一种针对尘螨皮炎导致毛孔粗大具有提亮肤色功能的信使rna活性细胞疗法
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，更具体地说，涉及一种针对尘螨皮炎导致毛孔粗大具有提亮肤色功能的信使rna活性细胞疗法。
背景技术：2.螨虫主要寄生在面部、头皮等部位的毛囊内，以皮脂、汗液、皮屑等为生，据调查表明，约有97％的成年人都有感染螨虫，有皮肤问题的人，每平方厘米大约有12.8个螨虫，而没有皮肤问题的人，每平方厘米大约0.7个，螨虫较多情况下，一般出现皮肤油腻、毛孔粗大、黑头的问题，且容易长红斑、瘙痒、脱屑、过敏，而且红斑不退，会慢慢出现丘疹、脓疱，甚至向玫瑰痤疮、红血丝等皮肤问题发展。螨虫还会导致皮肤粗糙、毛孔粗大、黑头大量螨虫不分昼夜在皮肤上爬行以及尸体、虫卵等刺激毛孔变大和角质层增生，而使皮肤粗糙，而且螨虫排泄物、尸体堆积在毛孔内会撑大毛孔，甚至与皮脂混合氧化形成黑头甚至出现玫瑰痤疮等严重皮肤问题。
3.针对尘螨皮炎导致的毛孔粗大以及皮肤暗沉等问题，一方面可以通过药物治疗驱除螨虫，另一方面可以通过促进人体胶原蛋白的合成过程，细化毛孔以及提亮肤色的过程，通过脂质体作为载体向人体细胞输送含有胶原蛋白基因序列的mrna，促进人体胶原蛋白的合成过程，从而实现治疗过程。
技术实现要素：4.本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种针对尘螨皮炎导致毛孔粗大具有提亮肤色功能的信使rna活性细胞疗法。
5.本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种针对尘螨皮炎导致毛孔粗大具有提亮肤色功能的信使rna活性细胞疗法，包括如下步骤：
6.步骤s1，分别制备载5－硝基咪唑类抗生素脂质体和载细胞生长因子脂质体，备用；
7.步骤s2，取冻存的插入有胶原蛋白基因编码的mrna，4000r/min离心1min，加入depc水震荡摇晃使其溶解；
8.步骤s3，取含有胶原蛋白基因编码的mrna溶液加入等质量的透明质酸溶液混合，室温静置10min，再与鱼精蛋白以体积比1:1进行混合，静置10min，备用；
9.步骤s4，取两份等量步骤s3的混合液，分别加入适量的载5－硝基咪唑类抗生素脂质体和载细胞生长因子脂质体得溶液a和溶液b；
10.步骤s5，取步骤s4的溶液b进行瞬时转染并进行筛选，得活性细胞液b；
11.步骤s6，将溶液a通过皮下注射的方式进行指定部位给药，且将步骤s5的活性细胞液b过继入待治疗人体。
12.作为优选的，所述步骤s1的制备步骤具体如下：
13.采用薄膜分散法，称取质量比为3:1的阳离子脂质体dotap与胆固醇，加入圆底晒平中并加入适量的三氯甲烷，30℃旋蒸至瓶底形成一层脂质体薄膜，真空干燥2h除去有机溶剂，加入适量去离子水，超声波处理30min，按照其他物质与脂质体质量比1:5进行配比，超声处理70min。
14.作为优选的，所述步骤s2的胶原蛋白基因编码包括col1a1、col1a2、col2a1、col3a1、col5a1、col5a2、col5a3、col11a1、col11a2、col11a3、col24a1。
15.作为优选的，所述步骤s5瞬时转染具体包括：
16.dc细胞培养，取待治疗人血液膜分离出单个核细胞，加入完全培养基贴壁法培养2-4h，移除悬浮液，取剩下贴壁的细胞加入含特定诱导因子的培养基，培养6-8d；
