价系统生成紫苏梗药物制剂的对照特征图谱。至少采用3批紫苏梗配方颗粒，例如采用3个批次、7个批次、15个批次、17个批次的紫苏梗配方颗粒。
30.某些实施方式中，利用中药色谱特征图谱相似度评价软件生成紫苏梗药物制剂的对照特征图谱后还包括标记共有特征峰的步骤。
31.本发明还提供了一种上述任一项所述的紫苏梗药物制剂的特征图谱的构建方法在紫苏梗药物制剂的质量检测中的应用。
32.本发明还提供了一种紫苏梗药物制剂的质量检测方法，包括将待测紫苏梗产品的特征图谱与紫苏梗药物制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测紫苏梗产品的特征图谱为使用待测紫苏梗产品按照上述任一所述的构建方法构建得到，所述紫苏梗药物制剂对照特征图谱选自如下(1)-(3)中的任意一项：
33.(1)其具有11个共有特征峰，与咖啡酸对照品参照物峰相应的峰为s峰，各特征峰与s峰的相对保留时间在规定值的
±
10％的范围之内；规定值为：0.32(峰1)、0.86(峰2)、1.00(峰3)、1.29(峰4)、1.40(峰5)、1.48(峰6)、1.76(峰7)、1.81(峰8)、2.06(峰9)、2.85(峰10)、3.22(峰11)；
34.(2)使用单批次或者多批次紫苏梗药物制剂按照上述任一所述的构建方法得到的紫苏梗药物制剂的特征图谱；
35.(3)使用多批次紫苏梗药物制剂按照上述任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。
36.本发明中“与咖啡酸对照品参照物峰相应的峰”是与咖啡酸对照品参照物峰的重合度不小于50％的特征峰。
37.％丙酮表示丙酮水溶液中丙酮的体积百分数，％甲醇表示甲醇水溶液中甲醇的体积百分数。
38.本发明技术方案，具有如下优点：
39.1.本发明所述的紫苏梗药物制剂的特征图谱的构建方法，采用waters cortec uplc t3色谱柱，流动相包括含酸的水溶液和乙腈，通过不断优选梯度洗脱程序，采用包括下述程序的梯度洗脱程序：0
→
3min
→
10min
→
16min
→
26min
→
35min
→
40min
→
45-48min，流动相中乙腈的体积百分数为：2％
→
5％
→
12％
→
14％
→
16％
→
16％
→
18％
→
18％；最终得到11个共有特征峰，并实现了11个共有特征峰的有效分离，而且得到的特征图谱基线平稳，特征峰峰形好、检测时间短，为全面建立紫苏梗配方颗粒的质量控制标准提供科学依据。而且还可以准确定位咖啡酸、迷迭香酸、维采宁-ii和芹菜素-7-o-二葡萄糖醛酸苷的峰位置，充分的反映紫苏梗药物制剂(例如配方颗粒等制剂)的整体性和特征性。
40.2.本发明所述的紫苏梗药物制剂的特征图谱的构建方法，通过优化色谱条件、提取溶剂、提取溶剂用量等提取条件进行考察，确定了最佳提取工艺和色谱条件，使得峰面积更高，分离效果更好，能够更加全面的对紫苏梗配方颗粒进行质量监控。
41.3.本发明所述的紫苏梗药物制剂的质量检测方法，通过待测紫苏梗配方颗粒产品的特征图谱与紫苏梗配方颗粒的对照特征图谱进行比较，可以全面、清楚、有效的对紫苏梗
配方颗粒进行质量检测。
附图说明
42.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
43.图1为实验例1流动相梯度优化实验中方法一的色谱图；
44.图2为实验例1流动相梯度优化实验中方法二的色谱图；
45.图3为实验例1流动相梯度优化实验中方法三的色谱图；
46.图4为实验例1流动相梯度优化实验中方法四的色谱图；
47.图5为实验例1流动相的考察实验中乙腈-水色谱图；
48.图6为实验例1流动相的考察实验中乙腈-0.2％磷酸水色谱图；
49.图7为实验例1流动相的考察实验中乙腈-0.2％甲酸水色谱图；
50.图8为实验例1流动相酸浓度的考察实验中乙腈-0.1％甲酸水色谱图；
51.图9为实验例1流动相酸浓度的考察实验中乙腈-0.2％甲酸水色谱图；
52.图10为实验例1流动相酸浓度的考察实验中乙腈-0.3％甲酸水色谱图；
53.图11为柱温的考察实验中20℃下色谱图；
54.图12为柱温的考察实验中25℃下色谱图；
55.图13为柱温的考察实验中30℃下色谱图；
56.图14为流速的考察试验中流速0.24ml/min下色谱图；
57.图15为流速的考察试验中流速0.25ml/min下色谱图；
58.图16为流速的考察试验中流速0.26ml/min下色谱图；
59.图17为色谱柱的考察实验中waters cortec uplc t3色谱柱的色谱图；
