1.本发明涉及一种检测试剂盒，特别是涉及用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，属于检测试剂盒技术领域。
背景技术：2.非洲猪瘟是由非洲猪瘟病毒引起的猪的一种急性、热性、高度接触性动物传染病，我国将其列为一类动物疫病。
3.asf是养猪业的头号杀手，根据其在全球范围内的流行特点和我国养殖现状，如何对asf进行科学防控是当前养猪业的重点和难点。
4.由于asf的发病临床症状和病理变化与其他猪传染病很相似，在生产实践中与其它病原混合感染已成常见现象，混合感染场的猪群又经常会出现临床症状复杂，病变不典型，现场难以确诊，需要依据实验室诊断才能定性。
5.聚合酶链式反应技术已广泛应用于asfv的诊断检测，oie《陆生动物诊断试验和疫苗手册》推荐的asfv检测方法主要是传统pcr 和实时荧光pcr。
6.然而传统pcr需要进行凝胶电泳分析，操作繁琐，且灵敏度相对较低；实时荧光pcr的灵敏度和试验速度较传统pcr大大提升，并且可以同时特异性检测多种病原。
7.现有的商品化猪疫病荧光pcr试剂盒多为单通道pcr，1个试剂盒1次试验仅能检测1种病原，对于混合感染2种及以上的病原的同份猪病病料要确诊其病原就进行2种及以上试剂盒或进行2次及以上的pcr试验，费时费力，成本较高，为此设计一种用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒来解决上述问题。
技术实现要素：8.本发明的主要目的是为了提供用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，用荧光pcr建立能够区分asfv和pcv2的精确鉴别检测方法就非常有应用价值，可为asfv的防控和净化提供新的技术保障，通过参考genbank中非洲猪瘟病毒的p72基因 (mh713612.1)和猪圆环病毒2型的orf1基因(af027217)的高度保守序列设计得到针对非洲猪瘟病毒p72基因的引物对(asfv-f/r) 及探针(asfv-p)和针对猪圆环病毒2型orf1基因的引物对 (pcv2-f/r)及探针(pcv2-p)。
9.本发明的目的可以通过采用如下技术方案达到：
10.用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，包括引物探针混合物和pro taq hs premix；
11.其中引物探针混合物包括工作浓度为200nm的asfv-f与 asfv-r；
12.工作浓度为150nm的asfv-probe；
13.工作浓度为200nm的csfv-f与csfv-r，工作浓度为150nm的 csfv-probe。
14.优选的，所述asfv-f为上游引物且基因序列为 ctgcataatggcgttaac；
15.其中asfv-f的识别标记为seq id no.1；
16.asfv-r为下游引物且基因序列为gctgatacgtgtccataa；
17.其中asfv-r的识别标记为seq id no.2。
18.优选的，pcv2-f为上游引物且基因序列为 ctctctatcggaggattac；
19.其中pcv2-f的识别标记为seq id no.4；
20.pcv2-r为下游引物且基因序列为ccacttaaaccctaaatgaa；
21.其中pcv2-r的识别标记为seq id no.6。
22.优选的，asfv-f/r扩增得到的目的基因的序列ctgcataatggcgttaacaacatgtccgaacttgtgccaatctcggtgttgatgagga ttttgatcggagatgttccaggtaggttttaatcctataaacatatattcaatgggcc atttaagagcagacattagtttttcatcgtggtggttattgttggtgtgggtcacctg cgttttatggacacgtatcagc；
23.其中asfv-f/r的识别标记为seq id no.7。
24.优选的，pcv2-f/r扩增得到的目的基因的序列 ctctctatcggaggattacttccttggtattttggaagaatgctacagaacaatccac ggaggaagggggccagttcgtcaccctttcccccccatgccctgaatttccatatgaa ataaattactgagtcttttttatcacttcgtaatggtttttatttttcatttagggtt taagtgg；
25.其中pcv2-f/r的识别标记为seq id no.8。
26.优选的，asfv-probe的基因序列为 caccaacaataaccaccacgatgaa；
27.其中asfv-probe的识别标记为seq id no.3。
28.优选的，pcv2-probe的基因序列为 aagaatgctacagaacaatccacgg；
29.其中pcv2-probe的识别标记为seq id no.6。
30.优选的，其中asfv-probe的5'端连接有6-fam，3'端连接有bhq1；
31.pcv2-probe的5'端连接有vic，3'端连接有bhq1。
32.优选的，还不包括试剂盒的识别方法：
33.选取样品核酸/阳性标准品/阴性标准品2μl、引物探针混合物 1.5μl、pro taq hs premix10μl和depc水补足至20μl；
34.反应程序为：95℃30s；95℃5s，57℃30s，40个循环，在每一循环退火结束时收集荧光信号；
35.通过荧光定量pcr仪自带软件读取相应的ct值。
36.本发明的有益技术效果：
37.本发明提供的用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，用荧光pcr建立能够区分asfv和pcv2的精确鉴别检测方法就非常有应用价值，可为asfv的防控和净化提供新的技术保障，通过参考genbank中非洲猪瘟病毒的p72基因(mh713612.1)和猪圆环病毒2型的orf1基因(af027217)的高度保守序列设计得到针对非洲猪瘟病毒p72基因的引物对(asfv-f/r)及探针(asfv-p)和针对猪圆环病毒2型orf1基因的引物对(pcv2-f/r)及探针(pcv2-p)。
