具有Fc突变的异二聚蛋白质的制作方法

具有fc突变的异二聚蛋白质
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2020年1月23日提交的国际申请第pct/cn2020/073960号的优先权益，所述国际申请以全文引用的方式并入本文中。
技术领域
3.本技术涉及异二聚蛋白质(诸如双特异性抗体)和可活化抗体、其制备方法和使用方法。
4.序列表的引用
5.以下以ascii文本文档提交的内容以全文引用的方式并入本文中：计算机可读形式(crf)的序列表(文档名：695402001041seqlist.txt，记录日期：2020年1月21日，大小：656kb)。


背景技术：

6.多特异性抗体可同时结合多个不同抗原。此特性使得使用常规单克隆抗体不可能的治疗策略能够发展。一种模式的多特异性抗体为异二聚蛋白质，例如由结合不同抗原的单独链组成的抗体。此类异二聚、多特异性抗体仅在经组装具有单体组分的右侧补体时才可恰当地靶向多个抗原。因此，本领域中需要以特异性且稳定的方式发生异二聚化的多特异性抗体。
7.可活化抗体展现“可活化”构象，使得在存在一种或多种特定蛋白酶的情况下，与裂解后相比，在未裂解时其中所含的抗原结合部分不太可用于结合至其靶标。因此，可活化抗体提供仅在某些背景下(例如在富含蛋白酶的肿瘤微环境中)能够结合靶标的抗原特异性结合蛋白。双特异性t细胞衔接器为能够结合至t细胞与目标细胞(诸如肿瘤细胞)两者的双特异性抗体(bite)。由于其中靶脱肿瘤效应，bite与高细胞毒性相关，包括对中枢神经系统(cns)的毒性和细胞因子风暴。本领域需要具有增强的特异性和降低的副作用的可活化bite分子。
8.本文中引用的所有参考文献，包括专利申请、专利公布、非专利文献和uniprotkb/swiss-prot/基因库登录号均以全文引用的方式并入本文中，如同各个别参考文献特定地且个别地指示以引用的方式并入一般。


技术实现要素：

9.本技术提供异二聚蛋白质，所述异二聚蛋白质包含具有形成二硫键和/或盐桥的经工程改造的残基的ch3结构域。还提供靶向cd3和/或her2的可活化抗体。
10.因此，本技术的一个方面提供一种异二聚蛋白质，其包含含有第一免疫球蛋白重链恒定结构域3(ch3结构域)的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中：i)第一ch3结构域包含在位置390的半胱氨酸(c)残基并且第二ch3结构域包含在位置400的半胱氨酸残基，或第一ch3结构域包含在位置400的半胱氨酸残基并且第二ch3结构域包含在位置
390的半胱氨酸残基；或ii)第一ch3结构域包含在位置392的半胱氨酸残基并且第二ch3结构域包含在位置397的半胱氨酸残基，或第一ch3结构域包含在位置397的半胱氨酸残基并且第二ch3结构域包含在位置392的半胱氨酸残基；或iii)第一ch3结构域包含在位置392的半胱氨酸残基并且第二ch3结构域包含在位置400的半胱氨酸残基，或第一ch3结构域包含在位置400的半胱氨酸残基并且第二ch3结构域包含在位置392的半胱氨酸残基；并且其中氨基酸残基编号是基于eu编号。在一些实施方案中，i)第一ch3结构域包含n390c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含n390c取代；或ii)第一ch3结构域包含k392c取代并且第二ch3结构域包含v397c取代，或第一ch3结构域包含v397c取代并且第二ch3结构域包含k392c取代；或iii)第一ch3结构域包含k392c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含k392c取代。
11.在根据上文所描述的异二聚蛋白质中的任一者的一些实施方案中，i)第一ch3结构域还包含在位置357的带正电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置351的带负电荷的残基，或第一ch3结构域还包含在位置351的带负电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置357的带正电荷的残基；或ii)第一ch3结构域还包含在位置411的带正电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置370的带负电荷的残基，或第一ch3结构域还包含在位置370的带负电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置411的带正电荷的残基；或iii)第一ch3结构域还包含在位置364的带正电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置370的带负电荷的残基，或第一ch3结构域还包含在位置370的带负电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置364的带正电荷的残基；或i)与ii)的组合，或i)与iii)的组合，并且其中氨基酸残基编号是基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域还包含在位置356的带正电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置439的带负电荷的残基，或第一ch3结构域还包含在位置439的带负电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置356的带正电荷的残基；并且其中氨基酸残基编号是基于eu编号。在一些实施方案中，i)带正电荷的残基为赖氨酸(k)残基，并且带负电荷的残基为天冬氨酸(d)残基；或ii)带正电荷的残基为赖氨酸(k)残基，并且带负电荷的残基为谷氨酸(e)残基；或iii)带正电荷的残基为精氨酸(r)残基，并且带负电荷的残基为天冬氨酸(d)残基；或iv)带正电荷的残基为精氨酸(r)残基，并且带负电荷的残基为谷氨酸(e)残基。在一些实施方案中，i)第一ch3结构域包含e357k和t411k取代并且第二ch3结构域包含l351d和k370d取代，或第一ch3结构域包含l351d和k370d取代并且第二ch3结构域包含e357k和t411k取代；或ii)第一ch3结构域包含e357k和s364k取代并且第二ch3结构域包含l351d和k370d取代，或第一ch3结构域包含l351d和k370d取代并且第二ch3结构域包含e357k和s364k取代；或iii)第一ch3结构域包含d356k、e357k和s364k取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k和s364k取代。
12.在根据上文所描述的异二聚蛋白质中的任一者的一些实施方案中，i)第一ch3结构域还包含k392d和k409d取代并且第二ch3结构域还包含d356k和d399k取代，或第一ch3结构域还包含d356k和d399k取代并且第二ch3结构域还包含k392d和k409d取代；或ii)第一ch3结构域还包含l368d和k370s取代并且第二ch3结构域还包含e357q和s364k取代，或第一ch3结构域还包含e357q和s364k取代并且第二ch3结构域还包含l368d和k370s取代；或iii)
第一ch3结构域还包含l351k和t366k取代并且第二ch3结构域还包含l351d和l368e取代，或第一ch3结构域还包含l351d和l368e取代并且第二ch3结构域还包含l351k和t366k取代；或(iv)第一ch3结构域还包含p395k、p396k和v397k取代并且第二ch3结构域包含t394d、p395d和p396d取代，或第一ch3结构域还包含t394d、p395d和p396d取代并且第二ch3结构域还包含p395k、p396k和v397k取代；或(v)第一ch3结构域还包含f405e、y407e和k409e取代并且第二ch3结构域包含f405k和y407k取代，或第一ch3结构域还包含f405k和y407k取代并且第二ch3结构域还包含f405e、y407e和k409e取代。
13.在根据上文所描述的异二聚蛋白质中的任一者的一些实施方案中，i)第一ch3结构域包含e357k、s364k和n390c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和s400c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和s400c取代并且第二ch3结构域包含e357k、s364k和n390c取代；或ii)第一ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代并且第二ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代；或iii)第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代；或iv)第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代。
14.在根据上文所描述的异二聚蛋白质中的任一者的一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域还包含杵入臼残基。在一些实施方案中，i)第一ch3结构域包含t336s、l368a和y407v取代并且第二ch3结构域包含t366w取代，或第一ch3结构域包含t366w取代并且第二ch3结构域包含t336s、l368a和y407v取代；或ii)第一ch3结构域包含l368v和y407v取代并且第二ch3结构域包含t366w取代，或第一ch3结构域包含t366w取代并且第二ch3结构域包含l368v和y407v取代。
15.本技术的另一方面提供一种异二聚蛋白质，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中：i)第一ch3结构域包含在位置357的带正电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置351的带负电荷的残基，或第一ch3结构域包含在位置351的带负电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置357的带正电荷的残基；或ii)第一ch3结构域包含在位置411的带正电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置370的带负电荷的残基，或第一ch3结构域包含在位置370的带负电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置411的带正电荷的残基；或iii)第一ch3结构域包含在位置364的带正电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置370的带负电荷的残基，或第一ch3结构域包含在位置370的带负电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置364的带正电荷的残基；并且其中氨基酸残基编号是基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置356的带正电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置439的带负电荷的残基，或第一ch3结构域包含在位置439的带负电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置356的带正电荷的残基；并且其中氨基酸残基编号是基于eu编号。在一些实施方案中，i)带正电荷的残基为赖氨酸(k)残基，并且带负电荷的残基为天冬氨酸(d)残基；或ii)带正电荷的残基为赖氨酸(k)残基，并且带负电荷的残基为谷氨酸(e)残基；或iii)带正电荷的残基为精氨酸(r)残基，并且带负电荷的残基为天
冬氨酸(d)残基；或iv)带正电荷的残基为精氨酸(r)残基，并且带负电荷的残基为谷氨酸(e)残基。在一些实施方案中，i)第一ch3结构域包含e357k和t411k取代并且第二ch3结构域包含l351d和k370d取代，或第一ch3结构域包含l351d和k370d取代并且第二ch3结构域包含e357k和t411k取代；或ii)第一ch3结构域包含e357k和s364k取代并且第二ch3结构域包含l351d和k370d取代，或第一ch3结构域包含l351d和k370d取代并且第二ch3结构域包含e357k和s364k取代；或iii)第一ch3结构域包含d356k、e357k和s364k取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k和s364k取代。
16.在根据上文所描述的异二聚蛋白质中的任一者的一些实施方案中，i)第一ch3结构域还包含k392c取代并且第二ch3结构域还包含d399c取代，或第一ch3结构域还包含d399c取代并且第二ch3结构域还包含k392c取代；或ii)第一ch3结构域还包含y394c取代并且第二ch3结构域还包含s354c取代，或第一ch3结构域还包含s354c取代并且第二ch3结构域还包含y394c取代；或iii)第一ch3结构域还包含d356c取代并且第二ch3结构域还包含y349c取代，或第一ch3结构域还包含y349c取代并且第二ch3结构域还包含d356c取代。
17.在根据上文所描述的异二聚蛋白质中的任一者的一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域为人类ch3结构域。
18.在根据上文所描述的异二聚蛋白质中的任一者的一些实施方案中，第一多肽和第二多肽自n端至c端各自包含至少一部分免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白重链恒定结构域2(ch2结构域)和ch3结构域。在一些实施方案中，ch2结构域和ch3结构域形成igg fc区。在一些实施方案中，fc区属于人类igg1亚类。在一些实施方案中，fc区属于人类igg4亚类。在一些实施方案中，fc区还包含s228p取代。在一些实施方案中，fc区还包含n297a取代。
19.在根据上文所描述的异二聚蛋白质中的任一者的一些实施方案中，第一多肽和第二多肽为抗体重链。在一些实施方案中，异二聚蛋白质还包含异二聚蛋白质还包含一个或多个抗体轻链。在一些实施方案中，异二聚蛋白质为多特异性抗体。
20.在根据上文所描述的异二聚蛋白质中的任一者的一些实施方案中，异二聚蛋白质还包含第三多肽和第四多肽，其中：
21.(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
22.vh1-ch1-铰链-ch2-第一ch3-l1-scfv1(ia)；
23.(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
24.vh2-ch1-铰链-ch2-第二ch3-l2-scfv2(iia)；
25.(iii)第三多肽包含由下式表示的结构：
26.vl1-cl(ib)；并且
27.(iv)第四多肽包含由下式表示的结构：
28.vl2-cl(iib)；
29.其中vl1为第一免疫球蛋白轻链可变结构域；vh1为第一免疫球蛋白重链可变结构域；vl2为第二免疫球蛋白轻链可变结构域；vh2为第二免疫球蛋白重链可变结构域；scfv1为第一单链可变片段；scfv2为第二单链可变片段；cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；铰链为连接ch1结构域和ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且l1和l2各自独立地为键或肽接头；其中vl1与vh1相
缔合以形成特异性结合于第一靶标的第一fv；其中vl2与vh2相缔合以形成特异性结合于第二靶标的第二fv；其中scfv1特异性结合于第三靶标；并且其中scfv2特异性结合于第四靶标。在一些实施方案中，scfv1与scfv2为相同的。在一些实施方案中，第一fv与第二fv为相同的。在一些实施方案中，第一fv与第二fv为不同的。在一些实施方案中，第一fv特异性结合pdl1，第二fv特异性结合cd137，并且scfv1和scfv2特异性结合ctla-4。在一些实施方案中，scfv1和/或scfv2自n端至c端包含：vh-l-vl，其中l为肽接头。在一些实施方案中，scfv1和/或scfv2包含vh中的在位置44的第一半胱氨酸残基和vl中的在位置100的第二半胱氨酸残基，其中第一半胱氨酸残基和第二半胱氨酸残基形成二硫键。在一些实施方案中，l1和/或l2为包含seq id no:80或seq id no:81的氨基酸序列的肽接头。在一些实施方案中，vl1与vl2为相同的。在一些实施方案中，vl1与vl2为不同的。
30.在根据上文所描述的异二聚蛋白质中的任一者的一些实施方案中，异二聚蛋白质包含第一多肽、第二多肽和第三多肽，其中：
31.(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
32.vh-ch1-铰链-ch2-第一ch3(iiia)；
33.(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
34.scfv-铰链-ch2-第二ch3(iva)；并且
35.(iii)第三多肽包含由下式表示的结构：
36.vl-cl(iiib)；
37.其中vl为免疫球蛋白轻链可变结构域；vh为免疫球蛋白重链可变结构域；scfv为单链可变片段；cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；并且铰链为连接ch1结构域和ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；其中vl与vh相缔合以形成特异性结合于第一靶标的fv；并且其中scfv特异性结合于第二靶标。在一些实施方案中，第一靶标为肿瘤抗原，并且第二靶标为cd3。在一些实施方案中，第一靶标为her2。在一些实施方案中，第一靶标为第一免疫检查点分子，并且第二靶标为第二免疫检查点分子。在一些实施方案中，第一靶标为pdl1并且第二靶标为cd137。在一些实施方案中，第一靶标为cd137并且第二靶标为pdl1。在一些实施方案中，scfv自n端至c端包含：vh-l-vl，其中l为肽接头。在一些实施方案中，scfv包含vh中的在位置44的第一半胱氨酸残基和vl中的在位置100的第二半胱氨酸残基，其中第一半胱氨酸残基和第二半胱氨酸残基形成二硫键。在一些实施方案中，scfv经由包含seq id no:80或seq id no:81的氨基酸序列的肽接头融合至第二多肽中的铰链。
38.在根据上文所描述的异二聚蛋白质中的任一者的一些实施方案中，异二聚蛋白质为可活化抗体，其中异二聚蛋白质包含第一多肽、第二多肽和第三多肽，并且其中：
39.(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
40.vh-ch1-铰链-ch2-第一ch3(va)；
41.(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
42.mm1-cm1-scfv-铰链-ch2-第二ch3(via)；并且
43.(iii)第三多肽包含由下式表示的结构：
44.mm2-cm2-vl-cl(ivb)；
45.其中vl为免疫球蛋白轻链可变结构域；vh为免疫球蛋白重链可变结构域；scfv为
单链可变片段；cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；铰链为连接ch1结构域和ch2结构域免疫球蛋白铰链区；mm1为第一遮蔽肽；mm2为第二遮蔽肽；cm1为第一可裂解肽；并且cm2为第二可裂解肽；其中vl与vh相缔合以形成特异性结合于第一靶标的第一fv；其中scfv特异性结合于第二靶标；其中当cm1未裂解时mm1抑制第一fv结合至第一靶标；并且其中当cm2未裂解时mm2抑制scfv结合至第二靶标。在一些实施方案中，第一靶标为肿瘤抗原，并且第二靶标为cd3。在一些实施方案中，mm1包含seq id no:35的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一fv包含vh，所述vh包含含有seq id no:61的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:62的氨基酸序列的cdr-h2和/或含有seq id no:63的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，tbm包含vl，所述vl包含含有seq id no:64的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:65的氨基酸序列的cdr-l2和/或含有seq id no:66的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，第一靶标为her2。在一些实施方案中，mm2包含seq id no:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，scfv包含vh，所述vh包含含有seq id no:69的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:70的氨基酸序列的cdr-h2和/或含有seq id no:71的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，tbm包含vl，所述vl包含含有seq id no:72的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:73的氨基酸序列的cdr-l2和/或含有seq id no:74的氨基酸序列的cdr-l3。
46.本技术的一个方面提供一种可活化抗体，其包含：第一多肽，所述第一多肽自n端至c端包含遮蔽部分(mm)、可裂解部分(cm)和靶标结合部分(tbm)，其中mm包含seq id no:35的氨基酸序列；其中当cm未裂解时mm抑制可活化抗体结合至人类cd3；其中cm至少包含第一裂解位点；并且其中：a)tbm包含vl且可活化抗体还包含含有vh的第二多肽；b)tbm包含vh且可活化抗体还包含含有vl的第二多肽；c)tbm自n端至c端包含vl和vh；或d)tbm自n端至c端包含vh和vl；并且其中当cm裂解时可活化抗体经由vh和vl结合至人类cd3。在一些实施方案中，tbm包含vh，所述vh包含含有seq id no:61的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:62的氨基酸序列的cdr-h2和/或含有seq id no:63的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，tbm包含vl，所述vl包含含有seq id no:64的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:65的氨基酸序列的cdr-l2和/或含有seq id no:66的氨基酸序列的cdr-l3。
47.本技术的一个方面提供一种可活化抗体，其包含：第一多肽，所述第一多肽自n端至c端包含遮蔽部分(mm)、可裂解部分(cm)和靶标结合部分(tbm)，其中mm包含seq id no:36的氨基酸序列；其中当cm未裂解时mm抑制可活化抗体结合至人类her2；其中cm至少包含第一裂解位点；并且其中a)tbm包含vl且可活化抗体还包含含有vh的第二多肽；b)tbm包含vh且可活化抗体还包含含有vl的第二多肽；c)tbm自n端至c端包含vl和vh；或d)tbm自n端至c端包含vh和vl；并且其中当cm裂解时可活化抗体经由vh和vl结合至人类her2。在一些实施方案中，tbm包含vh，所述vh包含含有seq id no:69的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:70的氨基酸序列的cdr-h2和/或含有seq id no:71的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，tbm包含vl，所述vl包含含有seq id no:72的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:73的氨基酸序列的cdr-l2和/或含有seq id no:74的氨基酸序列的cdr-l3。
48.在根据上文所描述的可活化抗体中的任一者的一些实施方案中，可活化抗体包含第一多肽、第二多肽和第三多肽，其中：
49.(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
50.vh-ch1-铰链-ch2-第一ch3(va)；
51.(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
52.mm1-cm1-scfv-铰链-ch2-第二ch3(via)；并且
53.(iii)第三多肽包含由下式表示的结构：
54.mm2-cm2-vl-cl(ivb)；
55.其中：
56.vl为免疫球蛋白轻链可变结构域；
57.vh为免疫球蛋白重链可变结构域；
58.scfv为单链可变片段；
59.cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；
60.ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；
61.ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；
62.铰链为连接ch1结构域和ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；
63.mm1为第一遮蔽肽；
64.mm2为第二遮蔽肽；
65.cm1为第一可裂解肽；并且
66.cm2为第二可裂解肽；
67.其中vl与vh相缔合以形成特异性结合于第一靶标的第一fv；其中scfv特异性结合于第二靶标；并且其中mm为mm1或mm2。
68.在根据上文所描述的可活化抗体中的任一者的一些实施方案中，可活化抗体包含含有第一ch3结构域和第二ch3结构域的fc区，其中第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。
69.本技术的一个方面提供编码根据上文所描述的异二聚蛋白质中的任一者的异二聚蛋白质或根据上文所描述的可活化抗体中的任一者的可活化抗体的一种或多种核酸、包含所述一种或多种核酸的载体和包含所述一种或多种核酸或所述载体的宿主细胞。在一些实施方案中，提供一种用于制备异二聚蛋白质或可活化抗体的方法，所述方法包括：(a)在允许一种或多种核酸或载体表达的条件下培养根据上文所描述的宿主细胞中的任一者的宿主细胞；和(b)自宿主细胞培养物回收异二聚蛋白质或可活化抗体。
70.本技术的一个方面提供一种药物组合物，其包含根据上文所描述的异二聚蛋白质中的任一者的异二聚蛋白质或根据上文所描述的可活化抗体中的任一者的可活化抗体和药学上可接受的载体。
71.本技术的一个方面提供一种用于治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的根据上文所描述的药物组合物中的任一者的药物组合物。在一些实施方案中，疾病或疾患为癌症。在一些实施方案中，癌症为肺癌。在一些实施方案中，癌症为her-2阳性癌症。在一些实施方案中，癌症为卵巢癌。在一些实施方案中，癌症为前列腺癌或黑素瘤。在一些实施方案中，癌症为晚期癌症。
72.还提供包含上文所描述的异二聚蛋白质中的任一者的组合物、用途、试剂盒和制
品。
附图说明
73.图1-5提供本技术的示例性抗体设计的示意图。
74.图1a显示fab-fc/fc单臂支架示意图。图1b显示共同轻链支架示意图。
75.图2显示莫里森模式(morrison format)双特异性支架示意图。右侧显示莫里森模式的pd-l1 x cd137和cd137 x pd-l1双特异性抗体。
76.图3显示三特异性支架示意图，包括右侧的针对pd-l1、cd137和ctla4的三特异性抗体。
77.图4显示scfv双特异性支架示意图，包括右侧的her2和cd3双特异性抗体示意图。
78.图5显示可活化支架示意图，包括右侧的针对her2和cd3的可活化抗体的示意图。遮蔽肽(表示为球)可经由可裂解接头融合至抗原结合结构域。
79.图6提供显示异二聚蛋白质的产率的10％sds-page凝胶。如所示，三个条带对应于轻链-重链同二聚体、轻链-重链-fc异二聚体和轻链-重链半体。
80.图7提供异二聚蛋白质的尺寸排阻高效液相色谱资料。时间在x轴上，并且相对蛋白质丰度在y轴上。星形指示对应于异二聚蛋白质的峰值。
81.图8提供显示在所示温度下培育1小时之后的异二聚蛋白质的所分析的尺寸排阻高效液相色谱资料。x轴指示温度(从左到右，对照、40℃、50℃、60℃、65℃或67.5℃)，并且y轴指示相对于对照(未培育)对应于培育后的异二聚蛋白质的峰面积。
82.图9提供如所示在4℃或37℃下存储7、14、21或28天之后异二聚蛋白质的尺寸排阻高效液相色谱谱。时间在x轴上，并且相对蛋白质丰度在y轴上。
83.图10显示nfκb活化荧光素酶报告子分析中双特异性抗体的效应。x轴指示对数转化的抗体浓度(nm)，并且y轴指示荧光素酶报告子的相对发光单位(“rlu”)。
84.图11a-11c提供不同模式的经纯化抗pdl1和cd137双特异性抗体的质量的评估。图11a显示在3个和6个冷冻-解冻循环之后通过分析型尺寸排阻色谱评估的蛋白质质量。图11b显示在40℃下培育28天之后通过分析型尺寸排阻色谱评估的蛋白质质量。在图11a和图11b中，时间在x轴上，并且相对蛋白质丰度在y轴上，并且指示双特异性抗体的模式。图11c提供不同模式的经纯化抗pdl1和cd137双特异性抗体的热稳定性的分析。将抗体在x轴上所指示的温度(从左到右，对照、50℃、60℃、65℃和70℃)下培育一小时，并且y轴指示主要峰面积的百分比。在图11c中，pdl1xcd137 tyf01指示为方形，cd137xpdl1 tyf01显示为圆形，pdl1xcd137 tyf02显示为尖朝上的三角形，并且cd137xpdl1 tyf02显示为尖朝下的三角形。
85.图12提供抗pdl1 xcd137双特异性抗体与pdl1和cd137的结合的流式细胞术分析。各图的x轴显示apc通道中的抗原展示，并且y轴显示pe通道中的配位体结合。
86.图13提供抗pdl1和cd137双特异性抗体结合和交叉反应的流式细胞术分析。tyf01抗体显示在上部一组图上，并且tyf02抗体显示在下部一组图上。各图的x轴显示fitc通道中的抗原展示，并且y轴显示apc通道中的抗体结合。如所示，测试不同模式的双特异性抗体结合小鼠、猴或人类来源的pdl1或cd137的能力。
87.图14提供pdl1xcd137和cd137xpdl1双特异性抗体对pdl1和cd137报告基因分析的
k439')。本文所描述的异二聚蛋白质提供用于以高产率、优良稳定性(例如对高温下或归因于冷冻-解冻循环的聚集和沉淀的抗性)和有效活性制备各种模式的多特异性蛋白质和抗体的平台。
94.i.定义
95.除非如下另外定义，否则术语在本文中如本领域中通常所用进行使用。
96.术语“抗体”在本文中以广义使用且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要其展现所需抗原结合活性即可。
97.术语“抗体”包括但不限于能够结合抗原的片段，诸如fv、fab、fab'和(fab')2。抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称为“fab”片段，各自具有单一抗原结合位点；以及剩余的“fc”片段，其名称反映其容易结晶的能力。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原组合位点且仍能够交联抗原的f(ab’)2片段。术语抗体还包括但不限于嵌合抗体、人源化抗体和各种物种(诸如小鼠、人类、食蟹猴等)的抗体。
98.术语“抗原结合片段”是指抗体中保留结合至抗体的抗原的能力的一个或多个部分。抗体的“抗原结合片段”的实例包括但不限于(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab
′
)2片段，包含在铰链区由二硫键连键的两个fab片段的二价片段；(iii)fv片段，其由抗体的单一臂的vl和vh结构域组成，(v)单链fv片段，其包含抗体的vh和vl结构域，并且vh和vl结构域彼此融合；和(vi)单链fab片段，其包含含有vl、vh、cl和ch1结构域的单一多肽。
99.如本文所用的术语“单克隆抗体”是指获自实质上均质的抗体群体(即，构成所述群体的个别抗体为相同的和/或结合相同表位)的抗体，除了可能的变体抗体，例如含有天然存在的突变或在制备单克隆抗体制剂期间产生的变体抗体，此类变体通常以微小量存在。与多克隆抗体制剂(典型地包括针对不同决定子(表位)的不同抗体)相比之下，单克隆抗体制剂的各单克隆抗体针对抗原上的单一决定子。因此，修饰语“单克隆”指示抗体的特征为获自实质上均质的抗体群体，并且不应视为需要通过任何特定方法制备抗体。举例来说，要根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来制备，包括但不限于杂交瘤法、重组dna法、噬菌体展示法和利用含有全部或部分的人类免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，此类方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法描述于本文中。