17.向dc细胞培养基中加入溶液b轻弹混匀，室温静置10-15min得混合液，取适量不含血清培养液将混合液缓慢加入培养液中，摇匀，37℃温箱放置6-24h，吸出无血清转染液，换入正常培养液中继续培养，48-72h后提取活性细胞得活性细胞液b。
18.作为优选的，所述步骤s1的细胞生长因子为白细胞介素2。
19.作为优选的，所述步骤s6的皮下注射给药分3-5次进药，且每次给药不超过总药量的五分之一。
20.本发明所述方案相比于现有技术的有益效果如下：
21.本发明通过在一个患者上同时进行两种治疗手段，其中将溶液b与待治疗人体培养的dc细胞进行转染，转染后的活性细胞过继入待治疗人体的同时，结合溶液a的皮下注射给药双治疗过程，既可以通过药物治疗螨虫病害，又可以提高人体胶原蛋白合成效率，细化毛孔提亮肤色。
具体实施方式
22.下面通过具体实施例对发明做进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的本发明的保护范围。
23.一种针对尘螨皮炎导致毛孔粗大具有提亮肤色功能的信使rna活性细胞疗法，包括如下步骤：
24.步骤s1，分别制备载5－硝基咪唑类抗生素脂质体和载细胞生长因子脂质体，备用；
25.步骤s2，取冻存的插入有胶原蛋白基因编码的mrna，4000r/min离心1min，加入depc水震荡摇晃使其溶解；
26.步骤s3，取含有胶原蛋白基因编码的mrna溶液加入等质量的透明质酸溶液混合，室温静置10min，再与鱼精蛋白以体积比1:1进行混合，静置10min，备用；
27.步骤s4，取两份等量步骤s3的混合液，分别加入适量的载5－硝基咪唑类抗生素脂质体和载细胞生长因子脂质体的溶液a和溶液b；
28.步骤s5，取步骤s4的溶液b进行瞬时转染并进行筛选，得活性细胞液b；
29.步骤s6，将溶液a通过皮下注射的方式进行指定部位给药，且将步骤s5的活性细胞液b过继入待治疗人体。
30.进一步的，步骤s1的具体制备如下：
31.采用薄膜分散法，称取质量比为3:1的阳离子脂质体dotap与胆固醇，加入圆底晒
平中并加入适量的三氯甲烷，30℃旋蒸至瓶底形成一层脂质体薄膜，真空干燥2h除去有机溶剂，加入适量去离子水，超声波处理30min，按照其他物质与脂质体质量比1:5进行配比，超声处理70min。
32.合成人体胶原蛋白基因编码包括col1a1、col1a2、col2a1、col3a1、col5a1、col5a2、col5a3、col11a1、col11a2、col11a3、col24a1。
33.细胞生长因子即白细胞介素2，其具体制备过程如下：
34.(i)无菌环境下采集本体血液，加入肝素抗凝，用rpmi1640按1∶1将血液稀释，然后重层于菲可液面上，以1500r/min离心30min，取白细胞层，用rpmi1640洗2次，按1-3
×
10细胞/ml浓度加入10％胎牛血清rpmi1640，注入一装有磁棒的大瓶中，置37℃搅拌培养4天，取出，分装于50ml离心管中，1500r/min离心20min，弃上清液，将细胞悬浮于1％胎牛血清rpmi1640培养液中，使细胞浓度为106细胞/ml。同时加入纯质pha1-2μg/ml以及多种b淋巴母细胞株，使其浓度为106细胞/ml，37℃搅拌培养18-24h后，取出以1500r/min离心30min，取上清，用045μg滤膜过滤除菌，滤液即为粗制il2；
