1.本发明涉及间充质干细胞和间充质干细胞用培养基。
背景技术：2.近年来，进行了人体的各部位的组织、细胞、受精卵等的细胞培养，培养而得的细胞正在实际用于再生医疗等。作为其中之一，包括间充质干细胞。间充质干细胞是由friedenstein首先从骨髓分离出的具有多分化潜能的祖细胞(参照非专利文献1)。已获知间充质干细胞存在于骨髓、脐带、脂肪等各种组织中，间充质干细胞移植作为各种疑难疾病的新的治疗方法而备受期待(参照专利文献1～2)。最近获知，脂肪组织、胎盘、脐带、卵膜等的间质细胞中存在具有同等功能的细胞。因此，有时也将间充质干细胞称为间质细胞(mesenchymal stromal cell)。
3.在培养间充质干细胞时，以往一直使用血清培养基。细胞培养中，血清是作为生长因子、粘附因子、激素、脂质和矿物质的供给源的重要因子。另一方面，使用胎牛血清等血清作为血清培养基，存在由动物血清导致的混入病毒、细菌等风险。另外，血清还存在有批次差异、不易获得稳定的效果的问题。因此，正在开发用合适的营养成分和激素成分来替代血清、能够避免使用动物血清时的问题的无血清培养基，但是存在细胞增殖速度比使用血清培养基时慢等问题。
4.另外，在利用现有的无血清培养基进行间充质干细胞的培养时，细胞的粘附性弱，因此需要利用胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白等包被剂包被培养容器的细胞粘附面，费事且费用高。
5.现有技术文献
6.专利文献
7.专利文献1：日本特开2012-157263号公报
8.专利文献2：日本特表2012-508733号公报
9.非专利文献
10.非专利文献1：pittenger f.m.et al.science，(1999)，284，pp.143-147
技术实现要素：11.发明要解决的问题
12.鉴于上述情况，本发明的目的在于，提供细胞粘附性优异、不需要血清培养基、能得到充分的细胞增殖速度的间充质干细胞。
13.用于解决问题的方案
14.本发明人们为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，间充质干细胞(mesenchymal stem(stromal)cell；msc)中的粒细胞集落刺激因子(g-csf(granulocyte colony stimulating factor))的产生(production)量亢进的细胞粘附所需的时间短、细胞增殖速度快，从而完成了本发明。根据本发明，可以提供细胞粘附性优异、细胞增殖速度
快的间充质干细胞。即，本发明的主旨如下所述。
15.[1]一种间充质干细胞，其特征在于，粒细胞集落刺激因子(g-csf(granulocyte colony stimulating factor))的产生(production)量亢进。
[0016]
[2]一种间充质干细胞，其特征在于，选自由嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、分形趋化因子(fractalkine)、gro、mcp-3和vegf组成的组中的至少一种的产生量亢进。
[0017]
[3]根据[1]或[2]所述的间充质干细胞，其源自脂肪组织、源自脐带组织、或源自骨髓组织。
[0018]
[4]一种细胞用培养基，其诱导[1]至[3]中任一项所述的间充质干细胞。
[0019]
发明的效果
[0020]
根据本发明，可以提供细胞粘附性优异、细胞增殖速度快的间充质干细胞。本发明的间充质干细胞即使培养中不使用血清也粘附性优异、不挑剔容器、能够快速增殖。另外，本发明的间充质干细胞还可降低巨噬细胞的ccl2、tnf和pdgfb的mrna表达，另外还具有抑制活化t细胞的增殖的作用，发挥显著的抗炎症效果。
附图说明
[0021]
图1为示出对于间充质干细胞而言细胞粘附所需的时间与g-csf分泌量的关系的图。
[0022]
图2为示出对于间充质干细胞而言细胞增殖活性与g-csf分泌量的关系的图。
[0023]
图3为示出在各培养基条件下培养的源自脂肪的间充质干细胞的postpdl的图。
[0024]
图4为示出在各培养基条件下培养的源自脂肪的间充质干细胞的postpdl的图。
[0025]
图5为示出在各培养基条件下培养的源自脐带的间充质干细胞的postpdl的图。
[0026]
图6为示出在各培养基条件下培养的源自脐带的间充质干细胞的postpdl的图。
[0027]
图7为示出在各培养基条件下培养的源自骨髓的间充质干细胞的postpdl的图。