100.如本文所用，术语“高变区”或“hvr”是指抗体可变结构域中序列高度可变的区域中的每一者。hvr可形成结构确定的环(“高变环”)。通常，天然四链抗体包含六个hvr；三个在vh中(h1、h2、h3)，并且三个在vl中(l1、l2、l3)。hvr通常包含来自高变环和/或来自“互补决定区”(cdr)的氨基酸残基，cdr具有最高序列变异性和/或参与抗原识别。示例性高变环出现在氨基酸残基26-32(l1)、50-52(l2)、91-96(l3)、26-32(h1)、53-55(h2)和96-101(h3)处。(chothia和lesk,j.mol.biol.196:901-917(1987)。)示例性cdr(cdr-l1、cdr-l2、cdr-l3、cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3)出现在l1的氨基酸残基24-34、l2的50-56、l3的89-97、h1的31-35b、h2的50-65和h3的95-102处。(kabat等人,sequences of proteins of immunological interest,第5版public health service,national institutes of health,bethesda,md(1991))除vh中的cdr1外，cdr通常包含形成高变环的氨基酸残基。cdr也包含“特异性决定残基”或“sdr”，其为接触抗原的残基。sdr含于称为缩短-cdr或a-cdr的
cdr区域内。示例性a-cdr(a-cdr-l1、a-cdr-l2、a-cdr-l3、a-cdr-h1、a-cdr-h2和a-cdr-h3)出现在l1的氨基酸残基31-34、l2的50-55、l3的89-96、h1的31-35b、h2的50-58和h3的95-102处。(参见almagro和fransson,front.biosci.13:1619-1633(2008))。除非另外指出，否则hvr残基和可变结构域中的其他残基(例如fr残基)在本文中根据kabat等人，同上来编号。
101.术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗体与抗原的结合的抗体重链或轻链结构域。天然抗体的重链和轻链(分别为vh和vl)的可变结构域通常具有类似结构，各结构域包含四个构架区(fr)和三个高变区(hvr)，自胺基端至羧基端按以下顺序排列：fr1、hvr1、fr2、hvr2、fr3、hvr3、fr4。(参见例如kindt等人kuby immunology,第6版,w.h.freeman and co.,第91页(2007)。)单一vh或vl结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可使用来自结合所述抗原的抗体的vh或vl结构域分别筛选互补vl或vh结构域的文库而加以分离。参见例如portolano等人,j.immunol.150:880-887(1993)；clarkson等人,nature 352:624-628(1991)。
102.术语“eu编号”或“基于eu编号的氨基酸位置编号”和其变化型式是指edelman,g.m.等人,proc.natl.acad.usa,63,78-85(1969)中用于抗体编辑的重链恒定结构域的编号系统。对于给定抗体，可通过在具有“标准”eu编号序列的抗体序列同源区域进行比对来确定残基的eu编号。
103.当提及可变结构域中的残基(大概为轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用kabat编号系统(例如kabat等人,sequences of immunological interest.第5版public health service,national institutes of health,bethesda,md.(1991))。使用此编号系统，实际线性氨基酸序列可含有更少或额外的氨基酸，对应于可变结构域的fr或hvr的缩短或插入。举例来说，重链可变结构域可包括在h2的残基52之后的单一氨基酸插入(根据kabat的残基52a)和在重链fr残基82之后插入的残基(例如根据kabat的残基82a、82b和82c等)。对于给定抗体，可通过在具有“标准”kabat编号序列的抗体序列同源区域进行比对来确定残基的kabat编号。
104.就具有两个ch3结构域的异二聚蛋白质而论，第一ch3结构域的给定氨基酸位置称为x，并且第二ch3结构域的对应氨基酸位置称为x'。举例来说，n390c-s400’c是指具有含有n390c突变的第一ch3结构域和含有s400c突变的第二ch3结构域的异二聚蛋白质。在本文中相对于野生型天然存在的ch3结构域来提及本文所描述的异二聚蛋白质中的所有突变或取代。
105.除非另外指示，否则本文所描述的多肽链的所有式子以自n端至c端的顺序列举多肽组分。举例来说，式vh1-ch1-铰链-ch2-第一ch3-l1-scfv1表明多肽自n端至c端包含以下结构组分：vh1、ch1、铰链、ch2、第一ch3、l1和scfv1。
106.如本文所用的术语“重链恒定区”是指包含至少三个重链恒定结构域ch1、ch2和ch3以及ch1与ch2之间的铰链区的区域。非限制性示例性重链恒定区包括γ、δ和α。非限制性示例性重链恒定区也包括ε和μ。各重恒定区对应于抗体同种型。举例来说，包含γ恒定区的抗体为igg抗体，包含δ恒定区的抗体为igd抗体，并且包含α恒定区的抗体为iga抗体。另外，包含μ恒定区的抗体为igm抗体，并且包含ε恒定区的抗体为ige抗体。某些同种型可进一步再分成亚类。举例来说，igg抗体包括但不限于igg1(包含γ1恒定区)、igg2(包含γ2恒定
区)、igg3(包含γ3恒定区)和igg4(包含γ4恒定区)抗体；iga抗体包括但不限于iga1(包含α1恒定区)和iga2(包含α2恒定区)抗体；并且igm抗体包括但不限于igm1和igm2。
107.术语人类igg fc区的“ch2结构域”通常根据eu编号系统自igg的约残基231延伸至约340。ch2结构域为独特的，因为其不与另一结构域紧密配对。相反地，两个n-连接分支链碳水化合物链插入完整天然igg分子的两个ch2结构域之间。已推测碳水化合物可提供对结构域-结构域配对的替代且帮助稳定ch2结构域。burton,molec.lmmunol.22:161-206(1985)。
108.术语“ch3结构域”包含c端至fc区中的ch2结构域的残基延伸段(即，根据eu编号系统，igg的约氨基酸残基341至约氨基酸残基447)。
109.如本文所用的术语“重链”是指在存在或不存在前导序列的情况下至少包含重链可变区的多肽。在一些实施方案中，重链包含至少一部分的重链恒定区。如本文所用的术语“全长重链”是指在存在或不存在前导序列的情况下包含重链可变区和重链恒定区的多肽。
110.如本文所用的术语“轻链恒定区”是指包含轻链恒定结构域cl的区域。非限制性示例性轻链恒定区包括λ和κ。
111.如本文所用的术语“轻链”是指在存在或不存在前导序列的情况下至少包含轻链可变区的多肽。在一些实施方案中，轻链包含至少一部分的轻链恒定区。如本文所用的术语“全长轻链”是指在存在或不存在前导序列的情况下包含轻链可变区和轻链恒定区的多肽。
[0112]“亲和力”是指分子(例如抗体)的结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。分子x对其配偶体y的亲和力通常可由解离常数(kd)表示。亲和力可通过本领域中已知的常用方法来测量，包括本文所描述的那些方法。在多特异性抗体(例如双特异性或三特异性抗体)的情形中，可测量具有各结合特异性(即靶标)的抗体的亲和力。
[0113]
术语“结合”、“特异性结合于”或“对
……
具特异性”是指诸如靶标与抗体之间的结合的可测量且可重现的相互作用，其在存在分子(包括生物分子)的非均质群体的情况下确定靶标的存在。举例来说，结合至或特异性结合于靶标(其可为表位)的抗体为与结合至其他靶标相比以更大的亲和力、亲合力，更容易地，和/或以更久的持续时间结合此靶标的抗体。在一些实施方案中，如例如通过放射免疫分析(ria)所测量，抗体结合至不相关靶标的程度小于抗体与靶标的结合的约10％。在一些实施方案中，特异性结合于靶标的抗体具有≤1μm、≤100nm、≤10nm、≤1nm或≤0.1nm的解离常数(kd)。在一些实施方案中，抗体特异性结合于蛋白质上在来自不同物种的蛋白质间保守的表位。在一些实施方案中，特异性结合可包括但不要求为排他性结合。
[0114]
术语“多特异性”在与抗体结合使用时是指具有多表位特异性(即，能够特异性结合于一个生物分子上的两个、三个或更多个不同表位或能够特异性结合于两个、三个或更多个不同生物分子上的表位)的抗体。
[0115]“亲和力成熟”抗体是指与不具有改变的亲本抗体相比在一个或多个高变区(hvr)中具有一个或多个改变的抗体，此类改变引起抗体对抗原的亲和力的改良。在一些实例中，亲和力成熟抗体是指与不具有改变的亲本抗体相比在一个或多个互补决定区(cdr)中具有一个或多个改变的抗体，此类改变引起抗体对抗原的亲和力的改良。
[0116]
如本文所用的“嵌合抗体”是指一部分重链和/或轻链衍生自特定来源或物种，而
其余重链和/或轻链衍生自不同来源或物种的抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体是指包含来自第一物种(诸如小鼠、大鼠、食蟹猴等)的至少一个可变区和来自第二物种(诸如人、食蟹猴等)的至少一个恒定区的抗体。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个小鼠可变区和至少一个人类恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体包含至少一个食蟹猴可变区和至少一个人类恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体的所有可变区来自第一物种且嵌合抗体的所有恒定区来自第二物种。
[0117]
如本文所用的“人源化抗体”是指非人类可变区的构架区中的至少一个氨基酸已经来自人类可变区的对应氨基酸置换的抗体。在一些实施方案中，人源化抗体包含至少一个人类恒定区或其片段。在一些实施方案中，人源化抗体为fab、(fab')2等。
[0118]
如本文所用的“hvr移植抗体”是指第一(非人类)物种的一个或多个高变区(hvr)已移植至第二(人类)物种的构架区(fr)上的人源化抗体。在一些实例中，如本文所用的“cdr移植抗体”是指第一(非人类)物种的一个或多个互补决定区(cdr)已移植至第二(人类)物种的构架区(fr)上的人源化抗体。
[0119]
如本文所用的“人类抗体”是指在人类中产生的抗体、在包含人类免疫球蛋白基因的非人类动物(诸如)中产生的抗体和使用体外方法(诸如噬菌体展示)选择的抗体，其中抗体谱是基于人类免疫球蛋白序列。
[0120]
术语“核酸分子”、“核酸”和“聚核苷酸”可互换使用，并且是指核苷酸的聚合物。此类核苷酸聚合物可含有天然和/或非天然核苷酸，并且包括但不限于dna、rna和pna。“核酸序列”是指包含核酸分子或聚核苷酸的核苷酸线性序列。
[0121]
术语“多肽”和“肽”可互换地用于指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。氨基酸残基的此类聚合物可含有天然或非天然氨基酸残基。所述定义涵盖全长蛋白与其片段二者。所述术语也包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化和类似修饰。此外，“多肽”包括对天然序列的修饰，诸如缺失、添加和取代(在自然界中通常为保守的)，只要多肽维持所需活性即可。这些修饰可为故意的，如通过定点诱变，或可为意外的，诸如通过宿主的突变，所述突变产生蛋白质或归因于pcr扩增的错误。
[0122]
多肽“变体”意谓在比对序列且在必要时引入空隙以达成最大序列同一性百分比之后与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物活性多肽，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分。此类变体包括例如在多肽的n端或c端添加或缺失一个或多个氨基酸残基的多肽。在一些实施方案中，变体将具有至少约80％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体将具有至少约90％氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，变体将与天然序列多肽具有至少约95％氨基酸序列同一性。
[0123]
如本文所用，关于肽、多肽或抗体序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列且在必要时引入空隙以达成最大序列同一性百分比之后，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分。出于测定氨基酸序列同一性百分比的目的而进行比对可以本领域内的各种方式来达成，例如使用公共可获得的计算机软件，诸如blast、blast-2、align或megalign
tm
(dnastar)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的整个长度上达成最大比对所需的任何算法。
[0124]
氨基酸取代可包括但不限于将多肽中的一个氨基酸用另一氨基酸置换。示例性取
代显示于表a中。可将氨基酸取代引入相关抗体中且针对所需活性(例如保留/改良的抗原结合、降低的免疫原性或改良的adcc或cdc)对产物进行筛选。
[0125]
表a.示例性氨基酸取代.
[0126][0127][0128]
可根据常见侧链特性对氨基酸进行分组：
[0129]
(1)疏水性：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
[0130]
(2)中性亲水性：cys、ser、thr、asn、gln；
[0131]
(3)酸性：asp、glu；
[0132]
(4)碱性：his、lys、arg；
[0133]
(5)影响链取向的残基：gly、pro；
[0134]
(6)芳族：trp、tyr、phe。
[0135]
非保守取代将需要将这些类别中的一者的成员换成另一类别。
[0136]
术语“载体”用于描述可经工程改造以含有可在宿主细胞中增殖的经克隆的聚核苷酸的聚核苷酸。载体可包括以下元件中的一者或多者：复制起点、调控相关多肽的表达的一个或多个调控序列(诸如启动子和/或增强子)和/或一个或多个可选标记基因(诸如抗生素抗性基因和可用于比色分析(例如β-半乳糖苷酶)的基因)。术语“表达载体”是指用于使相关多肽在宿主细胞中表达的载体。
[0137]“宿主细胞”是指可为或已为载体或经分离的聚核苷酸的接受者的细胞。宿主细胞可为原核细胞或真核细胞。示例性真核细胞包括哺乳动物细胞，诸如灵长类或非灵长类动物细胞；真菌细胞，诸如酵母；植物细胞；以及昆虫细胞。非限制性示例性哺乳动物细胞包括但不限于nso细胞、per.细胞(crucell)以及293和cho细胞和其衍生物，分别诸如293-6e和dg44细胞。术语“细胞”包括原代受试者细胞和其后代。
[0138]
如本文所用的术语“分离的”是指分子已与典型地在自然界中与其一起存在或一起产生的组分中的至少一些分离。举例来说，当多肽与产生它的细胞的组分中的至少一些分离时，将多肽称为“分离的”。多肽在表达之后由细胞分泌的情况下以物理方式将含有所述多肽的上清液与产生它的细胞分离被视为“分离”所述多肽。类似地，当聚核苷酸不为典型地在自然界中它在其中被发现的更大聚核苷酸的一部分(诸如在dna聚核苷酸的情况下为基因组dna或线粒体dna)，或与产生它的细胞的组分中的至少一些分离(例如在rna聚核苷酸的情况下)时，将所述聚核苷酸称为“分离的”。因此，宿主细胞内部的载体中所含的dna聚核苷酸可称为“分离的”。
[0139]
术语“个体”或“受试者”在本文中可互换地用于指哺乳动物。在一些实施方案中，提供治疗包括但不限于以下的哺乳动物的方法：人类、啮齿动物、猴、猫、犬、马、牛、猪、绵羊、公山羊、哺乳动物实验室动物、哺乳动物农场动物、哺乳动物运动动物和哺乳动物宠物。在一些实例中，“个体”或“受试者”是指需要针对疾病或病症进行治疗的受试者。
[0140]
如本文所用，“治疗(treatment/treating)”为用于获得有益或所需结果，包括临床结果的方法。出于本发明的目的，有益或所需临床结果包括但不限于以下中的一者或多者：缓解由疾病引起的一种或多种症状、降低疾病程度、稳定疾病(例如预防或延迟疾病的恶化)、预防或延迟疾病传播(例如转移)、预防或延迟疾病复发、延迟或减慢疾病进展、改善疾病状态、提供疾病缓和(部分或总体)、降低治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量、延迟疾病进展、增加生活质量和/或延长存活。“治疗”也涵盖减轻癌症的病理结果。本发明的方法考虑治疗的这些方面中的任何一者或多者。
[0141]
术语“预防(prevent)”和诸如“预防(prevented)”、“预防(preventing)”等类似字语指示用于预防、抑制疾病或疾患(例如癌症)或降低其复发可能性的方法。它也指延迟疾病或疾患的复发或者延迟疾病或疾患的症状的复发。如本文所用，“预防”和类似字语也包括在疾病或疾患复发之前降低疾病或疾患的强度、效应、症状和/或负荷。
[0142]
如本文所用，“延迟”癌症的发展意谓推迟、阻碍、减慢、阻滞、稳定和/或推迟疾病的发展。此延迟可视病史和/或所治疗的个体而定具有变化的时间长度。“延迟”癌症发展的方法为当与不使用所述方法相比时，降低给定时间范围内疾病发展的可能性和/或降低给定时间范围内的疾病程度的方法。此类比较是典型地基于使用统计显著性个体数目进行的临床研究。癌症发展可为使用标准方法可检测的，包括但不限于计算机断层扫描(cat扫描)、磁共振成像(mri)、腹部超声波、凝血测试、动脉造影术或活组织切片检查。发展还可指最初可能不可检测的癌症进展，并且包括发生、复发和发作。
[0143]
本文所用的术语“有效量”是指剂或剂组合足以治疗指定病症、疾患或疾病，以致于改善、减轻、减少和/或延迟其症状中的一者或多者的量。关于癌症，有效量包含足以使肿瘤缩小和/或降低肿瘤生长速率(以致抑制肿瘤生长)或者预防或延迟其他不希望的细胞增殖的量。在一些实施方案中，有效量为足以延迟疾病发展的量。在一些实施方案中，有效量
为足以预防或延迟复发的量。有效量可以一次或多次施用来施用。有效量的药物或组合物可：(i)减少癌细胞的数目；(ii)减小肿瘤尺寸；(iii)在某种程度上抑制、阻滞、减慢且优选阻止癌细胞浸润至外周器官中；(iv)抑制(即，在某种程度上减慢且优选阻止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在某种程度上缓解与癌症相关的症状中的一者或多者。
[0144]
应了解，本文所描述的本发明的实施方案包括“由实施方案组成”和/或“基本上由实施方案组成”。
[0145]
在本文中提及“约”为一值或参数包括(且描述)关于该值或参数本身的偏差。举例来说，提及“约x”的描述包括描述“x”。
[0146]
如本文所用，提及“不为”一值或参数通常意谓且描述“不同于”一值或参数。举例来说，所述方法不用于治疗x型癌症意味着所述方法用于治疗除x外的类型的癌症。
[0147]
本文所用的术语“约x-y”具有与“约x至约y”相同的含意。
[0148]
除非上下文另外明确指示，否则如本文和随附权利要求中所用，单数形式“一(a、an)”和“所述”包括复数指示物。
[0149]
如本文所用的术语“和/或”、诸如“a和/或b”的措辞意图包括a与b；a或b；a(单独)；和b(单独)。同样地，如本文所用的术语“和/或”、诸如“a、b和/或c”的措辞意图涵盖以下实施方案中的每一者：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；和c(单独)。
[0150]
应了解，为清楚起见在单独实施方案的情形中描述的某些本发明特征还可以组合形式提供于单一实施方案中。反过来，为简便起见描述于单一实施方案的情形中的各种本发明特征还可分开地或以任何适合的子组合形式提供。与异二聚蛋白质有关的实施方案的所有组合特定地由本发明涵盖且公开于本文中，就好像个别地且明确地公开每一种组合一般。此外，描述此类变量的实施方案中所列的异二聚蛋白质的所有子组合也特定地由本发明涵盖且公开于本文中，就好像本文个别地且明确地公开异二聚蛋白质的每一种此类亚组合一般。
[0151]
ii.异二聚蛋白质
[0152]
本技术提供包含具有任一经工程改造的残基或其组合的ch3结构域的异二聚蛋白质，所述经工程改造的残基如小节“ch3结构域突变”中所描述促进异二聚体形成。本文也考虑包含多个由包含第一经工程改造的ch3结构域的第一多肽和包含第二经工程改造的ch3结构域的第二多肽形成的异二聚体的异多聚体。
[0153]
在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中：i)第一ch3结构域包含在位置390的半胱氨酸(c)残基并且第二ch3结构域包含在位置400的半胱氨酸残基，或第一ch3结构域包含在位置400的半胱氨酸残基并且第二ch3结构域包含在位置390的半胱氨酸残基；或ii)第一ch3结构域包含在位置392的半胱氨酸残基并且第二ch3结构域包含在位置397的半胱氨酸残基，或第一ch3结构域包含在位置397的半胱氨酸残基并且第二ch3结构域包含在位置392的半胱氨酸残基；或iii)第一ch3结构域包含在位置392的半胱氨酸残基并且第二ch3结构域包含在位置400的半胱氨酸残基，或第一ch3结构域包含在位置400的半胱氨酸残基并且第二ch3结构域包含在位置392的半胱氨酸残基；并且其中氨基酸残基编号是
基于eu编号。
[0154]
在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中：i)第一ch3结构域还包含在位置357的带正电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置351的带负电荷的残基，或第一ch3结构域还包含在位置351的带负电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置357的带正电荷的残基；或ii)第一ch3结构域还包含在位置411的带正电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置370的带负电荷的残基，或第一ch3结构域还包含在位置370的带负电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置411的带正电荷的残基；或iii)第一ch3结构域还包含在位置364的带正电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置370的带负电荷的残基，或第一ch3结构域还包含在位置370的带负电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置364的带正电荷的残基；或i)与ii)的组合，或i)与iii)的组合，其中氨基酸残基编号是基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域还包含在位置356的带正电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置439的带负电荷的残基，或第一ch3结构域还包含在位置439的带负电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置356的带正电荷的残基，并且其中氨基酸残基编号是基于eu编号。
[0155]
在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中：i)第一ch3结构域包含在位置390的半胱氨酸(c)残基并且第二ch3结构域包含在位置400的半胱氨酸残基，或第一ch3结构域包含在位置400的半胱氨酸残基并且第二ch3结构域包含在位置390的半胱氨酸残基；或ii)第一ch3结构域包含在位置392的半胱氨酸残基并且第二ch3结构域包含在位置397的半胱氨酸残基，或第一ch3结构域包含在位置397的半胱氨酸残基并且第二ch3结构域包含在位置392的半胱氨酸残基；或iii)第一ch3结构域包含在位置392的半胱氨酸残基并且第二ch3结构域包含在位置400的半胱氨酸残基，或第一ch3结构域包含在位置400的半胱氨酸残基并且第二ch3结构域包含在位置392的半胱氨酸残基；并且其中：a)第一ch3结构域还包含在位置357的带正电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置351的带负电荷的残基，或第一ch3结构域还包含在位置351的带负电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置357的带正电荷的残基；或b)第一ch3结构域还包含在位置411的带正电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置370的带负电荷的残基，或第一ch3结构域还包含在位置370的带负电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置411的带正电荷的残基；或c)第一ch3结构域还包含在位置364的带正电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置370的带负电荷的残基，或第一ch3结构域还包含在位置370的带负电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置364的带正电荷的残基；或a)与b)的组合，或a)与c)的组合；其中氨基酸残基编号是基于eu编号。在一些实施方案中，第一ch3结构域还包含在位置356的带正电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置439的带负电荷的残基，或第一ch3结构域还包含在位置439的带负电荷的残基并且第二ch3结构域还包含在位置356的带正电荷的残基，并且其中氨基酸残基编号是基于eu编号。
[0156]
ch3结构域可衍生自任何天然存在的免疫球蛋白分子。在一些实施方案中，ch3结构域衍生自igg1分子、igg2分子、igg3分子或igg4分子。在一些实施方案中，ch3结构域为人类ch3结构域。在一些实施方案中，ch3结构域衍生自人类igg1分子。
[0157]
在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中：i)第一ch3结构域包含n390c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含n390c取代；或ii)第一ch3结构域包含k392c取代并且第二ch3结构域包含v397c取代，或第一ch3结构域包含v397c取代并且第二ch3结构域包含k392c取代；或iii)第一ch3结构域包含k392c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含k392c取代。
[0158]
在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中：i)第一ch3结构域包含e357k和t411k取代并且第二ch3结构域包含l351d和k370d取代，或第一ch3结构域包含l351d和k370d取代并且第二ch3结构域包含e357k和t411k取代；或ii)第一ch3结构域包含e357k和s364k取代并且第二ch3结构域包含l351d和k370d取代，或第一ch3结构域包含l351d和k370d取代并且第二ch3结构域包含e357k和s364k取代；或iii)第一ch3结构域包含d356k、e357k和s364k取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k和s364k取代。
[0159]
在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含e357k、s364k和n390c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和s400c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和s400c取代并且第二ch3结构域包含e357k、s364k和n390c取代。
[0160]
在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代并且第二ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代。
[0161]
在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。
[0162]
在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代。
[0163]
在一些实施方案中，异二聚蛋白质包含含有经工程改造的ch3结构域的igg fc区。fc区可衍生自任何适合的fc亚类，包括但不限于igg1、igg2、igg3和igg4亚类。
[0164]
实施例部分中的表1a-1b列出了包含本文所描述的经工程改造的二硫键和/或盐桥的ch3结构域(或fc区)的示例性多肽序列(seq id no:1-28)。fc区的经工程改造的ch3结构域或多肽的其他多肽序列包括seq id no:138-365。还提供包含选自由seq id no:1-28和138-365组成的群的氨基酸序列的多肽。
[0165]
在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有seq id no:1的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:2的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有seq id no:3的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:4的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有seq id no:5的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:6的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有seq id no:7的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:8的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有seq id no:9的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:10的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有seq id no:11的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:12的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有seq id no:13的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:14的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有seq id no:15的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:16的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有seq id no:17的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:18的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有seq id no:19的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:20的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含含有seq id no:21的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:22的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)，其包含包含seq id no:23的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:24的氨基酸序列的第二多肽。
[0166]
ch3结构域突变
[0167]
