用于生产培养乳制品的活细胞构建体及其使用方法
1.交叉引用
2.本技术要求于2020年1月8日提交的美国临时申请第62/958,407号和于2020年12月10日提交的美国临时申请第63/199,164号的优先权的权益，这些临时申请各自的内容通过引用以其整体并入本文。
发明领域
3.本发明涉及活细胞构建体和使用其从培养的乳腺细胞体外和/或离体生产培养乳制品(cultured milk product)的方法。
4.发明背景
5.乳是人类饮食的主食，无论是在婴儿期还是贯穿一生中。美国儿科学会(the american academy of pediatrics)和世界卫生组织(world health organization)建议婴儿在生命的前6个月完全母乳喂养，并且婴儿期以外的乳制品消耗是人类营养的支柱，代表着全球7000亿美元的产业。然而，哺乳是一个生理要求高和代谢密集的过程，可能会给母乳喂养的母亲带来生物的和实际的挑战，并且乳生产与农业背景下的环境、社会和动物福利影响相关。
6.近年来，随着从培养的肌肉和脂肪细胞开发出几种成功的肉类和海洋食品的原型，利用哺乳动物细胞培养物生产食品的可能性越来越引起人们的兴趣(stephens等人2018 trends food sci technol.78:155-166)。此外，正在努力利用微生物表达系统将蛋和乳蛋白的生产商业化。然而，这种基于发酵的方法依赖于个体组分的遗传工程化表达和纯化，并且无法复制乳或乳制品的完整分子谱(molecular profile)。
7.本发明通过提供活细胞构建体和使用其从培养的乳腺细胞体外和/或离体生产培养乳制品的方法来克服本领域的缺点。
8.发明概述
9.在某些实施方案中，本文公开了活细胞构建体，所述活细胞构建体包括：(a)三维支架，所述三维支架具有外表面、限定内腔/基室的内表面和从内表面延伸到外表面的多于一个孔；(b)基质材料，所述基质材料设置在三维支架的外表面上；(c)培养基，所述培养基设置在内腔/基室内并与内表面流体地接触；和(d)设置在基质材料上的至少70％汇合的极化的乳腺细胞的单层，其中乳腺细胞选自由以下组成的组：活的原代乳腺上皮细胞、活的乳腺肌上皮细胞、活的乳腺祖细胞、活的永生化乳腺上皮细胞、活的永生化乳腺肌上皮细胞和活的永生化乳腺祖细胞。在一些实施方案中，极化的乳腺细胞包括顶表面和基表面。在一些实施方案中，乳腺细胞的基表面与培养基流体地接触。在一些实施方案中，乳腺细胞中的至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％以相同方向极化。在一些实施方案中，极化的乳腺细胞的单层是至少70％汇合、至少80％汇合、至少90％汇合、至少95％汇合、至少99％汇合或100％汇合。在一些实施方案中，乳腺细胞包括有组成性活性的催乳素受体蛋白。在一些实施方案中，培养基包含碳源、化学缓冲系统、一种或更多种必需氨基酸、一种或更多种维生素和/或辅因子以及一种或更多种无机盐。在一些实施方案中，培养基还
包含催乳素。在一些实施方案中，基质材料包括一种或更多种细胞外基质蛋白。在一些实施方案中，三维支架包括天然聚合物、生物相容性合成聚合物、合成肽、源自前述中的任一种的复合物或其任何组合。在一些实施方案中，天然聚合物是胶原蛋白、壳聚糖、纤维素、琼脂糖、褐藻胶(alginate)、明胶、弹性蛋白、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和/或透明质酸。在一些实施方案中，生物相容性合成聚合物是聚砜、聚偏氟乙烯、聚乙烯共醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸酯聚合物和/或聚乙二醇。
10.在某些实施方案中，本文公开了从乳腺细胞生产分离的培养乳制品的方法，该方法包括：(a)在生物反应器中，在生产培养乳制品的条件下培养活细胞构建体，所述活细胞构建体包括：(i)三维支架，所述三维支架具有外表面、限定内腔/基室的内表面和从内表面延伸到外表面的多于一个孔；(ii)基质材料，所述基质材料设置在三维支架的外表面上；(iii)培养基，所述培养基设置在内腔/基室内并与内表面流体地接触；和(iv)设置在基质材料上的至少70％汇合的极化的乳腺细胞的单层，其中乳腺细胞选自由以下组成的组：活的原代乳腺上皮细胞、活的乳腺肌上皮细胞、活的乳腺祖细胞、活的永生化乳腺上皮细胞、活的永生化乳腺肌上皮细胞和活的永生化乳腺祖细胞；以及(b)分离培养乳制品。在一些实施方案中，极化的乳腺细胞包括顶表面和基表面。在一些实施方案中，乳腺细胞的基表面与培养基流体地接触。在一些实施方案中，生物反应器是封闭的生物反应器。在一些实施方案中，生物反应器包括基本上与活细胞构建体的内腔/基室分离的顶区室。在一些实施方案中，顶区室与乳腺细胞的顶表面流体地接触。在一些实施方案中，培养乳制品从乳腺细胞的顶表面分泌到顶区室中。在一些实施方案中，培养基基本上不接触培养乳制品。在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总细胞密度为至少10
11
。在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少1.5m2。在一些实施方案中，培养基包含碳源、化学缓冲系统、一种或更多种必需氨基酸、一种或更多种维生素和/或辅因子以及一种或更多种无机盐。在一些实施方案中，基质材料包括一种或更多种细胞外基质蛋白。在一些实施方案中，支架包括天然聚合物、生物相容性合成聚合物、合成肽、源自前述中的任一种的复合物(composite)或其任何组合。在一些实施方案中，天然聚合物是胶原蛋白、壳聚糖、纤维素、琼脂糖、褐藻胶、明胶、弹性蛋白、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和/或透明质酸。在一些实施方案中，生物相容性合成聚合物是聚砜、聚偏氟乙烯、聚乙烯共醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸酯聚合物和/或聚乙二醇。在一些实施方案中，培养在约27℃至约39℃的温度进行。在一些实施方案中，培养在约30℃至约37℃的温度进行。在一些实施方案中，培养在约4％至约6％的co2的大气浓度进行。在一些实施方案中，培养在约5％的co2的大气浓度进行。
11.在某些实施方案中，本文公开了生物反应器，所述生物反应器包括：(a)包含培养乳制品的顶区室；和(b)至少一种活细胞构建体，所述至少一种活细胞构建体包括：(i)三维支架，所述三维支架具有外表面、限定内腔/基室的内表面和从内表面延伸到外表面的多于一个孔；(ii)基质材料，所述基质材料设置在三维支架的外表面上；(iii)培养基，所述培养基设置在内腔/基室内并与内表面流体地接触；和(iv)设置在基质材料上的至少70％汇合的极化的乳腺细胞的单层，其中乳腺细胞选自由以下组成的组：活的原代乳腺上皮细胞、活的乳腺肌上皮细胞、活的乳腺祖细胞、活的永生化乳腺上皮细胞、活的永生化乳腺肌上皮细胞和活的永生化乳腺祖细胞；其中乳腺细胞的顶表面与顶区室流体地接触。在一些实施方
案中，生物反应器内乳腺细胞的总细胞密度为至少10
11
。在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少1.5m2。
12.在某些实施方案中，本文公开了包含乳腺细胞的将细胞的喂养和培养乳制品的分泌区室化(compartmentalize)的活细胞构建体。
13.在某些实施方案中，本文公开了活细胞构建体，该活细胞构建体包括：具有顶表面和底表面的支架；和支架的顶表面上的以下(a)、(b)和/或(c)的连续单层：(a)活的原代乳腺上皮细胞，(b)活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体，和/或(c)活的永生化乳腺上皮细胞，所述以下(a)、(b)和/或(c)的连续单层具有顶表面和基表面(例如，细胞形成极化的和汇合的细胞单层)：(a)活的原代乳腺上皮细胞，(b)活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体，和/或(c)永生化乳腺上皮细胞，其中构建体包括以下(a)、(b)和/或(c)的连续单层的顶表面上方和邻近的顶区室，以及支架的底表面下方和邻近的基区室：(a)活的原代乳腺上皮细胞，(b)活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体，和/或(c)永生化乳腺上皮细胞。
14.在某些实施方案中，本文公开了在培养物中生产乳的方法，该方法包括培养本发明的活细胞构建体，从而在培养物中生产乳。
15.在某些实施方案中，本文公开了制造用于在培养物中生产乳的活细胞构建体的方法，该方法包括(a)从来自乳腺组织(例如，乳腺、乳房、乳头组织)的乳腺外植体、活组织检查样品或原始母乳分离原代乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，以产生分离的乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；(b)培养分离的原代乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，以产生原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体；(c)在支架上培养(b)的混合群体，支架具有上表面和下表面，以在支架的上表面上产生混合群体的原代乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和乳腺祖细胞的极化的连续(即汇合)单层，其中极化的连续单层包括顶表面和基表面，从而产生用于在培养物中生产乳的活细胞构建体。
16.在某些实施方案中，本文公开了制造用于在培养物中生产乳的活细胞构建体的方法，该方法包括：a)从来自乳腺组织(例如，乳腺、乳房、乳头组织)的乳腺外植体、活组织检查样品或原始母乳分离原代乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，以产生分离的乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；(b)培养分离的原代乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，以产生原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体；(c)分选原代乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体，以产生原代乳腺上皮细胞的群体；和(d)在支架上培养原代乳腺上皮细胞的群体，支架具有上表面和下表面，以在支架的上表面上产生原代乳腺上皮细胞的极化的连续(即汇合)单层，其中极化的连续单层包括顶表面和基表面，从而产生用于在培养物中生产乳的活细胞构建体。
17.在某些实施方案中，本文公开了制造用于在培养物中生产乳的活细胞构建体的方法，该方法包括(a)培养永生化乳腺上皮细胞以产生增加的数量的永生化乳腺上皮细胞；(b)在支架上培养(a)的永生化乳腺上皮细胞，支架具有上表面和下表面，以在支架的上表面上产生永生化乳腺上皮细胞的极化的连续(即汇合)单层，其中极化的连续单层包括顶表面和基表面，从而产生用于在培养物中生产乳的活细胞构建体。
18.在某些实施方案中，本文公开了在培养物中生产乳的方法，该方法包括培养活细
胞构建体，该活细胞构建体包括(a)支架，该支架包括上表面和下表面，以及具有顶表面和基表面的活的原代乳腺上皮细胞的连续的(即汇合的)极化的单层，活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体的连续的极化的单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续的极化的单层，其中活的原代乳腺上皮细胞的连续的极化的单层，活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体的连续的极化的单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续的极化的单层位于支架的上表面，(b)基区室和顶区室，其中支架的下表面邻近基区室和活的原代乳腺上皮细胞单层的顶表面，活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体的单层和/或活的永生化乳腺上皮细胞的单层邻近顶区室，其中活的原代上皮乳腺细胞的单层，活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体的单层中的活的原代上皮乳腺细胞，或永生化乳腺上皮细胞的单层通过其顶表面分泌乳进入顶区室，从而在培养物中生产乳。