[0028]
图8为用r培养基培养的源自人脂肪细胞的干细胞(adsc)的显微镜照片。
[0029]
图9为用mc培养基培养的源自人脂肪细胞的干细胞(adsc)的显微镜照片。
[0030]
图10为用sp培养基培养的源自人脂肪细胞的干细胞(adsc)的显微镜照片。
[0031]
图11为示出由于与源自人脐带的间充质干细胞共培养而导致的、thp-1巨噬细胞的ccl2mrna表达量的抑制率的图。
[0032]
图12为示出由于与源自人脐带的间充质干细胞共培养而导致的、thp-1巨噬细胞的tnfmrna表达量的抑制率的图。
[0033]
图13为示出由于与源自人脐带的间充质干细胞共培养而导致的、thp-1巨噬细胞的pdgfbmrna表达量的抑制率的图。
[0034]
图14为示出由于与源自人脐带的间充质干细胞共培养而导致的、t细胞增殖抑制率的图。
[0035]
图15为示出由于与源自人脐带的间充质干细胞共培养而导致的、t细胞增殖抑制率的图。
[0036]
图16为示出由于与源自人脐带的间充质干细胞共培养而导致的、t细胞增殖抑制率的图。
[0037]
图17为示出由于与源自人脐带的间充质干细胞共培养而导致的、t细胞增殖抑制
率的图。
具体实施方式
[0038]
以下对本发明的间充质干细胞进行详细说明。
[0039]
[间充质干细胞]
[0040]
本发明的间充质干细胞的特征在于，粒细胞集落刺激因子(g-csf(granulocyte colony stimulating factor))的产生量亢进。另外，本发明的间充质干细胞的特征在于，选自由嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、分形趋化因子(fractalkine)、gro、mcp-3和vegf组成的组中的至少一种的产生量亢进。
[0041]
粒细胞集落刺激因子(g-csf(granulocyte colony stimulating factor))是使造血干细胞特异性分化为中性粒细胞(粒细胞)的生长因子。嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)是对嗜酸性粒细胞选择性赋予高趋化性的cc趋化因子的1个。分形趋化因子(fractalkine)是兼具趋化因子和细胞粘附分子这两种活性的、在活化的血管内皮细胞上表达的细胞膜结合型趋化因子。gro也称为cxcl1，是一种一般认为具有有丝分裂功能、作为中性粒细胞趋化因子的趋化因子。mcp-3(monocyte chemotactic protein-3，单核细胞趋化蛋白3)是也被称为单核细胞特异性细胞因子3(monocyte-specific cytokine-3)的cc趋化因子，是针对单核细胞、巨噬细胞等的趋化因子。血管内皮生长因子(vegf(vascular endothelial growth factor))为促进血管新生的蛋白，具有促进以血管内皮细胞增殖为代表的血管新生过程、血管通透性亢进作用。
[0042]
本发明中，粒细胞集落刺激因子(g-csf)、嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、分形趋化因子(fractalkine)、gro、mcp-3、vegf等各因子的产生量亢进包括：细胞中，各因子的mrna表达量多、各因子的蛋白产生量多、各因子的分泌量多、或这些中任意者的组合。另外，本发明的间充质干细胞与其它细胞相比上述各因子产生量亢进即可，具体而言，本发明的间充质干细胞与在现有培养条件下(例如，利用含10％fbs dmem/f12(dulbecco
‘
s modified eagle medium：nutrient mixture f-12，杜尔贝科改良伊戈尔培养基：f-12营养混合物)培养基的培养)得到的间充质干细胞相比，上述各因子的基因表达量多、蛋白产生量多、或各因子的分泌量多即可。
[0043]
上述各因子的产生量亢进优选是指：与在现有培养条件下得到的间充质干细胞相比，mrna表达量、蛋白产生量、分泌量为120％以上、更优选为300％以上、进一步优选为1500％以上、特别优选为3000％以上、最优选为10000％以上。
[0044]
具体而言，g-csf的产生量亢进优选是指：相对于在现有培养条件下得到的间充质干细胞，其产生量为500％以上、更优选为1000％以上、进一步优选为5000％以上、特别优选为15000％以上。
[0045]
