1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种植物细胞外囊泡在制备抗炎和/或降尿酸产品中的应用。
背景技术：2.菠萝蛋白酶又称菠萝酶；由菠萝汁、皮等提取的巯基蛋白酶，其分子量为33000da；酶活性受重金属抑制，它优先水解碱性氨基酸(例如精氨酸)或芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸)的羧基侧上的肽链，选择性水解纤维蛋白，可分解肌纤维，而对纤维蛋白原作用微弱。
3.菠萝蛋白酶可用于各种原因所致的炎症，水肿，血肿，血栓症如支气管炎，支气管哮喘，急性肺炎，产后乳房充血，乳腺炎，产后血栓静脉炎，视网膜炎等。与抗菌药物合并治疗关节炎，关节周围炎，蜂窝织炎，小腿溃疡等，均有较好的效果。还可用于烧伤、手术后的恢复，各种创伤的恢复，癌症，关节疾病，过敏；此外，菠萝蛋白酶能抑制尿酸的产生，溶解尿酸结石，有类似allopurino的作用。
4.然而，不经包裹的菠萝蛋白酶口服会被胃蛋白酶破坏，现存口服递送载体构建难以保证包裹的完整性和稳定性，而且递送载体靶向性弱、包裹技术存在封闭性差、包裹成功率低等缺陷。
5.有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：6.本发明的目的在于提供一种植物细胞外囊泡在制备抗炎和/或降尿酸产品中的应用，本发明中植物细胞外囊泡具有优异的抗炎效果，此外，包裹菠萝蛋白酶的植物细胞外囊泡包裹性和稳定性强，在不同的酸碱度和温度下都能维持较好的理化稳定性，不被胃酸和消化液破坏，不影响菠萝蛋白酶的活性，同时，该囊泡具有一定的靶向性，可以定向到小肠，穿过小肠绒毛上皮细胞，进入血液循环，在血液中，菠萝蛋白酶能够清除尿酸结晶，达到降尿酸的作用。
7.为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
8.本发明第一方面提供一种植物细胞外囊泡在制备抗炎和/或降尿酸产品中的应用。
9.优选地，所述植物细胞外囊泡选自红藻细胞外囊泡、苹果细胞外囊泡、葡萄细胞外囊泡和茶叶细胞外囊泡中的任意一种。
10.优选地，所述植物细胞外囊泡通过如下方法制得：
11.(a)将植物组织洗净、晒干并研磨成粉末，再将粉末置于pbs中搅拌混匀，过滤，收集滤液，得到植物粗提物；
12.(b)将植物粗提物以180～220g离心5～6min，然后，将沉淀重新悬浮，并与20～30mm多聚甲醛和1～3mm二硫苏糖醇在pbs中于37℃、5％co2下孵育1～3h；随后，在室温下以
180～220gg离心4～6min收集上清液(去除囊泡形成缓冲液中的杂质)，再在室温下以9000～9500g离心8～15min并收集上清液(去除碎片和其他微泡)；将初筛出的含植物细胞外囊泡的上清液用100kda离心过滤器在3000～3500g下室温浓缩12～18min，并用pbs冲洗，用等量的pbs重复1～3次，即得上述植物细胞外囊泡。
13.优选地，所述植物细胞外囊泡中包裹有菠萝蛋白酶。
14.本发明对植物细胞外囊泡包裹菠萝蛋白酶的方式不作严格限制，可以根据实际需要进行选择，例如，可以基于细胞的调控方式，也可以采用非基于细胞的调控方式，其中，基于细胞的调控方式包括转染方式；非基于细胞的调控方式包括共同孵育培养或主动加载(比如，通过电穿孔、超声波、皂苷渗透法等方式破坏细胞外囊泡，完成包裹后将细胞外囊泡置于37℃下培养一段时间来恢复膜)。
15.优选地，所述植物细胞外囊泡中菠萝蛋白酶的包裹量为0.01-100μg/ml。
16.优选地，所述植物细胞外囊泡包裹菠萝蛋白酶后的的粒径为100～115nm。
17.优选地，所述产品包括药物和食品。
18.本发明第二方面提供一种用于抗炎和/或降尿酸的产品，所述产品包括所述的植物细胞外囊泡。
19.优选地，所述产品中植物细胞外囊泡浓度为0.01-100mg/ml。
20.优选地，所述植物细胞外囊泡选自红藻细胞外囊泡、苹果细胞外囊泡、葡萄细胞外囊泡和茶叶细胞外囊泡中的任意一种；
21.所述植物细胞外囊泡中菠萝蛋白酶的包裹量为0.01-100μg/ml。