19.在某些实施方案中，本文公开了产生修饰的原代乳腺上皮细胞或永生化乳腺上皮细胞的方法，其中该方法包括将以下引入细胞：(a)编码含有修饰的细胞内信号传导结构域的催乳素受体的多核苷酸，任选地，其中该催乳素受体包括截短，其中外显子10的位置154已剪接到外显子11的3’序列；(b)编码与配体结合的嵌合催乳素受体的多核苷酸，该嵌合催乳素受体能够在不存在催乳素的情况下激活乳合成；(c)编码有组成性或条件性活性的催乳素受体蛋白的多核苷酸，任选地，其中该多核苷酸编码包含氨基酸9至187的缺失的有组成性活性的人类催乳素受体蛋白；(d)编码包含以下(i)和/或(ii)的催乳素蛋白的修饰的(重组)效应物的多核苷酸：(i)与stat5酪氨酸激酶结构域融合的jak2酪氨酸激酶结构域，和/或(ii)与jak2酪氨酸激酶结构域融合的催乳素受体细胞内结构域；(e)引入到昼夜节律相关基因per2(周期昼夜节律蛋白同源物2(period circadian protein homolog 2))中的功能丧失突变；和/或(f)编码一种或更多种葡萄糖转运蛋白基因glut1和/或glut12的多核苷酸，从而增加修饰的原代乳腺上皮细胞或永生化乳腺上皮细胞的细胞单层的基表面处的营养物摄取速率。
20.附图简述
21.图1示出了从在区室化培养装置中作为汇合单层生长的乳腺上皮细胞收集用于营养用途的乳的实例，在该区室化培养装置中，新鲜或回收的培养基被提供到基区室，并且乳从顶区室收集。teer，跨上皮电阻。
22.图2示出了跨越在基表面处锚定至支架的乳腺上皮细胞的汇合单层的极化的营养物吸收和乳分泌的实例。
23.图3示出了示例性微图案化支架，该支架为乳腺上皮细胞的汇合单层的区室化的营养物吸收和乳分泌提供增加的表面积。
24.图4示出了中空纤维生物反应器的三个实例，所述中空纤维生物反应器被描绘为一束毛细管(上图)，它可以支持乳腺上皮细胞衬覆(lining)毛细管的外表面(上图和左下图)或内表面(右下图)，提供定向的和区室化的营养物吸收和乳分泌。
25.图5举例说明了三维活细胞构建体的横截面。构建体由具有限定内腔/基室的内表面和外表面的支架组成。内腔/基室包含细胞培养基。基质材料位于支架的外表面上方。孔从内表面横穿支架到外表面，允许细胞培养基接触设置在基质材料上的细胞单层的细胞的基表面。
publishing associates,inc.和john wiley&sons,inc.,new york)。
46.如本文所使用的，过渡短语“基本上由...组成”应解释为包括所列举的材料或步骤以及那些不实质上影响所要求保护的发明的基本的和新颖的特征的材料或步骤。因此，如在本文中使用的术语“基本上由...组成”不应被解释为等同于“包括”。
47.如本文所使用的，术语“多肽”包括肽和蛋白质两者，并且不要求任何特定的氨基酸长度或三级结构，除非另外指示。
48.如本文所使用的关于细胞和/或细胞单层的术语“极化的”指的是细胞的空间状态，其中存在细胞的两个不同的表面，例如，顶表面和基表面，这两个表面可以是不同的。在一些实施方案中，极化细胞的不同表面包括不同的表面受体和/或跨膜受体和/或其他结构。在一些实施方案中，连续单层中的单个极化细胞具有类似取向的顶表面和基表面。在一些实施方案中，连续单层中的单个极化细胞具有单个细胞之间的通讯结构(例如，紧密连接)，以允许单个细胞之间的交叉通讯，并且产生顶区室和基区室的分离(例如，区室化)。
49.如本文所使用的，“顶表面”意指面对外部环境或朝向腔或室(例如内部器官的腔)的细胞表面。关于乳腺上皮细胞，顶表面是培养乳制品从其分泌的表面。
50.如本文所使用的，“基表面”意指与表面(例如生物反应器的基质)接触的细胞表面。
51.如本文所使用的，“生物反应器”意指支持生物活性环境的设备或系统，该环境使得能够从本文所描述的乳腺细胞生产本文所描述的培养乳制品。
52.如本文所使用的术语“催乳的”指的是刺激乳产生和/或分泌的能力。基因或蛋白(例如，催乳素)可以是催乳的，任何其他天然的和/或合成的产物也可以是催乳的。在一些实施方案中，催乳的培养基包含催乳素，从而刺激与培养基接触的细胞产生乳。
53.如本文所使用的，术语“食品级”指的是被认为无毒和可安全食用(例如，人类和/或其他动物食用)的材料，例如，由美国食品和药物管理局制定的标准监管。
54.在一些实施方案中，由原代乳腺上皮细胞(例如，来自分离的活的原代乳腺上皮细胞的原代乳腺上皮细胞，和/或来自活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体的原代乳腺上皮细胞)或永生化乳腺上皮细胞产生的乳通过细胞的顶表面分泌进入顶区室中。在一些实施方案中，基区室包含培养基，并且该培养基与活的原代乳腺上皮细胞，活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体和/或永生化乳腺上皮细胞的基表面接触。
55.活细胞构建体
56.在某些实施方案中，本文公开了用于在培养物中生产乳的活细胞构建体，该活细胞构建体包括选自由以下组成的组的活乳腺细胞的连续单层：(a)活的原代乳腺上皮细胞，(b)活的乳腺肌上皮细胞，(c)活的乳腺祖细胞，和/或(d)活的永生化乳腺上皮细胞。
57.在一些实施方案中，乳腺细胞包括产乳乳腺上皮细胞、收缩肌上皮细胞和/或可以产生乳腺上皮细胞和乳腺收缩肌上皮细胞两者的祖细胞。乳腺上皮细胞是唯一产生乳的细胞。在一些实施方案中，乳腺细胞包括乳腺上皮细胞、原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞。
58.在一些实施方案中，乳腺细胞来自哺乳动物的乳腺组织、乳房组织和/或乳头组织。在一些实施方案中，乳腺细胞来自任何哺乳动物，例如灵长类(例如，黑猩猩、猩猩、大猩
猩、猴子(例如，旧大陆猴、新大陆猴)、狐猴、人类)、狗、猫、兔、小鼠、大鼠、马、奶牛、山羊、绵羊、牛(例如，牛属(bos spp.))、猪、鹿、麝、牛科动物、鲸、海豚、河马、大象、犀牛、长颈鹿、斑马、狮、猎豹、虎、熊猫、小熊猫和水獭。在一些实施方案中，乳腺细胞来自濒危物种，例如濒危哺乳动物。在一些实施方案中，乳腺细胞来自人类。在一些实施方案中，乳腺细胞来自牛科动物(例如，奶牛)。
59.在一些实施方案中，活的乳腺细胞的连续单层来源于母乳来源的干细胞或来源于乳腺组织活检的乳腺干细胞。母乳的上皮组分不仅包括成熟的上皮细胞，还包括其前体和培养中的干细胞。母乳来源的干细胞亚群显示出非常高的多谱系潜能，类似于人类胚胎干细胞(hesc)的典型特征。乳腺干细胞也可能来源于乳腺组织活检，并且包括终末分化的mec。母乳来源的干细胞和来源于乳腺组织活检的乳腺干细胞都是可以产生mec或肌上皮细胞的多潜能细胞。
60.在一些实施方案中，活细胞培养物的乳腺细胞中的至少50％是极化的。在一些实施方案中，活细胞培养物的乳腺细胞中的至少55％是极化的。在一些实施方案中，活细胞培养物的乳腺细胞中的至少60％是极化的。在一些实施方案中，活细胞培养物的乳腺细胞中的至少65％是极化的。在一些实施方案中，活细胞培养物的乳腺细胞中的至少70％是极化的。在一些实施方案中，活细胞培养物的乳腺细胞中的至少75％是极化的。在一些实施方案中，活细胞培养物的乳腺细胞中的至少80％是极化的。在一些实施方案中，活细胞培养物的乳腺细胞中的至少85％是极化的。在一些实施方案中，活细胞培养物的乳腺细胞中的至少90％是极化的。在一些实施方案中，活细胞培养物的乳腺细胞中的至少95％是极化的。在一些实施方案中，活细胞培养物的乳腺细胞中的至少100％是极化的。在一些实施方案中，活细胞构建体的基本上所有乳腺细胞都是极化的(即，具有顶表面和基表面)。在一些实施方案中，活细胞构建体的基本上所有乳腺细胞都被极化，并且基本上所有极化细胞定向在相同的方向上。例如，在一些实施方案中，基本上所有的乳腺细胞具有顶表面和基表面，其中基本上所有的细胞的顶表面定向在相同的方向上，并且基本上所有的细胞的基表面定向在相同的方向上。
61.在一些实施方案中，上皮乳腺细胞的单层在支架上具有至少70％汇合。在一些实施方案中，乳腺上皮细胞的单层在支架上具有至少约75％汇合。在一些实施方案中，上皮乳腺细胞的单层在支架上具有至少约80％汇合。在一些实施方案中，上皮乳腺细胞的单层在支架上具有至少约85％汇合。在一些实施方案中，上皮乳腺细胞的单层在支架上具有至少约90％汇合。在一些实施方案中，上皮乳腺细胞的单层在支架上具有至少约95％汇合。在一些实施方案中，上皮乳腺细胞的单层在支架上具有至少约99％汇合。在一些实施方案中，上皮乳腺细胞的单层在支架上具有100％汇合。
62.对乳腺细胞的遗传修饰
63.在一些实施方案中，乳腺细胞包含有组成性活性的催乳素受体蛋白。在一些实施方案中，乳腺细胞包含有组成性活性的人类催乳素受体蛋白。当原代乳腺上皮细胞或永生化乳腺上皮细胞包含有组成性活性的催乳素受体时，培养基不含有催乳素。
64.在一些实施方案中，有组成性活性的人类催乳素受体蛋白包含氨基酸9至187的缺失，其中编号是基于被标识为seq id no:1的人类催乳素受体的参考氨基酸序列。
65.seq id no:1：人类催乳素受体(genbank登录号aad32032.1)
[0066][0067]
在一些实施方案中，有组成性活性的人类催乳素受体蛋白包含以下氨基酸的缺失：
[0068][0069]
(例如seq id no:1的氨基酸位置9至187)。
[0070]
在一些实施方案中，乳腺细胞包含引入到昼夜节律相关基因per2中的功能丧失突变。在一些实施方案中，引入到昼夜节律相关基因per2中的功能丧失突变促进培养乳组分的合成。在一些实施方案中，per2基因中的功能丧失突变包括在per2中从位置348至434的87个氨基酸的缺失，其中编号是基于被标识为seq id no:2的人类per2的参考氨基酸序列。
[0071]
seq id no:2：人类周期昼夜节律蛋白同源物2 (genbank登录号nm022817)
[0072][0073]
在一些实施方案中，引入到per2中的功能丧失突变包括以下氨基酸的缺失：
[0074][0075]
(例如seq id no:2的氨基酸位置348至434)。
[0076]
在一些实施方案中，乳腺细胞包含编码含有修饰的细胞内信号传导结构域的催乳素受体的多核苷酸。在一些实施方案中，引入到昼夜节律相关基因per2中的功能丧失突变促进单独的培养乳组分的合成。在一些实施方案中，催乳素受体包括截短，其中外显子10的位置154已经剪接到外显子11的3’序列。在一些实施方案中，催乳素受体包括根据seq id no:3的序列。
[0077]
seq id no:3：人类催乳素受体同种型4(genbank登录号af416619；trott等人2003 j.mol.endocrinol 3q(l):31-47)
[0078]
[0079]
在一些实施方案中，乳腺细胞包含编码催乳素蛋白的修饰(例如重组)效应物的多核苷酸。在一些实施方案中，催乳素蛋白的修饰效应物包含janus激酶-2(jak2)酪氨酸激酶结构域。在一些实施方案中，修饰效应物包含与信号转导物和转录活化因子-5(stat5)酪氨酸激酶结构域融合的jak2酪氨酸激酶结构域(例如，编码jak2酪氨酸激酶结构域的多核苷酸与编码stat5酪氨酸激酶结构域的多核苷酸的3’末端连接)。在一些实施方案中，催乳素蛋白的修饰效应物促进单独的培养乳组分的增加的合成。在一些实施方案中，修饰效应物具有根据seq id no:4的序列。加粗体的氨基酸对应于参考人类jak2氨基酸序列的氨基酸位置757至1129的jak2激酶结构域。
[0080]
seq id no:4.在3’末端与jak2人类酪氨酸蛋白激酶的氨基酸757-1129融合的sta5a人类信号转导物和转录活化因子5a
[0081][0082][0083]