附图说明
38.图1为按照本发明的用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒的一优选实施例的非洲猪瘟病毒检测敏感性分析图；
1.72％。如表2所示；
77.表2
[0078][0079]
以上，仅为本发明进一步的实施例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所公开的范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都属于本发明的保护范围。
技术特征：1.用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：包括引物探针混合物和pro taq hs premix；其中引物探针混合物包括工作浓度为200nm的asfv-f与asfv-r；工作浓度为150nm的asfv-probe；工作浓度为200nm的csfv-f与csfv-r，工作浓度为150nm的csfv-probe。2.根据权利要求1所述的用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：所述asfv-f为上游引物且基因序列为ctgcataatggcgttaac；其中asfv-f的识别标记为seq id no.1；asfv-r为下游引物且基因序列为gctgatacgtgtccataa；其中asfv-r的识别标记为seq id no.2。3.根据权利要求2所述的用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：pcv2-f为上游引物且基因序列为ctctctatcggaggattac；其中pcv2-f的识别标记为seq id no.4；pcv2-r为下游引物且基因序列为ccacttaaaccctaaatgaa；其中pcv2-r的识别标记为seq id no.6。4.根据权利要求3所述的用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：asfv-f/r扩增得到的目的基因的序列ctgcataatggcgttaacaacatgtccgaacttgtgccaatctcggtgttgatgaggattttgatcggagatgttccaggtaggttttaatcctataaacatatattcaatgggccatttaagagcagacattagtttttcatcgtggtggttattgttggtgtgggtcacctgcgttttatggacacgtatcagc；其中asfv-f/r的识别标记为seq id no.7。5.根据权利要求4所述的用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：pcv2-f/r扩增得到的目的基因的序列ctctctatcggaggattacttccttggtattttggaagaatgctacagaacaatccacggaggaagggggccagttcgtcaccctttcccccccatgccctgaatttccatatgaaataaattactgagtcttttttatcacttcgtaatggtttttatttttcatttagggtttaagtgg；其中pcv2-f/r的识别标记为seq id no.8。6.根据权利要求5所述的用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：asfv-probe的基因序列为caccaacaataaccaccacgatgaa；其中asfv-probe的识别标记为seq id no.3。7.根据权利要求6所述的用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：pcv2-probe的基因序列为aagaatgctacagaacaatccacgg；其中pcv2-probe的识别标记为seq id no.6。8.根据权利要求7所述的用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：其中asfv-probe的5'端连接有6-fam，3'端连接有bhq1；pcv2-probe的5'端连接有vic，3'端连接有bhq1。9.根据权利要求8所述的用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，其特征在于：还不包括试剂盒的识别方法：选取样品核酸/阳性标准品/阴性标准品2μl、引物探针混合物1.5μl、pro taq hs premix10μl和depc水补足至20μl；
反应程序为：95℃30s；95℃5s，57℃30s，40个循环，在每一循环退火结束时收集荧光信号；通过荧光定量pcr仪自带软件读取相应的ct值。
技术总结本发明公开了用于检测非洲猪瘟病毒和猪圆环病毒2型的试剂盒，属于检测试剂盒技术领域，用荧光PCR建立能够区分ASFV和PCV2的精确鉴别检测方法就非常有应用价值，可为ASFV的防控和净化提供新的技术保障，通过参考GenBank中非洲猪瘟病毒的P72基因(MH713612.1)和猪圆环病毒2型的ORF1基因(AF027217)的高度保守序列设计得到针对非洲猪瘟病毒P72基因的引物对(ASFV-F/R)及探针(ASFV-P)和针对猪圆环病毒2型ORF1基因的引物对(PCV2-F/R)及探针(PCV2-P)。P)。P)。
技术研发人员：周秀蓉 翟颀 罗胜军 孙铭飞 贾春玲 吕殿红 温肖会
受保护的技术使用者：广东省农业科学院动物卫生研究所
技术研发日：2022.05.16
技术公布日：2022/11/1