嗜酸性粒细胞趋化因子的产生量亢进优选是指：相对于在现有培养条件下得到的间充质干细胞，其产生量为200％以上、更优选为500％以上、进一步优选为1000％以上、特别优选为3000％以上。
[0046]
分形趋化因子的产生量亢进优选是指：相对于在现有培养条件下得到的间充质干细胞，其产生量为110％以上、更优选为120％以上、进一步优选为130％以上、特别优选为140％以上。
[0047]
gro的产生量亢进优选是指：相对于在现有培养条件下得到的间充质干细胞，其产生量为120％以上、更优选为300％以上、进一步优选为500％以上、特别优选为1500％以上。
[0048]
mcp-3的产生量亢进优选是指：相对于在现有培养条件下得到的间充质干细胞，其产生量为120％以上、更优选为150％以上、进一步优选为200％以上、特别优选为300％以上。
[0049]
vegf的产生量亢进优选是指：相对于在现有培养条件下得到的间充质干细胞，其产生量为110％以上、更优选为120％以上、进一步优选为130％以上、特别优选为140％以上。
[0050]
本发明中，间充质干细胞是指：具有分化为一种以上属于间充质的细胞(骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、腱细胞、脂肪细胞等)的分化潜能、能够在维持该能力的状态下增殖的细胞。本发明中使用的间充质干细胞这一术语是指与间质细胞相同的细胞，并非特意区分两者。另外，也有时简单记作间充质细胞。作为包含间充质干细胞的组织，可列举例如脂肪组织、脐带、骨髓、脐带血、子宫内膜、胎盘、羊膜、绒毛膜、蜕膜、真皮、骨骼肌、骨膜、牙囊、牙周膜、牙髓、牙胚等。例如，源自脂肪组织的间充质干细胞是指：脂肪组织中所含的间充质干细胞，也可以称为源自脂肪组织的间质细胞。这些中，优选源自脂肪组织的间充质干细胞、源自脐带的间充质干细胞、源自骨髓的间充质干细胞、源自胎盘的间充质干细胞、源自牙髓的间充质干细胞，更优选源自脂肪组织的间充质干细胞、源自脐带的间充质干细胞、源自骨髓的间充质干细胞。
[0051]
作为本发明中的间充质干细胞的物种，可列举人、马、牛、绵羊、猪、狗、猫、兔、小鼠、大鼠。
[0052]
本发明中，间充质干细胞是指：含有间充质干细胞的任意细胞群。该细胞群的至少20％以上、优选为30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、93％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上为间充质干细胞。
[0053]
本发明中，脂肪组织是指：含有脂肪细胞以及包含微血管细胞等间质细胞的组织，例如为对哺乳动物的皮下脂肪进行外科手术切除或抽吸而得到的组织。
[0054]
本发明中，脐带是指：连接胎儿和胎盘的白色管状组织，由脐静脉、脐动脉、胶样组织(华尔通氏胶；wharton’s jelly)、脐带基质本身等构成，其包含大量间充质干细胞。
[0055]
本发明中，骨髓是指：充满了骨内腔的柔性组织，是造血器官。骨髓中存在骨髓液，其中存在的细胞称为骨髓细胞。骨髓细胞除了包括红细胞、粒细胞、巨核细胞、淋巴细胞、脂肪细胞等以外，还包括间充质干细胞、造血干细胞、血管内皮祖细胞等。骨髓细胞可以从例如人髂骨、长骨或其它骨中采集。
[0056]
(间充质干细胞的制备方法)
[0057]
本发明的间充质干细胞的制备方法没有特别限定，例如可以如下制备。即，从脂肪组织、脐带、骨髓等组织中按照本领域技术人员公知的方法分离间充质干细胞，通过使用特定培养基的培养来诱导各因子的产生量亢进的间充质干细胞，由此可以获得本发明的间充质干细胞。该通过诱导而得到的细胞群中，优选细胞群的50％以上为本发明的细胞，更优选70％以上为本发明的细胞，进一步优选80％以上为本发明的细胞，特别优选90％以上为本发明的细胞，最优选实质上为本发明的细胞的均一细胞群。
[0058]
从将本发明的间充质干细胞用作细胞药物的观点出发，优选使用不含血清等异源成分(无异源物质)的培养基。从即便在这样的培养基中也使间充质干细胞成为g-csf等特定因子的产生量亢进的本发明的间充质干细胞的效果优异的观点出发，粘度为1.00～1.20的范围，优选为1.05～1.10。另外，培养基的渗透压为1.00～1.10的范围，优选为1.04～1.05。在使间充质干细胞成为g-csf等特定因子的产生量亢进的本发明的间充质干细胞方面有效的培养基属于本发明的范围。
[0059]
