1.本发明属于微生物领域，涉及的是一株新鞘氨醇杆菌及其用途，尤其涉及的是一株新鞘氨醇杆菌及其在降解化感物质甘草酸和缓解甘草连作障碍中的用途。
背景技术：2.甘草是我国重要的传统药用植物，土壤利用的限制和市场需求的增加导致种植甘草连作障碍问题十分严重，影响了甘草的生长、产量和品质。其中，化感自毒作用是导致甘草连作障碍的重要原因之一。自毒作用是指某些植物通过地上部淋溶、根系分泌和植株残茬腐解等途径释放一些化感物质，对同茬或下茬同种或同科植物生长产生抑制作用。产生自毒作用的物质有有机酸、直链醇、简单酚类、酚酸、单宁、醛类、萜类、氨基酸和生物碱等。研究发现，甘草酸是甘草最主要的根分泌物和引起连作障碍的化感物质，甘草酸在一定程度上阻碍了甘草的生长发育。同时，长期的栽培选择增加了药用植物根系次生代谢产物的含量，使甘草更容易通过根系分泌物释放化感物质，从而产生化感自毒作用。
3.目前，针对甘草酸降解菌的研究较少。
技术实现要素：4.鉴于以上技术问题，本发明从两年生甘草种植区健康植株根际土壤中筛选出甘草酸降解菌，并研究其降解特性，为利用降解菌缓解甘草连作障碍提供资源保障和科学依据。
5.本发明第一方面提供一种新鞘氨醇杆菌，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2022379。
6.本发明第二方面提供一种所述新鞘氨醇杆菌在缓解甘草连作障碍中的用途。
7.本发明第三方面提供一种所述新鞘氨醇杆菌的发酵方法，包括以下步骤：将所述新鞘氨醇杆菌接种至含有甘草酸的无机盐培养基中，在25～30℃、150～180r/min下培养4～5天；
8.其中，所述甘草酸与所述无机盐培养基的混合比为4～6g∶1l；
9.所述无机盐培养基按重量份数计由以下原料组成：磷酸氢钾2.5份、七水合硫酸镁0.2份、七水合硫酸铁0.1份、磷酸氢二钾2.0份、硝酸铵3.0份、水1000份，ph 7.5-8.0。
10.本发明第四方面提供一种根据上述发酵方法得到的发酵液。
11.本发明第五方面提供了所述发酵液在缓解甘草连作障碍中的用途。
12.优选地，所述连作障碍是由化感自毒物质的积累引起的。
13.优选地，所述化感自毒物质是甘草酸。
14.本发明第六方面提供一种用于降解甘草土壤化感物质的微生物菌剂，其包括所述新鞘氨醇杆菌和/或所述发酵液。
15.优选地，还包括可接受的辅料或载体。
16.对比现有技术，本发明的有益效果为：
17.本发明通过梯度富集培养的方法从两年生甘草土壤中筛选到一株甘草酸降解菌
n，经鉴定为新鞘氨醇杆菌(novosphingobium resinovorum)，该菌株可应用于缓解因化感物质甘草酸积累造成的甘草连作障碍问题，丰富了甘草土壤来源的甘草酸降解菌资源，为筛选能有效缓解甘草连作障碍的微生物奠定基础。
18.生物保藏信息：
19.一株新鞘氨醇杆菌，保藏名称为ccnw-l5，该菌株于2022年4月2日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国
·
武汉
·
武汉大学，该菌株的分类学命名为：新鞘氨醇杆菌，拉丁名为：novosphingobium resinovorum。
附图说明
20.图1是菌株n的系统发育树；
21.图2是菌株n在添加有甘草酸的无机盐培养基中的生长状态图；
22.图3是甘草酸添加和接种菌联合作用对甘草幼苗生长表型的影响；i、初始样本，a、甘草酸处理，w、水处理，c、对照：无菌接种，n、新鞘氨醇杆菌接种；ac1、an1、wc1、wn1均为单株植株，ac2、an2、wc2、wn2均为多株植物；
23.图4是不同采样时期和处理组间富集和持续性富集根际细菌类群的维恩图；i，初始样本；m，中期样本；f，末期样本；w，水处理；a、化感物质处理；
24.图5是不同处理相应的富集和持久分类群的系统发育树和相对丰度热图；
25.图6是随机森林分类模型对化感物质和水处理之间生物指示物种的鉴定，根据根际细菌相对丰度鉴定出持久分类群的前八个细菌科；生物指示物种按照对模型准确性的重要性降序排列；
26.图7是分箱基因组的基因组特征；x轴表示基因组的gc含量(％)，y轴表示宏基因组中基因组的丰度。
具体实施方式
27.本发明结合实施例和相应附图做进一步阐释说明，以下实施例仅用于说明目的，不用于限制本发明范围。
28.下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
29.实施例1