60.图18为色谱柱的考察实验中agilent infinitylab poroshell 120sb-aq色谱柱的色谱图；
61.图19为色谱柱的考察实验中thermo hypersil gold
tm aq色谱柱的色谱图；
62.图20为对照品图谱与紫苏梗配方颗粒的特征图谱对比图；
63.图21为紫苏梗对照药材的色谱图；
64.图22为15批紫苏梗配方颗粒的特征图谱和对照特征图谱；
65.图23为紫苏梗配方颗粒的对照特征图谱；
66.图24为实施例1中紫苏梗配方颗粒的特征图谱；
67.图25为实施例1中对照品参照图谱；
68.图26为实施例2中紫苏梗标准汤剂冻干粉的特征图谱；
具体实施方式
69.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的
保护范围之内。实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
70.实验例1构建方法的考察
71.1、仪器、试剂及试药
72.高效液相色谱仪1：waters arc uplc，pda检测器。高效液相色谱仪2：thermo ultimate3000，包括pump：lpg-3400sd；colum compartment：tcc-3000rs；autosumpler：wps-3000sl；photometer：dad-3000。其他仪器：kq-700de数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有效公司)；万分之一天平(bs 224s，sartorius)；万分之一天平(me204，mettler toledo)；十万分之一天平(xr 205sm-dr，precisa)；旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司，osb-2200)；色谱柱：waters cortec uplc t3(2.1mm
×
150mm，1.6μm)色谱柱；
73.迷迭香酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111871-202007)；紫苏梗对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121172-201403)；咖啡酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110885-201703)。乙腈为色谱纯，水为超纯水；其他试剂均为分析纯。
74.试药：紫苏梗配方颗粒可以采用本领域常规方法制备，例如本发明中按照如下步骤制备：取紫苏梗饮片10000g，加水煎煮，滤过，滤液浓缩成清膏，干燥，混匀，制粒，即得。采用不同批次的紫苏梗饮片制得批号为1904001w、1907002s、1912001s、2004001w、2005001s、2007001s、2008001w、2009002s、2011001w、2102001s、2104001w、2106001s、2108002w、2109001w、2111001s的紫苏梗配方颗粒。
75.紫苏梗标准汤剂冻干粉可以采用本领域常规方法制备，例如本发明按照如下步骤制备：取紫苏梗药材，根据《中国药典》2020年版紫苏梗药材项下有关规定炮制(炮制工艺：取紫苏梗药材适量，除去杂质，稍浸，润透，切厚片(2～4mm)，干燥制备成紫苏梗饮片。取紫苏梗饮片约100g，置砂锅中，提取两次，加水1000ml浸泡30分钟，先武火(5档)煮沸，再文火(3档)煎煮30分钟，200目纱布(尼龙)趁热过滤；药渣再加水800ml，武火(5档)煮沸后，再文火(3档)煎煮25分钟，200目纱布(尼龙)趁热过滤，合并滤液，滤液迅速冷却至室温，滤液减压浓缩(温度50℃，真空度20～50mbar)至相对密度为1.08g/ml～1.12g/ml的浓浸膏，浓浸膏置于冷冻干燥机中，冷冻干燥(-82℃，0mpa)至干燥状态，取出，称重，研磨成粉末，分装于西林瓶中，即得紫苏梗冻干粉。
76.2、供试品溶液的制备
77.精密称取紫苏梗配方颗粒，约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％丙酮25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，再称定重量，用60％丙酮补足减失的重量，摇匀，滤过，即得到供试品溶液。