为了确认所选择的细胞为本发明的源自脂肪组织的间充质干细胞，可以使用流式细胞术等通过现有方法对表面抗原进行分析。进而，也可以检查分化成各细胞谱系的能力，这样的分化可以通过现有方法来进行。
[0060]
本发明中的间充质干细胞可以如上述那样制备，除了g-csf等特定因子的产生量亢进以外，还可以定义为具有下述特性的细胞；
[0061]
(1)在用标准培养基的培养条件下对塑料显示出粘附性；
[0062]
(2)表面抗原cd44、cd73、cd90为阳性，cd31、cd45为阴性；
[0063]
(3)可根据培养条件分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。
[0064]
本发明的间充质干细胞可以为任意状态的细胞，例如可以为将培养中的细胞剥离、回收而得的细胞，可以为冷冻在冷冻保存液中的状态的细胞。
[0065]
实施例
[0066]
以下列举实施例和试验例详细说明本发明，但是本发明不受这些实施例等限定。
[0067]
[实施例1：细胞的培养1]
[0068]
将源自人脐带的间充质干细胞(promo cell公司、以下称为“hucmsc”)以5000个细胞/cm2接种于粘附细胞用t75烧瓶(corning公司)，分别用10％fbs dmem/f12培养基(sigma公司、以下称为“dmem/f12培养基”)、r：stem间充质干细胞用无血清培养基(rohto公司、以下称为“r培养基”)、stemfit for mesenchymal stem cell(味之素公司、以下称为“sf培养基”)和stempro(注册商标)msc sfm(thermo fisher scientific公司、以下称为“sp培养基”)培养3天(37℃、5％co2)。之后使用细胞剥离液进行传代，进一步培养4天(37℃、5％co2)后回收上清。使用人细胞因子/趋化因子磁珠板(emd millipore公司、cat.：hcytomag-60k)，利用magpix(注册商标)系统(merck millipor公司)进行多重试验，测定细胞上清中的粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor、以下称为“g-csf”)。需要说明的是，将用dmem/f12培养基培养的细胞的上清中的g-csf含量设为100％而求出用各培养基培养的细胞的上清中的g-csf量。将结果示于表1。
[0069]
另外，将hucmsc分别接种于dmem/f12培养基、r培养基、sf培养基和sp培养基，使用活细胞成像系统(si8000、sony公司)测定至细胞静止(粘附)为止的时间。将结果示于表1。
[0070]
进而，将hucmsc分别接种于dmem/f12培养基、r培养基、sf培养基和sp培养基后培养2天(37℃、5％co2)，通过wst-8(cell counting kit-8，细胞计数试剂盒-8)评价细胞增殖活性(表1)。
[0071]
[表1]
[0072][0073]
如表1所示，可知用r培养基培养的间充质干细胞的上清与用dmem/f12培养基培养的间充质干细胞的上清相比，g-csf含量高。与此相对地，用其它无血清培养基培养的间充质干细胞的上清与用dmem/f12培养基培养的间充质干细胞的上清相比，g-csf含量低。
[0074]
另外，用r培养基培养的间充质干细胞与用dmem/f12培养基培养的间充质干细胞相比，至粘附于培养容器为止的时间短。与此相对地，用其它无血清培养基培养的间充质干细胞与用dmem/f12培养基培养的间充质干细胞相比，至粘附于培养容器为止的时间长。
[0075]
进而，用r培养基培养的间充质干细胞与用dmem/f12培养基培养的间充质干细胞相比，细胞增殖活性高。与此相对地，用其它无血清培养基培养的间充质干细胞与用dmem/f12培养基培养的间充质干细胞相比，细胞增殖活性低。
[0076]
由以上结果可明确，用r培养基培养的间充质干细胞的g-csf分泌量多，另外细胞粘附所需的时间短，细胞增殖活性高。
[0077]
另外，对于上述培养中所使用的培养基彼此不同的细胞，将细胞粘附所需的时间与g-csf分泌量的关系、以及细胞增殖活性与g-csf分泌量的关系分别示于图1和图2。g-csf分泌量越多的细胞，细胞粘附所需的时间越短(图1)。g-csf分泌量越多的细胞，细胞增殖活性越高(图2)。
[0078]
[实施例2：细胞的培养2]
[0079]
