一种降解乙酰甲胺磷杀虫剂的潘多拉菌及其应用

1.本发明属于微生物降解技术领域。更具体地，涉及一种降解乙酰甲胺磷杀虫剂的潘多拉菌及其应用。


背景技术：

2.乙酰甲胺磷是一种常用的有机磷农药，因其低毒高效等特点，已被广泛应用于农林业害虫防治。乙酰甲胺磷可通过抑制乙酰胆碱酯酶的活性，进而产生神经毒性，从而产生杀虫作用。乙酰甲胺磷常被用于防治观赏植物、棉花、豆类和莴笋上的各种害虫。因为它的毒性比甲胺磷(iv类剧毒)小，最初被认为是甲胺磷的替代品。
3.乙酰甲胺磷的广泛应用导致了严重的环境污染问题，进而对非靶标生物造成危害，已引起公众关注。2019年中国开始限制使用乙酰甲胺磷，禁止在蔬菜、瓜果、茶叶、菌类和中草药材作物上使用乙酰甲胺磷(包括含其有效成分的单剂、复配制剂)。乙酰甲胺磷极易溶解在水中，容易污染地下水和土壤，也容易被植物吸收并积聚在植物的食用部位，并可能通过食物链富集到人体。近年来，在水/土壤中经常检测到残留的乙酰甲胺磷。2016-2017年某市水源地水源调查处结果显示，乙酰甲胺磷在某市江中的平均浓度分别为1.67μg/l和0.31μg/l，此外，乙酰甲胺磷在湿润的热带土壤中的半衰期为9.77d。
4.研究表明，乙酰甲胺磷对鱼类、老鼠、鸟类和人类等非目标生物具有神经毒性、生殖毒性和发育毒性等危害。乙酰甲胺磷会导致大鼠高血糖、代谢受损、dna损伤、生殖障碍和癌症，比如会改变怀孕和哺乳期大鼠的葡萄糖代谢，使其后代在成年期更易患ⅱ型糖尿病。暴露于乙酰甲胺磷中，可能导致大鼠代谢紊乱，而一些内源性代谢物的改变则会导致大鼠肾脏损伤并破坏正常的代谢过程，包括葡萄糖、核酸和蛋白质代谢。乙酰甲胺磷可能是一种基因毒素，对人类健康构成严重威胁。它可以导致人类淋巴细胞的染色体改变和dna损伤。此外，有人认为乙酰甲胺磷还通过破坏精子活力、细胞膜完整性和精子体积对人类精子产生细胞毒性和基因毒性作用。乙酰甲胺磷的广泛使用已经对许多生物造成毒性作用，并造成许多健康问题。因此，如何去除环境中残留的乙酰甲胺磷已成为当前亟待解决的问题。
5.微生物降解因其条件温和、无二次污染和优异的代谢活性成为乙酰甲胺磷农药残留修复的主流技术。目前，关于乙酰甲胺磷降解微生物报道较少，效率不高。同时由于降解微生物自身遗传特性及代谢活性不同，导致不同降解菌的降解效率也具有较大差距，因此，如何获得对于乙酰甲胺磷具有高效、稳定降解活性的降解微生物是目前需要解决的难题，同时也成为绿色修复乙酰甲胺磷农药残留污染的基础和重点。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是克服现有乙酰甲胺磷杀虫剂农药残留降解修复技术的不足，提供一株降解乙酰甲胺磷杀虫剂的菌株及其生产的菌剂和降解方法，能够快速高效地降解乙酰甲胺磷杀虫剂，可用于修复乙酰甲胺磷杀虫剂污染的土壤和水体等环境。
7.本发明的第一个目的是提供一株可高效降解乙酰甲胺磷杀虫剂的潘多拉菌
(pandoraea pnomenusa)菌株zq05。
8.本发明的第二个目的是提供潘多拉菌(pandoraea pnomenusa)在降解乙酰甲胺磷杀虫剂或在制备降解乙酰甲胺磷杀虫剂的产品中的应用。
9.本发明的第三个目的是提供潘多拉菌在修复乙酰甲胺磷杀虫剂污染的自然环境中的应用。
10.本发明的第四个目的是提供一种用于降解乙酰甲胺磷杀虫剂的菌剂。
11.本发明的第五个目的是提供一种降解乙酰甲胺磷杀虫剂或修复其污染的环境的方法。
12.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