35.(ii)硫酸铵沉淀与真空浓缩透析，在4℃下将硫酸铵粉末按50％饱和量加入上述粗制il2中，搅拌2h，12000g离心30min，取上清液，再加入80％饱和硫酸铵，4℃过夜，次日以12000g离心30min，弃上清液，将沉淀溶于01％peg6000的1∶2pbs溶液(ph值73)中，置真空负压浓缩透析器中透析浓缩至所需容量；
36.(iii)sephadexg100凝胶过滤，用2
×
180cm的过滤柱及pbs(同上)，以80ml/h流速过滤。将各管洗脱液用紫外分光光度计280nm检测其od值，同时将几种不同分子量的标准蛋白也用相同条件过滤及检测其od值，绘出il2及标准蛋白od值的曲线，将各管洗脱液过滤除菌后，作白细胞生物活性试验，按试验结果绘出曲线，找出具有最高il2活性的几管洗脱液，混合后，作下一步精制；
37.(iv)bluesepharose层析，将上述混合的洗脱液加入bluesepharose柱中，流速约15ml/h，按每管10ml收集流出液，当样品全部流出柱中以后，用上述pbs洗涤样品柱，再用梯度nacl溶液(从0075mol/l至06mol/lnacl的pbs溶液)洗脱，按2ml/管收集洗脱液。nacl溶液梯度及流速均由梯度混合器调节控制，洗脱完毕后，作各管od值及nacl浓度的测定，各管洗脱液过滤除菌后，作出生物活性测定。将峰值前后的数管洗脱液混合，即为精制的il2。置－20℃冰箱保存。
38.实施例1
39.一种针对尘螨皮炎导致毛孔粗大具有提亮肤色功能的信使rna活性细胞疗法，包括如下步骤：
40.步骤s1，制备载5－硝基咪唑类抗生素脂质体，备用；
41.步骤s2，取冻存的插入有胶原蛋白基因编码的mrna，4000r/min离心1min，加入depc水震荡摇晃使其溶解；
42.步骤s3，取含有胶原蛋白基因编码的mrna溶液加入等质量的透明质酸溶液混合，室温静置10min，再与鱼精蛋白以体积比1:1进行混合，静置10min，备用；
43.步骤s4，取步骤s3的混合液，加入适量的载5－硝基咪唑类抗生素脂质体得溶液a；
44.步骤s6，将溶液a通过皮下注射的方式进行指定部位给药。
45.进一步的，步骤s1的具体制备如下：
46.采用薄膜分散法，称取质量比为3:1的阳离子脂质体dotap与胆固醇，加入圆底晒平中并加入适量的三氯甲烷，30℃旋蒸至瓶底形成一层脂质体薄膜，真空干燥2h除去有机溶剂，加入适量去离子水，超声波处理30min，按照其他物质与脂质体质量比1:5进行配比，超声处理70min。
47.合成人体胶原蛋白基因编码包括col1a1、col1a2、col2a1、col3a1、col5a1、col5a2、col5a3、col11a1、col11a2、col11a3、col24a1。
48.实施例2
49.一种针对尘螨皮炎导致毛孔粗大具有提亮肤色功能的信使rna活性细胞疗法，包括如下步骤：
50.步骤s1，制备载细胞生长因子脂质体，备用；
51.步骤s2，取冻存的插入有胶原蛋白基因编码的mrna，4000r/min离心1min，加入depc水震荡摇晃使其溶解；
52.步骤s3，取含有胶原蛋白基因编码的mrna溶液加入等质量的透明质酸溶液混合，室温静置10min，再与鱼精蛋白以体积比1:1进行混合，静置10min，备用；
53.步骤s4，取步骤s3的混合液，加入适量的载细胞生长因子脂质体得溶液b；
54.步骤s5，取步骤s4的溶液b进行瞬时转染并进行筛选，得活性细胞液b；
55.步骤s6，将步骤s5的活性细胞液b过继入待治疗人体。
56.进一步的，步骤s1的具体制备如下：