与实施例1同样地将hucmsc以5000个细胞/cm2接种于粘附细胞用t75烧瓶(corning公司)，分别用dmem/f12培养基、r培养基和sp培养基培养了3天(37℃、5％co2)。之后使用细胞剥离液进行传代，进一步培养4天(37℃、5％co2)后回收上清。使用人细胞因子/趋化因子磁珠板(emd millipore公司、cat.：hcytomag-60k)，利用magpix(注册商标)系统(merck millipor公司)进行多重试验，测定细胞上清中的嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)和分形趋化因子(fractalkine)。需要说明的是，将用dmem/f12培养基培养的细胞的上清中的嗜酸性粒细胞趋化因子和分形趋化因子含量设为100％而求出用各培养基培养的细胞的上清中的嗜酸性粒细胞趋化因子和分形趋化因子的量(表2)。
[0080]
另外，将hucmsc分别接种于dmem/f2培养基、r培养基和sp培养基后，使用活细胞成像系统(si8000、sony公司)测定迁移距离(表2)。
[0081]
由以上结果可明确，用r培养基培养的间充质干细胞的嗜酸性粒细胞趋化因子和分形趋化因子的分泌量多，另外迁移距离长。
[0082]
[表2]
[0083]
[0084]
如表2所示，可知用r培养基培养的间充质干细胞的上清与用dmem/f12培养基培养的间充质干细胞的上清相比，嗜酸性粒细胞趋化因子和分形趋化因子的含量高。与此相对地，用sp培养基培养的间充质干细胞的上清与用dmem/f12培养基培养的间充质干细胞的上清为同等程度。
[0085]
另外，用r培养基培养的间充质干细胞与用dmem/f12培养基培养的间充质干细胞相比，迁移距离显著长。
[0086]
[实施例3：细胞的培养3]
[0087]
与实施例1同样地将hucmsc以5000个细胞/cm2接种于粘附细胞用t75烧瓶(corning公司)，分别用dmem/f12培养基、r培养基和mesenpro rs(商标)medium(thermo fisher scientific公司、以下称为“mp培养基”)培养3天(37℃、5％co2)。之后使用细胞剥离液进行传代，进一步培养4天(37℃、5％co2)后回收上清。使用人细胞因子/趋化因子磁珠板(emd millipore公司、cat.：hcytomag-60k)，利用magpix(注册商标)系统(merck millipor公司)进行多重试验，测定细胞上清中的嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)和分形趋化因子(fractalkine)。需要说明的是，将用dmem/f12培养基培养的细胞的上清中的嗜酸性粒细胞趋化因子和分形趋化因子含量设为100％而求出用各培养基培养的细胞的上清中的嗜酸性粒细胞趋化因子和分形趋化因子的量(表3)。
[0088]
另外，将hucmsc分别接种于dmem/f2培养基、r培养基和mp培养基后，使用活细胞成像系统(si8000、sony公司)测定至细胞静止(粘附)为止的时间和迁移距离(表3)。
[0089]
进而，将hucmsc分别接种于dmem/f12培养基、r培养基和mp培养基后培养2天(37℃、5％co2)，利用wst-8(细胞计数试剂盒-8)评价细胞增殖活性(表3)。
[0090]
[表3]
[0091][0092]
如表3所示，可知用r培养基培养的间充质干细胞的上清与用dmem/f12培养基培养的间充质干细胞的上清相比，嗜酸性粒细胞趋化因子和分形趋化因子的含量高。与此相对地，用ms培养基培养的间充质干细胞的上清与用dmem/f12培养基培养的间充质干细胞的上清为同等程度。
[0093]
另外，用r培养基培养的间充质干细胞与用dmem/f12培养基培养的间充质干细胞相比，至粘附于容器为止的时间显著短，细胞增殖活性高。与此相对地，用ms培养基培养的间充质干细胞与用dmem/f12培养基培养的间充质干细胞为同等程度。
[0094]
由以上结果可明确，用r培养基培养的间充质干细胞的嗜酸性粒细胞趋化因子和分形趋化因子的分泌量多，另外迁移距离长，细胞增殖活性高。
[0095]
[实施例4：细胞的培养4]
[0096]
与实施例1同样地将hucmsc以5000个细胞/cm2接种于粘附细胞用t75烧瓶(corning公司)，分别用dmem/f12培养基、r培养基、sf培养基、sp培养基和ms培养基培养3天(37℃、5％co2)。之后使用细胞剥离液进行传代，进一步培养4天(37℃、5％co2)后回收上清。