本文所描述的异二聚蛋白质可具有一个或多个经工程改造的二硫键、一个或多个经工程改造的(例如重排或逆转)盐桥或其组合。除非另外说明，否则本文的所有氨基酸残基编号是基于eu编号，并且氨基酸取代是在野生型(或天然存在的)ch3结构域序列中的对应氨基酸位置相对于野生型(或天然存在的)序列。应了解，本文所描述的突变或取代适用于所有igg亚类和同种异型。igg同种异型已描述于例如jefferis r.和lefranc m.mabs 1:4,1-7(2009)中，所述参考文献以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，本文所描述的氨基酸突变或取代是相对于igg1的野生型ch3结构域序列，诸如igg1同种异型g1m、1(a)、2(x)、3(f)或17(z)。在一些实施方案中，本文所描述的氨基酸突变或取代是相对于igg4的野生型ch3结构域序列。举例来说，相对于一种人类igg1同种异型的野生型ch3结构域(uniprot编号p01857；seq id no:29)的d356k取代等效于相对于第二人类igg1同种异型的野生型ch3结构域(seq id no:30)或人类igg4的野生型ch3结构域(seq id no:31)的e356k取代。示例性ch3结构域突变显示于表1a-1b中。在一些实施方案中，本文所描述的氨基酸突变或取代是相对于野生型fc区序列，例如igg1 fc区(seq id no:32或33)或igg4 fc区(seq id no:34)。
[0168]
新颖半胱氨酸突变
[0169]
在一些实施方案中，本文所描述的异二聚蛋白质包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含第一经工程改造的半胱氨酸残基并且第二ch3结构域包含第二经工程改造的半胱氨酸残基，其中第一经工程改造的半胱氨酸残基和第二半胱氨酸残基形成二硫键。
[0170]
在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置390的c并且第二ch3结构域包含在位置400的c，或第一ch3结构域包含在位置400的c并且第二ch3结构域包含在位置390的c。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含n390c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含n390c取代。
[0171]
在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置392的c并且第二ch3结构域包含在位置397的c，或第一ch3结构域包含在位置397的c并且第二ch3结构域包含在位置392的c。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含k392c取代并且第二ch3结构域包含v397c取代，或第一ch3结构域包含v397c取代并且第二ch3结构域包含k392c取代。
[0172]
在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置392的c并且第二ch3结构域包含在位置400的c，或第一ch3结构域包含在位置400的c并且第二ch3结构域包含在位置392的c。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含k392c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含k392c取代。
[0173]
新颖盐桥突变
[0174]
在一些实施方案中，本文所描述的异二聚蛋白质包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中第一ch3结构域包含经工程改造的带正电荷的残基并且第二ch3结构域包含经工程改造的带负电荷的残基，其中经工程改造的带正电荷的残基和经工程改造的带负电荷的残基形成盐桥。相对于野生型ch3结构域，经工程改造的盐桥可在ch3结构域之间引入新的盐桥，使两个或更多个氨基酸残基间的盐桥网状结构重排，或逆转形成盐桥的氨基酸残基上的电荷(即，“逆转”盐桥)。在一些实施方案中，经工程改造的带正电荷的残基将野生型ch3结构域中的带负电荷的残基用带正电荷的残基取代。在一些实施方案中，经工程改造的带正电荷的残基将野生型ch3结构域中的带正电荷的残基用带负电荷的残基取代。重排和逆转盐桥可使得包含经工程改造的ch3结构域的异二聚体和同二聚体的等电点(pi)改变，由此允许在纯化工艺中更好地分离异二聚体与同二聚体。
[0175]
在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置357的带正电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置351的带负电荷的残基，或第一ch3结构域包含在位置351的带负电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置357的带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置357的k并且第二ch3结构域包含在位置351的d，或第一ch3结构域包含在位置351的d并且第二ch3结构域包含在位置357的k。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置357的k并且第二ch3结构域包含在位置351的e，或第一ch3结构域包含在位置351的e并且第二ch3结构域包含在位置357的k。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置357的r并且第二ch3结构域包含在位置351的d，或第一ch3结构域包含在位置351的d并且第二ch3结构域包含在位置357的r。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置357的r并且第二ch3结构域包含在位置351的e，或第一ch3结构域包含在位置351的e并且第二ch3结构域包含在位置357的r。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含e357k取代并且第二ch3结
构域包含l351d取代，或第一ch3结构域包含l351d取代并且第二ch3结构域包含e357k取代。
[0176]
在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置411的带正电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置370的带负电荷的残基，或第一ch3结构域包含在位置370的带负电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置411的带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置411的k并且第二ch3结构域包含在位置370的d，或第一ch3结构域包含在位置370的d并且第二ch3结构域包含在位置411的k。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置411的k并且第二ch3结构域包含在位置370的e，或第一ch3结构域包含在位置370的e并且第二ch3结构域包含在位置411的k。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置411的r并且第二ch3结构域包含在位置370的d，或第一ch3结构域包含在位置370的d并且第二ch3结构域包含在位置411的r。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置411的r并且第二ch3结构域包含在位置370的e，或第一ch3结构域包含在位置370的e并且第二ch3结构域包含在位置411的r。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含t411k取代并且第二ch3结构域包含k370d取代，或第一ch3结构域包含k370d取代并且第二ch3结构域包含t411k取代。
[0177]
在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置364的带正电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置370的带负电荷的残基，或第一ch3结构域包含在位置370的带负电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置364的带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置364的k并且第二ch3结构域包含在位置370的d，或第一ch3结构域包含在位置370的d并且第二ch3结构域包含在位置364的k。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置364的k并且第二ch3结构域包含在位置370的e，或第一ch3结构域包含在位置370的e并且第二ch3结构域包含在位置364的k。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置364的r并且第二ch3结构域包含在位置370的d，或第一ch3结构域包含在位置370的d并且第二ch3结构域包含在位置364的r。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置364的r并且第二ch3结构域包含在位置370的e，或第一ch3结构域包含在位置370的e并且第二ch3结构域包含在位置364的r。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含s364k取代并且第二ch3结构域包含k370d取代，或第一ch3结构域包含k370d取代并且第二ch3结构域包含s364k取代。
[0178]
在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置356的带正电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置439的带负电荷的残基，或第一ch3结构域包含在位置439的带负电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置356的带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置356的k并且第二ch3结构域包含在位置439的d，或第一ch3结构域包含在位置439的d并且第二ch3结构域包含在位置356的k。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置356的k并且第二ch3结构域包含在位置439的e，或第一ch3结构域包含在位置439的e并且第二ch3结构域包含在位置356的k。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置356的r并且第二ch3结构域包含在位置439的d，或第一ch3结构域包含在位置439的d并且第二ch3结构域包含在位置356的r。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置356的r并且第二ch3结构域包含在位置439的e，或第一ch3结构域包含在位置439的e并且第二ch3结构域包含在位置356的r。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k取代并且第二ch3结构域包含k439d取代，或第一ch3结构域包含k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k取代。
[0179]
本文所描述的经工程改造的盐桥中的任一者可彼此组合。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置357的带正电荷的残基和在位置411的带正电荷的残基并且第二
ch3结构域包含在位置351的带负电荷的残基和在位置370的带负电荷的残基，或第一ch3结构域包含在位置351的带负电荷的残基和在位置370的带负电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置357的带正电荷的残基和在位置411的带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含e357k和t411k取代并且第二ch3结构域包含l351d和k370d取代，或第一ch3结构域包含l351d和k370d取代并且第二ch3结构域包含e357k和t411k取代。
[0180]
在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置357的带正电荷的残基和在位置364的带正电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置351的带负电荷的残基和在位置370的带负电荷的残基，或第一ch3结构域包含在位置351的带负电荷的残基和在位置370的带负电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置357的带正电荷的残基和在位置364的带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含e357k和s364k取代并且第二ch3结构域包含l351d和k370d取代，或第一ch3结构域包含l351d和k370d取代并且第二ch3结构域包含e357k和s364k取代。
[0181]
在一些实施方案中，第一ch3结构域包含在位置356的带正电荷的残基、在位置357的带正电荷的残基和在位置364的带正电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置351的带负电荷的残基、在位置370的带负电荷的残基和在位置439的带负电荷的残基，或第一ch3结构域包含在位置351的带负电荷的残基、在位置370的带负电荷的残基和在位置439的带负电荷的残基并且第二ch3结构域包含在位置356的带正电荷的残基、在位置357的带正电荷的残基和在位置364的带正电荷的残基。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k和s364k取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k和s364k取代。
[0182]
其他突变
[0183]
本文所描述的ch3结构域或fc区还可包含下表b中所列的经工程改造的二硫键和/或盐桥。
[0184]
表b.示例性fc突变.
[0185]
[0186][0187]
在一些实施方案中，第一ch3结构域还包含在位置392的c并且第二ch3结构域包含在位置399的c，或第一ch3结构域包含在位置399的c并且第二ch3结构域包含在位置392的c。在一些实施方案中，第一ch3结构域还包含k392c取代并且第二ch3结构域还包含d399c取代，或第一ch3结构域还包含d399c取代并且第二ch3结构域还包含k392c取代。
[0188]
在一些实施方案中，第一ch3结构域还包含在位置394的c并且第二ch3结构域包含在位置354的c，或第一ch3结构域包含在位置354的c并且第二ch3结构域包含在位置394的c。在一些实施方案中，第一ch3结构域还包含y394c取代并且第二ch3结构域还包含s354c取代，或第一ch3结构域还包含s354c取代并且第二ch3结构域还包含y394c取代。
[0189]
在一些实施方案中，第一ch3结构域还包含在位置356的c并且第二ch3结构域包含在位置349的c，或第一ch3结构域包含在位置349的c并且第二ch3结构域包含在位置356的c。在一些实施方案中，第一ch3结构域还包含d356c取代并且第二ch3结构域还包含y349c取代，或第一ch3结构域还包含y349c取代并且第二ch3结构域还包含d356c取代。
[0190]
在一些实施方案中，第一ch3结构域还包含k392d和k409d取代并且第二ch3结构域还包含d356k和d399k取代，或第一ch3结构域还包含d356k和d399k取代并且第二ch3结构域还包含k392d和k409d取代。
[0191]
在一些实施方案中，第一ch3结构域还包含l368d和k370s取代并且第二ch3结构域还包含e357q和s364k取代，或第一ch3结构域还包含e357q和s364k取代并且第二ch3结构域还包含l368d和k370s取代。
[0192]
在一些实施方案中，第一ch3结构域还包含l351k和t366k取代并且第二ch3结构域还包含l351d和l368e取代，或第一ch3结构域还包含l351d和l368e取代并且第二ch3结构域还包含l351k和t366k取代。
[0193]
在一些实施方案中，第一ch3结构域还包含p395k、p396k和v397k取代并且第二ch3结构域包含t394d、p395d和p396d取代，或第一ch3结构域还包含t394d、p395d和p396d取代并且第二ch3结构域还包含p395k、p396k和v397k取代。
[0194]
在一些实施方案中，第一ch3结构域还包含f405e、y407e和k409e取代并且第二ch3结构域包含f405k和y407k取代，或第一ch3结构域还包含f405k和y407k取代并且第二ch3结构域还包含f405e、y407e和k409e取代。
[0195]
本文所描述的包含经工程改造的ch3结构域二硫键和/或盐桥的异二聚蛋白质还可包含一个或多个杵入臼残基。“杵入臼”或“kih”是指本领域中已知用于制备双特异性抗体的方法，也称为“突起入空腔”法(参见例如美国专利第5,731,168号)。在此方法中，两个免疫球蛋白多肽(例如重链多肽)各包含一界面。一个免疫球蛋白多肽的界面与另一免疫球蛋白多肽上的对应界面相互作用，由此允许两个免疫球蛋白多肽相缔合。这些界面可经工
程改造，使得定位于一个免疫球蛋白多肽的界面中的“杵”或“突起”(这些术语在本文中可互换使用)与定位于另一免疫球蛋白多肽的界面中的“臼”或“空腔”(这些术语在本文中可互换使用)对应。在一些实施方案中，臼的尺寸与杵相同或类似且适当定位，使得当两个界面相互作用时，一个界面的杵可安置于另一界面的对应臼中。在不希望受理论约束的情况下，此被认为稳定异多聚体且相较于其他物质(例如均多聚体)有利于形成异多聚体。在一些实施方案中，kih法与本文所描述的经工程改造的二硫键和/或盐桥组合使用，以促进两种不同免疫球蛋白多肽的异多聚化，从而形成包含对不同表位具有结合特异性的两个免疫球蛋白多肽的双特异性抗体。在一些实施方案中，本文所描述的异二聚蛋白质的ch3结构域不包含kih残基。
[0196]
在一些实施方案中，第一ch3结构域还包含t336s、l368a和y407v取代并且第二ch3结构域还包含t366w取代，或第一ch3结构域还包含t366w取代并且第二ch3结构域还包含t336s、l368a和y407v取代。
[0197]
在一些实施方案中，第一ch3结构域包含l368v和y407v取代并且第二ch3结构域包含t366w取代，或第一ch3结构域包含t366w取代并且第二ch3结构域包含l368v和y407v取代。
[0198]
iii.多特异性抗体
[0199]
在一些实施方案中，本文所描述的异二聚蛋白质为多特异性抗体，诸如双特异性抗体或三特异性抗体。
[0200]
在一些实施方案中，提供一种多特异性抗体，其包含含有第一ch3结构域和第一靶标结合部分(tbm)的第一多肽、含有第二ch3结构域和第二tbm的第二多肽，其中第一ch3结构域和第二ch3结构域包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合，其中第一tbm特异性结合于第一靶标，并且其中第二tbm特异性结合于不同于第一靶标的第二靶标。在一些实施方案中，tbm为抗原结合结构域。在一些实施方案中，tbm为scfv或vhh。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含n390c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代并且第二ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg4 fc区，诸如具有s228p取代的igg4。
[0201]
在一些实施方案中，提供一种多特异性抗体，其包含第一ch3结构域、包含第二ch3结构域的第二多肽、第三多肽和第四多肽，其中第一ch3结构域和第二ch3结构域包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合，其中第一多肽为第一抗体重链，第二多肽为第二抗体重链，第三多肽为第一抗体轻链，并且第四多肽为第二抗体轻链，其中第一
多肽与第三多肽相缔合以形成特异性结合第一靶标的第一抗原结合位点，并且第二多肽与第四多肽相缔合以形成特异性结合不同于第一靶标的第二靶标的第二抗原结合位点。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含n390c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代并且第二ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg4 fc区，诸如具有s228p取代的igg4。
[0202]
在一些实施方案中，提供一种多特异性抗体，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽、含有第二ch3结构域的第二多肽、第三多肽和第四多肽，其中第一ch3结构域和第二ch3结构域包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合，其中：
[0203]
(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
[0204]
vh1-ch1-铰链-ch2-第一ch3；
[0205]
(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
[0206]
vh2-ch1-铰链-ch2-第二ch3；
[0207]
(iii)第三多肽包含由下式表示的结构：
[0208]
vl1-cl；并且
[0209]
(iv)第四多肽包含由下式表示的结构：
[0210]
vl2-cl；
[0211]
其中：
[0212]
vl1为第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0213]
vh1为第一免疫球蛋白重链可变结构域；
[0214]
vl2为第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0215]
vh2为第二免疫球蛋白重链可变结构域；
[0216]
cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0217]
ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；
[0218]
ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；
[0219]
铰链为连接ch1结构域和ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；
[0220]
其中vl1与vh1相缔合以形成特异性结合于第一靶标的第一fv；并且其中vl2与vh2相缔合以形成特异性结合于第二靶标的第二fv。在一些实施方案中，vl1与vl2相同(例如多特异性抗体为共同轻链抗体)。在一些实施方案中，vl1与vl2不同。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含n390c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含e357k、
s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代并且第二ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg4 fc区，诸如具有s228p取代的igg4。在一些实施方案中，第一靶标为pdl1并且第二靶标为cd137，或第一靶标为cd137并且第二靶标为pdl1。
[0221]
在一些实施方案中，提供一种多特异性抗体，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽、含有第二ch3结构域的第二多肽、第三多肽和第四多肽，其中第一ch3结构域和第二ch3结构域包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合，其中：
[0222]
(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
[0223]
vh1-ch1-铰链-ch2-第一ch3-l1-scfv1；
[0224]
(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
[0225]
vh2-ch1-铰链-ch2-第二ch3-l2-scfv2；
[0226]
(iii)第三多肽包含由下式表示的结构：
[0227]
vl1-cl；并且
[0228]
(iv)第四多肽包含由下式表示的结构：
[0229]
vl2-cl；
[0230]
其中：
[0231]
vl1为第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0232]
vh1为第一免疫球蛋白重链可变结构域；
[0233]
vl2为第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0234]
vh2为第二免疫球蛋白重链可变结构域；
[0235]
scfv1为第一单链可变片段；
[0236]
scfv2为第二单链可变片段；
[0237]
cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0238]
ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；
[0239]
ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；
[0240]
铰链为连接ch1结构域和ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且l1和l2各自独立地为键或肽接头；
[0241]
其中vl1与vh1相缔合以形成特异性结合于第一靶标的第一fv；其中vl2与vh2相缔合以形成特异性结合于第二靶标的第二fv；其中scfv1特异性结合于第三靶标；并且其中scfv2特异性结合于第四靶标。在一些实施方案中，异二聚蛋白质为双特异性抗体，其中第一靶标与第二靶标为相同的，并且第三靶标与第四靶标为相同的。在一些实施方案中，异二聚蛋白质为三特异性抗体，其中第三靶标与第四靶标为相同的或第一靶标与第二靶标为相
同的。在一些实施方案中，异二聚蛋白质为四特异性抗体。在一些实施方案中，vl1与vl2相同(例如多特异性抗体为共同轻链抗体)。在一些实施方案中，vl1与vl2不同。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含n390c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代并且第二ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg4 fc区，诸如具有s228p取代的igg4。
[0242]
在一些实施方案中，提供一种多特异性抗体，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽、含有第二ch3结构域和特异性结合第一靶标的第一靶标结合部分(tbm)的第二多肽和第三多肽，其中第一ch3结构域和第二ch3结构域包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合，其中第一多肽与第三多肽相缔合以形成特异性结合第二靶标的第二抗原结合位点。在一些实施方案中，第一靶标结合部分(tbm)为scfv或vhh。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含n390c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代并且第二ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg4 fc区，诸如具有s228p取代的igg4。在一些实施方案中，第一靶标为pdl1并且第二靶标为cd137。在一些实施方案中，第一靶标为cd137并且第二靶标为pdl1。在一些实施方案中，第一靶标为cd137并且第二靶标为ctla4。在一些实施方案中，第一靶标为ctla4并且第二靶标为pdl1。
[0243]
在一些实施方案中，提供一种多特异性抗体，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽、第二多肽和第三多肽，其中第一ch3结构域和第二ch3结构域包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合，其中：
[0244]
(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
[0245]
vh-ch1-铰链-ch2-第一ch3；
[0246]
(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
[0247]
scfv-铰链-ch2-第二ch3；并且
[0248]
(iii)第三多肽包含由下式表示的结构：
[0249]
vl-cl；
[0250]
其中：
[0251]
vl为免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0252]
vh为免疫球蛋白重链可变结构域；
[0253]
scfv为单链可变片段；
[0254]
cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0255]
ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；
[0256]
ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；并且
[0257]
铰链为连接ch1结构域和ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；
[0258]
其中vl与vh相缔合以形成特异性结合于第一靶标的fv；并且
[0259]
其中scfv特异性结合于第二靶标。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含n390c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代并且第二ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg4 fc区，诸如具有s228p取代的igg4。在一些实施方案中，scfv经由接头，诸如包含seq id no:80或81的氨基酸序列的肽接头连接至第二多肽中的铰链。在一些实施方案中，第一靶标为cd3并且第二靶标为肿瘤抗原(例如her2)。在一些实施方案中，第一靶标为肿瘤抗原(例如her2)并且第二靶标为cd3。
[0260]
在一些实施方案中，多特异性抗体包含一个或多个抗体恒定区。在一些实施方案中，人类重链恒定区属于选自iga、igg和igd的同种型。在一些实施方案中，人类轻链恒定区属于选自κ和λ的同种型。在一些实施方案中，多特异性抗体包含人类igg恒定区。在一些实施方案中，多特异性抗体包含人类igg4重链恒定区。在一些实施方案中，多特异性抗体包含人类igg1重链恒定区。在一些此类实施方案中，多特异性抗体在人类igg4恒定区中包含s228p突变。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽还包含s228p取代。
[0261]
效应功能是否为所需的可视意图用于多特异性抗体的特定处理方法而定。在一些实施方案中，当效应功能为所需的时，选择包含人类igg1重链恒定区或人类igg3重链恒定区的多特异性抗体。在一些实施方案中，当效应功能不为所需的时，选择包含人类igg4或igg2重链恒定区的多特异性抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体包含含有降低效应功能的一个或多个突变的人类igg1重链恒定区。在一些实施方案中，多特异性抗体包含含有n297a取代的igg1重链恒定区。在一些实施方案中，第一多肽和第二多肽还包含n297a取代。
[0262]
本文所描述的多特异性抗体中的任一者可特异性结合至少两个不同的靶标或表位。所识别的至少两个不同的表位可定位于相同抗原上，或不同抗原上。在一些实施方案中，抗原为细胞表面分子。在一些实施方案中，抗原为细胞外分子。