在一些实施方案中，乳腺细胞是永生化的。在一些实施方案中，乳腺细胞包含编码人类端粒酶逆转录酶(htert)或猿猴病毒40(sv40)的一种或更多种核酸。在一些实施方案中，乳腺细胞包括针对p16(周期蛋白依赖性激酶4的抑制剂)(p16(ink4))和细胞周期进入和增殖代谢的主调节物(c-myc)的小发夹rna(shrna)。
[0084]
在一些实施方案中，方法包括将以下引入细胞：(a)编码含有修饰的细胞内信号传
导结构域的催乳素受体的多核苷酸，任选地，其中该催乳素受体包括截短，其中外显子10的位置154已剪接到外显子11的3’序列；(b)编码与配体结合的嵌合催乳素受体的多核苷酸，该嵌合催乳素受体能够在不存在催乳素的情况下激活乳合成；(c)编码有组成性或条件性活性的催乳素受体蛋白的多核苷酸，任选地，其中该多核苷酸编码包含氨基酸9至187的缺失的有组成性活性的人类催乳素受体蛋白(例如，氨基酸9至187的缺失，其中编号基于鉴定为seq id no:1的人类催乳素受体的参考氨基酸序列)；(d)编码包含以下(i)和/或(ii)的催乳素蛋白的修饰的(例如重组)效应物的多核苷酸：(i)janus激酶-2(jak2)酪氨酸激酶结构域，任选地其中jak2酪氨酸激酶结构域与信号转导物和转录激活因子5(stat5)酪氨酸激酶结构域融合(例如，编码jak2酪氨酸激酶结构域的多核苷酸连接到编码stat5酪氨酸激酶结构域的多核苷酸的3’末端)；和/或(ii)与jak2酪氨酸激酶结构域融合的催乳素受体细胞内结构域；(e)引入到昼夜节律相关基因per2(周期昼夜节律蛋白同源物2)中的功能丧失突变；和/或(f)编码一种或更多种葡萄糖转运蛋白基因glut1和/或glut12的多核苷酸，从而增加单层的基表面处的营养物摄取速率。
[0085]
支架
[0086]
在一些实施方案中，活细胞构建体还包括具有顶表面/外表面和底表面/内表面的支架。在一些实施方案中，支架是二维表面或三维表面(例如，三维微图案化表面，和/或作为组装成束的圆柱形结构)。二维表面支架的非限制性实例是过滤器。在一些实施方案中，支架是三维表面。三维微图案化表面的非限制性实例包括微结构化生物反应器、脱细胞的组织(例如，脱细胞的乳腺或脱细胞的植物组织)、通过浇铸或三维打印用生物材料或生物相容性材料制造的微图案化支架、纹理化表面。在一些实施方案中，通过静电纺丝纤维素纳米纤维和/或可组装成束的圆柱形结构来制造支架(例如，中空纤维生物反应器)。在一些实施方案中，支架是多孔的。在一些实施方案中，支架是3d支架。在一些实施方案中，三维支架是具有封闭的中空内部/中心腔的任何结构。在一些实施方案中，三维支架与一个或更多个表面连接以形成封闭的内室/基区室。例如，支架可以与生物反应器的一个或更多个壁连接以形成内室/基区室。在一些实施方案中，支架是中空纤维生物反应器。在一些实施方案中，3d支架是其中中心腔被支架的内表面限定的管。在一些实施方案中，3d支架是其中中心腔被支架的内表面限定的中空球体。
[0087]
对于用于肠吸收研究的体外培养方法，二维表面支架诸如长期以来一直被作为标准，因为它们提供顶空间和基外侧空间两者来模拟肠血液屏障，并且实现药物和营养物的主动运输和被动运输两者。然而，接种到平支持物上的细胞表现出与体内细胞明显不同的表型，部分原因是3-d细胞外微环境的不良表现。
[0088]
三维支架允许乳腺细胞(例如mec)在所有三个维度上生长或与其周围环境相互作用。与2d环境不同，3d细胞培养允许体外细胞在各个方向上生长，接近体内乳腺环境。此外，3d支架允许更大的表面积用于细胞培养及用于代谢物和气体交换，加上它实现了必要的区室化——使培养乳制品能够分泌到一个区室中，而细胞培养基与另一个区室中的乳腺细胞接触。迄今为止，具有使用乳腺上皮细胞在3d表面上进行的基细胞表面和顶细胞表面的极化分离的汇合单层尚未实现(sharfstein等人1992)。
[0089]
在一些实施方案中，支架是多孔的。在一些实施方案中，支架是细胞培养基可渗透的，允许细胞培养基接触细胞单层的细胞。在一些实施方案中，支架被至少一个孔横穿，该
孔允许细胞培养基接触细胞单层的细胞的基表面。
[0090]
在一些实施方案中，支架的顶表面/外表面包被有基质材料。在一些实施方案中，基质由一种或更多种细胞外基质蛋白组成。细胞外基质蛋白的非限制性实例包括胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、生腱蛋白和/或纤连蛋白。在一些实施方案中，支架包括天然聚合物、生物相容性合成聚合物、合成肽和/或源自其任何组合的复合物。在一些实施方案中，可用于本发明的天然聚合物包括但不限于胶原蛋白、壳聚糖、纤维素、琼脂糖、褐藻胶、明胶、弹性蛋白、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和/或透明质酸。在一些实施方案中，可用于本发明的生物相容性合成聚合物包括但不限于纤维素、聚砜、聚偏氟乙烯、聚乙烯共醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸酯聚合物和/或聚乙二醇。在一些实施方案中，支架的顶部包被有层粘连蛋白和胶原蛋白。
[0091]
在一些实施方案中，基质材料是多孔的。在一些实施方案中，基质材料是细胞培养基可渗透的，允许细胞培养基接触细胞单层的细胞。在一些实施方案中，基质材料被至少一个孔横穿，该孔允许细胞培养基接触细胞单层细胞的基表面。
[0092]
在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约0.1μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约0.2μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约0.3μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约0.4μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约0.5μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约0.6μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约0.7μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约0.8μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约0.9μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约1.0μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约1.1μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约1.2μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约1.3μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约1.4μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约1.5μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约1.6μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约1.7μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约1.8μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约1.9μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约2.0μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约2.1μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约2.2μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约2.2μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约2.3μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约2.4μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约2.5μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约2.6μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约2.7μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约2.8μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约2.9μm。在一些实施方案中，支架和/或基质材料的孔径为至少约3.0μm。
[0093]
在一些实施方案中，活细胞构建体包括：具有顶表面/外表面和底表面/内表面的支架；和支架的顶表面上的以下(a)、(b)和/或(c)的连续单层：(a)活的原代乳腺上皮细胞，(b)活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体，和/或(c)活的永生
parasitology 26:21-29)。
[0101]
在配置中空纤维生物反应器时，设计考虑和参数可以根据与细胞扩增相关的目标而变化。一个这样的设计考虑是纤维壁中的孔的尺寸。这通常被设计为允许营养物通过以进入细胞，带走废弃物，向细胞提供所需的产物(诸如生长因子)，从细胞中去除所需的产物，并且排除可能存在的某些因子到达细胞。因此，纤维壁的孔径可以变化，以调整哪些组分会穿过壁。例如，孔径可以允许大的蛋白质分子通过，包括生长因子，包括但不限于表皮生长因子和血小板衍生生长因子。本领域普通技术人员将理解如何根据希望穿过纤维壁到达细胞或从细胞携带材料的组分来改变孔径。
[0102]
在一些实施方案中，孔径为约0.2μm。在一些实施方案中，孔径为约0.1μm。在一些实施方案中，孔径为约0.2μm。在一些实施方案中，孔径为约0.3μm。在一些实施方案中，孔径为约0.4μm。在一些实施方案中，孔径为约0.5μm。在一些实施方案中，孔径为约0.6μm。在一些实施方案中，孔径为约0.7μm。在一些实施方案中，孔径为约0.8μm。在一些实施方案中，孔径为约0.9μm。在一些实施方案中，孔径为约1.0μm。在一些实施方案中，孔径为约1.1μm。在一些实施方案中，孔径为约1.2μm。在一些实施方案中，孔径为约1.3μm。在一些实施方案中，孔径为约1.4μm。在一些实施方案中，孔径为约1.5μm。在一些实施方案中，孔径为约1.6μm。在一些实施方案中，孔径为约1.7μm。在一些实施方案中，孔径为约1.8μm。在一些实施方案中，孔径为约1.9μm。在一些实施方案中，孔径为约2.0μm。在一些实施方案中，孔径为约2.1μm。在一些实施方案中，孔径为约2.2μm。在一些实施方案中，孔径为约2.2μm。在一些实施方案中，孔径为约2.3μm。在一些实施方案中，孔径为约2.4μm。在一些实施方案中，孔径为约2.5μm。在一些实施方案中，孔径为约2.6μm。在一些实施方案中，孔径为约2.7μm。在一些实施方案中，孔径为约2.8μm。在一些实施方案中，孔径为约2.9μm。在一些实施方案中，孔径为约3.0μm。
[0103]
制造活细胞构建体的方法
[0104]