使用人细胞因子/趋化因子磁珠板(emd millipore公司、cat.：hcytomag-60k)，利用magpix(注册商标)系统(merck millipor公司)进行多重试验，测定细胞上清中的gro、单核细胞趋化蛋白-3(monocyte chemotactic protein-3)(以下称为“mcp-3”)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor、以下称为“vegf”)。需要说明的是，将用dmem/f12培养基培养的细胞的上清中的各成分的含量设为100％而求出用各培养基培养的细胞的上清中的各成分的含量(表4)。
[0097]
[表4]
[0098][0099]
如表4所示，用r培养基培养的间充质干细胞的上清与用dmem/f12培养基培养的间充质干细胞的上清相比，gro、mcp-3和vegf嗜酸性粒细胞趋化因子含量高。与此相对地，用其它无血清培养基培养的间充质干细胞与用dmem/f12培养基培养的间充质干细胞相比，所有因子的含量均低。
[0100]
[实施例5：源自脂肪的间充质干细胞的增殖1]
[0101]
在得到供体本人的同意后，将通过脂肪抽吸法得到的皮下脂肪组织用生理盐水清洗。为了破坏胞外基质和分离细胞，添加胶原酶(roche diagnostics公司)(溶剂为生理盐水)，在37℃下振荡90分钟而进行分散。接着，将上述悬浮液以800g离心分离5分钟，得到间质血管细胞群的沉淀。向上述细胞的沉淀中加入间充质干细胞用无血清培养基(rohto公司)，将该细胞悬浮液以400g离心分离5分钟，去除上清后重悬于间充质干细胞用无血清培养基(rohto公司)，将细胞接种到烧瓶中。将细胞在37℃下在5％co2中培养数天。数天后将培养物用pbs清洗，去除培养液中包含的血细胞、脂肪组织残片等，得到粘附于塑料容器的间充质干细胞。将得到的源自脂肪组织的间充质干细胞以5000个细胞/cm2接种于粘附细胞用t25烧瓶(corning公司)，分别用dmem/f12培养基、r培养基以及sp培养基以及ms培养基培养(37℃、5％co2)。测定培养4天、7天和11天后的各细胞数，求出postpdl(图3)。
[0102]
如图3所示，用r培养基培养的源自脂肪的间充质干细胞与用dmem/f12培养基和sp培养基培养的源自脂肪的间充质干细胞相比，细胞增殖活性高。
[0103]
[实施例6：源自脂肪的间充质干细胞的增殖2]
[0104]
将源自人脂肪的间充质干细胞(promo cell公司)以5000个细胞/cm2接种于粘附细胞用t25烧瓶(corning公司)，分别用dmem/f12培养基和r培养基培养。测定培养4天、7天和11天后的各细胞数，求出postpdl(图4)。
[0105]
与实施例5同样地，用r培养基培养的源自脂肪的间充质干细胞与用dmem/f12培养的源自脂肪的间充质干细胞相比，细胞增殖活性高。
[0106]
[实施例7：源自脐带的间充质干细胞的增殖1]
[0107]
用生理盐水清洗取得提供者的同意而采集的脐带。为了破坏胞外基质和分离细胞，添加胶原酶(roche diagnostics公司)(溶剂为生理盐水)，在37℃下振荡90分钟而进行分散。接着，将上述悬浮液以800g离心分离5分钟，得到间质血管细胞群的沉淀。向上述细胞
的沉淀中加入间充质干细胞用无血清培养基(rohto公司)，将该细胞悬浮液以400g离心分离5分钟，去除上清后重悬于间充质干细胞用无血清培养基(rohto公司)，将细胞接种到烧瓶中。将细胞在37℃下在5％co2中培养数天。数天后用pbs清洗培养物而去除培养液中包含的血细胞、脐带组织残片等，得到粘附于塑料容器的间充质干细胞。将得到的源自脐带的间充质干细胞以5000个细胞/cm2接种于粘附细胞用t25烧瓶(corning公司)，分别用dmem/f12培养基、r培养基和sp培养基、ms培养基和mesenculttm msc basal medium(human)(stemcell technologies公司、以下称为“mc培养基”)培养(37℃、5％co2)。测定培养4天、7天和11天后的各细胞数，求出postpdl(图5)。
[0108]
用r培养基培养的源自脐带的间充质干细胞与用dmem/f12培养基和其它无血清培养基培养的源自脐带的间充质干细胞相比，细胞增殖活性高。
[0109]
[实施例8：源自脐带的间充质干细胞的增殖2]
[0110]
将源自人脐带的间充质干细胞(promo cell公司)以5000个细胞/cm2接种于粘附细胞用t25烧瓶(corning公司)，分别用dmem/f12培养基和r培养基培养(37℃、5％co2)。测定培养4天、7天、10天和13天后的各细胞数，求出postpdl(图6)。