78.3、色谱条件的优化
79.(1)流动相梯度优化实验
80.采用高效液相色谱法对按照本实验例第2项下制得的供试品溶液进行检测，用waters cortec uplc t3(2.1mm
×
150mm，1.6μm)色谱柱，分别依照如下梯度条件进行洗脱，流速为每分钟0.25ml；柱温为25℃，检测波长为330nm，进样量为1μl。
81.表1方法一至三下的梯度条件
[0082][0083]
表2方法四下的梯度条件
[0084][0085]
表3各梯度色谱峰系统适用性参数
[0086]
[0087][0088]
结果如图1-4和表3所示，方法四下的特征峰信息量较多，且分离效果良好，峰形较好，尽管方法一也有11个峰，但是其中1个峰分离度较低，且峰形较差。
[0089]
(2)流动相的考察实验
[0090]
取紫苏梗配方颗粒按照本实验例第2项下的方法制得紫苏梗配方颗粒供试品溶
液。分别采用本实验例第3(1)项下方法四的色谱条件检测紫苏梗配方颗粒供试品溶液，区别仅在于流动相b不同，而梯度程序相同，比较不同流动相体系对紫苏梗配方颗粒特征图谱分离效果的影响，流动相体系设置：
①
流动相a：乙腈，流动相b：水，
②
流动相a：乙腈，流动相b：0.2％(体积百分数)甲酸水，
③
流动相a：乙腈，流动相b：0.2％(体积百分数)磷酸水。
[0091]
结果见下表和图5-7所示，结果表明，乙腈-0.2％磷酸水、乙腈-0.2％甲酸水流动相体系的各色谱峰分离效果较好，处于对色谱柱保护的考虑，乙腈-0.2％甲酸水为流动相为最佳选择。
[0092]
表4系统适应性参数
[0093][0094][0095]
(3)流动相酸浓度的考察实验
[0096]
取紫苏梗配方颗粒按照本实验例第2项下方法制得紫苏梗配方颗粒供试品溶液。分别采用本实验例第3(1)项下方法四的色谱条件检测紫苏梗配方颗粒供试品溶液，区别仅在于流动相b浓度不同，而梯度程序相同，比较不同流动相b浓度对紫苏梗配方颗粒特征图谱分离效果的影响，流动相体系设置：
①
流动相a：乙腈，流动相b：0.1％甲酸水，
②
流动相a：乙腈，流动相b：0.2％甲酸水，
③
流动相a：乙腈，流动相b：0.3％甲酸水。
[0097]
结果见下表和图8-10所示，结果表明，不同乙腈-甲酸水(体积百分数为0.1％～0.3％)流动相体系对各色谱峰分离效果相近，且各色谱峰系统适应性参数也相似。
[0098]
表5不同流动相酸浓度考察结果
[0099][0100][0101]
(4)柱温的考察实验
[0102]
取紫苏梗配方颗粒按照本实验例第2项下方法制得紫苏梗配方颗粒供试品溶液。分别采用本实验例第3(1)项下方法四的色谱条件检测紫苏梗配方颗粒供试品溶液，区别仅在于柱温不同，比较不同柱温对紫苏梗配方颗粒特征图谱耐用性影响，柱温设置：20℃、25℃、30℃。结果表明，20～30℃下分离度效果均较好，其中20-25℃最佳。
[0103]
表6不同柱温考察结果
[0104][0105]
(5)流速的考察实验
[0106]
取紫苏梗配方颗粒按照本实验例第2项下方法制得紫苏梗配方颗粒供试品溶液。分别采用本实验例第3(1)项下方法四的色谱条件检测紫苏梗配方颗粒供试品溶液，区别仅在于流速不同，比较不同流速对紫苏梗配方颗粒特征图谱耐用性影响，流速分别设置：0.24ml/min、0.25ml/min、0.26ml/min。结果表明，0.24-0.26ml/min下分离度效果均较好，其中0.24-0.25ml/min最佳。
[0107]
表7不同流速考察结果
[0108][0109]
(5)色谱柱的考察实验
[0110]
取紫苏梗配方颗粒按照本实验例第2项下方法制得紫苏梗配方颗粒供试品溶液。分别采用本实验例第3(1)项下方法四的色谱条件检测紫苏梗配方颗粒供试品溶液，区别仅在于色谱柱不同，比较不同色谱柱对紫苏梗配方颗粒特征图谱耐用性影响，分别以不同品牌的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(色谱柱1：waters cortec uplc t3(2.1mm
×
150mm，1.6μm)色谱柱；色谱柱2：agilent infinitylab poroshell 120sb-aq 2.1
×
150mm 1.9μm；色谱柱3：thermo hypersil gold
tm aq，2.1
×
150mm，1.9μm。结果表明：通过比较不同品牌色谱柱测得特征图谱可以发现，色谱柱2、3对各色谱峰的分离效果较差，色谱柱1的色谱峰信息
量明显增多，分离效果明显提高，因此，采用waters cortec uplc t3(2.1mm