在某些实施方案中，本文公开了制造用于生产培养乳制品的活细胞构建体的方法。在一些实施方案中，方法包括(a)从来自乳腺组织(例如，乳腺、乳房、乳头组织)的乳腺外植体、活组织检查样品或原始母乳分离原代乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，以产生分离的乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；(b)培养分离的原代乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，以产生原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体；(c)在具有上表面和下表面的支架上培养(b)的混合群体，以在支架的上表面上产生混合群体的原代乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的极化的单层，其中极化的单层包括顶表面和基表面，从而产生用于生产培养乳制品的活细胞构建体。
[0105]
在一些实施方案中，方法包括：a)从来自乳腺组织(例如，乳腺、乳房、乳头组织)的乳腺外植体、活组织检查样品或原始母乳分离原代乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，以产生分离的乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；(b)培养分离的原代乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，以产生原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体；(c)分选原代乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体(例如，选择原代乳腺上皮细胞)，以产生原代乳腺上皮细胞的群体；和(d)在具有上表面和下表面的支架上培养原代乳腺上皮细胞的群体，以在支架的上表面上产生原代乳腺上皮细胞的极化的单层，其中极化的单层包括顶表面和基表面，从而产生用于生产培养乳制
品的活细胞构建体。
[0106]
在一些实施方案中，方法包括(a)培养永生化乳腺上皮细胞以产生增加的数量的永生化乳腺上皮细胞；(b)在支架上培养(a)的永生化乳腺上皮细胞，支架具有上表面和下表面，以在支架的上表面上产生永生化乳腺上皮细胞的极化的单层，其中极化的单层包括顶表面和基表面，从而产生用于生产培养乳制品的活细胞构建体。
[0107]
在一些实施方案中，用于活细胞构建体的乳腺细胞的培养和/或培育在约35℃至约39℃的温度(例如，约35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃或约39℃或其中的任何值或范围的温度，例如，约35℃至约38℃、约36℃至约39℃、约36.5℃至约39℃、约36.5℃至约37.5℃，或约36.5℃至约38℃)进行。在一些实施方案中，培养和/或培育在约37℃的温度进行。
[0108]
在一些实施方案中，用于活细胞构建体的乳腺细胞的培养和/或培育在约4％至约6％的co2的大气浓度(例如，约4％、4.25％、4.5％、4.75％、5％、5.25％、5.5％、5.75％或6％或其中的任何值或范围的co2的大气浓度，例如约4％至约5.5％、约4.5％至约6％、约4.5％至约5.5％或约5％至约6％进行。在一些实施方案中，培养和/或培育在约5％的co2的大气浓度进行。
[0109]
在一些实施方案中，用于活细胞构建体的乳腺细胞的培养和/或培育包括在约每天至约每10天(例如，每1天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天、每8天、每9天、每10天，或其中的任何值或范围，例如，约每天至每3天、约每3天至每10天、约每2天至每5天)更换的培养基中培养和/或培育。在一些实施方案中，培养和/或培育还包括在约每天或约每几小时至约每10天(例如，约每1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时至约每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天，或其中的任何值或范围)更换的培养基中培养。例如，在一些实施方案中，培养和/或培育还包括在约每12小时至约每10天、约每10小时至约每5天或者约每5小时至约每3天更换的培养基中培养和/或培育。
[0110]
在一些实施方案中，活细胞构建体存储在冷冻器中或在液氮中。储存温度取决于所需的储存长度。例如，如果细胞要在6个月内(例如在1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月内)使用，可以使用冷冻器温度(例如，在约0℃至约-80℃或更低的温度储存，例如约0℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-100℃或其中的任何值或范围)。例如，液氮可以用于(例如储存在-100℃或更低的温度(例如-100℃、-110℃、-120℃、-130℃、-140℃、-150℃、-160℃、-170℃、-180℃、-190℃、-200℃或更低))长期储存(例如储存6个月或更长时间，例如6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月或12个月，或1年、2年、3年、4年、5年、6年或更多年)。
[0111]
在一些实施方案中，经由荧光激活细胞分选、磁激活细胞分选和/或微流体细胞分选来分离和分选乳腺细胞。
[0112]
基础培养基和催乳培养基
[0113]
在一些实施方案中，培养基包含碳源、化学缓冲系统、一种或更多种必需氨基酸、一种或更多种维生素和/或辅因子以及一种或更多种无机盐。在一些实施方案中，碳源、化学缓冲系统、一种或更多种必需氨基酸、一种或更多种维生素和/或辅因子和/或一种或更
多种无机盐是食品级。
[0114]
在一些实施方案中，培养基是催乳培养基。在一些实施方案中，培养基还包含催乳素(例如哺乳动物催乳素，例如人类催乳素)、亚油酸和α-亚油酸、雌激素和/或孕酮。例如，在一些实施方案中，培养基包含以下量的催乳素(或催乳素以以下量被添加)：约20ng/ml至约200ng/ml培养基，例如约20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml、150ng/ml、160ng/ml、170ng/ml、180ng/ml、190ng/ml或200ng/ml或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的催乳素(或催乳素以以下量被添加)：约20ng/ml至约195ng/ml、约50ng/ml至约150ng/ml、约25ng/ml至约175ng/ml、约45ng/ml至约200ng/ml或约75ng/ml至约190ng/ml培养基。在一些实施方案中，培养基还包含提高效率的其他因子，包括但不限于胰岛素、表皮生长因子和/或氢化可的松。
[0115]
在一些实施方案中，培养基包含以下量的碳源：约1g/l至约15g/l培养基(例如，约1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、14g/l或15g/l或其中的任何值或范围)，或约1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l或6g/l至约7g/l、8g/l、9g/l或10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、14g/l或15g/l培养基。碳源的非限制性实例包括葡萄糖和/或丙酮酸(pyruvate)。例如，在一些实施方案中，培养基包含以下量的葡萄糖：约1g/l至约12g/l培养基，例如约1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l、11g/l或12g/l或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的葡萄糖：约1g/l至约6g/l、约4g/l至约12g/l、约2.5g/l至约10.5g/l、约1.5g/l至约11.5g/l或约2g/l至约10g/l培养基。在一些实施方案中，培养基包含以下量的葡萄糖：约1g/l、2g/l、3g/l或4g/l至约5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l、11g/l或12g/l，或者约1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l或6g/l至约7g/l、8g/l、9g/l、10g/l、11g/l或12g/l。在一些实施方案中，培养基包含以下量的丙酮酸：约5g/l至约15g/l培养基，例如约5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、14g/l或15g/l或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的丙酮酸：约5g/l至约14.5g/l、约10g/l至约15g/l、约7.5g/l至约10.5g/l、约5.5g/l至约14.5g/l或约8g/l至约10g/l培养基。在一些实施方案中，培养基包含以下量的丙酮酸：约5g/l、6g/l、7g/l或8g/l至约9g/l、10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、14g/l或15g/l，或者约5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l或10g/l至约11g/l、12g/l、13g/l、14g/l或15g/l。
[0116]
在一些实施方案中，培养基包含以下量的化学缓冲系统：约1g/l至约4g/l培养基(例如，约1g/l、1.5g/l、2g/l、2.5g/l、3g/l、3.5g/l或4g/l或其中的任何值或范围)或约10mm至约25mm(例如，约10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm或25mm或其中的任何值或范围)。在一些实施方案中，化学缓冲系统包括但不限于碳酸氢钠和/或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)。例如，在一些实施方案中，培养基包含以下量的碳酸氢钠：约1g/l至约4g/l培养基，例如约1g/l、1.5g/l、2g/l、2.5g/l、3g/l、3.5g/l或4g/l或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的碳酸氢钠：约1g/l至约3.75g/l、约1.25g/l至约4g/l、约2.5g/l至约3g/l、约1.5g/l至约4g/l或约2g/l至约3.5g/l培养基。在一些实施方案中，培养基包含以下量的hepes：约10mm至约25mm，例如约10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm或25mm或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下
量的hepes：约11mm至约25mm、约10mm至约20mm、约12.5mm至约22.5mm、约15mm至约20.75mm或约10mm至约20mm。
[0117]
在一些实施方案中，培养基包含以下量的一种或更多种必需氨基酸：约0.5mm至约5mm(例如，约0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm或其中的任何值或范围)或约0.5mm、1mm、1.5mm、2mm至约2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm。在一些实施方案中，一种或更多种必需氨基酸是组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸和/或精氨酸。例如，在一些实施方案中，培养基包含以下量的精氨酸：约0.5mm至约5mm，例如约0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的必需氨基酸：约0.5mm至约4.75mm、约2mm至约3.5mm、约0.5mm至约3.5mm、约1mm至约5mm或约3.5mm至约5mm。
