modulating mtor pathway and apc function.j immunother cancer,2021,9(12):e003339.]。
4.电离辐射(ionizing radiation)是指会引起物质电离，破坏原子或分子结构的辐射。一般认为，接受长时间或较高强度的电离辐射会危害机体健康，导致器官和系统发生病理改变，引起放射病，甚至具有诱导癌症发生的可能性。近年来，电离辐射诱导免疫激活的现象逐渐引起科研人员的兴趣，其潜在的控制肿瘤的作用及其机制已成为研究热点。研究表明，较低剂量辐射不仅不会损害机体的免疫功能，反而能够正向调节免疫系统，抑制和延缓原发或转移性肿瘤的进展[yu hs, liu zm,yu xy,et al.low-dose radiation induces antitumour effects and erythrocytesystem hormesis.asian pac j cancer prev,2013,14(7):4121-4126.nowosielskaem,cheda a,wrembel-wargocka j,et al.effect of low doses of low-let radiation onthe innate anti-tumor reactions in radioresistant and radiosensitive mice.doseresponse,2012,10(4):500-515.]；上调免疫系统的固有和适应性免疫能力是其重要机制之一[yang g,kong q,wang g,jin h,et al.low-dose ionizing radiationinduces direct activation of natural killer cells and provides a novel approach foradoptive cellular immunotherapy.cancer biother radiopharm,2014,29(10): 428-434.]。
[0005]
当前，放射治疗作为肿瘤治疗的重要手段广泛应用于临床，电离辐射可通过直接诱导肿瘤细胞死亡和调节表型等机制发挥其增强抗肿瘤免疫效能。研究表明，电离辐射可导致调节性t细胞foxp3表达下调从而减弱其对cd8
+
t细胞增殖的抑制效果[persa e,balogh a,s
á
fr
á
ny g,et al.the effect of ionizing radiationon regulatory t cells in health and disease.cancer lett,2015,368(2):252-261.]。低剂量辐射体内可增加抗氧化基因的表达，下调促炎细胞因子白细胞介素1β (interleukin 1β，il-1β)、il-6和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，tnf-α表达，增加伤口愈合能力[son b,lee s,kim h,et al.low dose radiation attenuatesinflammation and promotes wound healing in a mouse burn model.dermatol sci, 2019,96(2):81-89.]，还可以刺激机体正常细胞增殖，激活其防御系统，减少对正常组织的损伤，诱导适应性反应发生，从而减少高剂量放疗对机体免疫系统的损伤，增加对微小肿瘤的清除，降低癌症发生率[paunesku,stevanovi a,popovij,et al.effects of low dose and low dose rate low linear energy transfer radiation onanimals
–
review of recent studies relevant for carcinogenesis[j].int j radiat biol, 2021,97(6):757-768.]；同时还具有增强癌症治疗效果和减少抗癌治疗毒副作用的潜力等[yang g,li w,jiang h,et al.low-dose radiation may be a novel approachto enhance the effectiveness of cancer therapeutics.int j cancer,2016,139(10): 2157-2168.]。低剂量辐射体外可激活nk细胞功能，显著增强nk细胞的扩增和细胞毒活性[chen j,liu x,zeng z,et al.immunomodulation of nk cells byionizing radiation.front oncol,2020,10:874.yang g,kong q,wang g,et al. low-dose ionizing radiation induces direct activation of natural killer cells andprovides a novel approach for adoptive cellular immunotherapy.cancer biotherradiopharm,2014,29(10):428-434.]。