[0111]
用r培养基培养的源自脐带的间充质干细胞与用dmem/f12培养基培养的源自脐带的间充质干细胞相比，细胞增殖活性高。
[0112]
[实施例9：源自骨髓的间充质干细胞的增殖]
[0113]
将源自人骨髓的间充质干细胞(promo cell公司)以5000个细胞/cm2接种于粘附细胞用t25烧瓶(thermo fisher scientific公司)，分别用dmem/f12培养基和r培养基培养(37℃、5％co2)。测定培养2天、7天、12天和15天后的各细胞数，求出postpdl(图7)。
[0114]
用r培养基培养的源自脐带的间充质干细胞与用dmem/f12培养基培养的源自脐带的间充质干细胞相比，细胞增殖活性高。
[0115]
[实施例10：源自脂肪的间充质干细胞的粘附]
[0116]
将源自人脂肪细胞的干细胞(adsc)(lonza公司、以下称为“adsc”)以2000个细胞/cm2接种于粘附细胞用培养烧瓶(nunc easyflask细胞培养瓶、t25、cat：156367、未使用包被剂)，分别用r培养基、mc培养基和sp培养基培养48小时(37℃、5％co2)，用显微镜观察细胞的粘附状态。将显微镜照片示于图8(r培养基)、图9(mc培养基)、图10(sp培养基)。
[0117]
r培养基的情况下，可观察到源自脂肪细胞的干细胞粘附于烧瓶而伸长，其它无血清培养基的情况下未观察到伸长状态的源自脂肪细胞的干细胞。由以上可确认，r培养基与其它无血清培养基相比细胞粘附性提高。
[0118]
[实施例11：对thp-1巨噬细胞的影响]
[0119]
按照推荐方案对源自人急性单核细胞白血病的细胞株thp-1(riken bioresource research center、以下称为“thp-1”)进行扩大培养，制备冷冻储备物。在thp-1复苏接种起第9天，回收thp-1悬浮液，以终浓度100nm的方式向thp-1悬浮液中添加佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(富士胶片和光纯药公司)。向12孔板(corning inc.公司)的各孔中接种各1ml thp-1悬浮液并进行培养(37℃、5％co2)，由此进行thp-1的分化诱导。将分别用dmem/f12培养基、r培养基、sf培养基、mp培养基和sp培养基培养hucmsc后冷冻保存的细胞融解，以活细胞浓度为8.96
×
104个细胞/ml的方式加入10％fbs-rpmi培养基，进而以终浓度为1μg/ml的方式加入lps-eb(invivogen公司)。需要说明的是，10％fbs-rpmi培养基是将50ml的fbs和
5ml的青霉素-链霉素液(thermo fisher scientific inc.公司)加入到445ml的rpmi-1640medium(thermo fisher scientific inc.公司)中而制备的。在thp-1分化诱导后第3天，将所制备的细胞加入到孔的transwell插件内并共培养2天。在共培养开始起2天后，回收thp-1的总rna，通过定量pcr测定ccl2、tnf和pdgfb的mrna表达量。根据由各样品得到的mrna表达量，使用式(1)求出抑制率。需要说明的是，引物使用了表5中记载的引物。将结果示于图11(ccl2)、图12(tnf)和图13(pdgfb)。
[0120]
100
×
(1-(各样品的mrna量)/(lps(+)的mrna量))
···
式(1)
[0121]
[表5]
[0122][0123]
通过与源自脐带的间充质干细胞进行共培养，thp-1巨噬细胞的ccl2、tnf和pdgfb的mrna表达量受到抑制。其中，用r培养基培养的源自脐带的间充质干细胞的该效果最高。
[0124]
[培养基特性]
[0125]
对于dmem/f12培养基、r培养基、sf培养基、sp培养基和ms培养基，使用低粘度计(转子no.01、tve-20l、东机产业公司)测定20℃、100rpm、180秒下的粘度。另外，也测定了渗透压和ph(表6)。需要说明的是，渗透压比基于第十七次修订日本药典而设为试样的渗透压相对于286mosm(0.9w/v％氯化钠水溶液)的渗透压的比，渗透压参考日本药典记载的渗透压测定法(冰点降低法)而测定。需要说明的是，渗透压比测定用标准液(0.9w/v％氯化钠水溶液)使用了日本药典生理盐水大塚生食注(大塚制药工场制)。
[0126]
[表6]