[0118]
在一些实施方案中，培养基包含以下量的一种或更多种维生素和/或辅因子：约0.01μm至约50μm(例如，约0.01μm、0.02μm、0.03μm、0.04μm、0.05μm、0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、12.5μm、15μm、17.5μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、46μm、47μm、48μm、49μm、49.025μm、49.05μm、49.075μm或50μm或其中的任何值或范围)或约0.01μm、0.02μm、0.03μm、0.04μm、0.05μm、0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm或0.9μm至约1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm或者约0.02μm、0.025μm、0.05μm、0.075μm、1μm、1.5μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm至约12.5μm、15μm、17.5μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、46μm、47μm、48μm、49μm、49.025μm、49.05μm、49.075μm或50μm。在一些实施方案中，一种或更多种维生素和/或辅因子包括但不限于硫胺素和/或核黄素。例如，在一些实施方案中，培养基包含以下量的硫胺素：约0.025μm至约50μm，例如约0.025μm、0.05μm、0.075μm、1μm、1.5μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、12.5μm、15μm、17.5μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、46μm、47μm、48μm、49μm、49.025μm、49.05μm、49.075μm或50μm或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的硫胺素：约0.025μm至约45.075μm、约1μm至约40μm、约5μm至约35.075μm、约10μm至约50μm或约0.05μm至约45.5μm。在一些实施方案中，培养基包含以下量的核黄素：约0.01μm至约3μm，例如约0.01μm、0.02μm、0.03μm、0.04μm、0.05μm、0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm或3μm或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的核黄素：约0.01μm至约2.05μm、约1μm至约2.95μm、约0.05μm至约3μm、约0.08μm至约1.55μm或约0.05μm至约2.9μm。
[0119]
在一些实施方案中，培养基包含以下量的一种或更多种无机盐：约100mg/l至约150mg/l培养基(例如，约100mg/l、105mg/l、110mg/l、115mg/l、120mg/l、125mg/l、130mg/l、135mg/l、140mg/l、145mg/l或150mg/l或其中的任何值或范围)或约100mg/l至约150mg/l培养基(例如，约100mg/l、105mg/l、110mg/l、115mg/l、120mg/l、125mg/l、130mg/l、135mg/l、140mg/l、145mg/l或150mg/l或其中的任何值或范围)。在一些实施方案中，一种或更多种无
机盐包括但不限于钙和/或镁。例如，在一些实施方案中，培养基包含以下量的钙：约100mg/l至约150mg/l培养基，例如，约100mg/l、105mg/l、110mg/l、115mg/l、120mg/l、125mg/l、130mg/l、135mg/l、140mg/l、145mg/l或150mg/l或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的精氨酸：约100mg/l至约125mg/l、约105mg/l至约150mg/l、约120mg/l至约130mg/l或约100mg/l至约145mg/l培养基。在一些实施方案中，培养基包含以下量的镁：约0.01mm至约1mm，例如约0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、0.91mm、0.92mm、0.93mm、0.94mm、0.95mm、0.96mm、0.97mm、0.98mm、0.99mm或1mm或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的镁：约0.05mm至约1mm、约0.01mm至约0.78mm、约0.5mm至约1mm、约0.03mm至约0.75mm或约0.25mm至约0.95mm。
[0120]
在一些实施方案中，培养基包含以下量的碳源：约1g/l至约15g/l培养基(例如，约1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、14g/l或15g/l或其中的任何值或范围)，或约1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l或6g/l至约7g/l、8g/l、9g/l或10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、14g/l或15g/l培养基。在一些实施方案中，碳源包括但不限于葡萄糖和/或丙酮酸。例如，在一些实施方案中，培养基包含以下量的葡萄糖：约1g/l至约12g/l培养基，例如约1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l、11g/l或12g/l或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的葡萄糖：约1g/l至约6g/l、约4g/l至约12g/l、约2.5g/l至约10.5g/l、约1.5g/l至约11.5g/l或约2g/l至约10g/l培养基。在一些实施方案中，培养基包含以下量的丙酮酸：约5g/l至约15g/l培养基，例如，约5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、14g/l或15g/l或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的丙酮酸：约5g/l至约14.5g/l、约10g/l至约15g/l、约7.5g/l至约10.5g/l、约5.5g/l至约14.5g/l或约8g/l至约10g/l培养基。
[0121]
在一些实施方案中，培养基包含以下量的化学缓冲系统：约1g/l至约4g/l培养基(例如，约1g/l、1.5g/l、2g/l、2.5g/l、3g/l、3.5g/l或4g/l或其中的任何值或范围)或约10mm至约25mm(例如，约10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm或25mm或其中的任何值或范围)。在一些实施方案中，化学缓冲系统包括但不限于碳酸氢钠和/或hepes。例如，在一些实施方案中，培养基包含以下量的碳酸氢钠：约1g/l至约4g/l培养基，例如约1g/l、1.5g/l、2g/l、2.5g/l、3g/l、3.5g/l或4g/l或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的碳酸氢钠：约1g/l至约3.75g/l、约1.25g/l至约4g/l、约2.5g/l至约3g/l、约1.5g/l至约4g/l或约2g/l至约3.5g/l培养基。在一些实施方案中，培养基包含以下量的hepes：约10mm至约25mm，例如约10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、21mm、22mm、23mm、24mm或25mm或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的hepes：约1mm至约25mm、约10mm至约20mm、约12.5mm至约22.5mm、约15mm至约20.75mm或约10mm至约20mm。
[0122]
在一些实施方案中，培养基包含以下量的一种或更多种必需氨基酸：约0.5mm至约5mm(例如，约0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm或其中的任何值或范围)或约0.5mm、1mm、1.5mm、2mm至约2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm。在一些实施方案中，一种或更多种必需氨基酸是精氨酸和/或半胱氨酸。例如，在一些实施方案中，培养基包
含以下量的精氨酸：约0.5mm至约5mm，例如约0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的精氨酸：约0.5mm至约4.75mm、约2mm至约3.5mm、约0.5mm至约3.5mm、约1mm至约5mm或约3.5mm至约5mm。例如，在一些实施方案中，培养基包含以下量的半胱氨酸：约0.5mm至约5mm，例如约0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的半胱氨酸：约0.5mm至约4.75mm、约2mm至约3.5mm、约0.5mm至约3.5mm、约1mm至约5mm或约3.5mm至约5mm。
[0123]
在一些实施方案中，培养基包含以下量的一种或更多种维生素和/或辅因子：约0.01μm至约50μm(例如，约0.01μm、0.02μm、0.03μm、0.04μm、0.05μm、0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、12.5μm、15μm、17.5μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、46μm、47μm、48μm、49μm、49.025μm、49.05μm、49.075μm或50μm或其中的任何值或范围)或约0.01μm、0.02μm、0.03μm、0.04μm、0.05μm、0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm或0.9μm至约1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm、3μm、4μm、5μm、6μm或约0.02μm、0.025μm、0.05μm、0.075μm、1μm、1.5μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm至约12.5μm、15μm、17.5μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、46μm、47μm、48μm、49μm、49.025μm、49.05μm、49.075μm或50μm。在一些实施方案中，一种或更多种维生素和/或辅因子包括但不限于硫胺素和/或核黄素。例如，在一些实施方案中，培养基包含以下量的硫胺素：约0.025μm至约50μm，例如0.025μm、0.05μm、0.075μm、1μm、1.5μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、12.5μm、15μm、17.5μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、46μm、47μm、48μm、49μm、49.025μm、49.05μm、49.075μm或50μm或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的硫胺素：约0.025μm至约45.075μm、约1μm至约40μm、约5μm至约35.075μm、约10μm至约50μm或约0.05μm至约45.5μm。在一些实施方案中，培养基包含以下量的核黄素：约0.01μm至约3μm，例如0.01μm、0.02μm、0.03μm、0.04μm、0.05μm、0.06μm、0.07μm、0.08μm、0.09μm、0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm、1μm、1.1μm、1.2μm、1.3μm、1.4μm、1.5μm、1.6μm、1.7μm、1.8μm、1.9μm、2μm、2.1μm、2.2μm、2.3μm、2.4μm、2.5μm、2.6μm、2.7μm、2.8μm、2.9μm或3μm或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的核黄素：约0.01μm至约2.05μm、约1μm至约2.95μm、约0.05μm至约3μm、约0.08μm至约1.55μm或约0.05μm至约2.9μm。