13.本发明筛选获得一株可高效降解乙酰甲胺磷杀虫剂的潘多拉菌(pandoraea pnomenusa)菌株zq05，所述菌株zq05于2021年7月21日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmccno：61815，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
14.本发明首次发现潘多拉菌(pandoraea pnomenusa)对乙酰甲胺磷杀虫剂的降解作用，并筛选得到一株可高效快速降解乙酰甲胺磷杀虫剂的潘多拉菌菌株zq05。该菌株是从广东广州某废水处理池的活性污泥中经人工富集培养、分离纯化得到，对乙酰甲胺磷具有高效快速的降解效能，在以乙酰甲胺磷杀虫剂为唯一碳源的无机盐培养基中培养18h，对乙酰甲胺磷杀虫剂的降解率达到96.81％，可耐受800mg/l的高浓度乙酰甲胺磷杀虫剂；将该菌株接种污染土壤15h后，土壤中乙酰甲胺磷杀虫剂残留量降低100％，降解能力优异，可高效快速地去除水体和土壤中该类农药的残留量，表明菌株zq05可以作为优良的生物降解菌应用于乙酰甲胺磷农药污染的生物修复。
15.因此，以下应用均应在本发明的保护范围之内：
16.潘多拉菌或其菌悬液在降解乙酰甲胺磷杀虫剂或在制备降解乙酰甲胺磷杀虫剂的产品中的应用。
17.潘多拉菌或其菌悬液在修复乙酰甲胺磷杀虫剂污染的自然环境中的应用。
18.优选地，所述环境包括水体和/或土壤。
19.另外，所述环境包括农业生产区域、工业生产区域、城市绿化区域和住宅区域中的一种或多种环境。
20.优选地，所述潘多拉菌为上述菌株zq05。
21.进一步地，本发明还提供了一种可用于高效降解乙酰甲胺磷杀虫剂的菌剂，所述菌剂中含有上述菌株zq05。
22.优选地，所述菌剂中的菌体数量不低于2.24
×
108cfu/ml。
23.基于此，利用菌株zq05降解乙酰甲胺磷杀虫剂或修复其污染的环境的方法，也应在本发明的保护范围之内。
24.另外为了达到更好更稳定的降解效果，利用所述菌株zq05降解乙酰甲胺磷杀虫剂或修复其污染的环境时，环境条件优选为：温度为20～40℃，更优选温度为25～30℃，最优选温度为26.9℃。
25.进一步地，利用所述菌株zq05降解乙酰甲胺磷杀虫剂或修复其污染的环境时，环境条件优选为：ph为5.0～9.0，更优选ph为5.0～7.0，最优选ph为5.4。
26.本发明具有以下有益效果：
27.(1)本发明首次公开了潘多拉菌对乙酰甲胺磷杀虫剂的降解作用，并筛选获得了一株高效快速降解乙酰甲胺磷杀虫剂的菌株zq05，该菌株可用于修复乙酰甲胺磷污染的水体、土壤等自然环境，直接施用可使水体和土壤中乙酰甲胺磷杀虫剂的残留量降低95％以上。本发明丰富了农药降解菌的种质资源库，在该类农药残留污染的水体和土壤生物修复中有重大应用价值，为打破现有治理农药残留污染瓶颈提供了新的开发途径。
28.(2)本发明进一步提供了所述菌株zq05的最优降解工艺条件：降解温度26.9℃、ph 5.4和接种量4.9
×
108cfu，在此工艺条件下菌剂降解效果明显提高，具有非常重要的理论和应用价值。
附图说明
29.图1为菌株zq05的全基因组测序的菌种鉴定。
30.图2为菌株zq05的扫描电镜图。
31.图3为温度影响菌株zq05降解乙酰甲胺磷杀虫剂的响应曲面图。
32.图4为ph影响菌株zq05降解乙酰甲胺磷杀虫剂的响应曲面图。
33.图5为接种量影响菌株zq05降解乙酰甲胺磷杀虫剂的响应曲面图。
34.图6为温度和ph值影响菌株zq05降解乙酰甲胺磷杀虫剂的响应曲面图。
35.图7为温度和接种量影响菌株zq05降解乙酰甲胺磷杀虫剂的响应曲面图。
36.图8为ph值和接种量影响菌株zq05降解乙酰甲胺磷杀虫剂的响应曲面图。
37.图9为菌株zq05在无机盐溶液中的生长与降解乙酰甲胺磷杀虫剂的动态图。
38.图10为不同乙酰甲胺磷杀虫剂初始浓度下，菌株zq05的比降解率变化图。