[0006]
由于人γδt细胞是肿瘤患者肿瘤免疫治疗中重要的抗肿瘤效应细胞，故有效促进
人γδt细胞增殖、增强其细胞毒活性是十分重要和必要的。既往实验主要进行以整体动物或动物细胞为模型的不同剂量电离辐射作用的研究，而电离辐射能否对人γδt细胞产生影响未见报道。
技术实现要素：[0007]
本发明提供一种促进人γδt细胞体外增殖与增强其细胞毒活性的方法。
[0008]
本发明的技术方案包括如下内容：一种促进人γδt细胞体外增殖与增强其细胞毒活性的方法，包括如下步骤：
[0009]
(1)无菌采集健康人外周血20ml，抗凝处理后，密度梯度离心获取外周血单个核细胞，经磷酸盐缓冲液洗涤后加入至gt551 h3无血清培养基中，形成初始细胞密度为1
×
106/ml的细胞溶液，置于37℃、5％co2环境下的细胞培养箱中培养，隔日补充完全培养基；
[0010]
(2)将步骤(1)中的人γδt细胞培养10天后，收集少量细胞经磷酸盐缓冲液洗涤后，与fitc标记的抗人γδtcr单抗在室温下避光孵育15min，再次使用磷酸盐缓冲液洗涤后经检测收集扩增效率达80％以上的人γδt细胞，经磷酸盐缓冲液洗涤2遍后悬浮于含0.5％牛血清白蛋白、2mmol/l乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液中，采用抗人γδtcr单抗包被的磁珠阳性分选人γδt细胞；
[0011]
(3)取步骤(2)中分选纯化后的人γδt细胞，将分选纯化后的人γδt细胞按1
×
107/ml的细胞密度转移至6孔细胞培养板中，每孔3ml，采用直线加速器治疗机，于室温条件下以6mv x线分别给予0.08gy进行辐射，机架ga为270
°
，源皮距ssd＝500cm，辐射野10cm
×
10cm，剂量率为0.08gy/min，输出量为2 gy/min，培养皿前覆盖1.5cm等效填充物(补充膜)，结束后置于37℃、5％co2环境下的细胞培养箱内继续培养48h，即获得体外增殖2倍以上的人γδt细胞；
[0012]
(4)取步骤(2)中分选纯化后的人γδt细胞，将分选纯化后的人γδt细胞按1
×
107/ml的细胞密度转移至6孔细胞培养板中，每孔3ml，采用直线加速器治疗机，于室温条件下以6mv x线分别给予2gy进行辐射，采用垂直辐射，机架ga为180
°
，源皮距ssd＝100cm，辐射野15cm
×
15cm，剂量率为200 gy/min，培养皿底部垫1.5cm等效填充物(补充膜)。结束后置于37℃、5％co2环境下的细胞培养箱内继续培养48h，即获得体外对肝癌hepg2细胞的杀伤活性为45％以上的人γδt细胞。经流式细胞术检测该人γδt细胞胞内抗原穿孔素、颗粒酶b表达，表面抗原溶酶体相关膜蛋白-1表达均显著提高。
[0013]
进一步地，gt551 h3无血清培养基中需补加重组人白细胞介素-2、异戊烯焦磷酸溶液，其中重组人白细胞介素-2的浓度为2μg/ml、异戊烯焦磷酸的浓度为100iu/ml。
[0014]
进一步地，人γδt细胞的增殖能力采用台盼兰染色法进行检测，人γδt细胞对肝癌hepg2细胞的杀伤活性采用乳酸脱氢酶释放法检测。
[0015]
本发明的有益效果是：1、首次发现了单次0.08gy电离辐射能够显著促进体外人γδt细胞增殖能力，获得体外增殖2倍以上的人γδt细胞；2、首次发现了单次2gy电离辐射能够显著增强人γδt细胞对肝癌hepg2细胞的肿瘤杀伤活性，获得体外对肝癌hepg2细胞的杀伤活性为45％以上的人γδt细胞，并证实其机制与电离辐射促进人γδt细胞穿孔素、颗粒酶b及cd107a的表达相关。3、发现了低剂量电离辐射对γδt细胞新的医药用途，可为进一步研究电离辐射应用于肿瘤免疫治疗的可能性及合适剂量提供依据及参考；4、本方法操作简
便、成本低廉，可有效获得体外增殖2倍以上的人γδt细胞和体外对肝癌hepg2细胞的杀伤活性为45％以上人γδt细胞，方法易于推广。
附图说明
[0016]
图1为人γδt细胞的形态学特征；
[0017]
图2为人γδt细胞的及纯度鉴定；
[0018]
图3为不同剂量电离辐射后人γδt细胞的扩增分析(与0gy未辐射对照组相比，*p《0.05、**p《0.01)；
[0019]
图4为不同剂量电离辐射后人γδt细胞对hepg2细胞的杀伤活性(与0gy 未辐射对照组相比，*p＜0.05、**p＜0.01)；
[0020]
图5为不同剂量电离辐射48h后人γδt细胞穿孔素、颗粒酶b及cd107a 表达的流式细胞图。
具体实施方式
[0021]
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0022]
实施例1：不同剂量电离辐射对人γδt细胞的增殖实验
[0023]
1材料与方法
[0024]
1.1实验材料
[0025]
1.1.1实验细胞人γδt细胞由健康志愿者提供的外周血体外扩增培养获得。人肝癌细胞株hepg2购于中国科学院上海细胞库。
[0026]