22.与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
23.本发明从植物中分离提取细胞外囊泡，该植物细胞外囊泡具有优异的抗炎效果，此外，将植物细胞外囊泡包裹菠萝蛋白酶，构建了口服递送系统，研究表明，该细胞外囊泡包裹性和稳定性强，在不同的酸碱度和温度下都能维持较好的理化稳定性，不被胃酸和消化液破坏，不影响菠萝蛋白酶的活性，同时，该囊泡具有一定的靶向性，可以定向到小肠，穿过小肠绒毛上皮细胞，进入血液循环，在血液中，菠萝蛋白酶能够消灭尿酸结晶，达到降尿酸的作用。
24.此外，本发明植物细胞外囊泡本身具有一定的抗痛风和关节炎症的作用，利用该方法降尿酸，具有高效、快速、准确的特点。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
26.图1本发明实验例中不同植物细胞外囊泡的电镜扫描图；
27.图2为包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡的电镜扫描图；
28.图3为红藻细胞外囊泡的粒径统计结果；
29.图4为包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡的粒径统计结果；
30.图5为采用琼脂糖凝胶电泳检测细胞外囊泡的marker蛋白的分子量的检测结果；
31.图6为本发明实验例中苹果，葡萄，茶，红藻细胞外囊泡对tnfα释放的抑制作用；
32.图7为本发明实验例中苹果，葡萄，茶，红藻细胞外囊泡对mcp-1释放的抑制作用；
33.图8为本发明实验例中苹果，葡萄，茶，红藻细胞外囊泡对mmp2释放的抑制作用；
34.图9为本发明实验例中红藻细胞外囊泡在ph＝1的溶液中的电镜图；
35.图10为本发明实验例中红藻细胞外囊泡被胰蛋白酶消化后的电镜图；
36.图11为本发明实验例中红藻细胞外囊泡被胰蛋白酶和巯基乙醇消化后的电镜图；
37.图12为本发明实验例中采用琼脂糖凝胶电泳检测红藻细胞外囊泡的完整性的检测结果；
38.图13为包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡口服2h后的活体成像结果
39.图14为包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡口服不同时间后的活体成像结果
40.图15为包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡口服0h后的消化道富集情况
41.图16为包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡口服1h后的消化道富集情况
42.图17为包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡口服2h后的消化道富集情况
43.图18为本发明实验例中菠萝蛋白酶和红藻细胞外囊泡包裹的菠萝蛋白酶的活性检测结果；
44.图19为本发明实验例中胃蛋白酶消化后的菠萝蛋白酶和红藻细胞外囊泡包裹的菠萝蛋白酶的活性检测结果；
45.图20为不同实验组小鼠血清中ua水平；
46.图21为不同实验组小鼠血清中bun水平；
47.图22为不同实验组小鼠肝脏中xod水平；
48.图23为不同实验组小鼠血清中xod水平；
49.图24为不同实验组小鼠血清中cre水平。
具体实施方式
50.下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
51.需要注意的是，除非另有说明，本技术使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
52.实施例1
53.本实施例为一种植物细胞外囊泡，该植物细胞外囊泡通过如下方法制得：
54.(a)将植物组织洗净、晒干并研磨成粉末，再将粉末置于pbs中搅拌混匀，过滤，收集滤液，得到植物粗提物，其中，植物组织为红藻；