39.图11为菌株zq05在土壤中降解乙酰甲胺磷杀虫剂的动态图。
具体实施方式
40.下面结合说明书附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。以下实施例为本发明较佳的实施方式，但并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。本发明主要阐述所述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。
41.除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
42.以下实施例中所述培养基配方如下：
43.基础盐培养基(msm，g/l)：(nh4)2so4，2.0；cacl2·
2h2o，0.01；feso4·
7h2o，0.001；na2hpo4·
12h2o，1.5；mgso4·
7h2o，0.2；kh2po4，1.5。
44.lb培养基(g/l)：酵母提取物，5.0；蛋白胨，10.0；氯化钠，10.0。
45.种子培养基和发酵培养基的配方与lb培养基一致。
46.以上培养基以蒸馏水配成，ph为7.2，于高压湿热灭菌锅121℃灭菌20分钟。固体培养基：每1l培养基加入15g琼脂粉。
47.实施例1菌株zq05的分离与鉴定
48.1、乙酰甲胺磷降解菌株的筛选分离：
49.采集广东广州某废水处理池的活性污泥，称取5g活性污泥样品加入到50ml含有乙酰甲胺磷(50mg/l)的上述msm液体培养基中。经30℃，200r/min培养7d后，每次取10％的上一轮培养液接种到新的msm培养基中，将农药质量浓度从50mg/l依次升至100mg/l、200mg/l、400mg/l、800mg/l进行连续富集培养。然后将转接4次的培养液梯度稀释涂布于含有400和800mg/l乙酰甲胺磷的msm固体平板上，30℃倒置培养2d。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落在lb固体培养基上多次划线纯化，随后使用高效液相色谱法(hplc)验证其降解效果，分离获得一株高效降解乙酰甲胺磷的细菌，编号为zq05。该菌株可以利用乙酰甲胺磷作为唯一的碳源和能源生长，18h内对乙酰甲胺磷的降解率达到96.18％。最终利用15％的甘油在-80℃条件下保存菌种。
50.2、菌株zq05的鉴定
51.(1)全基因组测序-菌种鉴定：
52.提取菌株zq05基因组dna，委托杭州联川生物技术股份有限公司进行全基因组测序。如图1所示，通过相似性比对分析，本发明筛选获得的降解菌鉴定为潘多拉菌(pandoraea pnomenusa)。
53.(2)形态学鉴定：
54.将菌株zq05接种于lb固体平板上30℃倒置培养2d，观察其菌落形态，分析菌株的生物学特性以及扫描电镜下的形态。
55.菌株zq05主要生物学特性为：好氧。如图2所示，扫描电镜下可以观察到该菌细胞呈杆状。
56.因此，基于上述鉴定结果，本发明的菌株zq05鉴定为潘多拉菌(pandoraea pnomenusa)，菌株分类命名为pandoraea pnomenusa zq05，并于2021年7月21日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc no：61815，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
57.实施例2菌株zq05降解菌剂的制备
58.1、使用实施例1获得的菌株zq05制备降解菌剂的生产工艺流程依次为：斜面菌种—摇瓶种子液—种子罐培养—生产罐发酵—制成产品(剂型可为悬浮剂或粉剂)。