30.新鞘氨醇杆菌株的分离与筛选
31.1、土壤样品采集
32.所用土壤均采集于甘肃省兰州市榆中地区两年生的栽培甘草样地(104
°
18'
–
104
°
19'e,36
°
8'
–
36
°
9'n)，在一块样地中随机选择三个样点采集0-20cm的表层土后混合样品。采集后的土壤过2毫米的筛网以清除植物和石头碎片，并储存在适宜的环境中。
33.2、甘草酸降解菌的筛选
34.利用以甘草酸为唯一碳源的无机盐培养基进行菌株的筛选、分离和培养。无机盐培养基配方见表1。
35.表1无机盐培养基配方(1l)
36.kh2po42.5gmgso4·
7h2o0.2g
feso4·
7h2o0.1gk2hpo42.0gnh4no33.0g ph7.5-8.0
37.降解菌的筛选采用以甘草酸为唯一碳源，逐渐提高甘草酸浓度的梯度富集培养方法。具体操作如下：将10克根际土壤样品加入90毫升无菌水中得到土壤悬浮液。将2ml土壤悬浮液加入含2.5g/l甘草酸的20ml筛选培养基中(10％的接种量)，在30℃下振荡培养5天(旋转摇床180转/分)。将2ml的初代培养液转移到含有3g/l甘草酸的20ml筛选培养基上，相同条件下再培养5天。同样，将第二代培养液分别连续三次转移到含有4、6、10g/l甘草酸的新筛选培养基上进行梯度富集培养。随后，将第五代培养液接种到含有10g/l甘草酸的琼脂固体筛选培养基上，相同条件下培养4～5天后，挑取平板上形态、颜色、大小有差异的单菌落，重悬入灭菌水中，将其再次接种于新鲜琼脂固体筛选培养基上，相同条件下培养4～5天。经过两次单菌划线纯培养，得到菌株。
38.实施例2
39.实施例1得到的菌株鉴定
40.16s rdna测序：采用细菌基因组提取试剂盒提取菌株的基因组dna，用细菌通用引物27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag)和1492r(5
’‑
taccttgttacgactt)扩增16s rdna，经电泳检测后送公司测序。将菌株的16s rdna序列与ncbi数据库中已收录的16s rdna序列进行同源性比对，采用clustalx 1.8进行序列匹配分析，通过mega 6.0软件使用邻接法构建系统发育树。菌株的系统发育树如图1所示。根据分析结果，将实施例1筛选得到的菌株鉴定为新鞘氨醇杆菌株，拉丁名为novosphingobium resinovorum，记为菌株n。
41.菌株n的16s rdna序列：
42.cctgcgcatgctacacatgcagtcgaacgagatcttcggatctagtggcgcacgggtgcgtaacgcgtgggaatctgcccttgggttcggaataacagtgagaaattactgctaataccggatgatgtcttcggaccaaagatttatcgcccagggatgagcccgcgtaggattaggtagttggtggggtaatggcctaccaagccgacgatccttagctggtctgagaggatgatcagccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagcaatgccgcgtgagtgatgaaggccttagggttgtaaagctcttttaccagggatgataatgacagtacctggagaataagctccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggagctagcgttgttcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggcggttactcaagtcagaggtgaaagcccggggctcaaccccggaactgcctttgaaactaggtgactagaatcttggagaggtcagtggaattccgagtgtagaggtgaaattcgtagatattcggaagaacaccagtggcgaaggcgactgactggacaagtattgacgctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgataactagctgtccgggtacttggtacttgggtggcgcagctaacgcattaagttatccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaaggaattgacgggggcctgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccagcgtttgacatgccggtcgcggatttgggagaccatttccttcagttcggctggaccgtgcacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgtccttagttgccagcatttggttgggcactctaaggaaactgccggtgataagccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcctcatggcccttacacgctgggctacacacgtgctacaatggcggtgacagtgggcagcaagcaggcgactgcaagctaatctccaaaagccgtctcagttcggattgttctctgcaactcgagagcatgaaggcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccaggccttgtac
acaccgcccgtcacaccatgggagttggattcactcgaaggcgttgagctaacccgcaagggaggcaggcgaccacagtgtaggcgg
43.实施例3
44.菌株n在纯培养条件下对甘草酸的降解能力测定
45.利用高分辨离子淌度液质联用仪(lc-ms/ms)分析菌株在纯培养基中对化感自毒物质(甘草酸)的降解效率和代谢产物。
46.首先，利用以甘草酸为唯一碳源的无机盐培养基，并向添加了甘草酸的无机盐培养基(甘草酸在培养基的浓度为10g/l)中加入适量的naoh以调节培养基的ph(7.5-8.0)。将分离的菌株n接种于20ml上述培养液中，30℃，180转/分摇床培养。5天后，用乙酸乙酯萃取培养液，放出下层水相，保留上层有机相，经抽滤后在室温下用真空旋转蒸发仪对有机相进行干燥处理。用100％甲醇(meoh)复溶干燥后的样品，然后用0.45μm的尼龙膜进行过滤后上机测定。
47.结果表明，菌株n(novosphingobium resinovorum)能够利用甘草酸作为唯一碳源生长繁殖，在纯培养基中对化感物质的降解效率高达87.94％。菌株n在添加有甘草酸的无机盐培养基中的生长状态如图2所示。
48.实施例4
49.菌株n对甘草酸的降解作用的植物盆栽试验
50.将甘草幼苗移到含有200克土壤的盆栽中，放在气候室中培养。每个盆栽中初始栽培四株甘草幼苗，四周后，每盆保留一株甘草幼苗(两片真叶时期)，之后再培养1周获得三叶期的甘草幼苗。
51.取菌株n培养至菌液浑浊后，离心沉淀菌体。沉淀经无菌水洗涤后，用无菌水溶解并调节浓度od
600
为0.08-1.0，同时用无菌水设置一个空白对照组(c)。分别用无菌注射器将n菌液及无菌水接种至盆栽植物根部附近，每盆接种10ml。接种2天后，用10ml egs(egs是质量浓度为2.5mg/ml的溶液，该溶液的制备方法为：将2.5g甘草酸与0.3g固体氢氧化钠在水浴加热条件下溶解在1l超纯水中，调ph＝7.5)和10ml自来水每3天处理一次甘草幼苗(化感物质处理组a)。以20ml自来水处理为对照(水处理组w)。36d后对每个处理的幼苗进行叶绿素含量、鲜重和干重等生长指标测定。结果见表2。
52.表2根际化感物质添加和接种菌联合作用下甘草幼苗的生长表型
[0053][0054]
注:a，甘草酸处理；w，水处理；i，初始样本；c，对照：无菌接种；n，新鞘氨醇杆菌接种。数值后含有不同的字母表示差异显著(p《0.05，one-wayanova，tukey’s hsdtest)。
[0055]
由图3不同处理下单株植物和多株植物的生长表型和表2的植物试验结果可知，不同化感物质添加处理组的甘草幼苗生长指标在接种菌株处理中均高于未接种菌的处理组，说明甘草植株的生长发育在一定程度上受到外源化感物质的抑制，而菌株n的回补接种对甘草植株具有一定的保护作用，这可能与它们在根际土中的高效定殖和对化感物质的降解
作用有关。
[0056]
实施例5
[0057]
菌株n在根际土中对甘草酸的降解能力测定
[0058]