55.(b)将植物粗提物以200g离心5.5min，然后，将沉淀重新悬浮，并与25mm多聚甲醛和2mm二硫苏糖醇在pbs中于37℃、5％co2下孵育2h；随后，在室温下以200g离心5min收集上清液(去除囊泡形成缓冲液中的杂质)，再在室温下以9300g离心10min并收集上清液(去除碎片和其他微泡)；将初筛出的含植物细胞外囊泡的上清液用100kda离心过滤器在3200g下室温浓缩15min，并用pbs冲洗，用等量的pbs重复两次，即得上述植物细胞外囊泡。
56.实施例2
57.(a)将植物组织洗净、晒干并研磨成粉末，再将粉末置于pbs中搅拌混匀，过滤，收
集滤液，得到植物粗提物，其中，植物组织为苹果；
58.(b)将植物粗提物以200g离心5.5min，然后，将沉淀重新悬浮，并与25mm多聚甲醛和2mm二硫苏糖醇在pbs中于37℃、5％co2下孵育2h；随后，在室温下以200g离心5min收集上清液(去除囊泡形成缓冲液中的杂质)，再在室温下以9300g离心10min并收集上清液(去除碎片和其他微泡)；将初筛出的含植物细胞外囊泡的上清液用100kda离心过滤器在3200g下室温浓缩15min，并用pbs冲洗，用等量的pbs重复两次，即得上述植物细胞外囊泡。
59.实施例3
60.(a)将植物组织洗净、晒干并研磨成粉末，再将粉末置于pbs中搅拌混匀，过滤，收集滤液，得到植物粗提物，其中，植物组织为葡萄；
61.(b)将植物粗提物以200g离心5.5min，然后，将沉淀重新悬浮，并与25mm多聚甲醛和2mm二硫苏糖醇在pbs中于37℃、5％co2下孵育2h；随后，在室温下以200g离心5min收集上清液(去除囊泡形成缓冲液中的杂质)，再在室温下以9300g离心10min并收集上清液(去除碎片和其他微泡)；将初筛出的含植物细胞外囊泡的上清液用100kda离心过滤器在3200g下室温浓缩15min，并用pbs冲洗，用等量的pbs重复两次，即得上述植物细胞外囊泡。
62.实施例4
63.本实施例为一种包裹菠萝蛋白酶的植物细胞外囊泡的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
64.将实施例1制备得到的植物细胞外囊泡分散于pbs中，然后，加入菠萝蛋白酶，在旋转器上于37℃下混合12h；随后，用100kda离心过滤器(室温下3200g，15min)浓缩植物细胞外囊泡，并用同等体积的pbs通过离心过滤冲洗收集的植物细胞外囊泡三次以去除未装载的菠萝蛋白酶，即得包裹菠萝蛋白酶的植物细胞外囊泡。
65.实验例
66.1、根据实施例1以及实施例4的制备方法分别获取红藻细胞外囊泡和包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡；按照实施例1的方法分别制备得到苹果细胞外囊泡、葡萄细胞外囊泡、茶叶细胞外囊泡；
67.在电镜下观察不同植物细胞外囊泡及包裹菠萝蛋白酶后的红藻细胞外囊泡的大小形态并统计，同时采用采用琼脂糖凝胶电泳检测红藻细胞外囊泡的marker蛋白的分子量；结果如图1～5所示，图1为不同植物细胞外囊泡的电镜扫描图，图中，从左至右依次是苹果细胞外囊泡、葡萄细胞外囊泡、茶叶细胞外囊泡和红藻细胞外囊泡；图2为包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡的电镜扫描图；图3为红藻细胞外囊泡的粒径统计结果；图4为包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡的粒径统计结果；图5为采用琼脂糖凝胶电泳检测细胞外囊泡的marker蛋白的分子量的检测结果；
68.由图1～4可知，植物细胞外囊泡大小主要介于30-200nm之间，包裹菠萝蛋白酶后，红藻细胞外囊泡大小介于100-115nm之间。
69.2、不同植物细胞外囊泡抗炎的研究：
70.为了验证不同植物细胞外囊泡的抗炎作用，进行动物实验，研究表明，不同植物细胞外囊泡(不同浓度0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml)对不同炎症因子如tnf-α、mcp-1以及mmp2具有调节作用(如图6～8所示)