59.2、具体方法如下：
60.(1)将菌株zq05菌种在lb固体平板上活化，接种于lb试管斜面上备用。
61.(2)将菌株zq05的试管种接种于含250ml lb培养基的1000ml摇瓶中，30℃恒温振荡至对数期，获得的菌液接种于种子罐，种子罐中装有灭菌的种子培养基，装液量为70％。将培养好的摇瓶菌液按10％的接种量接种于装液量为70％的种子罐，无菌空气的通气量为0.6～1.0m3/min，搅拌速度为180～240rpm，培养至对数生长期备用。
62.(3)将到达对数期的种子液按照10％的接种量投入装有发酵培养基的生产发酵罐(装液量为70％)发酵培养。投料后的生产罐，在1.1kg/cm3的压力，121℃条件下高压湿热灭菌，冷却至30℃后，通无菌空气，通气量为0.6～1.0m3/min，搅拌速度为180～240r/min，培养温度控制为30℃，整个工艺培养流程时间为24～48小时，发酵结束后菌体数量≥2.24
×
108cfu/ml，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
63.实施例3 zq05菌剂的最优降解工艺条件
64.1、将实施例2获得的zq05菌剂进行单因素降解试验，通过依次改变影响生长和降解的因素，如温度、ph值、降解浓度、接种量、装液量、振荡速率等，测定zq05菌剂的降解率，确定影响zq05菌剂降解率的关键因素。
65.利用design-expert软件根据响应曲面法box-behnken设计原则进行试验设计，以关键因子ph值(a)、温度(b)和接种量(c)为自变量，以乙酰甲胺磷降解率为响应值(y1)，建立多元二次回归方程，根据多元二次回归方程进行绘图分析，得到回归方程的响应曲面图。最后对多元二次回归方程求一阶偏导，通过解方程得到该模型的极值点，即zq05菌剂最优降解工艺条件。
66.通过sas统计软件分析，获得zq05菌剂降解的多元二次回归方程如下：
67.乙酰甲胺磷降解率(％)＝-142.77235+14.27022
×
温度+15.35356
×
ph+9.01124
×
接种量+0.14720
×
温度
×
ph-0.14395
×
温度
×
接种量-1.65734
×
ph
×
接种量-0.27609
×
温度
2-1.51673
×
ph2+2.07504
×
接种量2。如下表1为响应曲面box-behnken设计试验结果。
68.表1
[0069][0070]
2、统计分析结果表明，温度、ph、接种量、(温度
×
ph)、(ph
×
接种量)、温度2和ph2因子对菌株zq05降解效果的一次效应均达到显著水平(p《0.05)。为了能更直观的反映出各因素及其交互效应，利用sas软件程序作出响应曲面图，如图3～8所示。为了获得zq05菌剂降解工艺条件的最佳组合，对所得的多元二次回归模型方程求一阶偏导，通过解方程得到该模型的临界值，即菌剂最优降解工艺条件：26.9℃、ph 5.4和接种量4.9
×
108cfu。下表2为菌株zq05降解乙酰甲胺磷的多元二次回归方程拟合模型的方差分析。
[0071]
表2
[0072][0073]
实施例4菌株zq05对乙酰甲胺磷农药的降解效果实验
[0074]
1、实验方法
[0075]
(1)种子液制备：将实施例1获得的菌株zq05纯化后接入含有5ml的lb液体培养基过夜活化培养至对数期，取1ml菌液在4000rpm离心后，菌体用无菌生理盐水(0.9％nacl)冲洗两次，所得菌体(菌体数量约为5.0
×
108cfu/ml)作为接种体。
[0076]
(2)降解性能测定：将与(1)等量的菌体接种至50ml含有乙酰甲胺磷(50mg/l)的msm培养液中，以不接菌作为对照，每组三个重复。在30℃，200rpm恒温摇床培养18h，每2h取样一次，测定菌株zq05的生长情况，并采用hplc测定其对乙酰甲胺磷农药的降解情况。