57.采用薄膜分散法，称取质量比为3:1的阳离子脂质体dotap与胆固醇，加入圆底晒平中并加入适量的三氯甲烷，30℃旋蒸至瓶底形成一层脂质体薄膜，真空干燥2h除去有机溶剂，加入适量去离子水，超声波处理30min，按照其他物质与脂质体质量比1:5进行配比，超声处理70min。
58.合成人体胶原蛋白基因编码包括col1a1、col1a2、col2a1、col3a1、col5a1、col5a2、col5a3、col11a1、col11a2、col11a3、col24a1。
59.细胞生长因子即白细胞介素2，其具体制备过程如下：
60.(i)无菌环境下采集本体血液，加入肝素抗凝，用rpmi1640按1∶1将血液稀释，然后重层于菲可液面上，以1500r/min离心30min，取白细胞层，用rpmi1640洗2次，按1-3
×
10细胞/ml浓度加入10％胎牛血清rpmi1640，注入一装有磁棒的大瓶中，置37℃搅拌培养4天，取出，分装于50ml离心管中，1500r/min离心20min，弃上清液，将细胞悬浮于1％胎牛血清rpmi1640培养液中，使细胞浓度为106细胞/ml。同时加入纯质pha1-2μg/ml以及多种b淋巴母细胞株，使其浓度为106细胞/ml，37℃搅拌培养18-24h后，取出以1500r/min离心30min，取上清，用045μg滤膜过滤除菌，滤液即为粗制il2；
61.(ii)硫酸铵沉淀与真空浓缩透析，在4℃下将硫酸铵粉末按50％饱和量加入上述粗制il2中，搅拌2h，12000g离心30min，取上清液，再加入80％饱和硫酸铵，4℃过夜，次日以12000g离心30min，弃上清液，将沉淀溶于01％peg6000的1∶2pbs溶液(ph值73)中，置真空负压浓缩透析器中透析浓缩至所需容量；
62.(iii)sephadexg100凝胶过滤，用2
×
180cm的过滤柱及pbs(同上)，以80ml/h流速过滤。将各管洗脱液用紫外分光光度计280nm检测其od值，同时将几种不同分子量的标准蛋白也用相同条件过滤及检测其od值，绘出il2及标准蛋白od值的曲线，将各管洗脱液过滤除
菌后，作白细胞生物活性试验，按试验结果绘出曲线，找出具有最高il2活性的几管洗脱液，混合后，作下一步精制；
63.(iv)bluesepharose层析，将上述混合的洗脱液加入bluesepharose柱中，流速约15ml/h，按每管10ml收集流出液，当样品全部流出柱中以后，用上述pbs洗涤样品柱，再用梯度nacl溶液(从0075mol/l至06mol/lnacl的pbs溶液)洗脱，按2ml/管收集洗脱液。nacl溶液梯度及流速均由梯度混合器调节控制，洗脱完毕后，作各管od值及nacl浓度的测定，各管洗脱液过滤除菌后，作出生物活性测定。将峰值前后的数管洗脱液混合，即为精制的il2。置－20℃冰箱保存。
64.实施例3
65.一种针对尘螨皮炎导致毛孔粗大具有提亮肤色功能的信使rna活性细胞疗法，包括如下步骤：
66.步骤s1，分别制备载5－硝基咪唑类抗生素脂质体和载细胞生长因子脂质体，备用；
67.步骤s2，取冻存的插入有胶原蛋白基因编码的mrna，4000r/min离心1min，加入depc水震荡摇晃使其溶解；
68.步骤s3，取含有胶原蛋白基因编码的mrna溶液加入等质量的透明质酸溶液混合，室温静置10min，再与鱼精蛋白以体积比1:1进行混合，静置10min，备用；
69.步骤s4，取两份等量步骤s3的混合液，分别加入适量的载5－硝基咪唑类抗生素脂质体和载细胞生长因子脂质体的溶液a和溶液b；
70.步骤s5，取步骤s4的溶液b进行瞬时转染并进行筛选，得活性细胞液b；