71.由图6～8所示，不同植物细胞外囊泡均能够抑制tnf-α、mcp-1以及mmp2的释放，具
有很好的抗炎作用，其中，红藻细胞外囊泡抗炎效果最好。
72.3、在电镜下观察不同条件下红藻细胞外囊泡的大小形态；结果如图9～11所示，图9为红藻细胞外囊泡在ph＝1的溶液中的电镜图，图10为红藻细胞外囊泡被胰蛋白酶消化后的电镜图；图11为红藻细胞外囊泡被胰蛋白酶和巯基乙醇消化后的电镜图；由图9～11可知，本发明红藻细胞外囊泡在ph＝1以及胰蛋白酶以及巯基乙醇的消化下仍具有稳定结构。
73.4、采用琼脂糖凝胶电泳检测红藻细胞外囊泡的完整性(电泳结果如图12所示)，由图12可知，红藻细胞外囊泡包裹菠萝蛋白酶后电泳未出现条带，而未经包裹的菠萝蛋白酶出现了条带，菠萝蛋白酶的信号出现在孔中，证明植物细胞外囊泡具有良好的完整性，可以保证菠萝蛋白酶被封装在植物细胞外囊泡内部。
74.为了观察包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡在高尿酸血症小鼠中的生物分布以及封闭性，采用cy5.5标记了胶囊的表面聚合物外壳，为小鼠通过灌胃口服。在灌胃口服不同时间后，使用无创三维活体成像技术监测cy5.5标记的微囊的体内生物分布(如图13～14)。图13为包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡口服2h后的活体成像结果，图中左图为对照老鼠，右图为实验老鼠；图14为包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡口服0、1、2、3、4、5h后的活体成像结果，图中左图为空白对照；在0h时，仅观察到轻微的荧光信号。微囊进入胃内后疏水并迅速萎缩，影响cy5.5的荧光激发。而给药1h后，小鼠腹腔内观察到明显的荧光信号。潜在原因是微囊进入肠道变得亲水，cy5.5可再次被激发。此外，4h后，荧光信号再次无法检测到。这可能是由于结肠酶降解了微囊，随后破坏了cy5.5。进一步检测了从上述相应小鼠中分离出的胃肠道中的荧光信号(如图15～17)。图15为包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡口服0h后的消化道富集情况；图16为包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡口服1h后的消化道富集情况；图17为包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡口服2h后的消化道富集情况；结果显示，给药2h后，微囊已经在结肠中累计并逐渐吸收入循环系统，提高菠萝蛋白酶的血液循环治疗效率。
75.此外，使用共聚焦荧光显微镜评估了胃肠组织切片中cy5.5标记的微囊的分布。小鼠灌胃处理后，在食道和胃组织中未观察到荧光信号，而在肾脏中发现了明显的cy5.5标记的微囊。结果表明，微囊不会泄漏菠萝蛋白酶来影响非靶细胞，并且具有较高的生物安全性和治疗效率。
76.5、使用菠萝蛋白酶活性检测盒分别检测菠萝蛋白酶、红藻细胞外囊泡包裹的菠萝蛋白酶(图18)、胃蛋白酶消化后的菠萝蛋白酶、胃蛋白酶消化后的植物细胞外囊泡包裹的胃蛋白酶的活性(图19)，结果表明，未经包裹的菠萝蛋白酶在经过胃蛋白酶消化后活性明显减弱，植物细胞外囊泡包裹后的菠萝蛋白酶活性变化不大，可见，菠萝蛋白酶易被胃蛋白酶破坏，而红藻细胞外囊泡可以有效抵抗胃蛋白酶的消化作用，保护内部物质不受破坏。
77.6、在雄性昆明小鼠中构建了氧酸钾(po)(300mg/kg)诱导的高尿酸血症模型，该模型可引起明显的肾损伤。此外，应用具有明确降尿酸能力的别嘌醇(all)治疗小鼠作为阳性对照。进一步检测了尿酸(ua)、肌酐(cre)、血尿素氮(bun)、黄嘌呤氧化酶(xod)等指标，以评估包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡对高尿酸血症小鼠的治疗效果。检测结果如图20～24所示；