[0263]
在一些实施方案中，第一靶标、第二靶标、第三靶标和/或第四靶标为细胞表面抗原。在一些实施方案中，细胞表面抗原为免疫效应细胞(诸如t细胞(例如辅助t细胞、细胞毒性t细胞、记忆t细胞等)、b细胞、巨噬细胞和自然杀手(nk)细胞)上的抗原。在一些实施方案中，细胞表面抗原为t细胞表面抗原，诸如cd3。
[0264]
在一些实施方案中，细胞表面抗原为肿瘤抗原。肿瘤抗原为由肿瘤细胞产生的蛋白质，其可引发免疫反应，特定来说可引发t细胞介导的免疫反应。在一些实施方案中，肿瘤抗原为肿瘤特异性抗原(tsa)或肿瘤相关抗原(taa)。tsa为肿瘤细胞特有的且不出现在体内的其他细胞上。taa相关抗原并非肿瘤细胞特有的，并且替代地在未能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下也表达于正常细胞上。肿瘤上抗原的表达可发生在使免疫系统能够对抗原作出反应的条件下。taa可为在胎儿发育期间免疫系统不成熟且不能作出反应时表达于正常细胞上的抗原，或其可为通常以极低水平存在于正常细胞上但以高得多的水平表达于肿瘤细胞上的抗原。
[0265]
tsa或taa抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原，诸如mart-1/melana(mart-i)、gp 100(pmel 17)、酪氨酸酶、trp-1、trp-2和肿瘤特异性多谱系抗原，诸如mage-1、mage-3、bage、gage-1、gage-2、pl5；过表达的胚胎抗原，诸如cea；过表达的致癌基因和突变肿瘤抑制基因，诸如p53、ras、her2/neu；由染色体易位产生的独特肿瘤抗原；诸如bcr-abl、e2a-prl、h4-ret、igh-igk、myl-rar；和病毒抗原，诸如爱泼斯坦巴尔病毒(epstein barr virus)抗原ebva和人类乳头状瘤病毒(hpv)抗原e6和e7。其他基于蛋白质的大抗原包括tsp-180、mage-4、mage-5、mage-6、rage、ny-eso、pl85erbb2、pl80erbb-3、c-met、nm-23hi、psa、tag-72、ca 19-9、ca 72-4、cam 17.1、numa、k-ras、β-连环蛋白、cdk4、mum-1、p 15、p 16、43-9f、5t4、791tgp72、α-胎儿蛋白、β-hcg、bca225、btaa、ca 125、ca 15-3\ca 27.29\bcaa、ca 195、ca 242、ca-50、cam43、cd68\p1、co-029、fgf-5、g250、ga733\epcam、htgp-175、m344、ma-50、mg7-ag、mov18、nb/70k、ny-co-1、rcas 1、sdccag16、ta-90\mac-2结合蛋白\亲环蛋白c-相关蛋白、taal6、tag72、tlp和tps。
[0266]
在一些实施方案中，第一、第二、第三和/或第四靶标为免疫检查点分子。在一些实施方案中，免疫检查点分子为刺激免疫检查点分子。示例性刺激免疫检查点分子包括但不限于cd28、ox40、icos、gitr、4-1bb、cd27、cd40、cd3、hvem和tcr(例如mhc i类或ii类分子)。在一些实施方案中，免疫检查点分子为抑制性免疫检查点分子。示例性抑制性免疫检查点分子包括但不限于ctla-4、tim-3、a2a受体、lag-3、btla、kir、pd-1、ido、cd47和其配位体，诸如b7.1、b7.2、pdl1、pd-l2、hvem、b7-h4、nktr-218和sirp-α受体。
[0267]
靶标结合部分(tbm)
[0268]
在一些实施方案中，靶标结合部分(tbm)包含抗体轻链可变区(vl)和/或抗体重链可变区(vh)。在一些实施方案中，tbm包含vl。在一些实施方案中，tbm包含vh。在一些实施方案中，tbm包含对任何相关靶标的vl和/或vh特异性，包括例如ctla4、cd137、pd1、pdl1、pdl2、lag3、tim3、b7-h3、ox40、cd3、cd19、cd20、cd40、cd95、cd120a、btla、vista、icos、bcma、herl、her2、her3和/或b7-h4。
[0269]
在一些实施方案中，tbm为抗原结合片段，包括但不限于：(i)fab片段，其为由vl、vh、cl和chi结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，其为包含在铰链区由二硫键连接的两个fab片段的二价片段；(iii)fd片段，其由vh和chi结构域组成；(iv)fv片段，其由抗体的单一臂的vl和vh结构域组成；(v)dab片段(ward等人,(1989)nature 341:544-546)，其由vh结构域组成；(vi)经分离的cdr，和(vii)单链抗体(scfv)，其为包含连接至抗体vh区域的抗体vl区域的多肽(参见例如bird等人(1988)science 242:423-426；huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883)。
[0270]
在一些实施方案中，tbm为scfv，其自n端至c端包含：vl-l1-vh，其中l1为肽接头。在一些实施方案中，tbm为scfv，其自n端至c端包含：vh-l1-vl，其中l1为肽接头。在一些实施方案中，l1包含seq id no:82的氨基酸序列。在一些实施方案中，tbm为scfv包含vh与vl之间(诸如vh的c44与vl的c100之间)的经工程改造的二硫键，其中编号是基于kabat编号。在一些实施方案中，scfv包含vh中的在位置44的第一半胱氨酸残基和vl中的在位置100的第二半胱氨酸残基，其中第一半胱氨酸残基和第二半胱氨酸残基形成二硫键，并且其中编号是基于kabat编号。
[0271]
在一些实施方案中，tbm包含全长抗体轻链和/或全长抗体重链。抗体轻链可为κ或λ轻链。抗体重链可属于任何类别，诸如igg、igm、ige、iga或igd。在一些实施方案中，抗体重链属于igg类别，诸如iggl、igg2、igg3或igg4亚类。本文所描述的抗体重链可使用本领域中已知的方法自一种类别或亚类转换为另一类别或亚类。
[0272]
本文所描述的多特异性抗体可包含衍生自靶向相关抗原的任何适合的抗体的tbm。本文所描述的tbm可并入wo2019/036856、wo2019/036842、wo2019/036855、wo2019148444、wo2019185035、wo2019036855中所描述的抗体中的任一者的cdr序列(例如重链可变区cdr序列中的一者、两者或三者，和/或轻链可变区cdr序列中的一者、两者或三者)、重链可变区序列和/或轻链可变区序列中的任一者，所述专利以全文引用的方式并入本文中。下表c显示本文所描述的示例性tbm的抗体cdr、vh、vl、scfv序列。
[0273]
表c.示例性多特异性抗体
[0274]
[0275]
1316、sti-3031、zkab001、tqb2450、ly3300054和sti-a1010。
[0278]
在一些实施方案中，tbm包含vh，所述vh包含含有seq id no:37的氨基酸序列的抗体重链互补决定区(cdr-h)l、含有seq id no:38的氨基酸序列的cdr-h2和/或含有seq id no:39的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，tbm包含vl，所述vl包含含有seq id no:40的氨基酸序列的抗体轻链互补决定区(cdr-l)l、含有seq id no:41的氨基酸序列的cdr-l2和/或含有seq id no:42的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，tbm包含含有seq id no:43的氨基酸序列的vh。在一些实施方案中，tbm包含含有seq id no:44的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，tbm包含含有seq id no:77的氨基酸序列的scfv。
[0279]
在一些实施方案中，tbm为抗cd137抗体或其抗原结合结构域，包括例如vh、vl、scfv、轻链或重链(诸如iggl、igg2、igg4)。已知抗cd137抗体中的任一者均可用于本发明中，例如参见wo2016/134358。示例性抗cd137抗体包括但不限于乌瑞鲁单抗(urelumab)(也称为bms-663513)、乌托米单抗(utomilumab)(也称为pf-05082566)、ctx-471、ator-1017和agen2373。
[0280]
在一些实施方案中，tbm包含vh，所述vh包含含有seq id no:45的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:46的氨基酸序列的cdr-h2和/或含有seq id no:47的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，tbm包含vl，所述vl包含含有seq id no:48的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:49的氨基酸序列的cdr-l2和/或含有seq id no:50的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，tbm包含含有seq id no:51的氨基酸序列的vh。在一些实施方案中，tbm包含含有seq id no:52的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，tbm包含含有seq id no:78的氨基酸序列的scfv。
[0281]
在一些实施方案中，tbm为抗ctla4抗体或其抗原结合结构域，包括例如vh、vl、scfv、轻链或重链(诸如iggl、igg2、igg4)。已知抗ctla4抗体中的任一者均可用于本发明中，包括但不限于伊匹单抗(ipilimumab)(参见美国专利第6,984,720号、第7,452,535号、第7,605,238号、第8,017,114号和第8,142,778号)、曲美母单抗(tremilimumab)(参见美国专利第6,68,736号、第7,109,003号、第7,132,281号、第7,411,057号、第7,807,797号、第7,824,679号和第8,143,379号)和其他抗ctla-4抗体，诸如单链抗体(例如参见美国专利第5,811,097号、第6051,227号和第7,229,628号、美国专利公布第us20110044953号、美国专利公布第us2018037654号、美国专利公布第us2009025274号、美国专利公布第us2019127468号、国际专利公布第wo2019/152413号、国际专利公布第wo2018209701号、国际专利公布第wo2018/202649号和国际专利公布第wo2019/152423号)。其他示例性抗ctla-4抗体包括rg2077、onc-392、cs1002、bcd-145、ibi310、agen1884、agen1181和agen2041。
[0282]
在一些实施方案中，tbm包含vh，所述vh包含含有seq id no:53的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:54的氨基酸序列的cdr-h2和/或含有seq id no:55的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，tbm包含vl，所述vl包含含有seq id no:56的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:57的氨基酸序列的cdr-l2和/或含有seq id no:58的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，tbm包含含有seq id no:59的氨基酸序列的vh。在一些实施方案中，tbm包含含有seq id no:60的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，tbm包含含有seq id no:83的氨基酸序列的scfv。
[0283]
在一些实施方案中，tbm为抗cd3抗体或其抗原结合结构域，包括例如vh、vl、scfv、
轻链或重链(诸如iggl、igg2、igg4)。已知抗cd3抗体中的任一者均可用于本发明中，包括但不限于cris-7单克隆抗体(reinherz,e.l.等人(编),leukocyte typing ii,springer verlag,new york,(1986))、bc3单克隆抗体(anasetti等人(1990)j.exp.med.172:1691)、okt3(ortho multicenter transplant study group(1985)n.engl.j.med.313:337)和其衍生物，诸如okt3 ala-ala(herold等人(2003)j.clin.invest.11:409)、维西珠单抗(visilizu mab)(carpenter等人(2002)blood 99:2712)和145-2c11单克隆抗体(hirsch等人(1988)j.immunol.140:3766)、奥昔珠单抗(otelixizumab)和福雷芦单抗(foralumab)。本文考虑的其他cd3结合分子包括ucht-1(beverley,p c和callard,r.e.(1981)eur.j.immunol.11:329-334,sp34(silvana等人(1985)the embo journal.4:337-344)和wo2004/106380；wo2010/037838；wo2008/119567；wo2007/042261；wo2010/0150918；wo2018/052503；wo2016/204966中所描述的cd3结合分子。
[0284]
在一些实施方案中，tbm包含vh，所述vh包含含有seq id no:61的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:62的氨基酸序列的cdr-h2和/或含有seq id no:63的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，tbm包含vl，所述vl包含含有seq id no:64的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:65的氨基酸序列的cdr-l2和/或含有seq id no:66的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，tbm包含含有seq id no:67的氨基酸序列的vh。在一些实施方案中，tbm包含含有seq id no:68的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，tbm包含含有seq id no:79的氨基酸序列的scfv。
[0285]
在一些实施方案中，tbm为抗her2抗体或其抗原结合结构域，包括例如vh、vl、scfv、轻链或重链(诸如iggl、igg2、igg4)。已知抗her2抗体中的任一者均可用于本发明中，包括但不限于赫塞汀(herceptin)(1998,cancer res 58(13):2825-2831)、mdxh210(schwaab等人,2001,journal of immunotherapy,24(1):79-87)、迪西妥单抗(disitamab)(toxicol lett.2019.s0378-4274(19)30421-7)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(agus db,gordon ms,taylor c等人j clin oncol.2005；23(11):2534-2543)。
[0286]
在一些实施方案中，tbm包含vh，所述vh包含含有seq id no:69的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:70的氨基酸序列的cdr-h2和/或含有seq id no:71的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，tbm包含vl，所述vl包含含有seq id no:72的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:73的氨基酸序列的cdr-l2和/或含有seq id no:74的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，tbm包含含有seq id no:75的氨基酸序列的vh。在一些实施方案中，tbm包含含有seq id no:76的氨基酸序列的vl。
[0287]
如本技术中所用的术语“pdl1”包括人类pdl1(例如uniprot登录号q9nzq7)以及其变体、异型体和物种同源物(例如小鼠pdl1(uniprot登录号q9ep73)、大鼠pdl1(uniprot登录号p52944)、狗pdl1(uniprot登录号e2rkz5)、食蟹猴pdl1等)。
[0288]
如本技术中所用的术语“ctla4”包括人类ctla4(例如uniprot登录号p16410)以及其变体、异型体和物种同源物(例如小鼠ctla4(uniprot登录号p09793)、大鼠ctla4(uniprot登录号q9z1a7)、狗ctla4(uniprot登录号q9xsi1)、食蟹猴ctla4(uniprot登录号g7pl88)等)。
[0289]
如本技术中所用的术语“cd137”包括人类cd137(例如基因库登录号nm_001561；np_001552)以及其变体、异型体和物种同源物(例如小鼠cd137(基因库基因编号21942)、大
鼠cd137(基因库基因编号500590)、狗cd137(基因库基因编号608274)、食蟹猴ctla4(基因库基因编号102127961)等)。
[0290]
术语“cd3”在本领域中已知为六条链的多蛋白复合物(参见abbas和lichtman,2003；janeway等人,第172页和第178页,1999)。在哺乳动物中，复合物包含cd3γ链、cd3δ链、两个cd3ε链和cd3ξ链的同二聚体。cd3γ、cd3δ和cd3ε链为含有单一免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关细胞表面蛋白。cd3γ、cd3δ和cd3ε链的跨膜区为带负电荷的，其为允许这些链与带正电荷的t细胞受体链缔合的特征。cd3γ、cd3δ和cd3ε链的细胞内尾部各含有单一保守基序，称为免疫受体酪氨酸基活化基序或itam，而各cd3ξ链具有三个。在不受理论约束的情况下，相信itam对于tcr复合物的信号传导能力来说为重要的。如本文所用的cd3可来自各种动物物种，包括人、灵长类动物、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。举例来说，如本文所用的cd3包括人类cd3e(即，cd3ε；例如uniprot登录号p07766)以及其变体、异型体和物种同源物(例如小鼠cd3e(uniprot登录号p22646)、大鼠cd3e(uniprot登录号a0a0g2k986)、狗cd3e(uniprot登录号p27597)和食蟹猴cd3e(uniprot登录号q95li5))。
[0291]
如本技术中所用的术语“her2”包括人类her2(例如uniprot登录号p04626)以及其变体、异型体和物种同源物(例如小鼠her2(uniprot登录号p70424)、大鼠her2(uniprot登录号p06494)、狗her2、食蟹猴her2。her2也称为erbb2。
[0292]
本文所描述的tbm可结合人类靶标(例如pdl1、ctla4、cd137、cd3或her2)。在一些情况下，tbm可完全对人类靶标具特异性且可不展现物种或其他类型的交叉反应性。在其他情况下，tbm也结合来自除人类外的物种的靶标。
[0293]
接头
[0294]
本文所描述的多特异性抗体可包含安置在多肽中的各个区域之间的一个或多个接头(例如l1、l2、l3等)。
[0295]
可使用本领域中已知的任何适合的接头(例如柔性接头)，包括例如：甘氨酸聚合物(g)n，其中n为至少1(例如至少一、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10等)的整数；甘氨酸-丝氨酸聚合物(gs)n，其中n为至少1(例如至少一、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10等)的整数，诸如sgggs(seq id no:80)、gggsggggs(seq id no:81)、(g4s)4(seq id no:82)、ggggs(seq id no:130)、sggs(seq id no:131)、ggsg(seq id no:132)、ggsgg(seq id no:133)、gsgsg(seq id no:134)、gsggg(seq id no:135)、gggsg(seq id no:136)和/或gsssg(seq id no:137))；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；和类似物。接头序列可具有任何长度，诸如约1个氨基酸(例如甘氨酸或丝氨酸)至约20个氨基酸(例如20氨基酸甘氨酸聚合物或甘氨酸-丝氨酸聚合物)、约1个氨基酸至约15个氨基酸、约3个氨基酸至约12个氨基酸、约4个氨基酸至约10个氨基酸、约5个氨基酸至约9个氨基酸、约6个氨基酸至约8个氨基酸等。在一些实施方案中，接头的长度为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸中的任一者。
[0296]
示例性多特异性抗体
[0297]
本文所描述的示例性多特异性抗体包括但不限于靶向pdl1和cd137的双特异性抗体(例如pdl1
×
cd137和cd137
×
pdl1抗体)、靶向cd137和ctla4的双特异性抗体(例如cd137
×
ctla4抗体)、靶向cd3和细胞表面抗原的双特异性t细胞衔接器(bite)和靶向pdl1、cd137
和ctla4三特异性抗体(本文中也称为pdl1
×
cd137
×
ctla4抗体)。在一些实施方案中，多特异性抗体包含含有任一本文所描述的经工程改造的二硫键和/或盐桥或其组合的ch3结构域或fc区。在一些实施方案中，多特异性抗体不包含含有任一本文所描述的经工程改造的二硫键和/或盐桥或其组合的ch3结构域或fc区。
[0298]
在一些实施方案中，提供一种靶向pdl1和cd137的双特异性抗体，其包含第一多肽和第二多肽，其中：
[0299]
(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
[0300]
vh1-ch1-铰链-ch2-第一ch3-l1-scfv1；并且
[0301]
(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
[0302]
vl-cl；
[0303]
其中：
[0304]
vl为免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0305]
vh为免疫球蛋白重链可变结构域；
[0306]
scfv为单链可变片段；
[0307]
cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0308]
ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；
[0309]
ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；
[0310]
铰链为连接ch1结构域和ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；
[0311]
且l1为键或肽接头；
[0312]
其中vl与vh相缔合以形成特异性结合于cd137的fv；其中scfv特异性结合于pdl1。在一些实施方案中，scfv包含vh，所述vh包含含有seq id no:37的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:38的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:39的氨基酸序列的cdr-h3；和/或vl，所述vl包含含有seq id no:40的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:41的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:42的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，scfv包含含有seq id no:43的氨基酸序列的vh和/或含有seq id no:44的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，scfv自n端至c端包含：vh-l1-vl，其中l1为肽接头。在一些实施方案中，l1包含seq id no:82的氨基酸序列。在一些实施方案中，scfv包含vh中的在位置44的第一半胱氨酸残基和vl中的在位置100的第二半胱氨酸残基，其中第一半胱氨酸残基和第二半胱氨酸残基形成二硫键，并且其中编号是基于kabat编号。在一些实施方案中，scfv包含seq id no:77的氨基酸序列。在一些实施方案中，fv包含vh，所述vh包含含有seq id no:45的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:46的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:47的氨基酸序列的cdr-h3；和/或vl，所述vl包含含有seq id no:48的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:49的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:50的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，fv包含含有seq id no:51的氨基酸序列的vh和/或含有seq id no:52的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含n390c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含n390c取代。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg4 fc区，诸如具有s228p取代的igg4。在一些实施方案中，scfv经由接头，诸如包含seq id no:80或81的氨基酸序列的肽接头连接至第二多肽中的铰链。
[0313]
在一些实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含含有seq id no:96的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:97的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含含有seq id no:98的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:99的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含含有seq id no:100的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:101的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含含有seq id no:102的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:103的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含含有seq id no:104的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:105的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含含有seq id no:106的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:107的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含含有seq id no:108的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:109的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含含有seq id no:110的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:111的氨基酸序列的第二多肽。
[0314]
在一些实施方案中，提供一种靶向pdl1和cd137的双特异性抗体，其包含第一多肽和第二多肽，其中：
[0315]
(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
[0316]
vh1-ch1-铰链-ch2-第一ch3-l1-scfv1；并且
[0317]
(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
[0318]
vl-cl；
[0319]
其中：
[0320]
vl为免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0321]
vh为免疫球蛋白重链可变结构域；
[0322]
scfv为单链可变片段；
[0323]
cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0324]
ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；
[0325]
ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；
[0326]
铰链为连接ch1结构域和ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；
[0327]
且l1为键或肽接头；
[0328]
其中vl与vh相缔合以形成特异性结合于pdl1的fv；并且
[0329]
其中scfv特异性结合于cd137。在一些实施方案中，fv包含vh，所述vh包含含有seq id no:37的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:38的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:39的氨基酸序列的cdr-h3；和/或vl，所述vl包含含有seq id no:40的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:41的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:42的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，fv包含含有seq id no:43的氨基酸序列的vh和/或含有seq id no:44的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，scfv包含vh，所述vh包含含有seq id no:45的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:46的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:47的氨基酸序列的cdr-h3；和/或vl，所述vl包含含有seq id no:48的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:49的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:50的氨基酸序列的cdr-l3。在一