71.步骤s6，将溶液a通过皮下注射的方式进行指定部位给药，且将步骤s5的活性细胞液b过继入待治疗人体。
72.进一步的，步骤s1的具体制备如下：
73.采用薄膜分散法，称取质量比为3:1的阳离子脂质体dotap与胆固醇，加入圆底晒平中并加入适量的三氯甲烷，30℃旋蒸至瓶底形成一层脂质体薄膜，真空干燥2h除去有机溶剂，加入适量去离子水，超声波处理30min，按照其他物质与脂质体质量比1:5进行配比，超声处理70min。
74.合成人体胶原蛋白基因编码包括col1a1、col1a2、col2a1、col3a1、col5a1、col5a2、col5a3、col11a1、col11a2、col11a3、col24a1。
75.细胞生长因子即白细胞介素2，其具体制备过程如下：
76.(i)无菌环境下采集本体血液，加入肝素抗凝，用rpmi1640按1∶1将血液稀释，然后重层于菲可液面上，以1500r/min离心30min，取白细胞层，用rpmi1640洗2次，按1-3
×
10细胞/ml浓度加入10％胎牛血清rpmi1640，注入一装有磁棒的大瓶中，置37℃搅拌培养4天，取出，分装于50ml离心管中，1500r/min离心20min，弃上清液，将细胞悬浮于1％胎牛血清rpmi1640培养液中，使细胞浓度为106细胞/ml。同时加入纯质pha1-2μg/ml以及多种b淋巴母细胞株，使其浓度为106细胞/ml，37℃搅拌培养18-24h后，取出以1500r/min离心30min，取上清，用045μg滤膜过滤除菌，滤液即为粗制il2；
77.(ii)硫酸铵沉淀与真空浓缩透析，在4℃下将硫酸铵粉末按50％饱和量加入上述粗制il2中，搅拌2h，12000g离心30min，取上清液，再加入80％饱和硫酸铵，4℃过夜，次日以
12000g离心30min，弃上清液，将沉淀溶于01％peg6000的1∶2pbs溶液(ph值73)中，置真空负压浓缩透析器中透析浓缩至所需容量；
78.(iii)sephadexg100凝胶过滤，用2
×
180cm的过滤柱及pbs(同上)，以80ml/h流速过滤。将各管洗脱液用紫外分光光度计280nm检测其od值，同时将几种不同分子量的标准蛋白也用相同条件过滤及检测其od值，绘出il2及标准蛋白od值的曲线，将各管洗脱液过滤除菌后，作白细胞生物活性试验，按试验结果绘出曲线，找出具有最高il2活性的几管洗脱液，混合后，作下一步精制；
79.(iv)bluesepharose层析，将上述混合的洗脱液加入bluesepharose柱中，流速约15ml/h，按每管10ml收集流出液，当样品全部流出柱中以后，用上述pbs洗涤样品柱，再用梯度nacl溶液(从0075mol/l至06mol/lnacl的pbs溶液)洗脱，按2ml/管收集洗脱液。nacl溶液梯度及流速均由梯度混合器调节控制，洗脱完毕后，作各管od值及nacl浓度的测定，各管洗脱液过滤除菌后，作出生物活性测定。将峰值前后的数管洗脱液混合，即为精制的il2。置－20℃冰箱保存。
80.分别在病情相近的三位尘螨病人的相同病害部位进行实施例1-3的治疗过程，治疗时长分为30d，每隔4天按上述治疗过程进行治疗，治疗期结束，对比三位患者病变区治疗结果可以发现，本发明的实施例3的患者在细化毛孔和肤色提亮方面取得了更好的治疗效果。
81.本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施条例作出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