×
150mm，1.6μm)色谱柱为紫苏梗配方颗粒特征图谱构建方法的色谱柱。
[0111]
表8不同色谱柱考察结果
[0112][0113]
4、供试品溶液的制备
[0114]
(1)提取溶剂考察
[0115]
取紫苏梗配方颗粒，约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入提取溶剂(60％丙酮、40％甲醇、60％甲醇、80％甲醇，以上均为体积百分数)25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，再称定重量，用相应的提取溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1μl，按本实验例第3(1)项下方法四的色谱条件测定。结果表明，60％丙酮、40％甲醇、60％甲醇、80％甲醇提取的供试品系统适应性参数均较好。
[0116]
表9不同提取溶剂考察结果
[0117][0118]
[0119]
(2)提取溶剂用量的考察
[0120]
取紫苏梗配方颗粒，约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入提取溶剂60％甲醇5ml、10ml、20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1μl，按本实验例第3(1)项下方法四的色谱条件测定。由下表可以看出，提取溶剂为5-20ml都能满足色谱分离的要求。
[0121]
表10不同提取溶剂用量考察结果
[0122][0123][0124]
(3)取样量的考察
[0125]
取紫苏梗配方颗粒，考察了不同取样量(0.25g、0.50g、1.0g)对提取效果的影响，分别置具塞锥形瓶中，分别精密加入提取溶剂60％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功
率250w，频率40khz)30分钟，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1μl，按本实验例第3(1)项下方法四的色谱条件测定。由下表可以看出，取样量0.25g、0.50g、1.0g都能满足色谱分离的要求。
[0126]
表11不同取样量考察结果
[0127][0128][0129]
(4)取样体积的考察
[0130]
取紫苏梗配方颗粒，约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入提取溶剂60％甲醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250w，频率40khz)30分钟，再称定重量，用60％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，分别精密吸取续滤液1μl、2μl、3μl，按本实验例第3(1)项下方法四的色谱条件测定。由下表可以看出，取样体积为1μl、2μl、3μl都能满足色谱
分离的要求，各进样量结果相差较小。
[0131]
表12不同进样体积考察结果
[0132][0133][0134]
(5)供试品溶液制备方法的确定
[0135]
根据上述研究结果，确定的供试品溶液制备方法为：取供试品适量，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0136]
5、特征峰的指认
[0137]
取咖啡酸对照品、迷迭香酸对照品、维采宁-ii对照品、芹菜素-7-o-二葡萄糖醛酸苷对照品适量，精密称定，加60％甲醇制成每1ml含40μg各对照品的对照品溶液。
[0138]
按照实施例1的制备方法制得紫苏梗配方颗粒供试品溶液，将咖啡酸对照品溶液、迷迭香酸对照品溶液、维采宁-ii对照品溶液、芹菜素-7-o-二葡萄糖醛酸苷对照品溶液及紫苏梗配方颗粒供试品溶液，按实施例1的方法高效液相色谱法进行检测后比对，结果如图20，其中s1为紫苏梗配方颗粒，s2为维采宁-ii，s3为芹菜素-7-o-二葡萄糖醛酸苷，s4为咖啡酸，s5为迷迭香酸。
[0139]
小结：紫苏梗配方颗粒供试品色谱图中3号峰、4号峰、10号峰和11号峰分别与咖啡酸、维采宁-ii、芹菜素-7-o-二葡萄糖醛酸苷和迷迭香酸对照品色谱峰图谱保留时间一致，可确认3号峰为咖啡酸、4号峰为维采宁-ii、10号峰为芹菜素-7-o-二葡萄糖醛酸苷、11号峰为迷迭香酸。
[0140]