提取并分析实施例4盆栽根际土中甘草酸的含量。具体步骤如下：每个处理根际土过筛后(11g)用60ml的甲醇浸提，超声2次(每次30分钟)，然后用离心机(6000rpm)离心5分钟。保留的上清液经抽滤后，在室温下用真空旋转蒸发仪进行干燥处理。同样用100％甲醇(meoh)复溶干燥样品，然后用0.45μm的尼龙膜进行过滤后利用高分辨离子淌度液质联用仪(lc-ms/ms)进行化感物质的测定。结果见表3。
[0059]
表3接种菌株n时根际土中化感物质的含量
[0060][0061]
由表3可知，加菌处理组根际土中的化感物质含量均低于未添加菌的处理，土壤中加入菌株n后对甘草酸降解效果显著，表明这株甘草酸降解菌在土壤环境下能有效地分解甘草酸，降低土壤中甘草酸的含量，能在一定程度上缓解由化感物质甘草酸积累引起的甘草连作障碍问题。
[0062]
实施例6
[0063]
化感物质处理组根际土壤宏基因组测序和分析
[0064]
在化感物质添加的影响下，不同采样时期的根际土中共同富集了许多细菌物种，且部分类群被定义为生物指示物种(图4)。在此基础上，通过随机森林分析得到8个生物指示物种，这些生物指示物种在科水平上大多数被注释为鞘脂单胞菌(sphingomonadaceae)，其中otu 7909的解释度最高，尽管其相对丰度较低。相似的是，大部分特异性富集的物种被注释为新鞘氨醇杆菌(novosphingobium)属，它们归属于鞘脂单胞菌科，变形菌门(图5-6)。
[0065]
另外，本发明通过宏基因组的分箱技术，总共重建了74个组装良好的基因组(物种)。这些基因组的gc％含量在26.4％-72.9％之间。这些组装的类群通常归属于novosphingobium、usitatibacter、sphingomonas、aminobacter lisissarensis、mesorhizobium属。其中novosphingobium属的丰度最高(图7)。
[0066]
综上所述，本发明中的新鞘氨醇杆菌n作为根际细菌群落中的特异性富集物种而存在，并可以通过宏基因组组装得到。以上结果为新鞘氨醇杆菌n的鉴定提供了一定的理论支持。
[0067]
实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0068]
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
技术特征：1.一株新鞘氨醇杆菌，其特征在于，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2022379。2.权利要求1所述的新鞘氨醇杆菌在缓解甘草连作障碍中的用途。3.一种权利要求1所述的新鞘氨醇杆菌的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述新鞘氨醇杆菌接种至含有甘草酸的无机盐培养基中，在25～30℃、150～180r/min下培养4～5天；其中，所述甘草酸与所述无机盐培养基的混合比为4～6g∶1l；所述无机盐培养基按重量份数计由以下原料组成：磷酸氢钾2.5份、七水合硫酸镁0.2份、七水合硫酸铁0.1份、磷酸氢二钾2.0份、硝酸铵3.0份、水1000份，ph 7.5-8.0。4.一种根据权利要求3所述的发酵方法得到的发酵液。5.权利要求4所述的发酵液在缓解甘草连作障碍中的用途。6.根据权利要求2或5所述的用途，其特征在于，所述连作障碍是由化感自毒物质的积累引起的。7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述化感自毒物质是甘草酸。8.一种用于降解甘草土壤化感物质的微生物菌剂，其特征在于，其包括权利要求1所述的新鞘氨醇杆菌和/或权利要求4所述的发酵液。9.根据权利要求8所述的微生物菌剂，其特征在于，还包括可接受的辅料或载体。
技术总结本发明涉及微生物领域，提供了一株新鞘氨醇杆菌及其用途，其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCCNo：M2022379。该菌株能有效降解栽培甘草连作障碍土壤中的化感自毒物质甘草酸，其对甘草酸有较高的降解效率从而在一定程度上缓解甘草连作障碍中的化感自毒作用。定程度上缓解甘草连作障碍中的化感自毒作用。定程度上缓解甘草连作障碍中的化感自毒作用。
技术研发人员：焦硕 邱雨 刘洋 戚杰军 韦革宏
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：2022.05.16
技术公布日：2022/11/1