些实施方案中，scfv包含含有seq id no:51的氨基酸序列的vh和/或含有seq id no:52的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，scfv自n端至c端包含：vh-l1-vl，其中l1为肽接头。在一些实施方案中，l1包含seq id no:82的氨基酸序列。在一些实施方案中，scfv包含vh中的在位置44的第一半胱氨酸残基和vl中的在位置100的第二半胱氨酸残基，其中第一半胱氨酸残基和第二半胱氨酸残基形成二硫键，并且其中编号是基于kabat编号。在一些实施方案中，scfv包含seq id no:78的氨基酸序列。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含n390c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含n390c取代。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg4fc区，诸如具有s228p取代的igg4。在一些实施方案中，scfv经由接头，诸如包含seq id no:80或81的氨基酸序列的肽接头连接至第二多肽中的铰链。
[0330]
在一些实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含含有seq id no:84的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:85的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含含有seq id no:86的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:87的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含含有seq id no:88的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:89的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含含有seq id no:90的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:91的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含含有seq id no:92的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:93的氨基酸序列的第二多肽。在一些实施方案中，提供一种双特异性抗体，其包含含有seq id no:94的氨基酸序列的第一多肽和含有seq id no:95的氨基酸序列的第二多肽。
[0331]
在一些实施方案中，提供一种靶向pdl1、cd137和ctla4的三特异性抗体，其包含第一多肽、第二多肽和第三多肽，其中：
[0332]
(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
[0333]
vh-ch1-铰链-ch2-第一ch3-l1-scfv1；
[0334]
(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
[0335]
vh-ch1-铰链-ch2-第二ch3-l2-scfv2；
[0336]
(iii)第三多肽包含由下式表示的结构：
[0337]
vl-cl；并且
[0338]
(iv)第四多肽包含由下式表示的结构：
[0339]
vl-cl；
[0340]
其中：
[0341]
vh为免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0342]
vl为免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0343]
scfv1为第一单链可变片段；
[0344]
cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0345]
ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；
[0346]
ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；
[0347]
铰链为连接ch1结构域和ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且
[0348]
l1和l2独立地为键或肽接头；
[0349]
其中vl与vh相缔合以形成特异性结合于cd137的fv；其中scfv1特异性结合于pd-l1，并且scfv2特异性结合于ctla4。在一些实施方案中，scfv1包含vh，所述vh包含含有seq id no:37的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:38的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:39的氨基酸序列的cdr-h3；和/或vl，所述vl包含含有seq id no:40的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:41的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:42的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，scfv1包含含有seq id no:43的氨基酸序列的vh和/或含有seq id no:44的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，fv包含vh，所述vh包含含有seq id no:45的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:46的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:47的氨基酸序列的cdr-h3；和/或vl，所述vl包含含有seq id no:48的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:49的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:50的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，fv包含含有seq id no:51的氨基酸序列的vh和/或含有seq id no:52的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，scfv2包含vh，所述vh包含含有seq id no:53的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:54的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:55的氨基酸序列的cdr-h3；和/或vl，所述vl包含含有seq id no:56的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:57的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:58的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，scfv2包含含有seq id no:59的氨基酸序列的vh和/或含有seq id no:60的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代并且第二ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。
[0350]
在一些实施方案中，提供一种三特异性抗体，其包含：含有seq id no:118的氨基酸序列的第一多肽、含有seq id no:119的氨基酸序列的第二多肽和含有seq id no:120的氨基酸序列的第三多肽。在一些实施方案中，提供一种三特异性抗体，其包含：含有seq id no:121的氨基酸序列的第一多肽、含有seq id no:122的氨基酸序列的第二多肽和含有seq id no:123的氨基酸序列的第三多肽。在一些实施方案中，提供一种三特异性抗体，其包含：含有seq id no:124的氨基酸序列的第一多肽、含有seq id no:125的氨基酸序列的第二多肽和含有seq id no:126的氨基酸序列的第三多肽。
[0351]
在一些实施方案中，提供一种靶向cd3和肿瘤抗原(例如her2)的双特异性t细胞衔接器(bite)分子，其包含第一多肽、第二多肽和第三多肽，其中：
[0352]
(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
[0353]
vh-ch1-铰链-ch2-第一ch3；
[0354]
(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
[0355]
scfv-铰链-ch2-第二ch3；并且
[0356]
(iii)第三多肽包含由下式表示的结构：
[0357]
vl-cl；
[0358]
其中：
[0359]
vl为免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0360]
vh为免疫球蛋白重链可变结构域；
[0361]
scfv为单链可变片段；
[0362]
cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0363]
ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；
[0364]
ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；并且
[0365]
铰链为连接ch1结构域和ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；
[0366]
其中vl与vh相缔合以形成特异性结合于肿瘤抗原(例如her2)的fv；并且其中scfv特异性结合于cd3。在一些实施方案中，scfv包含vh，所述vh包含含有seq id no:61的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:62的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:63的氨基酸序列的cdr-h3；和/或vl，所述vl包含含有seq id no:64的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:65的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:66的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，scfv包含含有seq id no:67的氨基酸序列的vh和/或含有seq id no:68的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，scfv包含seq id no:79的氨基酸序列。在一些实施方案中，fv特异性结合于her2。在一些实施方案中，fv包含vh，所述vh包含含有seq id no:69的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:70的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:71的氨基酸序列的cdr-h3；和/或vl，所述vl包含含有seq id no:72的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:73的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:74的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，fv包含含有seq id no:75的氨基酸序列的vh和/或含有seq id no:76的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，多特异性抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。在一些实施方案中，提供一种双特异性t细胞衔接器分子，其包含含有seq id no:112的氨基酸序列的第一多肽、含有seq id no:113的氨基酸序列的第二多肽和含有seq id no:114的氨基酸序列的第三多肽。
[0367]
iv.可活化抗体
[0368]
本技术的某些方面涉及可活化抗体(包括可活化双特异性t细胞衔接器分子)、其可活化抗原结合片段或可活化抗体的衍生物。
[0369]
在一些实施方案中，可活化抗体包含含有靶向结合部分(tbm)、可裂解部分(cm)和遮蔽部分(mm)的多肽。在一些实施方案中，tbm包含结合至诸如cd3或her2的靶标的氨基酸序列。在一些实施方案中，tbm包含抗体或其抗体片段的抗原结合结构域(abd)。在一些实施方案中，tbm包含抗体轻链可变区(vl)和抗体重链可变区(vh)，其中vh和vl形成在不存在mm的情况下结合至靶标的结合结构域。在一些实施方案中，vh与vl共价连接，例如在scfv中。在一些实施方案中，vh和vl形成fv片段。在一些实施方案中，vh连接至抗体重链恒定区，并且vl连接至抗体轻链恒定区。在一些实施方案中，可活化抗体包含含有任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合的fc区。在一些实施方案中，可活化抗体包含不包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合的fc区。
[0370]
在一些实施方案中，可活化抗体包含自n端至c端包含以下结构的多肽：遮蔽部分(mm)-可裂解部分(cm)-vl，并且可活化抗体还包含含有vh的第二多肽(例如fab片段)。在一些实施方案中，可活化抗体包含自n端至c端包含以下结构的多肽：遮蔽部分(mm)-可裂解部
分(cm)-vl-vh(例如scfv)。在一些实施方案中，可活化抗体包含自n端至c端包含以下结构的多肽：遮蔽部分(mm)-可裂解部分(cm)-vh，并且可活化抗体还包含含有vl的第二多肽(例如fab片段)。在一些实施方案中，可活化抗体包含自n端至c端包含以下结构的多肽：遮蔽部分(mm)-可裂解部分(cm)-vh-vl(例如scfv)。
[0371]
在一些实施方案中，可活化抗体包含自n端至c端包含以下结构的多肽：遮蔽部分(mm)-l1-可裂解部分(cm)-l2-vl，并且可活化抗体还包含含有vh的第二多肽(例如fab片段)。在一些实施方案中，可活化抗体包含自n端至c端包含以下结构的多肽：遮蔽部分(mm)-l1-可裂解部分(cm)-l2-vl-l3-vh(例如scfv)。在一些实施方案中，可活化抗体包含自n端至c端包含以下结构的多肽：遮蔽部分(mm)-可裂解部分(cm)-l1-vh，并且可活化抗体还包含含有vl的第二多肽(例如fab片段)。在一些实施方案中，可活化抗体包含自n端至c端包含以下结构的多肽：遮蔽部分(mm)-l1-可裂解部分(cm)-l2-vh-l3-vl(例如scfv)。在一些实施方案中，l1、l2和/或l3为接头。在一些实施方案中，l1、l2和l3各自为接头，所述接头可独立地为键或肽接头，其独立选择的长度为1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个或10个或更多个氨基酸。
[0372]
在一些实施方案中，提供一种可活化抗体，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽、含有第二ch3结构域的第二多肽和第三多肽，其中：
[0373]
(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
[0374]
vh-ch1-铰链-ch2-第一ch3；
[0375]
(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
[0376]
mm1-cm1-scfv-铰链-ch2-第二ch3；并且
[0377]
(iii)第三多肽包含由下式表示的结构：
[0378]
mm2-cm2-vl-cl；
[0379]
其中：
[0380]
vl为免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0381]
vh为免疫球蛋白重链可变结构域；
[0382]
scfv为单链可变片段；
[0383]
cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0384]
ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；
[0385]
ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；
[0386]
铰链为连接ch1结构域和ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；
[0387]
mm1为第一遮蔽肽；
[0388]
mm2为第二遮蔽肽；
[0389]
cm1为第一可裂解肽；并且
[0390]
cm2为第二可裂解肽；
[0391]
其中vl与vh相缔合以形成特异性结合于第一靶标的第一fv；其中scfv特异性结合于第二靶标；其中当cm1未裂解时mm1抑制scfv结合至第一靶标；并且其中当cm2未裂解时mm2抑制第一fv结合至第二靶标。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域不包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合。在一些实施方案中，第一ch3结
构域和第二ch3结构域包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含n390c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代并且第二ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，可活化抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。在一些实施方案中，第一靶标为肿瘤抗原(例如her2)并且第二靶标为cd3(例如cd3e)。在一些实施方案中，第一靶标为cd3(例如cd3e)并且第二靶标为肿瘤抗原(例如her2)。
[0392]
在一些实施方案中，提供一种可活化抗体，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽、含有第二ch3结构域的第二多肽和第三多肽，其中：
[0393]
(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
[0394]
mm1-cm1-vh-ch1-铰链-ch2-第一ch3；
[0395]
(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
[0396]
mm2-cm2-scfv-铰链-ch2-第二ch3；并且
[0397]
(iii)第三多肽包含由下式表示的结构：
[0398]
vl-cl；
[0399]
其中：
[0400]
vl为免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0401]
vh为免疫球蛋白重链可变结构域；
[0402]
scfv为单链可变片段；
[0403]
cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0404]
ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；
[0405]
ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；
[0406]
铰链为连接ch1结构域和ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；
[0407]
mm1为第一遮蔽肽；
[0408]
mm2为第二遮蔽肽；
[0409]
cm1为第一可裂解肽；并且
[0410]
cm2为第二可裂解肽；
[0411]
其中vl与vh相缔合以形成特异性结合于第一靶标的第一fv；其中scfv特异性结合于第二靶标；其中当cm1未裂解时mm1抑制第一fv结合至第一靶标；并且其中当cm2未裂解时mm2抑制scfv结合至第二靶标。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域不包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合。在一些
实施方案中，第一ch3结构域包含n390c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代并且第二ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，可活化抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。在一些实施方案中，第一靶标为肿瘤抗原(例如her2)并且第二靶标为cd3(例如cd3e)。在一些实施方案中，第一靶标为cd3(例如cd3e)并且第二靶标为肿瘤抗原(例如her2)。
[0412]
在一些实施方案中，提供一种可活化抗体，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽、含有第二ch3结构域的第二多肽、第三多肽和第四多肽，其中：
[0413]
(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
[0414]
mm1-cm1-vh1-ch1-铰链-ch2-第一ch3；
[0415]
(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
[0416]
mm2-cm2-vh2-ch1-铰链-ch2-第二ch3；
[0417]
(iii)第三多肽包含由下式表示的结构：
[0418]
vl1-cl；并且
[0419]
(iv)第四多肽包含由下式表示的结构：
[0420]
vl2-cl；
[0421]
其中：
[0422]
vl1为第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0423]
vh1为第一免疫球蛋白重链可变结构域；
[0424]
vl2为第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0425]
vh2为第二免疫球蛋白重链可变结构域；
[0426]
cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0427]
ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；
[0428]
ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；
[0429]
铰链为连接ch1结构域和ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；
[0430]
mm1为第一遮蔽肽；
[0431]
mm2为第二遮蔽肽；
[0432]
cm1为第一可裂解肽；并且
[0433]
cm2为第二可裂解肽；
[0434]
其中vl1与vh1相缔合以形成特异性结合于第一靶标的第一fv；其中vl2与vh2相缔合以形成特异性结合于第二靶标的第二fv；其中当cm1未裂解时mm1抑制第一fv结合至第一靶标；并且其中当cm2未裂解时mm2抑制第二fv结合至第二靶标。在一些实施方案中，第一
ch3结构域和第二ch3结构域不包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含n390c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代并且第二ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，可活化抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。在一些实施方案中，第一靶标为肿瘤抗原(例如her2)并且第二靶标为cd3(例如cd3e)。在一些实施方案中，第一靶标为cd3(例如cd3e)并且第二靶标为肿瘤抗原(例如her2)。
[0435]
在一些实施方案中，提供一种可活化抗体，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽、含有第二ch3结构域的第二多肽、第三多肽和第四多肽，其中：
[0436]
(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
[0437]
mm1-cm1-vh1-ch1-铰链-ch2-第一ch3；
[0438]
(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
[0439]
vh2-ch1-铰链-ch2-第二ch3；
[0440]
(iii)第三多肽包含由下式表示的结构：
[0441]
vl1-cl；并且
[0442]
(iv)第四多肽包含由下式表示的结构：
[0443]
mm2-cm2-vl2-cl；
[0444]
其中：
[0445]
vl1为第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0446]
vh1为第一免疫球蛋白重链可变结构域；
[0447]
vl2为第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0448]
vh2为第二免疫球蛋白重链可变结构域；
[0449]
cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0450]
ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；
[0451]
ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；
[0452]
铰链为连接ch1结构域和ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；
[0453]
mm1为第一遮蔽肽；
[0454]
mm2为第二遮蔽肽；
[0455]
cm1为第一可裂解肽；并且
[0456]
cm2为第二可裂解肽；
[0457]
其中vl1与vh1相缔合以形成特异性结合于第一靶标的第一fv；其中vl2与vh2相缔
合以形成特异性结合于第二靶标的第二fv；其中当cm1未裂解时mm1抑制第一fv结合至第一靶标；并且其中当cm2未裂解时mm2抑制第二fv结合至第二靶标。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域不包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含n390c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代并且第二ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，可活化抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。在一些实施方案中，第一靶标为肿瘤抗原(例如her2)并且第二靶标为cd3(例如cd3e)。在一些实施方案中，第一靶标为cd3(例如cd3e)并且第二靶标为肿瘤抗原(例如her2)。
[0458]
在一些实施方案中，提供一种可活化抗体，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽、含有第二ch3结构域的第二多肽、第三多肽和第四多肽，其中：
[0459]
(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
[0460]
vh1-ch1-铰链-ch2-第一ch3；
[0461]
(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
[0462]
vh2-ch1-铰链-ch2-第二ch3；
[0463]
(iii)第三多肽包含由下式表示的结构：
[0464]
mm1-cm1-vl1-cl；并且
[0465]
(iv)第四多肽包含由下式表示的结构：
[0466]
mm2-cm2-vl2-cl；
[0467]
其中：
[0468]
vl1为第一免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0469]
vh1为第一免疫球蛋白重链可变结构域；
[0470]
vl2为第二免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0471]
vh2为第二免疫球蛋白重链可变结构域；
[0472]
cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0473]
ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；
[0474]
ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；
[0475]
铰链为连接ch1结构域和ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；
[0476]
mm1为第一遮蔽肽；
[0477]
mm2为第二遮蔽肽；
[0478]
cm1为第一可裂解肽；并且
[0479]
cm2为第二可裂解肽；
[0480]
其中vl1与vh1相缔合以形成特异性结合于第一靶标的第一fv；其中vl2与vh2相缔合以形成特异性结合于第二靶标的第二fv；其中当cm1未裂解时mm1抑制第一fv结合至第一靶标；并且其中当cm2未裂解时mm2抑制第二fv结合至第二靶标。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域不包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合。在一些实施方案中，第一ch3结构域和第二ch3结构域包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含n390c取代并且第二ch3结构域包含s400c取代，或第一ch3结构域包含s400c取代并且第二ch3结构域包含n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代并且第二ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，可活化抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。在一些实施方案中，第一靶标为肿瘤抗原(例如her2)并且第二靶标为cd3(例如cd3e)。在一些实施方案中，第一靶标为cd3(例如cd3e)并且第二靶标为肿瘤抗原(例如her2)。
[0481]
在一些实施方案中，可活化抗体是基于本文所描述的多特异性抗体中的任一者设计的，例如通过将遮蔽部分(mm)经由可裂解部分(cm)融合至多特异性抗体中的靶向结合部分(tbm)，其中当cm未裂解时mm抑制tbm结合至其靶标。可活化抗体已描述于例如wo2019/149282中，其内容以全文引用的方式并入本文中。可活化抗体可包含描述于章节iii“多特异性抗体”的小节“靶标结合部分(tbm)”中的tbm中的任一者。本文所描述的可活化抗体可包含描述于章节iii“多特异性抗体”的小节“接头”中(例如安置在mm与cm、cm与tbm或tbm与fc的铰链区之间)的一个或多个接头。
[0482]
mm是指当可活化抗体的cm完整(例如未由对应酶裂解，和/或含有未还原的半胱氨酸-半胱氨酸二硫键)时，mm妨碍或抑制tbm结合至其靶标的氨基酸序列。在一些实施方案中，mm如此高效地妨碍或抑制tbm结合至其靶标，以致tbm结合至其靶标极其低和/或低于检测限(例如在elisa或流式细胞术分析中不能检测到结合)。cm的氨基酸序列可与mm重叠或包括于mm内。应注意，为方便起见，“abp”或“可活化抗体”在本文中用于指呈未裂解(或“天然”)状态以及呈裂解状态的abp或可活化抗体。对一般熟练技工来说将显而易见的是，在一些实施方案中，裂解的abp可因cm例如由蛋白酶裂解从而至少释放mm而缺乏mm(例如在mm不通过共价键(例如半胱氨酸残基之间的二硫键)连接至abp的情况下)。下文更详细地描述示例性abp。
[0483]
cm通常包括可裂解的氨基酸序列，例如充当酶的底物和/或能够形成可还原的二硫键的半胱氨酸-半胱氨酸对。因而，当术语“裂解”、“可裂解”、“裂解的”和类似术语结合cm使用时，所述术语涵盖例如由蛋白酶酶促裂解，以及经由可由暴露于还原剂所引起的二硫键还原破坏半胱氨酸-半胱氨酸对之间的二硫键。
[0484]
在一些实施方案中，可活化抗体不诱导adcc效应。测量adcc效应的方法为本领域中已知的。在一些实施方案中，相对于对照，可活化抗体(当呈活性形式或非活性形式时)不产生adcc效应达超过约10％(不诱导adcc达超过约10％、超过约5％、超过约1％、超过约0.1％、超过约0.01％)。