[0124]
在一些实施方案中，培养基包含以下量的一种或更多种无机盐：约100mg/l至约150mg/l培养基(例如，约100mg/l、105mg/l、110mg/l、115mg/l、120mg/l、125mg/l、130mg/l、135mg/l、140mg/l、145mg/l或150mg/l或其中的任何值或范围)或约100mg/l至约150mg/l培养基(例如，约100mg/l、105mg/l、110mg/l、115mg/l、120mg/l、125mg/l、130mg/l、135mg/l、140mg/l、145mg/l或150mg/l或其中的任何值或范围)。在一些实施方案中，示例性的一种或更多种无机盐是钙和/或镁。例如，在一些实施方案中，培养基包含以下量的钙：约100mg/l至约150mg/l培养基，例如，约100mg/l、105mg/l、110mg/l、115mg/l、120mg/l、125mg/l、130mg/l、135mg/l、140mg/l、145mg/l或150mg/l或其中的任何值或范围。在一些实施方案
中，培养基包含以下量的精氨酸：约100mg/l至约125mg/l、约105mg/l至约150mg/l、约120mg/l至约130mg/l或约100mg/l至约145mg/l培养基。在一些实施方案中，培养基包含以下量的镁：约0.01mm至约1mm，例如约0.01mm、0.02mm、0.03mm、0.04mm、0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm、0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、0.91mm、0.92mm、0.93mm、0.94mm、0.95mm、0.96mm、0.97mm、0.98mm、0.99mm或1mm或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的镁：约0.05mm至约1mm、约0.01mm至约0.78mm、约0.5mm至约1mm、约0.03mm至约0.75mm或约0.25mm至约0.95mm。
[0125]
在一些实施方案中，碳源、化学缓冲系统、一种或更多种必需氨基酸、一种或更多种维生素和/或辅因子和/或一种或更多种无机盐是食品级。
[0126]
在一些实施方案中，培养基是催乳培养基，例如，培养基还包含催乳素(例如，哺乳动物催乳素，例如，人类催乳素)。例如，在一些实施方案中，培养基包含以下量的催乳素(或催乳素以以下量被添加)：约20ng/ml至约200ng/l培养基，例如约20ng/ml、30ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、110ng/ml、120ng/ml、130ng/ml、140ng/ml、150ng/ml、160ng/ml、170ng/ml、180ng/ml、190ng/ml或200ng/ml或其中的任何值或范围。在一些实施方案中，培养基包含以下量的催乳素(或催乳素以以下量被添加)：约20ng/ml至约195ng/ml、约50ng/ml至约150ng/ml、约25ng/ml至约175ng/ml、约45ng/ml至约200ng/ml或约75ng/ml至约190ng/ml培养基。在一些实施方案中，方法还包括向培养基添加催乳素，从而提供催乳培养基。在一些实施方案中，催乳素由表达重组催乳素(例如，包含用天冬氨酸对催乳素基因的位置179处的丝氨酸残基进行的取代(s179d)的催乳素，例如，s179d-催乳素)的微生物细胞和/或人类细胞产生。在一些实施方案中，向培养基添加催乳素包括通过培养表达和分泌催乳素的细胞来调节(conditioning)培养基，并且将包含催乳素的调节培养基施加到原代乳腺上皮细胞的单层的基表面、混合群体的单层的基表面或活的永生化乳腺上皮细胞的单层的基表面。
[0127]
在一些实施方案中，培养基还包含提高效率的其他因子，包括但不限于胰岛素、表皮生长因子和/或氢化可的松。在一些实施方案中，本发明的方法还包括向培养基添加其他因子(例如，胰岛素、表皮生长因子和/或氢化可的松)，例如，以提高效率。
[0128]
生产培养乳制品的方法
[0129]
在某些实施方案中，本文公开了制造培养乳制品的方法。在一些实施方案中，方法包括在包含基区室和顶区室的生物反应器中培养本文公开的活细胞构建体，其中基区室包含培养基，并且乳腺细胞将培养乳制品分泌到顶区室中。
[0130]
在一些实施方案中，活细胞构建体包括含有上表面和下表面的支架以及具有顶表面和基表面的活的原代乳腺上皮细胞的极化的单层，活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体的连续的极化的单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续的极化的单层，其中活的原代乳腺上皮细胞的连续的极化的单层，活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体的连续的极化的单层和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续的极化的单层位于支架的上表面。
[0131]
在一些实施方案中，支架的下表面邻近基区室。在一些实施方案中，活的原代乳腺上皮细胞的连续的极化的单层，活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体的连续的极化的单层和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续的极化的单层的顶表
面邻近顶区室。在一些实施方案中，活的原代上皮乳腺细胞的连续的极化的单层，活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体的连续的极化的单层的活的原代上皮乳腺细胞，或永生化乳腺上皮细胞的连续的极化的单层通过其顶表面分泌乳到顶区室中，从而在培养物中生产乳。
[0132]
在一些实施方案中，上皮乳腺细胞的极化的单层形成将顶区室和基区室分隔的屏障，其中乳腺细胞的基表面附着到支架，并且顶表面朝向顶区室定向。
[0133]
在一些实施方案中，基区室邻近支架的下表面。在一些实施方案中，基区室包含与乳腺上皮细胞的极化的单层(例如，原代乳腺上皮细胞的极化的单层、混合群体的极化的单层或活的永生化乳腺上皮细胞的极化的单层)的基表面流体地接触的培养基。
[0134]
在一些实施方案中，培养基包含碳源、化学缓冲系统、一种或更多种必需氨基酸、一种或更多种维生素和/或辅因子以及一种或更多种无机盐。
[0135]
在一些实施方案中，生物反应器包括与单层的顶表面相邻的顶区室。在一些实施方案中，顶区室邻近支架的上表面。
[0136]
在一些实施方案中，生物反应器中乳腺细胞的总细胞密度为至少10
11
个乳腺细胞。在一些实施方案中，生物反应器中乳腺细胞的总细胞密度为至少10
12
个乳腺细胞。在一些实施方案中，生物反应器中乳腺细胞的总细胞密度为至少10
13
个乳腺细胞。
[0137]
在一些实施方案中，生物反应器中乳腺细胞的总细胞密度为每100μm2约20个至55个细胞。在一些实施方案中，生物反应器中乳腺细胞的总细胞密度为每100μm2约20个细胞。在一些实施方案中，生物反应器中乳腺细胞的总细胞密度为每100μm
2 25个细胞。在一些实施方案中，生物反应器中乳腺细胞的总细胞密度为每100μm2约30个细胞。在一些实施方案中，生物反应器中乳腺细胞的总细胞密度为每100μm2约35个细胞。在一些实施方案中，生物反应器中乳腺细胞的总细胞密度为每100μm2约40个细胞。在一些实施方案中，生物反应器中乳腺细胞的总细胞密度为每100μm2约45个细胞。在一些实施方案中，生物反应器中乳腺细胞的总细胞密度为每100μm2约50个细胞。在一些实施方案中，生物反应器中乳腺细胞的总细胞密度为每100μm2约55个细胞。
[0138]
在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少约1.5m2。在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少约2m2。在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少约2.5m2。在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少约3m2。在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少约4m2。在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少约5m2。在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少约10m2。在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少约15m2。在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少约20m2。在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总表面积至少约25m2。在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少约50m2。在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少约100m2。在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少约250m2。在一些实施方案中，生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少约500m2。
[0139]
在一些实施方案中，生物反应器保持约27℃至约39℃的温度(例如，约27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、
38.5℃或约39℃，或其中的任何值或范围的温度，例如，约27℃至约38℃、约36℃至约39℃、约36.5℃至约39℃、约36.5℃至约37.5℃或约36.5℃至约38℃)。在一些实施方案中，生物反应器保持约37℃的温度。
[0140]
在一些实施方案中，生物反应器具有约4％至约6％的co2的大气浓度，例如，约4％、4.25％、4.5％、4.75％、5％、5.25％、5.5％、5.75％或6％或其中的任何值或范围的co2的大气浓度，例如约4％至约5.5％、约4.5％至约6％、约4.5％至约5.5％或约5％至约6％。在一些实施方案中，生物反应器具有约5％的co2的大气浓度。
[0141]