6、特征峰的确定及对照图谱的建立
[0141]
(1)构建方法
[0142]
取紫苏梗对照药材3.0g，置具塞锥形瓶中，加水50ml，加热回流45分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加入60％甲醇10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。取15批紫苏梗配方颗粒分别按照下述方法制备供试品溶液，精密称取供试品，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0143]
将15批紫苏梗配方颗粒供试品溶液和对照药材参照物溶液分别进行高效液相色谱法检测：waters cortec uplc t3(2.1mm
×
150mm，1.6μm)色谱柱；以为乙腈流动相a，以0.2％甲酸水溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.25ml；柱温为25℃；检测波长为330nm。理论板数按咖啡酸峰计算应不低于10000。
[0144]
表13梯度洗脱程序
[0145][0146][0147]
结果如图21-23所示，其中图22中，s1(11)～s15(11)为15批紫苏梗配方颗粒1904001w～2111001s的特征图谱，r(11)为对照特征图谱。
[0148]
表14 15批紫苏梗配方颗粒相对保留时间
[0149][0150]
表15 15批紫苏梗配方颗粒相对峰面积
[0151]
[0152][0153]
(2)采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)对15批紫苏梗配方颗粒样品进行合成，建立了紫苏梗配方颗粒特征图谱的对照图谱(即对照特征图谱)，见图23所示，共选择了11个峰作为特征峰。3号峰为咖啡酸对照品参照物峰(s峰)，各特征峰与s峰的相对保留时间为0.32(峰1)、0.86(峰2)、1.00(峰3)、1.29(峰4)、1.40(峰5)、1.48(峰6)、1.76(峰7)、1.81(峰8)、2.06(峰9)、2.85(峰10)、3.22(峰11)。15批紫苏梗配方颗粒特征图谱结果显示，11个共有峰传递性良好，15批紫苏梗配方颗粒各特征峰的相对保留时间均在规定值的
±
10％范围之内。
[0154]
因此规定：供试品特征图谱中应呈现11个特征峰，与咖啡酸对照品参照物峰相应的峰为s峰，各特征峰与s峰的相对保留时间应在规定值的
±
10％之内。规定值为：0.32(峰1)、0.86(峰2)、1.00(峰3)、1.29(峰4)、1.40(峰5)、1.48(峰6)、1.76(峰7)、1.81(峰8)、2.06(峰9)、2.85(峰10)、3.22(峰11)。
[0155]
实验例2方法学验证
[0156]
1、仪器精密度
[0157]
取紫苏梗配方颗粒(批号：2008001w)按照实施例1的方法制备供试品溶液，取供试品溶液6份，按照实施例1的高效液相色谱法测试，重复进样6次，计算11个特征峰的相对保留时间的rsd为0～0.08％，结果表明，仪器精密度良好。
[0158]
表16仪器精密度试验相对保留时间结果
[0159]
[0160][0161]
2、重复性
[0162]
取紫苏梗配方颗粒(批号：2008001w)样品，按实施例1的方法平行制备6份供试品溶液并测定，计算各特征峰的相对保留时间的rsd小于2.0％，结果表明，方法重复性良好。
[0163]
表17重复性试验相对保留时间结果
[0164][0165]
3、中间精密度(人员)
[0166]
取紫苏梗配方颗粒(批号：2008001w)分别有三名实验人员按实施例1的方法制备紫苏梗配方颗粒供试品溶液并测定，计算特征峰的相对保留时间的rsd小于2.0％，中间精密度良好。
[0167]
表18中间精密度(人员)相对保留时间
[0168][0169][0170]
4、耐用性
[0171]
(1)稳定性考察
[0172]
取紫苏梗配方颗粒(批号：2008001w)按照实施例1的方法制备供试品溶液，分别在
0h、2h、4h、8h、12h、24h按实施例1的高效液相色谱法测试，计算特征峰的相对保留时间的rsd应小于2.0％。结果表明，供试品溶液在24h内稳定，满足测定需求。
[0173]
表19稳定性试验相对保留时间结果表
[0174][0175]
(2)不同仪器
[0176]