[0077]
(3)色谱条件：
[0078]
hplc型号：2690型(waters，usa)；色谱柱：c
18
反相柱(phenomenex，250nm
×
4.60mm，5μm)；色谱柱为c
18
，流动相为水：乙腈(80：20，v：v)，流速比为80：20，流动相总流速为0.6ml/min。本试验使用的乙酰甲胺磷紫外吸收波长为211nm。进样量：10μl。在上述条件下，乙酰甲胺磷的保留时间为4.1min。
[0079]
按照下式计算乙酰甲胺磷降解率：降解率(％)＝(1-a1/a0)
×
100％，其中，a1为降解菌处理后乙酰甲胺磷残留浓度，a0为对照处理后的乙酰甲胺磷残留浓度。
[0080]
质量控制：采用外标法校正标准物质制作标准曲线。
[0081]
2、实验结果
[0082]
结果如图9所示，菌株zq05能高效地降解乙酰甲胺磷，并可利用其作为生长的唯一碳源。且乙酰甲胺磷降解与菌株zq05生长呈正相关。在乙酰甲胺磷作为唯一碳源条件下，菌
株zq05生长没有产生明显的滞后期，并迅速进入生长对数期，1-10h为菌株的生长对数期，此时该菌株对乙酰甲胺磷的降解最快；随着菌株生长达到稳定期，此时乙酰甲胺磷的降解曲线趋于平缓；培养10h后，菌株开始进入衰亡期。培养18h后，菌株zq05对乙酰甲胺磷的降解率达到96.18％，表明该菌株具有高效快速降解乙酰甲胺磷的能力。
[0083]
图10和表3显示了菌株zq05降解乙酰甲胺磷农药的降解效果和动力学参数，其揭示了乙酰甲胺磷农药的降解过程遵循一阶动力学模型。并计算了乙酰甲胺磷的理论半衰期(t
1/2
)值，菌株zq05降解25mg/l、50mg/l、100mg/l、200mg/l、400mg/l和800mg/l乙酰甲胺磷的理论半衰期(t
1/2
)值为5.6、3.8、3.5、6.9、7.2和9.0，降解系数(r2)分别为0.9874、0.9827、0.9867、0.7008、0.8853和0.6949，这表明实际降解数据与一阶动力学模型吻合良好。这些结果进一步说明了菌株zq05具有高效降解乙酰甲胺磷农药的能力。
[0084]
表3
[0085][0086]
注：k表示降解常数；r2是相关系数；t
1/2
是指理论半衰期(h)。
[0087]
实施例5土壤修复实验
[0088]
1、供试土样
[0089]
森林表层土(5-20cm)，取自广州市华南农业大学农场，属红壤土，5年内未有施用乙酰甲胺磷和其他农药的记录。土壤的理化参数表征为(g/kg,干重)：硝态氮的浓度为7mg/kg，钾的浓度为13mg/kg，速效磷的浓度为0.2mg/kg，有机质的浓度为6.5g/kg。
[0090]
土壤样品取回后首先置于阴凉通风处自然风干，风干后碾磨，过10目筛(2mm)，随后一部分土壤拿去121℃高温湿热灭菌1小时。分别取一定量的乙酰甲胺磷溶于水中，将其拌入灭菌和未灭菌的土壤中，使土壤中乙酰甲胺磷的终浓度为50mg/kg，然后置于30℃恒温恒湿培养箱中培养，接入实施例1中获取的zq05菌体(菌体数量约为2.24
×
108cfu/ml)，以加蒸馏水(即未加菌)的作为对照，土壤的持水量保持在40％。在30℃和避光条件下连续培养15h，并定期取样，hplc法测定乙酰甲胺磷残留量并计算降解率。降解率计算方法如实施例4。
[0091]
2、实验结果
[0092]
还在灭菌和未灭菌土壤中研究了菌株zq05降解乙酰甲胺磷的能力，以探索其在自然条件下的功效。如表4中菌株zq05在土壤中降解乙酰甲胺磷的回归方程及半衰期相关动力学数据表明，乙酰甲胺磷降解过程遵循一阶动力学模型。乙酰甲胺磷降解的回归系数(0.96435至0.98481)表明降解数据与模型具有很好的相关性。在灭菌和未灭菌土壤中，乙