在一些实施方案中，生物反应器具有约4％至约6％的co2的大气浓度，例如，约4％、4.25％、4.5％、4.75％、5％、5.25％、5.5％、5.75％或6％或其中的任何值或范围的co2的大气浓度，例如约4％至约5.5％、约4.5％至约6％、约4.5％至约5.5％或约5％至约6％。在一些实施方案中，生物反应器具有约5％的co2的大气浓度。
[0142]
在一些实施方案中，方法包括监测溶解的o2和co2的浓度。在一些实施方案中，溶解的o2的浓度保持在约10％至约25％之间或其中的任何值或范围(例如，约10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％)。例如，在一些实施方案中，溶解的o2的浓度保持在约12％至约25％、约15％至约22％、约10％至约20％之间，约15％、约20％或约22％。在一些实施方案中，co2的浓度保持在约4％至约6％之间，例如约4％、4.25％、4.5％、4.75％、5％、5.25％、5.5％、5.75％或6％或其中的任何值或范围的co2浓度，例如约4％至约5.5％、约4.5％至约6％、约4.5％至约5.5％或约5％至约6％。在一些实施方案中，co2的浓度保持在约5％。
[0143]
在一些实施方案中，培养基约每天至约每10天(例如，每1天、每2天、每3天、每4天、每5天、每6天、每7天、每8天、每9天、每10天，或其中的任何值或范围，例如，约每天至每3天、约每3天至每10天、约每2天至每5天)更换。在一些实施方案中，培养基约每天或约每几小时至约每10天，例如约每1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时至约每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天或其中的任何值或范围更换。例如，在一些实施方案中，培养基约每12小时至约每10天、约每10小时至约每5天更换或者约每5小时至约每3天更换。
[0144]
在一些实施方案中，方法包括监测培养基中和/或催乳培养基中的葡萄糖浓度和/或葡萄糖消耗速率。在一些实施方案中，当培养基中葡萄糖消耗速率为稳态时添加催乳素。
[0145]
在一些实施方案中，方法还包括应用跨上皮电阻(teer)来测量上皮细胞单层的维持。teer测量在两个区室(例如，在顶区室和基区室之间)中的流体(例如，培养基)之间的电压差，其中如果区室之间的屏障失去完整性，则两个区室中的流体可以混合。当有流体混合时，电压差会减小或消除；电压差指示屏障是完整的。在一些实施方案中，当通过teer检测到电压损失时，支架(例如，过滤器、微结构化生物反应器、脱细胞的组织、中空纤维生物反应器等)用另外的细胞重新接种，并且允许在恢复培养乳制品的生产(例如乳生产)之前有时间重新建立屏障(例如单层)。
[0146]
在一些实施方案中，方法还包括从顶区室收集培养乳制品以生产收集的培养乳制品。在一些实施方案中，经由端口、经由重力和/或经由真空收集。在一些实施方案中，将真空附接到端口。
[0147]
在一些实施方案中，方法还包括冷冻收集的培养乳制品以生产冷冻的培养乳制品，和/或冻干收集的培养乳制品以生产冻干的培养乳制品。
[0148]
在一些实施方案中，方法还包括将收集的培养乳制品、冷冻的培养乳制品和/或冻干的培养乳制品包装到容器中。
[0149]
在一些实施方案中，方法还包括从收集的培养乳制品提取一种或更多种组分。来自收集的培养乳制品的组分的非限制性实例包括乳蛋白、脂质、碳水化合物、维生素和/或矿物质内容物。在一些实施方案中，来自收集的培养乳制品的组分被冻干和/或浓缩以生产冻干的或浓缩的培养乳制品组分产品。在一些实施方案中，通过例如膜过滤和/或反相渗透浓缩来自收集的培养乳制品的组分。在一些实施方案中，将冻干的或浓缩的培养乳制品组分产品包装在容器中，任选地其中容器是无菌的和/或食品级容器。在一些实施方案中，容器是真空密封的。在一些实施方案中，容器是罐、半开容器(ajar)、瓶、袋、盒或小袋(pouch)。
[0150]
培养乳制品
[0151]
在某些实施方案中，本文公开了培养乳制品。在一些实施方案中，培养乳制品是标准化的、无菌的培养乳制品。在一些实施方案中，培养乳制品用于营养用途。
[0152]
在一些实施方案中，培养乳制品通过本文公开的任何方法生产。
[0153]
母乳含有低但可测量浓度的环境污染物、在环境中广泛传播的来自工业的有害健康的化学物质和制造产品。环境污染物部分地分泌在母乳中。母乳中的污染物水平反映了母亲体内的污染物水平，并且因此非常理想地用于监测暴露水平。有毒的环境污染物可以通过母乳喂养从母亲传给婴儿。持久性有机污染物(pop)是一类亲脂性的稳定化学物质，其在脂肪组织中生物积累，并且产生持久的有毒身体负担。母乳喂养是人类生命早期暴露于pop的重要来源，其影响是未知的。
[0154]
在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含一种或更多种环境污染物。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含有持久性有机污染物(pop)。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含多氯二苯并对二噁英(polychlorinated dibenzo-p-dioxins,pcdd)、多氯二苯并呋喃(pcdf)、多氯联苯(pcb)和杀虫剂诸如ddt。
[0155]
重金属，诸如汞、铅、砷、镉、镍、铬、钴、锌和分散在整个环境中的其他潜在有毒金属，也具有已知在人乳中积累的生物积累特征，并且因此对乳儿(nursing infant)来说是令人担忧的。母乳中的金属来源于外源性来源，即经由污染的空气、食物和饮用水摄取，并且与必需微量元素一起内源性释放。例如，铅和汞在人类食物链中同等地扩散，并且它们对胎儿发育的影响在很大程度上由母亲的饮食和营养状态决定。暴露于有毒金属具有重大的公众健康影响，即使在低浓度和急性暴露下，这些金属对人类仍然有毒。乳儿可能在最易感的时期暴露于有毒金属。乳儿可能通过母乳暴露于超过他们应该接触的重金属，并且暴露可能对婴儿有健康影响。尤其是对于婴儿，这些暴露可能会对发育中的中枢神经系统产生不良影响，对他们的认知能力留下终生缺陷。
[0156]
在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含一种或更多种重金属，诸如砷、铅、镉、镍、汞、铬、钴和锌。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含砷。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含铅。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含镉。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含镍。在一些实施方案
中，培养乳制品不包含或基本上不含汞。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含铬。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含钴。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含锌。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含砷、铅、镉、镍、汞、铬、钴和锌。
[0157]
外来的过敏蛋白可能难以与内源性人类乳蛋白区分。已在人乳中检测到具有致敏潜力的食物蛋白包括鸡蛋和花生蛋白。在美国，有八种主要的食物过敏原，被称为八大过敏原(the big 8)，它们是造成大多数严重食物过敏反应的原因。八大过敏原列表包括乳过敏原、蛋过敏原、鱼过敏原、甲壳类贝类过敏原、树坚果过敏原、花生过敏原、小麦过敏原和大豆过敏原。已知导致蛋过敏的蛋白包括卵类黏蛋白、卵清蛋白和伴清蛋白。花生蛋白包括花生球蛋白6(arachin 6)、花生球蛋白3、花生伴球蛋白(conarachin)、主要过敏原arah1和花生球蛋白arah2。作为母亲膳食蛋白向乳运输的一个实例，已经表明，与不吃蛋的母亲相比，每天吃一个蛋会导致人乳中更高的鸡蛋过敏原卵清蛋白(ova)浓度。
[0158]
在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含一种或更多种食物过敏原。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含蛋过敏原、鱼过敏原、甲壳类贝类过敏原、树坚果过敏原、花生过敏原、小麦过敏原和大豆过敏原。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含蛋过敏原。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含鱼过敏原。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含甲壳类过敏原。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含树坚果过敏原。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含花生过敏原。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含小麦过敏原。在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含大豆过敏原。
[0159]
在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含花生球蛋白6、花生球蛋白3、花生伴球蛋白、arah1和arah2。
[0160]
在一些实施方案中，培养乳制品不包含或基本上不含卵清蛋白(ova)。
[0161]
在描述了本发明之后，将在以下实施例中更详细地解释本发明，这些实施例包括在本文中仅用于说明目的，并且不旨在限制本发明。
实施例
[0162]
实施例1：
[0163]
设计用于收集乳的细胞培养系统应该支持产物的区室化分泌，使得乳不会暴露于给细胞提供营养物的培养基。在体内，产乳的上皮细胞衬覆在乳腺的内表面作为连续单层。单层被定向为使得基表面附着至下面的基膜，而乳从顶表面分泌并储存在腺体或泡的腔区室(luminal compartment)中，直到其在挤乳或喂食期间被取出。沿着细胞的侧表面的紧密连接确保了下面的组织和位于泡区室中的乳之间的屏障。因此，在体内，乳腺的组织被布置为使得乳分泌是区室化的，乳腺上皮细胞本身建立界面并且维持定向的营养物吸收和乳分泌。
[0164]
本公开内容描述了重演乳腺的区室化能力的细胞培养装置，其用于从身体之外生长的乳腺上皮细胞收集乳。这样的装置可以包括支架以支持乳腺细胞在两个区室之间的界面处的增殖，使得上皮单层在营养物培养基和分泌的乳之间提供物理边界。除了提供用于生长的表面，支架还提供了指导细胞的极化的空间信号并且确保了吸收和分泌的方向性。
本发明描述了在区室化细胞培养装置中的乳腺上皮细胞的制备、培养和刺激，用于生产和收集用于营养用途的乳(参见例如，图1)。
[0165]
乳腺上皮细胞的制备。乳腺上皮细胞从解剖的乳腺组织(例如，乳腺、乳房、乳头)的外科手术外植体、活组织检查样品或原始母乳获得。通常，在乳腺组织的外科手术解剖之后，在无菌条件下手动去除任何脂肪或基质组织，并用在化学上确定的营养物培养基中制备的胶原酶和/或透明质酸酶酶消化乳腺的剩余组织，该营养物培养基应由“公认安全”(gras)的成分组成。样品保持在37℃伴有温和搅拌。消化后，通过离心或通过将样品倾倒通过无菌尼龙细胞过滤器，收集单细胞或类器官(organoids)的悬浮液。然后将细胞悬浮液转移到包被有适当的细胞外基质组分(例如，胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白)的组织培养板中。
[0166]
替代地，外植体样本可以加工成小块，例如通过用无菌手术刀切碎。将组织块铺板到合适的表面上，诸如包被有适当的细胞外基质的明胶海绵或塑料组织培养板。