78.图20为不同实验组小鼠血清中ua水平；图21为不同实验组小鼠血清中bun水平；图22为不同实验组小鼠肝脏中xod水平；图23为不同实验组小鼠血清中xod水平；图24为不同
实验组小鼠血清中cre水平；
79.由图20～24可知，与对照组相比，po处理导致小鼠血清ua、cre、bun、xod水平及肾脏xod水平显着升高(p《0.01)，初步得出该模型可有效诱导小鼠高尿酸血症。包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡在0.1、1、10、100mg/kg剂量下也显着降低血清ua水平，表明包裹菠萝蛋白酶的红藻细胞外囊泡可以缓解po引起的高尿酸血症。
80.最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
技术特征：1.植物细胞外囊泡在制备抗炎和/或降尿酸产品中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物细胞外囊泡选自红藻细胞外囊泡、苹果细胞外囊泡、葡萄细胞外囊泡和茶叶细胞外囊泡中的任意一种。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物细胞外囊泡通过如下方法制得：(a)将植物组织洗净、晒干并研磨成粉末，再将粉末置于pbs中搅拌混匀，过滤，收集滤液，得到植物粗提物；(b)将植物粗提物以180～220g离心5～6min，然后，将沉淀重新悬浮，并与20～30mm多聚甲醛和1～3mm二硫苏糖醇在pbs中于37℃、5％co2下孵育1～3h；随后，在室温下以180～220g离心4～6min收集上清液，再在室温下以9000～9500g离心8～15min并收集上清液；将初筛出的含植物细胞外囊泡的上清液用100kda离心过滤器在3000～3500g下室温浓缩12～18min，并用pbs冲洗，用等量的pbs重复1～3次，即得上述植物细胞外囊泡。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述植物细胞外囊泡中包裹有菠萝蛋白酶。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物细胞外囊泡中菠萝蛋白酶的包裹量为0.01-100μg/ml。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述植物细胞外囊泡包裹菠萝蛋白酶后的的粒径为100～115nm。7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物和食品。8.一种用于抗炎和/或降尿酸的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1～4中任一所述的植物细胞外囊泡。9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述产品中植物细胞外囊泡浓度为0.01-100mg/ml。10.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述植物细胞外囊泡选自红藻细胞外囊泡、苹果细胞外囊泡、葡萄细胞外囊泡和茶叶细胞外囊泡中的任意一种；所述植物细胞外囊泡中菠萝蛋白酶的包裹量为0.01-100μg/ml。
技术总结本发明公开了一种植物细胞外囊泡在制备抗炎和/或降尿酸产品中的应用；本发明植物细胞外囊泡具有优异的抗炎效果，此外，包裹菠萝蛋白酶的植物细胞外囊泡包裹性和稳定性强，在不同的酸碱度和温度下都能维持较好的理化稳定性，不被胃酸和消化液破坏，可有效保持菠萝蛋白酶的活性，同时，该囊泡具有一定的靶向性，可以定向到小肠，穿过小肠绒毛上皮细胞，进入血液循环，在血液中，菠萝蛋白酶能够清除尿酸结晶，达到降尿酸的作用。达到降尿酸的作用。达到降尿酸的作用。
技术研发人员：宋佳怡 于涛 亓洪昭 杨艳艳
受保护的技术使用者：青岛海富德食品有限公司
技术研发日：2022.07.04
技术公布日：2022/11/1