酰甲胺磷降解的t
1/2
值分别为50.4h和50.4h。在未灭菌和灭菌土壤中加入菌株zq05，乙酰甲胺磷降解的t
1/2
值显着降低至4.1h和2.9h。结果证实，菌株zq05在灭菌和未灭菌土壤中均影响了乙酰甲胺磷的残留量(见图11)。菌株zq05在非无菌土壤中降解率比同时期的无菌土壤高约10％，表明土壤中可能存在微生物能够与潘多拉菌zq05产生协同代谢作用。
[0093]
表4
[0094][0095]
菌株zq05在直接施入土壤中后，没有出现不降解或降解滞后效应现象，其降解性能稳定，这就为菌株zq05对乙酰甲胺磷的土壤修复提供了科学依据。
[0096]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种降解乙酰甲胺磷杀虫剂的潘多拉菌(pandoraea pnomenusa)菌株zq05，其特征在于，所述菌株zq05于2021年7月21日保存于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为gdmcc no:61815。2.潘多拉菌或其菌悬液在降解乙酰甲胺磷杀虫剂或在制备降解乙酰甲胺磷杀虫剂的产品中的应用。3.潘多拉菌或其菌悬液在修复乙酰甲胺磷杀虫剂污染的自然环境中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述自然环境为水体和/或土壤。5.根据权利要求2～4任一所述的应用，其特征在于，所述潘多拉菌为权利要求1所述的潘多拉菌菌株zq05。6.一种用于降解乙酰甲胺磷杀虫剂的菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的潘多拉菌菌株zq05和/或其菌悬液。7.根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于，所述菌株zq05的菌体数量不低于2.24
×
108cfu/ml。8.一种降解乙酰甲胺磷杀虫剂或修复其污染的环境的方法，其特征在于，利用权利要求6或7所述菌剂进行处理。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述处理条件控制在：温度为20～40℃。10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述处理条件控制在：ph为5～9。

技术总结
本发明公开了一种降解乙酰甲胺磷杀虫剂的潘多拉菌及其应用。本发明分离获得了一株潘多拉菌(Pandoraea pnomenusa)菌株ZQ05，于2021年7月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：61815。本发明首次公开了潘多拉菌对乙酰甲胺磷杀虫剂的降解作用，分离获得的菌株ZQ05可以在不同的温度和pH条件下保持对乙酰甲胺磷较高的降解活性，并能在18h内降解水中96.8％的乙酰甲胺磷(50mg/L)，在15h内完全降解土壤中的乙酰甲胺磷(50mg/Kg)。此外，菌株ZQ05可制备成优良的降解菌剂应用于乙酰甲胺磷污染水体和土壤等环境的生物修复。本发明为农药环境污染的生物修复提供新的微生物资源，为开发乙酰甲胺磷的治理新技术提供理论基础和实践依据。提供理论基础和实践依据。提供理论基础和实践依据。


技术研发人员：陈少华 林子秋 吴小珍 庞诗梅 黄耀华 雷琪琪 张希东
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2022.05.16
技术公布日：2022/11/1