比较不同高效液相色谱仪对紫苏梗配方颗粒(批号：2008001w)特征图谱耐用性影响，用不同仪器进行检测。取紫苏梗配方颗粒适量，按实施例1的方法，使用不同仪器(waters arc uplc和thermo ultimate 3000)对紫苏梗配方颗粒供试品进行测定。结果显示各特征峰的相对保留时间的rsd应小于5.0％。表明该方法对的耐用性较好。
[0177]
表20不同仪器相对保留时间结果
[0178][0179]
实施例1
[0180]
本实施例提供了一种紫苏梗配方颗粒的特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
[0181]
供试品溶液的制备：精密称取紫苏梗配方颗粒，研细，取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入60％甲醇10ml，超声处理(功率250w，频率40khz)20分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0182]
对照品溶液的制备：取咖啡酸、迷迭香酸对照品适量，精密称定，加60％甲醇制成每1ml各含0.2mg的混合溶液，作为对照品参照物溶液；
[0183]
高效液相色谱法测试：精密吸取对照品参照物溶液1μl、紫苏梗配方颗粒供试品溶液1μl，注入液相色谱仪，测定，色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(waters cortec uplc t3(2.1mm
×
150mm，1.6μm)色谱柱)；以乙腈为流动相a，以0.2％甲酸水溶液为流动相b，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.25ml；柱温为25℃；检测波长为330nm。理论板数按咖啡酸峰计算应不低于10000。
[0184]
表21梯度程序
[0185][0186]
表22峰结果
[0187][0188]
由上表和图24-25可知，图24中11个特征峰分离效果良好，峰面积较高，检测分析时间短，图25中峰1为咖啡酸；峰2为迷迭香酸。
[0189]
实施例2
[0190]
本实施例提供了一种紫苏梗标准汤剂冻干粉的特征图谱的构建方法，与实施例1的区别仅在于，采用紫苏梗标准汤剂冻干粉代替紫苏梗配方颗粒，峰结果见下表所示。
[0191]
表23峰结果
[0192]
序号保留时间峰面积峰高分离度对称因子理论板数14.0836818820439-0.9634710211.011756862176476.661.11244631312.76255373612890418.381.54244664416.4691229762175630.691.48207442517.87125783503510.21.05272067618.884131930246277.651.49331501722.56230679473424.711.27285084823.2035431286863.811.06303775926.29871701928516.290.952534751036.55047722310933.241.181276681141.18412740079168912.091.23203837
[0193]
由上表和图26可知，11个特征峰分离效果良好，检测分析时间短。
技术特征：1.一种紫苏梗药物制剂的特征图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤，(1)供试品溶液的制备；(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，采用waters cortec uplc t3色谱柱，流动相包括含酸的水溶液和乙腈，梯度洗脱程序包括：0
→
3min
→
10min
→
16min
→
26min
→
35min
→
40min
→
45-48min，流动相中乙腈的体积百分数为：2％
→
5％
→
12％
→
14％
→
16％
→
16％
→
18％
→
18％。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)还满足如下1)-5)中的至少一项：1)检测波长为325-335nm，流速为0.24-0.26ml/min，柱温为20-30℃，进样体积为1-10μl；2)流动相为乙腈和含酸的水溶液的混合液；3)所述梯度洗脱程序还包括：45-48min
→
50min，流动相中乙腈的体积百分数为：18％
→