[0485]
在一些实施方案中，可活化抗体(例如bite分子)能够抑制肿瘤细胞生长和/或增殖。在一些实施方案中，相对于不与可活化抗体接触的对应肿瘤细胞(或相对于不与同种型对照抗体和t细胞接触的对应肿瘤细胞)，当与可活化抗体和t细胞接触时，肿瘤细胞生长和/或增殖抑制至少约5％(例如至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约99％)。在一些实施方案中，当为受试者施用可活化抗体时，可活化抗体能够使受试者中的肿瘤体积减小。在一些实施方案中，相对于受试者中的初始肿瘤体积(例如在施用可活化抗体之前；与施用同种型对照抗体的受试者中的对应肿瘤相比)，可活化抗体(例如bite分子)能够使受试者中的肿瘤体积减小至少约5％(例如至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约99％)。监测肿瘤细胞生长/增殖、肿瘤体积和/或肿瘤抑制的方法为本领域中已知的。
[0486]
在一些实施方案中，可活化抗体对癌症具有治疗作用。在一些实施方案中，可活化抗体使癌症的一个或多个迹象或症状减轻。在一些实施方案中，当施用可活化抗体时，罹患癌症的受试者进入部分或完全缓解。
[0487]
遮蔽部分(mm)
[0488]
本文所描述的可活化抗体包含一个、两个或更多个遮蔽部分。示例性遮蔽部分的序列显示于下表d中。遮蔽部分可分离自噬菌体展示文库，例如如以全文引用的方式并入本文中的wo2019/149282中所描述。
[0489]
在一些实施方案中，可活化抗体包含含有seq id no:35的氨基酸序列的mm。在一些实施方案中，可活化抗体包含含有seq id no:36的氨基酸序列的mm。在一些实施方案中，可活化抗体包含含有seq id no:35的氨基酸序列的第一mm和含有seq id no:36的氨基酸序列的第二mm。
[0490]
表d.遮蔽部分.
[0491]
seq id no遮蔽部分序列35cd3 mmevgsypyddpdcpshdsdcdn36her2 mmesdacdadpfdcqaggggsgsggs
[0492]
在一些实施方案中，遮蔽肽(mm)妨碍、阻断与其靶标(例如“非活性可活化抗体”)的结合、降低与其靶标结合的能力、阻止、抑制与其靶标的结合或与对应靶标结合部分竞争结合至其靶标。在一些实施方案中，仅在抗体尚未活化(例如通过ph值改变(增加或降低)而活化、通过温度转变(增加或降低)而活化、在与第二分子(诸如小分子或蛋白质配位体)接触之后活化等)时，遮蔽肽(mm)妨碍、阻断、减少、阻止、抑制与其靶标的结合或与靶标结合部分竞争结合至其靶标。在一些实施方案中，活化诱导可裂解部分的裂解。在一些实施方案中，活化诱导多肽的构象变化(例如mm的置换)，从而使得mm不再阻止可活化抗体结合至其靶标。在一些实施方案中，仅在可裂解部分(cm)尚未由在可裂解部分(cm)内裂解的一个或多个蛋白酶裂解时，mm妨碍、阻断与其靶标的结合、降低与其靶标结合的能力、阻止、抑制与
其靶标的结合或与靶标结合部分竞争结合至其靶标。在一些实施方案中，在活化之前mm具有至少约2.0(例如至少约2.0、至少约3.0、至少约4.0、至少约5.0、至少约6.0、至少约7.0、至少约8.0、至少约9.0、至少约10、至少约25、至少约50、至少约75、至少约100、至少约150、至少约200、至少约300、至少约400、至少约500等)的遮蔽效率。在一些实施方案中，将遮蔽效率测量为包含mm的可活化抗体对于结合其靶标的亲和力(活化之前)相对于缺乏mm的多肽对于结合其靶标的亲和力的差异(例如包含mm的可活化抗体(活化之前)相对于缺乏mm的亲本抗体对靶标抗原(诸如cd3或her2)的亲和力的差异，或包含mm的可活化抗体(活化之前)对靶标抗原(诸如cd3或her2)的亲和力相对于活化之后可活化抗体对靶标抗原的亲和力的差异)。在一些实施方案中，通过用包含mm的可活化抗体的结合(活化之前)的ec50除以亲本抗体的ec50(例如通过elisa来测量ec50)来测量遮蔽效率。在一些实施方案中，将遮蔽效率测量为活化之前包含mm的可活化抗体对于结合其靶标的亲和力相对于活化之后包含mm的可活化抗体对于结合其靶标的亲和力的差异(例如活化之前可活化抗体对靶标抗原(诸如cd3或her2)的亲和力相对于活化之后的可活化抗体的差异)。在一些实施方案中，mm结合至靶标结合部分(tbm)，并且防止可活化抗体结合至其靶标(例如“非活性”可活化抗体)。在一些实施方案中，mm对于结合至靶标结合部分(tbm)具有比靶标结合部分(tbm)对其靶标的解离常数大的解离常数。解离常数可例如通过诸如elisa、表面等离子体共振或生物层干涉术(bli)或流式细胞术的技术来测量。
[0493]
在一些实施方案中，在多肽已活化(例如通过用在可裂解部分(cm)内裂解的一种或多种蛋白酶处理而活化、通过ph值改变(增加或降低)而活化、通过温度转变(增加或降低)而活化、在与第二分子(诸如酶)接触之后活化等)之后，mm不妨碍、阻断与其靶标的结合、降低与其靶标结合的能力、阻止、抑制与其靶标的结合或与靶标结合部分(tbm)竞争结合至其靶标。在一些实施方案中，在可裂解部分(cm)已由在可裂解部分(cm)内裂解的一种或多种蛋白酶裂解之后，mm不妨碍、阻断与其靶标的结合、降低与其靶标结合的能力、阻止、抑制与其靶标的结合或与靶标结合部分(tbm)竞争结合至其靶标。在一些实施方案中，在活化之后mm具有至多约1.75(例如至多约1.75、至多约1.5、至多约1.4、至多约1.3、至多约1.2、至多约1.1、至多约1.0、至多约0.9、至多约0.8、至多约0.7、至多约0.6或至多约0.5等)的遮蔽效率(例如与亲本抗体的亲和力相比，活化之后可活化抗体的相对亲和力)。
[0494]
在一些实施方案中，本文所描述的mm中的任一者还可包含一个或多个其他氨基酸序列(例如一个或多个多肽标签)。适合的其他氨基酸序列的实例可包括但不限于纯化标签(诸如his-标签、flag-标签、麦芽糖结合蛋白和谷胱甘肽-s-转移酶标签)、检测标签(诸如通过光度测定可检测的标签(例如红色或绿色荧光蛋白等))、具有可检测酶活性的标签(例如碱性磷酸酶等)、含有分泌序列、前导序列和/或稳定序列的标签、蛋白酶裂解位点(例如弗林蛋白酶裂解位点、tev裂解位点、凝血酶裂解位点)和类似标签。在一些实施方案中，所述一个或多个其他氨基酸序列位于mm的n端。
[0495]
可裂解部分(cm)
[0496]
在一些实施方案中，可活化抗体包含一个或多个cm，其中的每一者安置在mm与tbm之间。
[0497]
在一些实施方案中，cm至少包含第一裂解位点(cs1)(例如第一蛋白酶裂解位点)。在一些实施方案中，第一裂解位点为第一蛋白酶裂解位点。可使用由本领域中已知的任何
蛋白酶(例如已知与包含cm的多肽的靶标共同局部化的蛋白酶)识别和/或裂解的任何适合的蛋白酶裂解位点，包括例如由尿激酶型纤溶酶原活化剂(upa)；基质金属蛋白酶(例如mmp-1、mmp-2、mmp-3、mmp-7、mmp-8、mmp-9、mmp-10、mmp-11、mmp-12、mmp-13、mmp-14、mmp-15、mmp-16、mmp-17、mmp-19、mmp-20、mmp-23、mmp-24、mmp-26和/或mmp-27)；烟草蚀刻病毒(tev)蛋白酶；纤维蛋白溶酶；凝血酶；psa；psma；adams/adamts(例如adam 8、adam 9、adamio、adam12、adamis、adam17/tace、adamdeci、adamtsi、adamts4和/或adamts5))；半胱天冬酶(例如半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10、半胱天冬酶-11、半胱天冬酶-12、半胱天冬酶-13和/或半胱天冬酶-14)；天冬氨酸蛋白酶(例如race和/或肾素)；天冬氨酸组织蛋白酶(例如组织蛋白酶d和/或组织蛋白酶e)；半胱氨酸组织蛋白酶(例如组织蛋白酶b、组织蛋白酶c、组织蛋白酶k、组织蛋白酶l、组织蛋白酶s、组织蛋白酶v/l2和/或组织蛋白酶x/z/p)；半胱氨酸蛋白酶(例如克鲁兹蛋白酶(cruzipain)、豆荚蛋白和/或otubain-2)；klk(例如klk4、klk5、klk6、klk7、klk8、klk10、klk11、klk13和/或klk14)；金属蛋白酶(例如甲基多巴、脑啡肽酶、psma和/或bmp-1)；丝氨酸蛋白酶(例如活化蛋白质c、组织蛋白酶a、组织蛋白酶g、胃促胰酶和/或凝血因子蛋白酶(诸如fviia、fixa、fxa、fxla、fxiia))；弹性酶；颗粒酶b；胍基苯甲酸酯酶；htral；人类嗜中性粒细胞弹性酶；乳铁传递蛋白；马拉普星(marapsin)；ns3/4a；pace4；tpa；类胰蛋白酶；ii型跨膜丝氨酸蛋白酶(ttsp)(例如desc1、dpp-4、fap、hepsin、间质蛋白酶-2、mt-sp1/间质蛋白酶、tmprss2、tmprss3和/或tmprss4)等识别和/或裂解的蛋白酶裂解位点。在一些实施方案中，第一蛋白酶裂解位点为选自以下的蛋白酶的裂解位点：upa、mmp-1、mmp-2、mmp-3、mmp-8、mmp-9、mmp-14、tev蛋白酶、纤维蛋白溶酶、凝血酶、因子x、psa、psma、组织蛋白酶d、组织蛋白酶k、组织蛋白酶s、adam10、adam12、adamts、半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10、半胱天冬酶-11、半胱天冬酶-12、半胱天冬酶-13、半胱天冬酶-14和tace。在一些实施方案中，第一蛋白酶裂解位点为选自以下的蛋白酶的裂解位点：upa、mmp-2、mmp-9和/或tev蛋白酶。在一些实施方案中，蛋白酶裂解包含选自以下的氨基酸序列：sgrsa(seq id no:127)、plglag(seq id no:128)和enlyfqg(seq id no:129)。
[0498]
在一些实施方案中，可裂解部分(cm)还包含至少第二裂解位点(例如至少第二裂解位点、至少第三裂解位点、至少第四裂解位点、至少第五裂解位点等)。在一些实施方案中，可裂解部分(cm)还包含第二裂解位点(cs2)。在一些实施方案中，第二裂解位点为第二蛋白酶裂解位点。第二蛋白酶裂解位点可为由上文所描述的蛋白酶中的任一者识别和/或裂解的任何适合的蛋白酶裂解位点。在一些实施方案中，第一(cs1)和第二(cs2)裂解位点为由相同蛋白酶识别和/或裂解的蛋白酶裂解位点。在一些实施方案中，第一(cs1)和第二(cs2)裂解位点为由不同蛋白酶识别和/或裂解的蛋白酶裂解位点(例如第一蛋白酶裂解位点由upa识别和/或裂解，而第二蛋白酶裂解位点由mmp-2识别和/或裂解；第一蛋白酶裂解位点由upa识别和/或裂解，而第二蛋白酶裂解位点由mmp-9识别和/或裂解；第一蛋白酶裂解位点由upa识别和/或裂解，而第二蛋白酶裂解位点由tev蛋白酶识别和/或裂解；等)。在一些实施方案中，至少第二裂解位点(cs2)位于第一接头(l1)的c端。在一些实施方案中，可裂解部分(cm)自n端至c端包含以下结构：(cs1)-l1-(cs2)。
[0499]
在一些实施方案中，可裂解部分(cm)还包含至少第二接头(例如至少第二接头、至少第三接头、至少第四接头、至少第五接头等)。在一些实施方案中，可裂解部分(cm)还包含第二接头(l2)。第二接头(l2)可为上文所描述的任何适合的接头。在一些实施方案中，第一(l1)和第二(l2)接头为相同的。在一些实施方案中，第一(l1)和第二(l2)接头为不同的。在一些实施方案中，至少第二接头(l2)位于第二裂解位点(cs2)的c端。在一些实施方案中，可裂解部分(cm)自n端至c端包含以下结构：(cs1)-l1-(cs2)-l2。
[0500]
靶向cd3的可活化抗体
[0501]
本技术提供靶向cd3的可活化抗体、可活化抗体片段和多肽，其包含含有seq id no:35的氨基酸序列的遮蔽部分(mm)。
[0502]
在一些实施方案中，提供一种抗体轻链，其包含自n端至c端包含mm、可裂解部分(cm)和靶标结合部分(tbm)的多肽，其中mm包含seq id no:35的氨基酸序列；其中cm至少包含第一裂解位点；并且其中tbm包含抗cd3抗体的vl。在一些实施方案中，抗cd3抗体包含vl，所述vl包含含有seq id no:64的氨基酸序列的cdr-l1、含有seq id no:65的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:66的氨基酸序列的cdr-l3。
[0503]
在一些实施方案中，提供一种抗体重链，其包含自n端至c端包含mm、cm和tbm的多肽，其中mm包含seq id no:35的氨基酸序列；其中cm至少包含第一裂解位点；并且其中tbm包含抗cd3抗体的vh。在一些实施方案中，抗cd3抗体包含vh，所述vh包含含有seq id no:61的氨基酸序列的cdr-h1、含有seq id no:62的氨基酸序列的cdr-h2。
[0504]
在一些实施方案中，提供一种靶向cd3的可活化抗体，其包含自n端至c端包含mm、cm和tbm的第一多肽，其中mm包含seq id no:35的氨基酸序列，其中当cm未裂解时mm抑制可活化抗体结合至cd3；其中cm至少包含第一裂解位点；其中tbm包含vl，并且可活化抗体还包含含有vh的第二多肽；并且其中当cm裂解时可活化抗体经由vh和vl结合至cd3。在一些实施方案中，可活化抗体包含vh，所述vh包含含有seq id no:61的氨基酸序列的cdr-h1、含有seq id no:62的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:63的氨基酸序列的cdr-h3；和/或vl，所述vl包含含有seq id no:64的氨基酸序列的cdr-l1、含有seq id no:65的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:66的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，可活化抗体包含含有seq id no:67的氨基酸序列的vh和/或含有seq id no:68的氨基酸序列的vl。
[0505]
在一些实施方案中，提供一种靶向cd3的可活化抗体，其包含自n端至c端包含mm、cm和tbm的第一多肽，其中mm包含seq id no:35的氨基酸序列，其中当cm未裂解时mm抑制可活化抗体结合至cd3；其中cm至少包含第一裂解位点；其中tbm包含vh，并且可活化抗体还包含含有vl的第二多肽；并且其中当cm裂解时可活化抗体经由vh和vl结合至cd3。在一些实施方案中，可活化抗体包含vh，所述vh包含含有seq id no:61的氨基酸序列的cdr-h1、含有seq id no:62的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:63的氨基酸序列的cdr-h3；和/或vl，所述vl包含含有seq id no:64的氨基酸序列的cdr-l1、含有seq id no:65的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:66的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，可活化抗体包含含有seq id no:67的氨基酸序列的vh和/或含有seq id no:68的氨基酸序列的vl。
[0506]
在一些实施方案中，提供一种靶向cd3的可活化抗体，其包含自n端至c端包含mm、cm和scfv的第一多肽，其中mm包含seq id no:35的氨基酸序列，其中当cm未裂解时mm抑制可活化抗体结合至cd3；其中cm至少包含第一裂解位点；并且其中当cm裂解时可活化抗体经
由scfv结合至cd3。在一些实施方案中，scfv包含vh，所述vh包含含有seq id no:61的氨基酸序列的cdr-h1、含有seq id no:62的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:63的氨基酸序列的cdr-h3；和/或vl，所述vl包含含有seq id no:64的氨基酸序列的cdr-l1、含有seq id no:65的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:66的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，scfv包含含有seq id no:67的氨基酸序列的vh和/或含有seq id no:68的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，scfv自n端至c端包含：vl和vh。在一些实施方案中，scfv自n端至c端包含：vh和vl。在一些实施方案中，scfv包含seq id no:79的氨基酸序列。
[0507]
在一些实施方案中，靶向cd3的可活化抗体为多特异性抗体，诸如双特异性抗体。在一些实施方案中，靶向cd3的可活化抗体为双特异性t细胞衔接器(bite)分子，其也靶向肿瘤抗原，诸如her2。
[0508]
在一些实施方案中，提供一种可活化双特异性t细胞衔接器分子，其包含：包含第一ch3结构域的第一多肽、包含第二ch3结构域的第二多肽和第三多肽，其中：
[0509]
(i)第一多肽包含由下式表示的结构：
[0510]
vh-ch1-铰链-ch2-第一ch3；
[0511]
(ii)第二多肽包含由下式表示的结构：
[0512]
mm1-cm1-scfv-铰链-ch2-第二ch3；并且
[0513]
(iii)第三多肽包含由下式表示的结构：
[0514]
mm2-cm2-vl-cl；
[0515]
其中：
[0516]
vl为免疫球蛋白轻链可变结构域；
[0517]
vh为免疫球蛋白重链可变结构域；
[0518]
scfv为单链可变片段；
[0519]
cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；
[0520]
ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；
[0521]
ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；
[0522]
铰链为连接ch1结构域和ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；
[0523]
mm1为第一遮蔽肽；
[0524]
mm2为第二遮蔽肽；
[0525]
cm1为第一可裂解肽；并且
[0526]
cm2为第二可裂解肽；
[0527]
其中vl与vh相缔合以形成特异性结合于肿瘤抗原(例如her2)的第一fv；其中scfv特异性结合于cd3；其中当cm1未裂解时mm1抑制scfv结合至cd3；并且其中当cm2未裂解时mm2抑制第一fv结合至肿瘤抗原(例如her2)。在一些实施方案中，mm1包含seq id no:35的氨基酸序列。在一些实施方案中，scfv包含vh，所述vh包含含有seq id no:61的氨基酸序列的cdr-h1、含有seq id no:62的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:63的氨基酸序列的cdr-h3；和/或vl，所述vl包含含有seq id no:64的氨基酸序列的cdr-l1、含有seq id no:65的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:66的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，scfv包含含有seq id no:67的氨基酸序列的vh和/或含有seq id no:68的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，scfv包含seq id no:79的氨基酸序列。
[0528]
在一些实施方案中，可活化bite分子靶向her2。在一些实施方案中，mm2包含seq id no:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，vh包含含有seq id no:69的氨基酸序列的cdr-h1、含有seq id no:70的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:71的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，vl包含含有seq id no:72的氨基酸序列的cdr-l1、含有seq id no:73的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:74的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，vh包含seq id no:75的氨基酸序列。在一些实施方案中，vl包含seq id no:76的氨基酸序列。
[0529]
在根据本文所描述的靶向cd3的可活化抗体(包括bite分子)中的任一者的一些实施方案中，可活化抗体包含第一ch3结构域和第二ch3结构域，其不包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合。在一些实施方案中，可活化抗体包含第一ch3结构域和第二ch3结构域，其包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，可活化抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。
[0530]
示例性bite分子显示于例如表10和表11中。在一些实施方案中，提供一种可活化双特异性t细胞衔接器分子，其包含含有seq id no:115的氨基酸序列的第一多肽、含有seq id no:116的氨基酸序列的第二多肽和含有seq id no:117的氨基酸序列的第三多肽。
[0531]
靶向her2的可活化抗体
[0532]
本技术提供靶向her2的可活化抗体、可活化抗体片段和多肽，其包含含有seq id no:36的氨基酸序列的遮蔽部分(mm)。
[0533]
在一些实施方案中，提供一种抗体轻链，其包含自n端至c端包含mm、可裂解部分(cm)和靶标结合部分(tbm)的多肽，其中mm包含seq id no:36的氨基酸序列；其中cm至少包含第一裂解位点；并且其中tbm包含抗her2抗体的vl。在一些实施方案中，抗her2抗体包含vl，所述vl包含含有seq id no:72的氨基酸序列的cdr-l1、含有seq id no:73的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:74的氨基酸序列的cdr-l3。
[0534]
在一些实施方案中，提供一种抗体重链，其包含自n端至c端包含mm、cm和tbm的多肽，其中mm包含seq id no:36的氨基酸序列；其中cm至少包含第一裂解位点；并且其中tbm包含抗her2抗体的vh。在一些实施方案中，抗her2抗体包含vh，所述vh包含含有seq id no:69的氨基酸序列的cdr-h1、含有seq id no:70的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:71的氨基酸序列的cdr-h3。
[0535]
在一些实施方案中，提供一种靶向her2的可活化抗体，其包含自n端至c端包含mm、cm和tbm的第一多肽，其中mm包含seq id no:36的氨基酸序列，其中当cm未裂解时mm抑制可活化抗体结合至her2；其中cm至少包含第一裂解位点；其中tbm包含vl，并且可活化抗体还包含含有vh的第二多肽；并且其中当cm裂解时可活化抗体经由vh和vl结合至her2。在一些实施方案中，可活化抗体包含vh，所述vh包含含有seq id no:69的氨基酸序列的cdr-h1、含有seq id no:70的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:71的氨基酸序列的cdr-h3；和/或vl，所述vl包含含有seq id no:72的氨基酸序列的cdr-l1、含有seq id no:73的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:74的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，可活化抗
体包含含有seq id no:75的氨基酸序列的vh和/或含有seq id no:76的氨基酸序列的vl。
[0536]
在一些实施方案中，提供一种靶向her2的可活化抗体，其包含自n端至c端包含mm、cm和tbm的第一多肽，其中mm包含seq id no:36的氨基酸序列，其中当cm未不裂解时mm抑制可活化抗体结合至her2；其中cm至少包含第一裂解位点；其中tbm包含vh，并且可活化抗体还包含含有vl的第二多肽；并且其中当cm裂解时可活化抗体经由vh和vl结合至her2。在一些实施方案中，可活化抗体包含vh，所述vh包含含有seq id no:69的氨基酸序列的cdr-h1、含有seq id no:70的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:71的氨基酸序列的cdr-h3；和/或vl，所述vl包含含有seq id no:72的氨基酸序列的cdr-l1、含有seq id no:73的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:74的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，可活化抗体包含含有seq id no:75的氨基酸序列的vh和/或含有seq id no:76的氨基酸序列的vl。
[0537]
在一些实施方案中，提供一种靶向her2的可活化抗体，其包含自n端至c端包含mm、cm和scfv的第一多肽，其中mm包含seq id no:36的氨基酸序列，其中当cm未裂解时mm抑制可活化抗体结合至her2；其中cm至少包含第一裂解位点；并且其中当cm裂解时可活化抗体经由scfv结合至her2。在一些实施方案中，scfv包含vh，所述vh包含含有seq id no:69的氨基酸序列的cdr-h1、含有seq id no:70的氨基酸序列的cdr-h2和含有seq id no:71的氨基酸序列的cdr-h3；和/或vl，所述vl包含含有seq id no:72的氨基酸序列的cdr-l1、含有seq id no:73的氨基酸序列的cdr-l2和含有seq id no:74的氨基酸序列的cdr-l3。在一些实施方案中，scfv包含含有seq id no:75的氨基酸序列的vh和/或含有seq id no:76的氨基酸序列的vl。在一些实施方案中，scfv自n端至c端包含：vl和vh。在一些实施方案中，scfv自n端至c端包含：vh和vl。在一些实施方案中，scfv包含seq id no:79的氨基酸序列。
[0538]
在一些实施方案中，靶向her2的可活化抗体为多特异性抗体，诸如双特异性抗体。在一些实施方案中，靶向her2的可活化抗体为双特异性t细胞衔接器(bite)分子，其也靶向cd3。
[0539]
在根据本文所描述的靶向her2的可活化抗体(包括bite分子)中的任一者的一些实施方案中，可活化抗体包含第一ch3结构域和第二ch3结构域，其不包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合。在一些实施方案中，可活化抗体包含第一ch3结构域和第二ch3结构域，其包含任一本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥或其组合。在一些实施方案中，第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。在一些实施方案中，可活化抗体包含igg1 fc区，诸如具有n297a取代的igg1 fc。
[0540]
v.变体和衍生物
[0541]
本文也考虑本文所描述的异二聚蛋白质、多特异性抗体和可活化抗体中的任一种的变体和衍生物。
[0542]
在一些实施方案中，在保留亲本异二聚蛋白质或抗体的总分子结构的同时，对亲本异二聚蛋白质或抗体的氨基酸序列进行修饰而衍生出异二聚蛋白质或抗体衍生物。可对亲本异二聚蛋白质或抗体的任何区域的氨基酸序列链进行修饰，诸如构架区、cdr区或恒定区。修饰的类型包括亲本异二聚蛋白质或抗体的一个或多个氨基酸的取代、插入、缺失或其
组合。
[0543]
在一些实施方案中，抗体(例如多特异性抗体或可活化抗体)衍生物包含与如seq id no:84-143中的任一者中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的多肽。在一些实施方案中，抗体(例如多特异性抗体或可活化抗体)衍生物包含与如seq id no:43、44、51、52、59、60、67、68、75和76中的任一者中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的vl或vh区。在一些实施方案中，抗体衍生物包含与如seq id no:37、45、53、61和69中的任一者中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的cdr-h1氨基酸序列区域。在一些实施方案中，抗体衍生物包含与如seq id no:38、46、54、62和70中的任一者中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的cdr-h2氨基酸序列区域。在一些实施方案中，抗体衍生物包含与如seq id no:39、47、55、63和71中的任一者中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的cdr-h3氨基酸序列区域。在一些实施方案中，抗体衍生物包含与如seq id no:40、48、56、64和72中的任一者中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的cdr-l1氨基酸序列区域。在一些实施方案中，抗体衍生物包含与如seq id no:41、49、57、65和73中的任一者中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的cdr-l2氨基酸序列区域。在一些实施方案中，抗体衍生物包含与如seq id no:42、50、58、66和74中的任一者中所阐述的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的cdr-l3氨基酸序列区域。
[0544]
在一些实施方案中，异二聚蛋白质或抗体衍生物包含本文所描述的异二聚蛋白质或抗体的氨基酸序列的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15处保守或非保守取代，和/或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15处添加和/或缺失。
[0545]
氨基酸取代涵盖保守取代与非保守取代两者。术语“保守氨基酸取代”意味着一种氨基酸经另一种氨基酸置换，其中两种氨基酸在所涉及的残基的某些理化特性(诸如极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性质)方面具有相似性。举例来说，取代典型地可在以下基团中的每一种内进行：(a)非极性(疏水性)氨基酸，诸如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；(b)极性中性氨基酸，诸如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；(c)带正电荷的(碱性)氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和(d)带负电荷的(酸性)氨基酸，诸如天冬氨酸和谷氨酸。
[0546]
可在抗体的氨基酸序列的任何位置，包括cdr、构架区或恒定区中进行修饰。在一些实施方案中，本技术提供一种抗体衍生物，其含有本文所描述的说明性抗体的vh和vl cdr序列，但含有不同于说明性抗体的构架序列。此类构架序列可获自包括种系抗体基因序
列的公共dna资料库或公布的参考文献。举例来说，用于人类重链和轻链可变区基因的种系dna序列可见于基因库资料库中或“vbase”人类种系序列资料库中(kabat等人,sequences of proteins of immunological interest,第五版,u.s.department of health and human services,nih公布第91-3242号(1991)；tomlinson等人,j.mal.biol.227:776-798(1992)；和cox等人,eur.j.immunol.24:827-836(1994))。可用于构建抗体衍生物的构架序列包括在结构上类似于由本技术的说明性抗体使用的构架序列的那些构架序列。举例来说，说明性抗体的cdr-h1、cdr-h2和cdr-h3序列以及cdr-l1、cdr-l2和cdr-l3序列可移植至序列与衍生出构架序列的种系免疫球蛋白基因中所见相同的构架区上，或cdr序列可移植至与种系序列相比含有一个或多个突变的构架区上。
[0547]