[0127] 粘度ph渗透压dmem/f12培养基1.6707.101.088r培养基1.0677.211.045sf培养基1.1167.201.050sp培养基1.1147.301.088ms培养基1.2477.401.063
[0128]
任一无血清培养基与dmem/f12培养基相比粘度均低，其中r培养基的粘度最低。另外，sp培养基与dmem/f12培养基的渗透压为同等程度，但是其它无血清培养基与dmem/f12培养基相比渗透压低，其中r培养基的渗透压最低。
[0129]
以上的结果表明，r培养基虽然为低粘度、低渗透压但可能使细胞具有强粘附性。
[0130]
[实施例12：对t细胞的影响1]
[0131]
将用r培养基或sf培养基培养后冷冻保存的hucmsc融解，以1.33
×
105个细胞/孔接种于24孔板，培养15小时以上。之后进行羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(5-(和-6)-羧基荧光
素二乙酸琥珀酰亚胺酯、以下称为“cfse”)染色，与用抗cd3/cd28抗体刺激增殖的4.00
×
105个细胞/孔的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells、以下称为“pbmc”)共培养4天。共培养后回收pbmc，使用流式细胞仪通过cfse染色的荧光强度来计测增殖的t细胞的比例。需要说明的是，分析对象设为cd4阳性和cd8阳性t细胞，通过cd3、cd4和cd8的抗体染色来鉴定这些t细胞。另外，对于增殖的t细胞的比例，在无抗cd3/cd28抗体刺激组的增殖率为0.5％左右的位置设门，将同样的门应用于抗cd3/cd28抗体刺激试验组，从而进行测定。需要说明的是，虽然图中未示出，但是使用了源自人脂肪的间充质细胞(hadmsc)作为阳性对照。与进行了抗cd3/cd28抗体刺激、未与msc共培养的组(cntl)相比，与hucmsc共培养的组中增殖的cd4阳性t细胞和cd8阳性t细胞的比例减少(图14和图15)。另外，与用r培养基培养的hucmsc相比，用sf培养基培养的hucmsc的增殖抑制效果低。
[0132]
[实施例13：对t细胞的影响2]
[0133]
将用dmem/f12培养基培养后冷冻保存的hucmsc融解，与实施例12同样地计测增殖的t细胞的比例。与进行了抗cd3/cd28抗体刺激、未与hucmsc共培养的组(cntl)相比，与hucmsc共培养的组中，增殖的cd4阳性t细胞和cd8阳性t细胞的比例减少(图16和图17)。由实施例12和实施例13与阳性对照的比较可知，用r培养基培养的hucmsc的t细胞增殖抑制效果与用dmem/f12培养基培养的hucmsc的t细胞增殖抑制效果相比更高。
[0134]
产业上的可利用性
[0135]
根据本发明，能够提供细胞粘附性高、细胞增殖速度快的间充质干细胞。另外，本发明的间充质干细胞使巨噬细胞的ccl2、tnf和pdgfb的mrna表达下降，另外还具有抑制活化的t细胞的增殖的作用，发挥显著的抗炎症效果。
技术特征：1.一种间充质干细胞，其特征在于，粒细胞集落刺激因子(g-csf(granulocyte colony stimulating factor))的产生(production)量亢进。2.一种间充质干细胞，其特征在于，选自由嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin)、分形趋化因子(fractalkine)、gro、mcp-3和vegf组成的组中的至少一种的产生量亢进。3.根据权利要求1或2所述的间充质干细胞，其源自脂肪组织、源自脐带组织、或源自骨髓组织。4.一种细胞用培养基，其诱导权利要求1至3中任一项所述的间充质干细胞。
技术总结本发明的目的在于，提供细胞粘附性优异、不需要血清培养基、可得到充分的细胞增殖速度的间充质干细胞。本发明为一种间充质干细胞，其特征在于，粒细胞集落刺激因子(G-CSF(Granulocyte Colony Stimulating Factor))的产生量亢进。另外，本发明还包括一种间充质干细胞，其特征在于，选自由嗜酸性粒细胞趋化因子(EOTAXIN)、分形趋化因子(FRACTALKINE)、GRO、MCP-3和VEGF组成的组中的至少一种的产生量亢进。量亢进。
技术研发人员：石川格靖 阿部正通 野中秀纪
受保护的技术使用者：日本乐敦制药株式会社
技术研发日：2021.02.09
技术公布日：2022/11/1