技术特征：1.一种针对尘螨皮炎导致毛孔粗大具有提亮肤色功能的信使rna活性细胞疗法，其特征在于，包括如下步骤：步骤s1，分别制备载5－硝基咪唑类抗生素脂质体和载细胞生长因子脂质体，备用；步骤s2，取冻存的插入有胶原蛋白基因编码的mrna，4000r/min离心1min，加入depc水震荡摇晃使其溶解；步骤s3，取含有胶原蛋白基因编码的mrna溶液加入等质量的透明质酸溶液混合，室温静置10min，再与鱼精蛋白以体积比1:1进行混合，静置10min，备用；步骤s4，取两份等量步骤s3的混合液，分别加入适量的载5－硝基咪唑类抗生素脂质体和载细胞生长因子脂质体得溶液a和溶液b；步骤s5，取步骤s4的溶液b进行瞬时转染并进行筛选，得活性细胞液b；步骤s6，将溶液a通过皮下注射的方式进行指定部位给药，且将步骤s5的活性细胞液b过继入待治疗人体。2.根据权利要求1所述的一种针对尘螨皮炎导致毛孔粗大具有提亮肤色功能的信使rna活性细胞疗法，其特征在于，所述步骤s1的制备步骤具体如下：采用薄膜分散法，称取质量比为3:1的阳离子脂质体dotap与胆固醇，加入圆底晒平中并加入适量的三氯甲烷，30℃旋蒸至瓶底形成一层脂质体薄膜，真空干燥2h除去有机溶剂，加入适量去离子水，超声波处理30min，按照其他物质与脂质体质量比1:5进行配比，超声处理70min。3.根据权利要求1所述的一种针对尘螨皮炎导致毛孔粗大具有提亮肤色功能的信使rna活性细胞疗法，其特征在于，所述步骤s2的胶原蛋白基因编码包括col1a1、col1a2、col2a1、col3a1、col5a1、col5a2、col5a3、col11a1、col11a2、col11a3、col24a1。4.根据权利要求1所述的一种针对尘螨皮炎导致毛孔粗大具有提亮肤色功能的信使rna活性细胞疗法，其特征在于，所述步骤s5瞬时转染具体包括：dc细胞培养，取待治疗人血液膜分离出单个核细胞，加入完全培养基贴壁法培养2-4h，移除悬浮液，取剩下贴壁的细胞加入含特定诱导因子的培养基，培养6-8d；向dc细胞培养基中加入溶液b轻弹混匀，室温静置10-15min得混合液，取适量不含血清培养液将混合液缓慢加入培养液中，摇匀，37℃温箱放置6-24h，吸出无血清转染液，换入正常培养液中继续培养，48-72h后提取活性细胞得活性细胞液b。5.根据权利要求1所述的一种针对尘螨皮炎导致毛孔粗大具有提亮肤色功能的信使rna活性细胞疗法，其特征在于，所述步骤s1的细胞生长因子为白细胞介素2。6.根据权利要求1所述的一种针对尘螨皮炎导致毛孔粗大具有提亮肤色功能的信使rna活性细胞疗法，其特征在于，所述步骤s6的皮下注射给药分3-5次进药，且每次给药不超过总药量的五分之一。
技术总结本发明涉及生物工程技术领域，并公开了一种针对尘螨皮炎导致毛孔粗大具有提亮肤色功能的信使RNA活性细胞疗法，包括如下步骤，分别制备载5－硝基咪唑类抗生素脂质体和载细胞生长因子脂质体，且将与透明质酸溶液以及鱼精蛋白混合后的mRNA溶液，分别与载5－硝基咪唑类抗生素脂质体和载细胞生长因子脂质体混合得溶液A和溶液B，通过将溶液B与待治疗人体培养的DC细胞进行转染，转染后的活性细胞过继入待治疗人体的同时，结合溶液A的皮下注射给药双治疗过程，既可以通过药物治疗螨虫病害，又可以提高人体胶原蛋白合成效率，细化毛孔提亮肤色。色。
技术研发人员：杜希静
受保护的技术使用者：湖南基茵美生命科技有限公司
技术研发日：2022.07.05
技术公布日：2022/11/1