在一些实施方案中，抗体衍生物为嵌合抗体，其包含本文所描述的说明性抗体的氨基酸序列。在一个实例中，来自一个或多个说明性抗体的一个或多个cdr与来自非人类动物(诸如小鼠或大鼠)的抗体的cdr组合。在另一实例中，嵌合抗体的所有cdr均衍生自一种或多种说明性抗体。在一些特定实施方案中，嵌合抗体包含来自说明性抗体的重链可变区的一个、两个或三个cdr和/或来自轻链可变区的一个、两个或三个cdr。嵌合抗体可使用本领域中已知的常规方法产生。
[0548]
另一类型的修饰为使vh和/或vl链的cdr区内的氨基酸残基突变。可进行定点诱变或pcr介导的诱变以引入突变和对抗体结合的影响，或可在本领域中已知的体外或体内分析中对其他相关功能特性进行评估。典型地，引入保守取代。突变可为氨基酸添加和/或缺失。此外，典型地改变cdr区内的不超过一个、两个、三个、四个或五个残基。在一些实施方案中，抗体衍生物包含重链cdr中和/或轻链cdr中的1、2、3或4个氨基酸取代。在另一实施方案中，氨基酸取代为使抗体中的一个或多个半胱氨酸变为另一残基，诸如但不限于丙氨酸或丝氨酸。半胱氨酸可为规范或非规范半胱氨酸。在一些实施方案中，相对于说明性抗体的氨基酸序列，抗体衍生物在重链cdr区中具有1、2、3或4个保守氨基酸取代。
[0549]
还可对vh和/或vl区内的构架残基进行修饰。典型地，形成此类构架变体以降低抗体的免疫原性。一种方法为使一个或多个构架残基“反向突变”为对应种系序列。已经历体细胞突变的抗体可含有不同于衍生出抗体的种系序列的构架残基。此类残基可通过将抗体构架序列与衍生出抗体的种系序列相比较加以鉴定。为使架区序列恢复为其种系组态，体细胞突变可为通过例如定点诱变或pcr介导的诱变“反向突变”为种系序列。
[0550]
此外，还可在说明性抗体的fc区内进行修饰，典型地以改变抗体的一种或多种功能特性，诸如血清半衰期、补体结合、fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。在一个实例中，对ch1的铰链区进行修饰，使得铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或降低。此方法进一步描述于美国专利第5,677,425号中。改变ch1的铰链区中半胱氨酸残基的数目以例如有助于轻链和重链的组装或者增加或降低抗体的稳定性。在另一情况下，使抗体的fc铰链区突变以缩短抗体的生物半衰期。
[0551]
在一些实施方案中，与野生型igg或野生型抗体的fc区相比，本文所描述的异二聚蛋白质或抗体的fc区除形成如本文所描述的经工程改造的二硫键或盐桥的氨基酸取代外也具有至少一个(例如至少一个、两个或三个或更多个)氨基酸取代。在一些实施方案中，fc区与天然序列fc区和/或与亲本多肽的fc区具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或更多同源性。
[0552]
此外，可对fc区进行修饰以根据本领域中已知的常规实验改变其潜在糖基化位点或模式。在另一方面中，本技术提供一种本文所描述的异二聚蛋白质或抗体的衍生物，其在轻链或重链的可变区中含有改变可变区中的糖基化模式的至少一个突变。此类抗体衍生物对于结合抗原可具有增加的亲和力和/或修改的特异性。突变可在v区中添加新颖糖基化位点，改变一个或多个v区糖基化位点的位置，或移除预先存在的v区糖基化位点。在一些实施方案中，本技术提供一种在重链可变区中的天冬酰胺处具有潜在n-连接糖基化位点的本文所描述的抗体的衍生物，其中重链可变区中的潜在n-连接糖基化位点被移除。在一些实施方案中，本技术提供一种在重链可变区中的天冬酰胺处具有潜在n-连接糖基化位点的本文所描述的抗体的衍生物，其中两个重链可变区中的潜在n-连接糖基化位点均被移除。改变抗体的糖基化模式的方法为本领域中已知的，诸如描述于美国专利第6,933,368号中的那些方法，所述申请以引用的方式并入本文中。
[0553]
在一些实施方案中，本文所描述的抗体(例如多特异性抗体和可活化抗体)可属于任何类别，诸如igg、igm、ige、iga或igd。在一些实施方案中，本文所描述的可活化抗体(例如cd3和/或her2抗体)属于igg类别，诸如igg1、igg2、igg3或igg4亚类。本文所描述的抗体可使用本领域中已知的方法由一种类别或亚类转换成另一类别或亚类。用于产生所需类别或亚类中的抗体的示例性方法包括以下步骤：分离编码本文所描述的抗体(例如多特异性或可活化抗体)的重链的核酸和编码本文所描述的抗体(例如多特异性或可活化抗体)的轻链的核酸，分离编码vh区的序列，将vh序列连结至编码所需类别或亚类的重链恒定区的序列，使轻链基因和重链构建体在细胞中表达，和收集抗体。
[0554]
还提供具有胺基端前导延伸段的异二聚蛋白质或抗体变体。举例来说，胺基端前导序列的一个或多个氨基酸残基存在于抗体的任何一个或多个重链或轻链的胺基端。
[0555]
本文所描述的异二聚蛋白质或抗体(例如多特异性抗体或可活化抗体)可进一步经修饰。在一些实施方案中，异二聚蛋白质或抗体连接至另一分子实体。其他分子实体的实例包括剂、肽或蛋白质、检测剂或标记和抗体。
[0556]
在一些实施方案中，本技术的异二聚蛋白质或抗体连接至剂。剂的实例包括细胞毒性剂或其他癌症治疗剂，和放射性同位素。细胞毒性剂的具体实例包括紫杉醇、细胞松弛素b、短杆菌素d、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷(etoposide)、替诺泊苷(tenoposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱、多柔比星(doxorubicin)、柔红比星(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌(mitoxantrone)、光辉霉素(mithramycin)、放线菌素d、1-去氢睾酮、糖皮质素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素和其类似物或同源物。也包括治疗剂，例如抗代谢物(例如胺甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴嗪(decarbazine))、烷基化剂(例如甲基二(氯乙基)胺、噻替派氮芥苯丁酸(thioepa chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(bsnu)和洛莫司汀(lomustine)(ccnu)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素c和顺-二氯二胺铂(ii)(ddp)顺铂)、蒽环类(例如柔红比星(以前为道诺霉素(daunomycin))和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(dactinomycin)(以前为放线菌素)、博来霉素(bleomycin)、光辉霉素和安曲霉素(anthramycin)(amc))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。可结合至抗体供诊断或治疗使用的放射性同位素的实例包括但不限于碘
131、铟、钇90和镥177。用于将多肽连接至剂的方法为本领域中已知的，诸如使用各种接头技术。接头类型的实例包括腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽接头。关于接头和用于将治疗剂连接至抗体的方法的进一步论述参见例如saito等人,adv.drug de/iv.rev.55:199-215(2003)；trail等人,cancer immunol.immunother.52:328-337(2003)；payne,cancer cell 3:207-212(2003)；allen,nat.rev.cancer 2:750-763(2002)；pastan和kreitman,curr.opin.investig.drugs 3:1089-1091(2002)；senter和springer(2001)adv.drug de/iv.rev.53:247-264。
[0557]
在一些实施方案中，本技术的异二聚蛋白质或抗体结合至标记和/或细胞毒性剂。如本文所用，标记为有助于抗体检测和/或有助于与抗体结合的分子的检测的部分。非限制性示例性标记包括但不限于放射性同位素、荧光基团、酶基团、化学发光基团、生物素、表位标签、金属结合标签等。本领域技术人员可根据预期应用选择适合的标记。
[0558]
如本文所用，细胞毒性剂为降低一个或多个细胞的增殖能力的部分。当细胞变得不太能够增殖时，细胞具有降低的增殖能力，例如因为细胞经历凋亡或以其他方式死亡，细胞未能进入细胞周期和/或未能分裂，细胞分化等。非限制性示例性细胞毒性剂包括但不限于放射性同位素、毒素和化学治疗剂。本领域技术人员可根据预期应用选择适合的细胞毒性剂。
[0559]
在一些实施方案中，使用体外化学方法使标记和/或细胞毒性剂结合至异二聚蛋白质或抗体。非限制性示例性化学结合方法为本领域中已知的，并且包括可自例如thermo scientific life science research produces(以前为pierce；rockford,ill.)、prozyme(hayward,calif.)、sacri antibody services(calgary,canada)、abd serotec(raleigh,n.c.)等商购获得的服务、方法和/或试剂。在一些实施方案中，当标记和/或细胞毒性剂为多肽时，可使标记和/或细胞毒性剂自具有至少一个抗体链的相同表达载体表达，以产生包含融合至抗体链的标记和/或细胞毒性剂的多肽。本领域技术人员可选择适合用于根据预期应用使标记和/或细胞毒性剂结合至抗体的方法。
[0560]
vi.制备方法
[0561]
在一个方面中，本技术提供用于制备本文所描述的异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体的方法。举例来说，提供用于制备异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)或可活化抗体的方法，所述方法包括在允许编码异二聚蛋白质(例如多特异性抗体)或可活化抗体多肽的一种或多种核酸或载体表达的条件下培养包含所述一种或多种核酸或载体的宿主细胞，和自宿主细胞培养物回收异二聚蛋白质多肽或可活化抗体多肽。
[0562]
本技术的多肽(例如上文所描述的异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体中的任一种)可使用例如如美国专利第4,816,567号中所描述的重组方法和组合物产生。在一些实施方案中，提供编码任何或所述多肽(例如上文所描述的异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体中的任一种)的经分离的核酸。在一些实施方案中，提供编码异二聚蛋白质的第一多肽和/或第二多肽的一种或多种核酸。在一些实施方案中，提供一种或多种核酸，其编码多特异性抗体或可活化抗体的包含vl的氨基酸序列和/或包含vh的氨基酸序列(例如抗体的轻链和/或重链)。在一些实施方案中，本文提供包含此类核酸的一种或多种载体(例如表达载体)。在一些实施方案中，宿主细胞包含(例如已经转化具有)包含编码本文所描述的异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体的核酸的一种或多种载体。在一些实施方案
中，宿主细胞为真核细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞或淋巴样细胞(例如yo、ns0、sp20细胞)。
[0563]
对于本技术的多肽(例如上文所描述的异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体中的任一种)的重组制备，将编码多肽(例如上文所描述的异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体)的核酸(例如如上文所描述)分离且插入一种或多种载体中用于进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。此类核酸可使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合于编码所述或所述多肽的基因的寡核苷酸探针)容易地分离和测序。
[0564]
适合用于多肽编码载体的克隆或表达的宿主细胞包括原核或真核细胞。举例来说，可在细菌中产生多肽，尤其在不需要糖基化和fc效应功能时(参见例如美国专利第5,648,237号、第5,789,199号和第5,840,523号；也参见charlton,methods in molecular biology,第248卷(b.k.c.lo编,humana press,totowa,nj,2003),第245-254页，所述文献描述抗体片段在大肠杆菌(e.coli.)中的表达。在表达之后，可自可溶性级分中的细菌细胞糊分离多肽且可进一步纯化。
[0565]
除原核生物之外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也为适合于多肽编码载体的克隆或表达宿主，包括糖基化通路已“经人源化”的真菌和酵母菌株，从而使得以部分或完全人类糖基化模式产生多肽。参见gerngross,nat.biotech.22:1409-1414(2004)和li等人,nat.biotech.24:210-215(2006)。
[0566]
适合用于表达糖基化多肽的宿主细胞也衍生自多细胞有机体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已鉴定可与昆虫细胞结合使用，尤其用于转染草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda)细胞的许多杆状病毒株。
[0567]
还可利用植物细胞培养物作为宿主。参见例如美国专利第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号和第6,417,429号(描述用于在转基因植物中产生抗体的plantibodies
tm
技术)。
[0568]
脊椎动物细胞也可用作宿主。举例来说，适合于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可为适用的。适用的哺乳动物宿主细胞系的其他实例为由sv40转化的猴肾cv1细胞系(cos-7)；人类胚胎肾细胞系(如例如graham等人,j.gen virol.36:59(1977)中所描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(bhk)；小鼠足细胞(如例如mather,biol.reprod.23:243-251(1980)中所描述的tm4细胞)；猴肾细胞(cv1)；非洲绿猴肾细胞(vero-76)；人类子宫颈癌细胞(hela)；犬肾细胞(mdck；布法罗大鼠(buffalo rat)肝细胞(brl 3a)；人类肺细胞(w138)；人类肝细胞(hep g2)；小鼠乳房肿瘤(mmt 060562)；如例如mather等人,annals n.y.acad.sci.383:44-68(1982)中所描述的tri细胞；mrc 5细胞；和fs4细胞。其他适用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(cho)细胞，包括dhfr-cho细胞(urlaub等人,proc.natl.acad.sci.usa,77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系，诸如y0、ns0和sp2/0。关于适合用于制备抗体的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如yazaki和wu,methods in molecular biology,第248卷(b.k.c.lo编,humana press,totowa,nj),第255-268页(2003)。
[0569]
为使一些分泌的蛋白质大量表达和分泌，来自异源蛋白质的前导序列可能为所需的。在一些实施方案中，采用异源前导序列可能有利，因为在前导序列在分泌过程期间在er中移除时所得成熟多肽可保持不变。可能需要添加异源前导序列以表达和分泌一些蛋白
质。
[0570]
某些示例性前导序列描述于例如由新加坡国立大学生物化学系(department of biochemistry,national university of singapore)维护的在线前导序列资料库(leader sequence database)中。参见choo等人,bmc bioinformatics,6:249(2005)；和pct公布第wo 2006/081430号。
[0571]
vii.组合物和试剂盒
[0572]
在一些实施方案中，本技术提供包含本文所公开的异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体中的任一种和药学上可接受的载体的药物组合物。组合物可通过本领域中已知的常规方法制备。
[0573]
术语“药学上可接受的载体”是指适合在用于递送多肽(例如异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体)的制剂中使用的任何非活性物质。载体可为防粘剂、结合剂、包衣剂、崩解剂、填料或稀释剂、防腐剂(诸如抗氧化剂、抗细菌剂或抗真菌剂)、甜味剂、吸收延迟剂、润湿剂、乳化剂、缓冲剂和类似物。适合的药学上可接受的载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇和类似物)右旋糖、植物油(诸如橄榄油)、盐水、缓冲液、缓冲盐水和等张剂，诸如糖、多元醇、山梨糖醇和氯化钠。
[0574]
组合物可呈任何适合的形式，诸如液体、半固体和固体剂型。液体剂型的实例包括溶液(例如可注射溶液和难溶溶液)、微乳液、脂质体、分散体或悬浮液。固体剂型的实例包括片剂、丸剂、胶囊、微胶囊和粉剂。适合用于递送多肽(例如异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体)的组合物的一种特定形式为用于注射或输注的无菌液体，诸如溶液、悬浮液或分散体。无菌溶液可通过将多肽(例如异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体)以所需量并入适当的载体中，随后进行灭菌型微量过滤来制备。分散体可通过将多肽并入含有基础分散介质和其他载体的无菌媒介物中来制备。在用于制备无菌液体的无菌粉剂的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥(冻干)，以自事先经无菌过滤的溶液得到活性成分加上任何其他所需成分的粉剂。组合物的各种剂型可通过本领域中已知的常规技术来制备。
[0575]
组合物中所包括的多肽(例如异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体)的相对量将视许多因素而变化，诸如所用的特定多肽和载体、剂型以及所需释放和药效动力学特征。单一剂型中(例如异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体)的量将通常为产生治疗作用的量，但也可为较少的量。通常，相对于剂型的总重量，此量将在约0.01％至约99％、约0.1％至约70％或约1％至约30％范围内。
[0576]
除多肽(例如异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体)之外，组合物中还可包括一种或多种其他治疗剂。要包括在组合物中的其他治疗剂的适当量可由本领域技术人员容易地选择，并且将视许多因素而变化，诸如所用的特定剂和载体、剂型以及所需释放和药效动力学特征。单一剂型中所包括的其他治疗剂的量将通常为所述剂产生治疗作用的量，但也可为较少的量。
[0577]
本文所描述的多肽(例如异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体)和/或组合物(例如药物组合物)中的任一种均可用于制备药剂(例如用于治疗有需要的受试者的癌症或延迟其进展的药剂)。
[0578]
在一些实施方案中，本文提供一种试剂盒，其包含本文所描述的异二聚蛋白质、多
特异性抗体、可活化抗体和/或组合物中的任一种。在一些实施方案中，试剂盒还包含含有异二聚蛋白质、多特异性抗体、可活化抗体和/或组合物的使用说明书的包装插页。包装插页可含有关于适应症、用法、剂量、施用、组合疗法、禁忌和/或有关治疗剂产品的使用的警告的信息。在一些实施方案中，试剂盒还包含例如用于存储、转移、施用或以其他方式使用异二聚蛋白质、多特异性抗体、可活化抗体和/或组合物的一种或多种缓冲液。在一些实施方案中，试剂盒还包含用于存储或施用(例如注射器等)异二聚蛋白质、多特异性抗体、可活化抗体和/或组合物的一个或多个容器。还提供包含本文所描述的异二聚蛋白质、多特异性抗体、可活化抗体和/或组合物中的任一种的制品。
[0579]
viii.使用方法
[0580]
本文所描述的异二聚蛋白质、多特异性抗体、可活化抗体和药物组合物适用于治疗、诊断或其他目的，诸如调节免疫反应、治疗癌症、增强其他癌症疗法的功效、增强疫苗功效或治疗自体免疫疾病。
[0581]
在一些实施方案中，提供一种用于治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含本文所描述的异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体(例如可活化bite分子)中的任一者的药物组合物。在一些实施方案中，疾病或疾患为癌症。多种癌症可用由本技术提供的方法、用途或药物组合物治疗或预防。
[0582]
在一些实施方案中，提供一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含本文所描述的靶向一种或多种免疫检查点分子的多特异性抗体中的任一者(例如pdl1
×
cd137、cd137
×
pdl1或pdl1
×
cd137
×
ctla4抗体中的任一者)的药物组合物。在一些实施方案中，癌症为肺癌。在一些实施方案中，癌症为前列腺癌。在一些实施方案中，癌症为黑素瘤。在一些实施方案中，癌症为晚期癌症。
[0583]
在一些实施方案中，提供一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的包含本文所描述的bite或可活化bite分子中的任一者(例如her2
×
cd3抗体或可活化her2
×
cd3抗体中的任一者)的药物组合物。在一些实施方案中，癌症为her2阳性癌症。在一些实施方案中，癌症为卵巢癌。
[0584]
在一些实施方案中，提供一种增强哺乳动物中的免疫反应的方法，所述方法包括向哺乳动物施用有效量的包含本文所描述的异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体(例如可活化bite分子)中的任一种的药物组合物。术语“增强免疫反应”或其语法变化型式意谓刺激、引起、增加、改良或加强受试者免疫系统的任何反应。免疫反应可为细胞反应(即细胞介导的反应，诸如细胞毒性t淋巴细胞介导的反应)或体液反应(即抗体介导的反应)，并且可为一次或二次免疫反应。增强免疫反应的实例包括活化pbmc和/或t细胞(包括增加诸如il-2和/或ifnγ的一种或多种细胞因子的分泌)。免疫反应的增强可使用本领域技术人员已知的许多体外或体内测量进行评估，包括但不限于细胞毒性t淋巴细胞分析、细胞因子的释放、肿瘤的消退、带肿瘤的动物的存活、抗体产生、免疫细胞增殖、细胞表面标记物的表达和细胞毒性。典型地，当与未治疗的哺乳动物或未使用所述的方法治疗的哺乳动物所产生的免疫反应相比时，本技术的方法增强哺乳动物所产生的免疫反应。
[0585]
在实践治疗方法时，异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体可作为单一疗法单独施用，或与一种或多种其他治疗剂或疗法组合施用。因此，在另一方面中，本技术提供一种组合疗法，其包含本文所描述的异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体与用于分
开、依序或同时施用的一种或多种其他疗法或治疗剂的组合。术语“其他治疗剂”可指除由本技术提供的异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体外的任何治疗剂。
[0586]
多种癌症治疗剂可与由本技术提供的异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体组合使用。本领域技术一般人员将认可可与本技术的方法和异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体组合使用的其他癌症疗法的存在和开展，并且将不限于本文所阐述的那些疗法形式。可用于组合疗法中以治疗癌症的其他治疗剂类别的实例包括(1)化学治疗剂、(2)免疫治疗剂和(3)激素治疗剂。在一些实施方案中，另一治疗剂为病毒基因疗法、免疫检查点抑制剂、靶标疗法、辐射疗法和/或化学治疗剂。在一些实施方案中，组合疗法包含用于移除肿瘤的手术。
[0587]
用于本文所描述的治疗方法的剂量、给药频率、施用途径视许多因素而定，诸如所要治疗的病症的类型和严重程度；所施用的特定异二聚蛋白质、多特异性抗体或可活化抗体；施用时间；治疗的持续时间；所施用的特定其他疗法；所治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、一般健康和现有病史；和医学技术中已知的类似因素。
[0588]
癌症治疗可通过例如肿瘤消退、肿瘤重量或尺寸收缩、到进展的时间、存活的持续时间、无进展存活、总反应率、反应的持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性进行评估。可采用用于测定疗法功效的方法，包括例如通过辐射成像来测量反应。
[0589]
实施例
[0590]
以下实施例旨在单纯地例示本发明且因此不应视为以任何方式限制本发明。以下实施例和详细描述通过说明而非限制的方式来提供。
[0591]
实施例1.fc结构域突变的设计
[0592]
设计新颖fc突变，包括如表1a和1b中所示的二硫键突变、电荷突变和其组合。
[0593]
表1a.所设计的新颖fc突变
[0594][0595]
表1b.fc突变id.
[0596][0597][0598]
实施例2.异二聚体纯度评估
[0599]
为了测试新颖fc突变，构建异二聚体tym01至tym013和参考异二聚体。对应新颖fc突变列于表2中。fab-fc/fc单臂构建体经设计在ch3结构域界面处具有突变(图1a)。为了评估突变对ch3结构域的异二聚化和同二聚化的效应，在哺乳动物表达载体中进行克隆，使得所构建的ch3_a结构域可在轻链-重链(“lc-hc”)半体中表达，并且ch3_b结构域可在仅fc形式中表达。将编码轻链(“lc”)、重链(“hc”)和fc的质粒以2:1:1摩尔比共转染至hek293细胞中用于瞬时表达。使用相较于hc过量的lc链dna，以避免lc受限制。将细胞培养上清液经0.45μm无菌过滤器过滤。使用hitrap mabselect sure预填充柱(ge healthcare)通过蛋白质a亲和色谱将抗体纯化且随后进行缓冲液交换。通过sds-page和sec-hplc对产物进行评估以评估异二聚产率。
[0600]
在fab-fc/fc单臂构建体系统中，异二聚体和两种同二聚体具有不同的尺寸和分子量，有助于通过sds-page电泳和尺寸排阻高效液相色谱(“sec-hplc”)鉴定各种配对。在还原和非还原条件下以电泳方式使蛋白质可视化。在还原条件下，观测到三个条带，对应于hc单体、fc单体和lc单体。图6表明在非还原条件下存在三个条带，对应于lc-hc同二聚体、lc-hc-fc异二聚体和lc-hc半体。在这些条件下未检测到fc同二聚体。还通过sec-hplc评估异二聚体产率。如图7中所示，总体上检测到三个峰。谱图中的第一峰对应于同二聚体，46.6min处的第二峰对应于异二聚体，并且第三峰对应于lc-hc半体。对sec-hplc中的峰面
积进行定量使得能够鉴定相对于同二聚体稳定异二聚体的变体对。使用第一峰和第二峰计算纯度，并且结果显示于表2中。
[0601]
表2.异二聚体纯度
[0602][0603]
实施例3.异二聚体稳定性评估
[0604]
另外，通过在强制降解条件下培育对异二聚体的稳定性进行评估。将经纯化的异二聚体样品以1mg/ml稀释至适当缓冲液中且加热至不同温度并持续1小时(图8)，或在37℃下培育长达4周(图9)。将经处理的样品通过sec-hplc分析。图8显示在高温下蛋白质聚集和沉淀的不同抗性。在37℃下存储之后sec-hplc谱的变化显示于图9中。蛋白质tym10、tym11和tym013显示相对优良的稳定性。
[0605]
实施例4.靶向cd137和pdl1的异二聚体的产生
[0606]
使用抗cd137和抗pdl1抗体来构建具有fc突变的双特异性抗体。单克隆抗体的药物动力学可通过改变其与新生儿fc受体fcrn的相互作用进行调节。改良fcrn-igg相互作用的亲和力可延长经修饰的igg的半衰期。fcrn以严格ph值依赖性方式结合至igg的fc区。在生理ph 7.4下，fcrn不结合igg，但在内体的酸性ph值(ph6-6.5)下，fcrn对igg的fc区具有低微摩尔至纳摩尔亲和力。因此，fcrn结合特征可反映突变如何影响fc区的pk。表3说明双特异性抗体的ph值依赖性fcrn结合在酸性与生理ph值下均不受影响。
[0607]
表3.双特异性抗体的fcrn结合
[0608][0609]
使用具有共同轻链的抗cd137和抗pdl1抗体来构建具有共同轻链和不同fc突变的双特异性抗体(图1b)。也在293t-cd137-nfκb报告子分析中对双特异性抗体进行测试。简单地说，将每毫升50x104个293t-cd137细胞和每毫升50x104个293t-pdl1细胞混合在一起，并且接着将经混合的细胞以5x104个细胞/孔(100μl/孔)的密度分至96孔板的孔中。将50μl的经稀释抗体溶液添加至对应孔中且培育18h。培育之后，将培养基吸出且接着添加50μl的被动溶解缓冲液(promega e1980)且在37℃下培育30分钟。将20μl上清液转移至白色板(costar，3912)且接着添加40μl的荧火虫底物和40μl的肾素(renina)底物，并且读取发光信号(promega e1980)。
[0610]
如图10中所示，在nfκb报告子分析中tym10和tym11具有相对较高的活性。
[0611]
实施例5.靶向cd137和pdl1的双特异性抗体的产生和表征
[0612]
a.双特异性抗体的产生
[0613]
以下实施例描述靶向cd137和pdl1的双特异性抗体的可研发且有效模式的研发。基于“莫里森模式”对模式进行最优化(图2)。使用编码抗cd137 fv和抗pdl1 fv的dna来构建呈fab或scfv形式的表达质粒。scfv与fab相比具有降低的亲和力，因此两个fv的取向(即，fab
×
scfv形式中的cd137
×
pdl1或pdl1
×
cd137)可能影响双特异性抗体的功效。
[0614]
采用igg1或igg4(s228p)同种型。scfv通过sgggs(seq id no:80)或gggsggggs(seq id no:81)的接头以vh-至-vl取向连接至fc的c端。在scfv间，vh的c端通过(g4s)4(seq id no:82)接头连接至vl的n端。vh-44至vl-100二硫键也并入scfv中，经设计以使模式稳定。也对ch3结构域中的一对新颖经工程改造的n390c
ch3a-s400'c
ch3b
二硫键进行测试(seq id no:23-24)。此外，引入n297a突变以使由fc区介导的效应功能沉默。表4提供所研发的八种支架设计。表5列举对应于示例性cd137
×
pdl1和pdl1
×
cd137抗体的第一重链、第一轻链、第二重链、第二轻链的seq id no。
[0615]
表4.双特异性抗体的支架设计
[0616][0617]
b.双特异性抗体的cmc表征
[0618]
将编码双特异性抗体的重链和轻链的质粒瞬时转染至哺乳动物细胞中。在转染之后7天时，通过在14000g下离心30min收获含有双特异性抗体的细胞培养物上清液且经无菌过滤器(0.22μm)过滤。使用mabselect sure预填充柱(ge healthcare)通过蛋白质a亲和色谱将抗体纯化且随后在20mm组氨酸(ph 5.5)缓冲液中进行缓冲液交换。
[0619]
在纯化之后通过分析型尺寸排阻色谱(“sec”)评估经纯化的双特异性抗体的聚集率。如下进行分析：在与waters 2996uv检测器组合的waters 2695上进行sec。使用具有tsk凝胶g3000 swxl前置柱的tsk凝胶g3000 swxl柱(300mm
×
7.8mm)(tosoh bioscience)。注射10μg的各样品且在0.5ml/min的流速下进行分离。溶析缓冲液由ph 7.0的200mm磷酸钠组成。在214nm下进行uv检测。通过将100μl样品(1mg/ml)在-80℃下冷冻30min，随后在室温下解冻60min来研究冷冻-解冻稳定性。进行六个冷冻-解冻循环且还通过分析型尺寸排阻色谱测定聚集率。
[0620]
表5提供纯化之后双特异性抗体的产率，并且表6提供纯化和冷冻-解冻之后双特异性抗体的聚集率。tyf05为最好模式，在表达期间具有低程度的聚集形成且在冷冻-解冻过程期间没有聚集倾向。ch3中的二硫键与sgggs(seq id no:80)接头用九氨基酸接头gggsggggs(seq id no:81)替换均改良胶体稳定性。
[0621]
表5.纯化之后双特异性抗体的产率
[0622][0623]