20％；4)所述含酸的水溶液为含体积百分数为0.1-0.3％的磷酸或0.1-0.3％的甲酸的水溶液；5)所述waters cortec uplc t3色谱柱为waters cortec uplc t3(2.1mm
×
150mm，1.6μm)色谱柱。3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)包括，称取供试品，加溶剂提取，得到提取液，固液分离，取液体，即为供试品溶液。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(1)还满足如下a-e中的任意一项或者多项：a、供试品的质量与溶剂的体积之比为0.25-3.0：5-20；质量与体积的关系为g/ml；b、提取方式为回流提取或者超声提取；c、提取时间为≥10min，优选为15-40min；d、所述固液分离选自离心或者滤膜过滤；e、溶剂选自体积百分数为40-80％的甲醇水溶液或者体积百分数为40-80％的丙酮水溶液。5.根据权利要求1-4中任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用咖啡酸、迷迭香酸、维采宁-ii和芹菜素-7-o-二葡萄糖醛酸苷中的至少一种加溶剂制备对照品溶液的步骤，以及按照权利要求1-4中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照品溶液得到对照品图谱的步骤。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，每1ml对照品溶液中含1-100μg咖啡酸、1-100μg迷迭香酸、1-100μg维采宁-ii和1-100μg芹菜素-7-o-二葡萄糖醛酸苷中的至少一种；和/或，对照品溶液制备中所采用的溶剂选自甲醇或甲醇水溶液。7.根据权利要求1-6中任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括采用紫苏梗对照药材加水提取后得到的提取物按照权利要求1-4中任一所述的构建方法中的供试品溶液的制备方法制备对照药材参照物溶液，以及按照权利要求1-4中任一所述的构建方法中的高效液相色谱法检测对照药材参照物溶液得到对照品药材参照图谱的步骤，优选地，紫苏梗对照药材水提取后经滤过、取液体干燥处理再按照权利要求1-4中任一所述的构
建方法中的供试品溶液的制备方法制备对照药材参照物溶液。8.根据权利要求1-7中任一所述的构建方法，其特征在于，所述紫苏梗药物制剂的特征图谱具有11个共有特征峰，与咖啡酸对照品参照物峰相应的峰为s峰，各特征峰与s峰的相对保留时间在规定值的
±
10％的范围之内；规定值为：0.32(峰1)、0.86(峰2)、1.00(峰3)、1.29(峰4)、1.40(峰5)、1.48(峰6)、1.76(峰7)、1.81(峰8)、2.06(峰9)、2.85(峰10)、3.22(峰11)。9.权利要求1-8中任一项所述的紫苏梗药物制剂的特征图谱的构建方法在紫苏梗药物制剂的质量检测中的应用。10.一种紫苏梗药物制剂的质量检测方法，其特征在于，包括将待测紫苏梗产品的特征图谱与紫苏梗药物制剂的对照特征图谱进行比较的步骤；所述待测紫苏梗产品的特征图谱为使用待测紫苏梗产品按照权利要求1-8中任一所述的构建方法构建得到，所述紫苏梗药物制剂的对照特征图谱选自如下(1)-(3)中的任意一项：(1)其具有11个共有特征峰，与咖啡酸对照品参照物峰相应的峰为s峰，各特征峰与s峰的相对保留时间在规定值的
±
10％的范围之内；规定值为：0.32(峰1)、0.86(峰2)、1.00(峰3)、1.29(峰4)、1.40(峰5)、1.48(峰6)、1.76(峰7)、1.81(峰8)、2.06(峰9)、2.85(峰10)、3.22(峰11)；(2)使用单批次或者多批次紫苏梗药物制剂按照权利要求1-8中任一所述的构建方法得到的紫苏梗药物制剂的特征图谱；(3)使用多批次紫苏梗药物制剂按照权利要求1-8中任一所述的构建方法得到的特征图谱通过平均值或者中位数法制成对照特征图谱。
技术总结本发明属于中药检测技术领域，具体提供了一种紫苏梗药物制剂的特征图谱的构建方法，包括以下步骤，(1)供试品溶液的制备；(2)取供试品溶液采用高效液相色谱法检测，采用Waters CORTEC UPLC T3色谱柱，流动相包括含酸的水溶液和乙腈，梯度洗脱程序包括：0
技术研发人员：张辉 江斌 赵伟志 郑晓英 李璐
受保护的技术使用者：华润三九现代中药制药有限公司
技术研发日：2022.05.13
技术公布日：2022/11/1