[0167]
铺板的细胞在具有5％co2气氛的加湿培养箱中保持在37℃。在孵育期间，大约每1天至3天更换培养基，并将细胞进行传代培养，直到实现用于进行后续处理的足够的活细胞数，其包括制备用于在液氮中储存；通过稳定转染基因诸如sv40、tert或与衰老相关的其他基因来开发永生化细胞系；通过例如荧光激活细胞分选分离乳腺上皮细胞、肌上皮细胞和干/祖细胞类型；和/或引入到用于生产和收集供人类消耗的乳的区室化组织培养装置中。
[0168]
用于乳生产的乳腺上皮细胞的培养。用于营养用途的乳由如上文所描述地分离并且以支持区室化分泌从而保持营养物培养基和产物之间的分离的形式培养的乳腺上皮细胞产生。系统依赖于乳腺上皮细胞在接种到定位于顶区室和基区室之间的界面处的适当支架上时建立具有适当的顶-基极性的连续单层的能力，乳分泌到所述顶区室中，并且营养物培养基通过基区室提供(参见例如，图2)。例如，放置在组织培养板中的过滤器，以及基于中空纤维或微结构化支架的生物反应器，被用于支持这些特征。
[0169]
在乳腺上皮细胞的分离和扩增之后，将细胞悬浮在由食品级组分组成的化学上确定的营养物培养基中，并且接种到预包被有细胞外基质蛋白(诸如胶原蛋白、层粘连蛋白和/或纤连蛋白)的混合物的培养装置中。细胞培养装置是允许从极化的、汇合的上皮单层中区室化地吸收营养物和分泌产物的任何设计。实例包括中空纤维和微结构化支架生物反应器(分别参见例如，图3和图4)。替代方案包括其他三维组织培养方法，诸如制备脱细胞的乳腺作为支架，用干细胞重新填充以在体外产生功能性器官，或从生长在水凝胶基质或悬浮液中的乳腺上皮细胞类器官或“乳腺球”的腔收集乳。
[0170]
装置包括在约5％co2的加湿气氛中保持约37℃的温度的密封外壳。当细胞在生物反应器内增殖时，监测葡萄糖摄取以评估培养物的生长。葡萄糖消耗的稳定化指示细胞已达到汇合、接触抑制状态。使用跨上皮电阻确保单层的完整性。传感器在多个位置监测培养基中溶解的o2和co2的浓度。计算机化的泵使培养基通过生物反应器以平衡营养物的输送与代谢废弃物诸如氨和乳酸的去除的速率循环。在使用乳酸补充和适应技术(freund等人2018int j mol sci.19(2))或通过穿过填充沸石(packed zeolite)的室去除废弃物后，培养基可以通过系统回收。
[0171]
乳生产的刺激。在体内和在培养的乳腺上皮细胞中，乳的产生和分泌受到催乳素的刺激。在培养物中，催乳素可以在营养物培养基中以接近于泌乳期间在体内观察到的那
些浓度的浓度例如约20ng/ml至约200ng/ml从外源供应。纯化的催乳素可以商业化获得；然而，提供催乳素或刺激泌乳的替代方法被使用，包括从微生物或哺乳动物细胞培养物表达和纯化重组蛋白。替代地，通过培养表达和分泌催乳素的细胞制备的条件培养基可以应用于乳腺上皮细胞培养物以刺激泌乳。可以串联设置生物反应器，使得通过表达催乳素的细胞的培养物或其他关键培养基补充物的培养基在暴露于如所述的区室化培养装置中生长的乳腺细胞之前被调节。
[0172]
上调乳生产和/或避免使用外源性催乳素的其他方法包括对受催乳素与其在乳腺上皮细胞表面上的受体的结合调节的信号途径进行的分子操纵，诸如以下：(a)靶向催乳素翻译后修饰的构建体的表达；(b)催乳素受体的替代同种型的表达；(c)嵌合催乳素受体的表达，其中细胞外结构域与不同配体的结合位点交换；(d)引入编码有组成性或条件性活性的催乳素受体或其下游效应物诸如stat5或akt的修饰形式的基因；(e)per2昼夜节律基因的敲除或修饰；和/或(f)旨在提高乳腺上皮单层的基表面处的营养物摄取速率的分子方法。
[0173]
乳的收集。通过例如安装在培养装置的顶区室中的端口连续地或间隔地收集分泌的乳。将真空应用于端口以促进收集，并且也有助于刺激进一步的生产。收集的乳被包装到无菌容器中并且密封以供分配，冷冻或冻干以进行储存，或加工以提取特定组分。
[0174]
本发明提供用于生产用于营养用途的乳的乳腺上皮细胞培养物。除人类母乳外，这种方法还可用于从其他哺乳动物物种生产乳，例如用于人类食用或兽医学使用。由于以前不可能在体外生产乳，这项技术除了为现有产品提供替代的生产模式之外，还可能产生新的商业机会。这项技术的商业化开发的社会和经济效应是广泛而深远的。从培养的细胞生产人类母乳可以提供一种手段来解决在食物短缺社区的婴儿营养不良，为无法母乳喂养的早产儿提供必需的营养物，并且为母亲们提供一种喂养她们的婴儿的新选择，该选择以婴儿配方乳粉的便利提供最佳营养。牛乳或山羊乳的生产为减少畜牧业对环境、社会和动物福利的影响提供了机会。这里描述的方法解决了细胞农业的新兴领域的一个重要空白，并引入了一个机会以在不损害我们对最基本营养来源的生物和文化依附的情况下大幅更新人类食物供应。
[0175]
前述实施例说明了本发明且不应被解释为是对其的限制。尽管已经参考优选实施方案详细描述了本发明，但在如所附权利要求书中描述和限定的本发明的范围和精神内存在变化形式和修改。
技术特征：1.一种活细胞构建体，所述活细胞构建体包括：(a)三维支架，所述三维支架具有外表面、限定内腔/基室的内表面和从所述内表面延伸到所述外表面的多于一个孔；(b)基质材料，所述基质材料设置在所述三维支架的外表面上；(c)培养基，所述培养基设置在所述内腔/基室内并与所述内表面流体地接触；和(d)设置在所述基质材料上的至少70％汇合的极化的乳腺细胞的单层，其中所述乳腺细胞选自由以下组成的组：活的原代乳腺上皮细胞、活的乳腺肌上皮细胞、活的乳腺祖细胞、活的永生化乳腺上皮细胞、活的永生化乳腺肌上皮细胞和活的永生化乳腺祖细胞。2.根据权利要求1所述的活细胞构建体，其中所述极化的乳腺细胞包括顶表面和基表面。3.根据权利要求2所述的活细胞构建体，其中所述乳腺细胞的基表面与所述培养基流体地接触。4.根据权利要求1所述的活细胞构建体，其中所述乳腺细胞中的至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％以相同方向极化。5.根据权利要求1所述的活细胞构建体，其中所述极化的乳腺细胞的单层是至少70％汇合、至少80％汇合、至少90％汇合、至少95％汇合、至少99％汇合或100％汇合。6.根据权利要求1所述的活细胞构建体，其中所述乳腺细胞包括有组成性活性的催乳素受体蛋白。7.根据权利要求1所述的活细胞构建体，其中所述培养基包含碳源、化学缓冲系统、一种或更多种必需氨基酸、一种或更多种维生素和/或辅因子以及一种或更多种无机盐。8.根据权利要求7所述的活细胞构建体，其中所述培养基还包含催乳素。9.根据权利要求1所述的活细胞构建体，其中所述基质材料包括一种或更多种细胞外基质蛋白。10.根据权利要求1所述的活细胞构建体，其中所述三维支架包括天然聚合物、生物相容性合成聚合物、合成肽、源自前述中的任一种的复合物或其任何组合。11.根据权利要求10所述的活细胞构建体，其中所述天然聚合物是胶原蛋白、壳聚糖、纤维素、琼脂糖、褐藻胶、明胶、弹性蛋白、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和/或透明质酸。12.根据权利要求10所述的活细胞构建体，其中所述生物相容性合成聚合物是聚砜、聚偏氟乙烯、聚乙烯共醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸酯聚合物和/或聚乙二醇。13.一种从乳腺细胞生产分离的培养乳制品的方法，所述方法包括：(a)在生物反应器中在生产所述培养乳制品的条件下培养活细胞构建体，所述活细胞构建体包括：(i)三维支架，所述三维支架具有外表面、限定内腔/基室的内表面和从所述内表面延伸到所述外表面的多于一个孔；(ii)基质材料，所述基质材料设置在所述三维支架的外表面上；(iii)培养基，所述培养基设置在所述内腔/基室内并与所述内表面流体地接触；和(iv)设置在基质材料上的至少70％汇合的极化的乳腺细胞的单层，其中所述乳腺细胞选自由以下组成的组：活的原代乳腺上皮细胞、活的乳腺肌上皮细胞、活的乳腺祖细胞、活
的永生化乳腺上皮细胞、活的永生化乳腺肌上皮细胞和活的永生化乳腺祖细胞；以及(b)分离所述培养乳制品。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述极化的乳腺细胞包括顶表面和基表面。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述乳腺细胞的基表面与所述培养基流体地接触。16.根据权利要求13所述的方法，其中所述生物反应器是封闭的生物反应器。17.根据权利要求14所述的方法，其中所述生物反应器包括基本上与所述活细胞构建体的内腔/基室分离的顶区室。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述顶区室与所述乳腺细胞的顶表面流体地接触。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述培养乳制品从所述乳腺细胞的顶表面分泌到所述顶区室中。20.根据权利要求17所述的方法，其中所述培养基基本上不接触所述培养乳制品。21.根据权利要求13所述的方法，其中所述生物反应器内乳腺细胞的总细胞密度为至少10
11
。22.根据权利要求13所述的方法，其中所述生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少1.5m2。23.根据权利要求13所述的方法，其中所述培养基包含碳源、化学缓冲系统、一种或更多种必需氨基酸、一种或更多种维生素和/或辅因子以及一种或更多种无机盐。24.根据权利要求13所述的方法，其中所述基质材料包括一种或更多种细胞外基质蛋白。25.根据权利要求13所述的方法，其中所述支架包括天然聚合物、生物相容性合成聚合物、合成肽、源自前述中的任一种的复合物或其任何组合。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述天然聚合物是胶原蛋白、壳聚糖、纤维素、琼脂糖、褐藻胶、明胶、弹性蛋白、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素和/或透明质酸。27.根据权利要求25所述的方法，其中所述生物相容性合成聚合物是聚砜、聚偏氟乙烯、聚乙烯共醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸酯聚合物和/或聚乙二醇。28.根据权利要求13所述的方法，其中所述培养在约27℃至约39℃的温度进行。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述培养在约30℃至约37℃的温度进行。30.根据权利要求13所述的方法，其中所述培养在约4％至约6％的co2的大气浓度进行。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述培养在约5％的co2的大气浓度进行。32.一种生物反应器，所述生物反应器包括：(a)包含培养乳制品的顶区室；和(b)至少一种活细胞构建体，所述活细胞构建体包括：(i)三维支架，所述三维支架具有外表面、限定内腔/基室的内表面和从所述内表面延伸到所述外表面的多于一个孔；(ii)基质材料，所述基质材料设置在所述三维支架的外表面上；(iii)培养基，所述培养基设置在所述内腔/基室内并与所述内表面流体地接触；和(iv)设置在基质材料上的至少70％汇合的极化的乳腺细胞的单层，其中所述乳腺细胞
选自由以下组成的组：活的原代乳腺上皮细胞、活的乳腺肌上皮细胞、活的乳腺祖细胞、活的永生化乳腺上皮细胞、活的永生化乳腺肌上皮细胞和活的永生化乳腺祖细胞；其中所述乳腺细胞的顶表面与所述顶区室流体地接触。33.根据权利要求32所述的生物反应器，其中所述生物反应器内乳腺细胞的总细胞密度为至少10
11
。34.根据权利要求32所述的生物反应器，其中所述生物反应器内乳腺细胞的总表面积为至少1.5m2。
技术总结本发明涉及用于从乳腺细胞体外和/或离体生产培养乳制品(culturedmilk product)的活细胞构建体，从乳腺细胞生产分离的培养乳制品的方法，用于生产分离的培养乳制品的生物反应器，以及培养乳制品。以及培养乳制品。
技术研发人员：莱拉
受保护的技术使用者：生物乳业公司
技术研发日：2020.12.18
技术公布日：2022/11/1