表6.纯化和冷冻-解冻之后双特异性抗体的聚集率
[0624][0625]
通过使用1mg/ml经纯化的蛋白质测试持续6个循环的冷冻和解冻，还在40℃下培育28天(图11a-11b)。还在高温下加热四种经纯化的蛋白质以证实其热稳定性(图11c)。图11a-11b显示通过分析型尺寸排阻色谱评估的蛋白质质量。所有模式均几乎不聚集且在加速存储条件下降解，此指示其具有良好长期存储稳定性。如图11c中所示，所有所测试的蛋白质在60℃时均聚集和沉淀，并且与pdl1xcd137双特异性抗体相比，cd137xpdl1双特异性抗体具有优选的胶体稳定性。这些资料指示cd137xpdl1为最适合于靶向cd137和pdl1的抗体模式。
[0626]
c.双特异性抗体的结合亲和力
[0627]
使用biacore t200(ge healthcare)作为用于使用表面等离子体共振技术(“spr”)进行实时生物分子互相作用分析的高效能系统。在测量期间，将来自由biacore提供的人类抗体捕获试剂盒的抗人类igg单克隆抗体固定于cm5芯片上，并且将igg样品注射至感测器芯片上。将分析物注射至捕获igg的流动池上用于在hbs-ep缓冲液中的结合动力学分析。根据1:1朗缪尔模型对数据进行拟合且确定kd值(表7)。在所有双特异性抗体的中，模式5具有最高亲和力。
[0628]
还针对在酵母或hek293f细胞的表面上瞬时表达的人类、猴和小鼠cd137或pdl1对抗体的亲和力进行评估。简言之，将酵母或hek293f细胞用表达人类、猴或小鼠cd137或pdl1的质粒转染。48小时之后，收获经转染的细胞且接着洗涤。接着将细胞与igg(各自在100nm下)一起在4℃下在振荡床中培育1小时，在300rpm下避光振荡。对于同时结合，将细胞与同人类fc片段融合的生物素化人类cd137或pdl1蛋白质和sa-pe(链霉亲和素藻红素结合型)一起培育。对于交叉反应性，将细胞与alexa fluor 647结合的小鼠抗人类fc抗体一起培育。将混合物在4℃下在振荡床中培育30分钟，在300rpm下避光振荡。将细胞洗涤一次，然后通过流式细胞术(beckman cytoflex)进行分析。图12表明双特异性抗体同时结合人类pdl1和cd137。此外，图13表明双特异性抗体维持与人类、小鼠或猴来源的pdl1或cd137的亲本交叉反应性。
[0629]
表7.对pdl1h和cd137h的结合亲和力
[0630][0631][0632]
d.体外和体内功效
[0633]
测试pdl1xcd137和cd137xpdl1双特异性抗体对体外报告基因分析的影响(图14)。通过pdl1阻断生物分析评估抗pdl1基双特异性抗体。简言之，使用表达人类pd-1和由nfat反应元件(nfat-re)驱动的荧光素酶报告子的jurkat t细胞作为pd-1效应细胞。使用表达人类pdl1和经设计以非抗原依赖性方式活化同源tcr的经工程改造的细胞表面蛋白的cho-k1细胞作为pdl1aapc/cho-k1细胞。如图14中所示，在不存在或存在抗pdl1基双特异性抗体或pdl1单体阻断抗体的情况下，将pd-1效应细胞与pdl1 aapc/cho-k1细胞一起培育。添加bio-glo
tm
试剂且对发光进行定量。使用graphpad软件对资料进行分析。通过nfκb报告子分析对抗cd137基双特异性抗体进行评估。将cd137-nfκb-293t稳定细胞回收，培养且分至96孔板中(每孔50μl，以6x105个的密度)。在培育5.5小时之后，添加以1:5比率与交联剂预混合的经稀释的测试抗体(图14中所示)。18小时后测量荧光素酶水平。使用海肾荧光素酶活性针对转染效率将相比空白对照(未经抗体处理)的相对荧光素酶单位(rlu)正规化，并且将结果表示为平均值
±
标准误差(一式三份)。
[0634]
如图14的上部图中所示，pdl1报告基因分析中表明pdl1xcd137双特异性抗体具有与pdl1单体类似的活性，并且两者均比cd137xpdl1双特异性抗体更强。类似地，在图14的下部图(cd137报告基因分析)中，与pdl1xcd137双特异性抗体相比，cd137xpdl1双特异性抗体具有更强的活性。这些结果表明与scfv相比fab具有更好的活性。不希望受理论限制，此可能是由于亲和力的差异所致。
[0635]
因为抗cd137和抗pdl1 fv与小鼠和猴抗原交叉反应，所以在3ll同源小鼠肿瘤模型中研究双特异性抗体的体内功效(图15a-15c)。pdl1xcd137与cd137xpdl1双特异性抗体均抑制肿瘤生长。cd137xpdl1双特异性抗体与cd137与pdl1亲本抗体的组合相比有效性稍低，而与单独两种亲本抗体相比要有效得多。pdl1xcd137双特异性抗体不像cd137xpdl1抗体那样有效，表明在此双特异性模式中两种抗原的取向于功效至关重要。
[0636]
实施例6.三特异性抗体的产生
[0637]
以下实施例提供能够结合cd137、pdl1和ctla4的三特异性抗体(图3)。
[0638]
如表8中所示，构建组合fc突变体tym11与双特异性模式tyf01、tyf02和tyf04的三种三特异性抗体且纯化。tyf02显示最好质量且所有所述三种模式在冷冻-解冻和40℃存储下均稳定。
[0639]
抗cd137和抗pdl1 fv与小鼠和猴抗原交叉反应，因此在3ll同源小鼠肿瘤模型中研究双特异性抗体的体内功效。为c57bl/6小鼠皮下移植2
×
106个3ll肺癌细胞。当肿瘤已
建立(70mm3)时，通过腹膜内注射以同种型对照igg(n＝6)、pdl1xcd137双特异性抗体(10mg/kg，n＝8)、cd137xpdl1双特异性抗体(10mg/kg，n＝8)、cd137单体(7.5mg/kg，n＝6)、pdl1单体(7.5mg/kg，n＝6)或cd137单体+pdl1单体(两者均为7.5mg/kg，n＝8)开始处理，持续多至6个剂量。每周监测三次肿瘤生长且报告为随时间推移的平均肿瘤体积
±
sem。如图15a-15b中所示，pdl1xcd137与cd137xpdl1双特异性抗体均抑制肿瘤生长。cd137xpdl1双特异性抗体与cd137与pdl1亲本抗体的组合相比有效性稍低，而与两种亲本抗体中的单独一者相比要有效得多。pdl1xcd137双特异性抗体不像cd137xpdl1抗体那样有效，表明在此双特异性模式中两种抗原的取向于功效至关重要。
[0640]
还选择tyf02三特异性抗体使用3ll同源小鼠肿瘤模型测试体内功效。为c57bl/6小鼠皮下移植2
×
106个3ll肺癌细胞。当肿瘤已建立(65mm3)时，通过腹膜内注射以同种型对照igg(n＝6)、cd137xpdl1xctla4三特异性抗体(10mg/kg，n＝8)、cd137xpdl1xctla4三特异性抗体(5mg/kg，n＝8)、cd137xpdl1双特异性抗体(10mg/kg，n＝6)、cd137xctla4双特异性抗体(10mg/kg，n＝6)、cd137单体(7.5mg/kg，n＝6)、pdl1(3.75mg/kg，n＝6)、ctla4(3.75mg/kg，n＝6)或cd137单体(7.5mg/kg)+pdl1(3.75mg/kg)+ctla4(3.75mg/kg)(n＝6)开始处理，持续多至5个剂量。每两天监测一次肿瘤生长且报告为随时间推移的平均肿瘤体积
±
sem。如图15c中所示，与对应双特异性抗体或三种单igg的亲本组合相比，此三特异性抗体显示优选的肿瘤生长抑制。
[0641]
表8.三特异性抗体化学性质、制造和对照
[0642][0643]
实施例7.异二聚her2
×
cd3 t细胞接合双特异性抗体的生物物理学表征
[0644]
使用tym13 fc突变体设计异二聚双特异性支架。将轻链-重链半抗体和scfv-fc链组合以形成异fc结构域中具有tym13突变的双特异性抗体(图4)。使用此支架构建her2xcd3双特异性t细胞接合抗体。为进行比较，也构建具有杵入臼突变y394c、t366s、l368a、y407v-s354’c t366’w和“xencor突变”e357q、s364k-l368’d、k370’s的对应抗体。
[0645]
将编码双特异性抗体的重链、轻链和scfv-fc链的质粒瞬时转染至哺乳动物细胞中。在转染之后7天时，通过在14000g下离心30min收获含有双特异性抗体的细胞培养物上清液且经无菌过滤器(0.22μm)过滤。使用mabselect sure预填充柱(ge healthcare)通过蛋白质a亲和色谱将抗体纯化且随后在20mm组氨酸(ph 5.5)缓冲液中进行缓冲液交换。
[0646]
通过sec-hplc和sds-page评估异二聚双特异性抗体的生物物理学纯度。如图16和图17中所示，具有tym13突变的ty24051显示极佳的异二聚纯度，没有可检测的同二聚体，而具有杵入臼和xencor突变的ty24105与ty24106两者均含有一些150kda同二聚体(分别指示于图16和图17中的sds-page和sec-hplc图中)。此外，与ty24105和ty24106相比，ty24051含有较少的聚集物。
[0647]
当ty24051转化成可活化抗体ty24052时，产生一些聚集物(参见表9)。ty24052可通过阳离子交换色谱(cex)纯化。
[0648]
表9.双特异性抗体和其sec-hplc纯度
[0649][0650]
实施例8.可活化双特异性抗体构建和功能表征
[0651]
构建可活化her2
×
cd3双特异性抗体(本文中也称为“safe体”或“safe-双特异性抗体”)(图5)。构建体描述于表10和表11中。
[0652]
表10.双特异性抗体和其通过sec-hplc测定的纯度
[0653][0654]
表11.her2
×
cd3双特异性safe体的设计
[0655][0656]
通过酶联免疫吸附分析(elisa)分析对双特异性抗体(ty24051)和其safe体型式(ty24052)的亲和力进行分析。制备2μg/ml的与人类fc片段融合的人类her2或cd3(ε和δ链异二聚体)且用于在2-8℃下包被elisa板过夜。在洗涤和封闭之后，添加50μl经连续稀释的igg且在37℃下培育1小时。将板洗涤三次且接着与每孔50μl的tmb底物一起在室温下培育约20分钟。在反应停止之后测量450nm下的吸光度。通过graphpad prism 6使用非线性拟合分析数据。如图18a-18b中所示，ty24051结合至her2与cd3两者，而ty24052与ty24051相比显示明显较低的亲和力。活化之后，ty24052的亲和力完全恢复。
[0657]
为比较ty24051与ty24052之间的功能活性，使抗体表达，将其纯化且针对抗原依赖性双特异性抗体介导的杀肿瘤细胞活性进行评估(图19)。对于体外细胞毒性分析，自新鲜人类血液分离原初人类全t细胞且与增加量的双特异性抗体一起与her2阳性肿瘤细胞(skov3)混合24小时(目标细胞：1x104个细胞/孔，e:t＝10:1)。如图19中所示，观测ty24051和ty24052的剂量依赖性杀伤作用，并且与ty24051相比，ty24052显示约800倍的ec
50
。在同种型对照情况下，未观测到特异性杀伤作用。

技术特征：
1.一种异二聚蛋白质，其包含含有第一免疫球蛋白重链恒定结构域3(ch3结构域)的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中：i)所述第一ch3结构域包含在位置390的半胱氨酸(c)残基并且所述第二ch3结构域包含在位置400的半胱氨酸残基，或所述第一ch3结构域包含在位置400的半胱氨酸残基并且所述第二ch3结构域包含在位置390的半胱氨酸残基；或ii)所述第一ch3结构域包含在位置392的半胱氨酸残基并且所述第二ch3结构域包含在位置397的半胱氨酸残基，或所述第一ch3结构域包含在位置397的半胱氨酸残基并且所述第二ch3结构域包含在位置392的半胱氨酸残基；或iii)所述第一ch3结构域包含在位置392的半胱氨酸残基并且所述第二ch3结构域包含在位置400的半胱氨酸残基，或所述第一ch3结构域包含在位置400的半胱氨酸残基并且所述第二ch3结构域包含在位置392的半胱氨酸残基；并且其中氨基酸残基编号是基于eu编号。2.如权利要求1所述的异二聚蛋白质，其中：i)所述第一ch3结构域包含n390c取代并且所述第二ch3结构域包含s400c取代，或所述第一ch3结构域包含s400c取代并且所述第二ch3结构域包含n390c取代；或ii)所述第一ch3结构域包含k392c取代并且所述第二ch3结构域包含v397c取代，或所述第一ch3结构域包含v397c取代并且所述第二ch3结构域包含k392c取代；或iii)所述第一ch3结构域包含k392c取代并且所述第二ch3结构域包含s400c取代，或所述第一ch3结构域包含s400c取代并且所述第二ch3结构域包含k392c取代。3.如权利要求1或权利要求2所述的异二聚蛋白质，其中：i)所述第一ch3结构域还包含在位置357的带正电荷的残基并且所述第二ch3结构域还包含在位置351的带负电荷的残基，或所述第一ch3结构域还包含在位置351的带负电荷的残基并且所述第二ch3结构域还包含在位置357的带正电荷的残基；或ii)所述第一ch3结构域还包含在位置411的带正电荷的残基并且所述第二ch3结构域还包含在位置370的带负电荷的残基，或所述第一ch3结构域还包含在位置370的带负电荷的残基并且所述第二ch3结构域还包含在位置411的带正电荷的残基；或iii)所述第一ch3结构域还包含在位置364的带正电荷的残基并且所述第二ch3结构域还包含在位置370的带负电荷的残基，或所述第一ch3结构域还包含在位置370的带负电荷的残基并且所述第二ch3结构域还包含在位置364的带正电荷的残基；或i)与ii)的组合，或i)与iii)的组合；并且其中氨基酸残基编号是基于eu编号。4.如权利要求1-3中任一项所述的异二聚蛋白质，其中所述第一ch3结构域还包含在位置356的带正电荷的残基并且所述第二ch3结构域还包含在位置439的带负电荷的残基，或第一ch3结构域还包含在位置439的带负电荷的残基并且所述第二ch3结构域还包含在位置356的带正电荷的残基；并且其中氨基酸残基编号是基于eu编号。5.如权利要求3或权利要求4所述的异二聚蛋白质，其中：i)所述带正电荷的残基为赖氨酸(k)残基，并且所述带负电荷的残基为天冬氨酸(d)残基；或ii)所述带正电荷的残基为赖氨酸(k)残基，并且所述带负电荷的残基为谷氨酸(e)残
基；或iii)所述带正电荷的残基为精氨酸(r)残基，并且所述带负电荷的残基为天冬氨酸(d)残基；或iv)所述带正电荷的残基为精氨酸(r)残基，并且所述带负电荷的残基为谷氨酸(e)残基。6.如权利要求5所述的异二聚蛋白质，其中：i)所述第一ch3结构域包含e357k和t411k取代并且所述第二ch3结构域包含l351d和k370d取代，或所述第一ch3结构域包含l351d和k370d取代并且所述第二ch3结构域包含e357k和t411k取代；或ii)所述第一ch3结构域包含e357k和s364k取代并且所述第二ch3结构域包含l351d和k370d取代，或所述第一ch3结构域包含l351d和k370d取代并且所述第二ch3结构域包含e357k和s364k取代；或iii)所述第一ch3结构域包含d356k、e357k和s364k取代并且所述第二ch3结构域包含l351d、k370d和k439d取代，或所述第一ch3结构域包含l351d、k370d和k439d取代并且所述第二ch3结构域包含d356k、e357k和s364k取代。7.如权利要求1-5中任一项所述的异二聚蛋白质，其中：i)所述第一ch3结构域还包含k392d和k409d取代并且所述第二ch3结构域还包含d356k和d399k取代，或所述第一ch3结构域还包含d356k和d399k取代并且所述第二ch3结构域还包含k392d和k409d取代；或ii)所述第一ch3结构域还包含l368d和k370s取代并且所述第二ch3结构域还包含e357q和s364k取代，或所述第一ch3结构域还包含e357q和s364k取代并且所述第二ch3结构域还包含l368d和k370s取代；或iii)所述第一ch3结构域还包含l351k和t366k取代并且所述第二ch3结构域还包含l351d和l368e取代，或所述第一ch3结构域还包含l351d和l368e取代并且所述第二ch3结构域还包含l351k和t366k取代；或(iv)所述第一ch3结构域还包含p395k、p396k和v397k取代并且所述第二ch3结构域包含t394d、p395d和p396d取代，或所述第一ch3结构域还包含t394d、p395d和p396d取代并且所述第二ch3结构域还包含p395k、p396k和v397k取代；或(v)所述第一ch3结构域还包含f405e、y407e和k409e取代并且所述第二ch3结构域包含f405k和y407k取代，或所述第一ch3结构域还包含f405k和y407k取代并且所述第二ch3结构域还包含f405e、y407e和k409e取代。8.如权利要求6所述的异二聚蛋白质，其中i)所述第一ch3结构域包含e357k、s364k和n390c取代并且所述第二ch3结构域包含l351d、k370d和s400c取代，或所述第一ch3结构域包含l351d、k370d和s400c取代并且所述第二ch3结构域包含e357k、s364k和n390c取代；或ii)所述第一ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代并且所述第二ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代，或所述第一ch3结构域包含l351d、k370d和n390c取代并且所述第二ch3结构域包含e357k、s364k和s400c取代；或iii)所述第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且所述第二ch3结构
域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或所述第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且所述第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代；或iv)所述第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代并且所述第二ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代，或所述第一ch3结构域包含l351d、k370d、k439d和s400c取代并且所述第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和n390c取代。9.如权利要求1-8中任一项所述的异二聚蛋白质，其中所述第一ch3结构域和所述第二ch3结构域还包含杵入臼残基。10.如权利要求9所述的异二聚蛋白质，其中：i)所述第一ch3结构域包含t336s、l368a和y407v取代并且所述第二ch3结构域包含t366w取代，或所述第一ch3结构域包含t366w取代并且所述第二ch3结构域包含t336s、l368a和y407v取代；或ii)所述第一ch3结构域包含l368v和y407v取代并且所述第二ch3结构域包含t366w取代，或所述第一ch3结构域包含t366w取代并且所述第二ch3结构域包含l368v和y407v取代。11.一种异二聚蛋白质，其包含含有第一ch3结构域的第一多肽和含有第二ch3结构域的第二多肽，其中：i)所述第一ch3结构域包含在位置357的带正电荷的残基并且所述第二ch3结构域包含在位置351的带负电荷的残基，或所述第一ch3结构域包含在位置351的带负电荷的残基并且所述第二ch3结构域包含在位置357的带正电荷的残基；或ii)所述第一ch3结构域包含在位置411的带正电荷的残基并且所述第二ch3结构域包含在位置370的带负电荷的残基，或所述第一ch3结构域包含在位置370的带负电荷的残基并且所述第二ch3结构域包含在位置411的带正电荷的残基；或iii)所述第一ch3结构域包含在位置364的带正电荷的残基并且所述第二ch3结构域包含在位置370的带负电荷的残基，或所述第一ch3结构域包含在位置370的带负电荷的残基并且所述第二ch3结构域包含在位置364的带正电荷的残基；并且其中氨基酸残基编号是基于eu编号。12.如权利要求11所述的异二聚蛋白质，其中所述第一ch3结构域包含在位置356的带电荷残基并且所述第二ch3结构域包含在位置439的带负电荷的残基，或第一ch3结构域包含在位置439的带负电荷的残基并且所述第二ch3结构域包含在位置356的带正电荷的残基；并且其中氨基酸残基编号是基于eu编号。13.如权利要求11或权利要求12所述的异二聚蛋白质，其中：i)所述带正电荷的残基为赖氨酸(k)残基，并且所述带负电荷的残基为天冬氨酸(d)残基；或ii)所述带正电荷的残基为赖氨酸(k)残基，并且所述带负电荷的残基为谷氨酸(e)残基；或iii)所述带正电荷的残基为精氨酸(r)残基，并且所述带负电荷的残基为天冬氨酸(d)残基；或iv)所述带正电荷的残基为精氨酸(r)残基，并且所述带负电荷的残基为谷氨酸(e)残基。14.如权利要求13所述的异二聚蛋白质，其中：
i)所述第一ch3结构域包含e357k和t411k取代并且所述第二ch3结构域包含l351d和k370d取代，或所述第一ch3结构域包含l351d和k370d取代并且所述第二ch3结构域包含e357k和t411k取代；或ii)所述第一ch3结构域包含e357k和s364k取代并且所述第二ch3结构域包含l351d和k370d取代，或所述第一ch3结构域包含l351d和k370d取代并且所述第二ch3结构域包含e357k和s364k取代；或iii)所述第一ch3结构域包含d356k、e357k和s364k取代并且所述第二ch3结构域包含l351d、k370d和k439d取代，或所述第一ch3结构域包含l351d、k370d和k439d取代并且所述第二ch3结构域包含d356k、e357k和s364k取代。15.如权利要求11-14中任一项所述的异二聚蛋白质，其中：i)所述第一ch3结构域还包含k392c取代并且所述第二ch3结构域还包含d399c取代，或所述第一ch3结构域还包含d399c取代并且所述第二ch3结构域还包含k392c取代；或ii)所述第一ch3结构域还包含y394c取代并且所述第二ch3结构域还包含s354c取代，或所述第一ch3结构域还包含s354c取代并且所述第二ch3结构域还包含y394c取代；或iii)所述第一ch3结构域还包含d356c取代并且所述第二ch3结构域还包含y349c取代，或所述第一ch3结构域还包含y349c取代并且所述第二ch3结构域还包含d356c取代。16.如权利要求1-15中任一项所述的异二聚蛋白质，其中所述第一ch3结构域和所述第二ch3结构域为人类ch3结构域。17.如权利要求1-16中任一项所述的异二聚蛋白质，其中所述第一多肽和所述第二多肽自n端至c端各自包含至少一部分免疫球蛋白铰链区、免疫球蛋白重链恒定结构域2(ch2结构域)和所述ch3结构域。18.如权利要求17所述的异二聚蛋白质，其中所述ch2结构域和所述ch3结构域形成igg fc区。19.如权利要求18所述的异二聚蛋白质，其中所述fc区属于人类igg1亚类。20.如权利要求18所述的异二聚蛋白质，其中所述fc区属于人类igg4亚类。21.如权利要求20所述的异二聚蛋白质，其中所述fc区还包含s228p取代。22.如权利要求18-20中任一项所述的异二聚蛋白质，其中所述fc区还包含n297a取代。23.如权利要求1-22中任一项所述的异二聚蛋白质，所述第一多肽和所述第二多肽为抗体重链，并且其中所述异二聚蛋白质还包含一个或多个抗体轻链。24.如权利要求23所述的异二聚蛋白质，其中所述异二聚蛋白质为多特异性抗体。25.如权利要求24所述的异二聚蛋白质，其还包含第三多肽和第四多肽，其中：(i)所述第一多肽包含由下式表示的结构：vh1-ch1-铰链-ch2-第一ch3-l1-scfv1(ia)；(ii)所述第二多肽包含由下式表示的结构：vh2-ch1-铰链-ch2-第二ch3-l2-scfv2(iia)；(iii)所述第三多肽包含由下式表示的结构：vl1-cl(ib)；并且(iv)所述第四多肽包含由下式表示的结构：vl2-cl(iib)；
其中：vl1为第一免疫球蛋白轻链可变结构域；vh1为第一免疫球蛋白重链可变结构域；vl2为第二免疫球蛋白轻链可变结构域；vh2为第二免疫球蛋白重链可变结构域；scfv1为第一单链可变片段；scfv2为第二单链可变片段；cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；铰链为连接所述ch1结构域和所述ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；并且l1和l2各自独立地为键或肽接头；其中vl1与vh1相缔合以形成特异性结合于第一靶标的第一fv；其中vl2与vh2相缔合以形成特异性结合于第二靶标的第二fv；其中scfv1特异性结合于第三靶标；并且其中scfv2特异性结合于第四靶标。26.如权利要求25所述的异二聚蛋白质，其中scfv1与scfv2为相同的。27.如权利要求25或26所述的异二聚蛋白质，其中vl1与vl2为相同的。28.如权利要求26或27所述的异二聚蛋白质，其中所述第一fv特异性结合pdl1，所述第二fv特异性结合cd137，并且scfv1和scfv2特异性结合ctla-4。29.如权利要求24所述的异二聚蛋白质，其还包含第三多肽，其中：(i)所述第一多肽包含由下式表示的结构：vh-ch1-铰链-ch2-第一ch3(iiia)；(ii)所述第二多肽包含由下式表示的结构：scfv-铰链-ch2-第二ch3(iva)；并且(iii)所述第三多肽包含由下式表示的结构：vl-cl(iiib)；其中：vl为免疫球蛋白轻链可变结构域；vh为免疫球蛋白重链可变结构域；scfv为单链可变片段；cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；且铰链为连接所述ch1结构域和所述ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；其中vl与vh相缔合以形成特异性结合于第一靶标的fv；并且其中所述scfv特异性结合于第二靶标。30.如权利要求29所述的异二聚蛋白质，其中所述fv特异性结合cd137并且所述scfv特异性结合pdl1。
31.如权利要求24所述的异二聚蛋白质，其中所述异二聚蛋白质为可活化抗体，其中所述异二聚蛋白质包含第三多肽，并且其中：(i)所述第一多肽包含由下式表示的结构：vh-ch1-铰链-ch2-第一ch3(va)；(ii)所述第二多肽包含由下式表示的结构：mm1-cm1-scfv-铰链-ch2-第二ch3(via)；并且(iii)所述第三多肽包含由下式表示的结构：mm2-cm2-vl-cl(ivb)；其中：vl为免疫球蛋白轻链可变结构域；vh为免疫球蛋白重链可变结构域；scfv为单链可变片段；cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；铰链为连接所述ch1结构域和所述ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；mm1为第一遮蔽肽；mm2为第二遮蔽肽；cm1为第一可裂解肽；并且cm2为第二可裂解肽；其中vl与vh相缔合以形成特异性结合于第一靶标的第一fv；其中所述scfv特异性结合于第二靶标；其中当cm1未裂解时，mm1抑制所述scfv结合至所述第一靶标；并且其中当cm2未裂解时，mm2抑制所述第一fv结合至所述第二靶标。32.如权利要求29或31所述的异二聚蛋白质，其中所述第一靶标为肿瘤抗原，并且所述第二靶标为cd3。33.如权利要求31或32所述的异二聚蛋白质，其中mm1包含seq id no:35的氨基酸序列。34.如权利要求32或33所述的异二聚蛋白质，其中所述第一靶标为her2。35.如权利要求34所述的异二聚蛋白质，其中mm2包含seq id no:36的氨基酸序列。36.一种可活化抗体，其包含：第一多肽，所述第一多肽自n端至c端包含遮蔽部分(mm)、可裂解部分(cm)和靶标结合部分(tbm)，其中所述mm包含seq id no:35的氨基酸序列；其中当所述cm未裂解时，所述mm抑制所述可活化抗体结合至人类cd3；其中所述cm至少包含第一裂解位点；并且其中：a)所述tbm包含vl并且所述可活化抗体还包含含有vh的第二多肽；b)所述tbm包含vh并且所述可活化抗体还包含含有vl的第二多肽；c)所述tbm自n端至c端包含vl和vh；或d)所述tbm自n端至c端包含vh和vl；并且其中当所述cm裂解时，所述可活化抗体经由所述vh和所述vl结合至人类cd3。
37.一种可活化抗体，其包含：第一多肽，所述第一多肽自n端至c端包含遮蔽部分(mm)、可裂解部分(cm)和靶标结合部分(tbm)，其中所述mm包含seq id no:36的氨基酸序列；其中当所述cm未裂解时，所述mm抑制所述可活化抗体结合至人类her2；其中所述cm至少包含第一裂解位点；并且其中：a)所述tbm包含vl并且所述可活化抗体还包含含有vh的第二多肽；b)所述tbm包含vh并且所述可活化抗体还包含含有vl的第二多肽；c)所述tbm自n端至c端包含vl和vh；或d)所述tbm自n端至c端包含vh和vl；并且其中当所述cm裂解时，所述可活化抗体经由所述vh和所述vl结合至人类her2。38.如权利要求36或37所述的可活化抗体，其包含第一多肽、第二多肽和第三多肽，其中：(i)所述第一多肽包含由下式表示的结构：vh-ch1-铰链-ch2-第一ch3(va)；(ii)所述第二多肽包含由下式表示的结构：mm1-cm1-scfv-铰链-ch2-第二ch3(via)；并且(iii)所述第三多肽包含由下式表示的结构：mm2-cm2-vl-cl(ivb)；其中：vl为免疫球蛋白轻链可变结构域；vh为免疫球蛋白重链可变结构域；scfv为单链可变片段；cl为免疫球蛋白轻链恒定结构域；ch1为免疫球蛋白重链恒定结构域1；ch2为免疫球蛋白重链恒定结构域2；铰链为连接所述ch1结构域和所述ch2结构域的免疫球蛋白铰链区；mm1为第一遮蔽肽；mm2为第二遮蔽肽；cm1为第一可裂解肽；并且cm2为第二可裂解肽；其中vl与vh相缔合以形成特异性结合于第一靶标的第一fv；其中所述scfv特异性结合于第二靶标；并且其中mm为mm1或mm2。39.如权利要求32-35中任一项所述的异二聚蛋白质或如权利要求36或38所述的可活化抗体，其中所述第一fv或所述tbm包含vh，所述vh包含含有seq id no:61的氨基酸序列的cdr-hl、含有seq id no:62的氨基酸序列的cdr-h2和/或含有seq id no:63的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，所述tbm包含vl，所述vl包含含有seq id no:64的氨基酸序列的cdr-ll、含有seq id no:65的氨基酸序列的cdr-l2和/或含有seq id no:66的氨基酸序列的cdr-l3。40.如权利要求34或35所述的异二聚蛋白质或如权利要求37-39中任一项所述的可活化抗体，其中所述scfv或所述tbm包含vh，所述vh包含含有seq id no:69的氨基酸序列的
cdr-h1、含有seq id no:70的氨基酸序列的cdr-h2和/或含有seq id no:71的氨基酸序列的cdr-h3。在一些实施方案中，所述tbm包含vl，所述vl包含含有seq id no:72的氨基酸序列的cdr-l1、含有seq id no:73的氨基酸序列的cdr-l2和/或含有seq id no:74的氨基酸序列的cdr-l3。41.如权利要求31-35中任一项所述的异二聚蛋白质或如权利要求36-40中任一项所述的可活化抗体，其中所述可活化抗体包含含有第一ch3结构域和第二ch3结构域的fc区，其中所述第一ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代并且所述第二ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代，或所述第一ch3结构域包含l351d、k370d、n390c和k439d取代并且所述第二ch3结构域包含d356k、e357k、s364k和s400c取代。42.一种或多种核酸，其编码权利要求1-35和39-41中任一项所述的异二聚蛋白质或权利要求36-41中任一项所述的可活化抗体。43.一种载体，其包含权利要求42所述的一种或多种核酸。44.一种宿主细胞，其包含权利要求42所述的一种或多种核酸或权利要求43所述的载体。45.一种用于制备异二聚蛋白质或可活化抗体的方法，所述方法包括：(a)在允许所述一种或多种核酸或载体表达的条件下培养权利要求44所述的宿主细胞；和(b)自宿主细胞培养物回收所述异二聚蛋白质或所述可活化抗体。46.一种药物组合物，其包含1-35和39-41所述的异二聚蛋白质或权利要求36-41中任一项所述的可活化抗体，和药学上可接受的载体。47.一种用于治疗有需要的受试者的疾病或疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求46所述的药物组合物。48.如权利要求47所述的方法，其中所述疾病或疾患为癌症。49.如权利要求48所述的方法，其中所述癌症为肺癌。50.如权利要求48所述的方法，其中所述癌症为卵巢癌。

技术总结
提供了异二聚蛋白质，所述异二聚蛋白质包含具有含形成二硫键和/或盐桥的经工程改造的残基的CH3结构域的多肽。还提供了靶向CD3和/或HER2的可活化抗体。还提供了使用所述异二聚蛋白质和所述可活化抗体的组合物、制造方法和治疗方法。治疗方法。


技术研发人员：罗培志 杜方勇 刘桂中 戴正喜 施建峰 林志雄 李艳
受保护的技术使用者：天演药业（瑞士）公司
技术研发日：2021.01.22
技术公布日：2022/11/1