1.1.2主要试剂mem培养基，购自invitrogen公司；gt551 h3培养基，购自takara公司；胰蛋白酶，胎牛血清，均购自gibco公司；重组人白细胞介素-2(recombinant human interleukin-2，rhil-2)，购自厦门特宝生物工程股份有限公司；淋巴细胞分离液，购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；fitc 标记的抗人γδtcr单抗，pe标记的穿孔素(perforin)单抗，pe标记的颗粒酶b(granzyme b)单抗，apc标记的溶酶体相关膜蛋白-1(lysosome-associatedmembrane protein 1或cd107a)单抗，均购自ebioscience公司；fix&perm破膜剂，购自invitrogen公司；乳酸脱氢酶试剂盒，购自上海长征复星公司。异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，ipp)，磷酸盐缓冲液(phosphate buffersolution，pbs)，均为分析纯，购自sigma公司。
[0027]
1.1.3主要设备2300c/d sn416型直线加速器治疗机(精度99.8％)，美国 varian公司产品，徐州医科大学附属淮海医院放射治疗科装机使用。st-360型酶标仪，上海科华实验系统有限公司产品；au680型全自动生化分析仪，beckmancoulter公司产品；te-2000型倒置显微镜，nikon公司产品；hf90/hf240型co2培养箱，上海力康公司产品；facs calibur型流式细胞仪，bd公司产品。采用 cell quest软件进行细胞分析，每个标本分析细胞数≥10000。
[0028]
1.2方法
[0029]
1.2.1人γδt细胞的培养及鉴定无菌抽取健康志愿者(健康志愿者知情同意，签属知情同意书)外周血20ml，抗凝处理后，密度梯度离心获取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，pbmcs)，经pbs洗涤后加入至 gt551 h3无血清培养基中，补加
rhil-2(浓度100iu/ml)、ipp(浓度2μg/ml) 溶液，形成初始细胞密度为1
×
106/ml的细胞溶液，置于37℃、5％co2环境下的细胞培养箱中培养，隔日补充完全培养基。培养10天后，收集少量细胞经pbs 洗涤后，与fitc标记的抗人γδtcr单抗在室温下避光孵育15min，再次使用 pbs洗涤后上机检测人γδt细胞的百分含量，判定细胞扩增效率。
[0030]
1.2.2人γδt细胞的纯度分析收集扩增效率达80％以上的人γδt细胞，经 pbs洗涤2遍后悬浮于含0.5％牛血清白蛋白、2mmol/l edta的pbs中，采用抗人γδtcr单抗包被的磁珠阳性分选人γδt细胞，使用流式细胞术对进行细胞纯度分析。
[0031]
1.2.3不同剂量辐射人γδt细胞进行分组将分选纯化后的人γδt细胞按 1
×
107/ml的细胞密度转移至6孔细胞培养板中，每孔3ml，采用直线加速器治疗机，于室温条件下以6mv x线分别给予0.08gy、0.5gy、2gy、4gy、6gy 进行辐射。其中，0.08gy剂量组辐射时机架ga为270
°
，源皮距ssd＝500cm，辐射野10cm
×
10cm，剂量率为0.08gy/min，输出量为2gy/min，培养皿前覆盖1.5cm等效填充物；其余各组均采用垂直辐射，机架ga为180
°
，源皮距ssd ＝100cm，辐射野15cm
×
15cm，剂量率为200gy/min，分别给予0.5gy、2gy、 4gy、6gy辐射，培养皿底部垫1.5cm等效填充物。相应设置0gy未辐射对照组。结束后置于37℃、5％co2环境下的细胞培养箱内培养。
[0032]
1.2.4不同剂量辐射人γδt细胞的增殖分析人γδt细胞辐射后继续培养24 h、48h，收集各组细胞，经pbs洗涤后采用台盼兰染色法(cck-8法)并计数，检测并分析人γδt细胞增殖情况。
[0033]
1.3统计学处理
[0034]
实验数据采用表示，采用spss 16.0软件进行单因素方差分析，以p《0.05 为差异有统计学意义。
[0035]
2结果
[0036]
2.1人γδt细胞培养和鉴定
[0037]
rhil-2、ipp扩增培养的第10天，倒置显微镜下可见细胞呈梭形、圆形、纺锤形等不同形态以及大小不等的细胞集落，见图1。经流式细胞术检测，γδt细胞百分含量为81.22％
±
3.51％；与扩增前分离的单个核细胞中的γδt细胞比例相比，γδt细胞得到了有效扩增。经磁珠阳性分选纯化后的γδt细胞百分含量为 96.76％
±
1.37％，见图2。
[0038]
2.2人γδt细胞增殖能力
[0039]
辐射后培养24h、48h的各组人γδt细胞中，0.08gy剂量组增殖最为显著，其辐射后培养24h的扩增倍数为1.32
±
0.07，增殖能力较0gy未辐射对照组显著增强(p《0.05)，辐射后培养48h的扩增倍数为2.22
±
0.11，增殖能力较0gy未辐射对照组极显著增强(p《0.01)；0.5gy剂量组较0gy未辐射对照组略有增强，但差异无统计学意义(p》0.05)；其余各组人γδt细胞随辐射剂量增加呈增殖抑制趋势，见图3。
[0040]
实施例2：不同剂量电离辐射人γδt细胞对肝癌hepg2细胞的杀伤活性实验
[0041]
1材料与方法
[0042]
1.1实验材料
[0043]
1.1.1实验细胞、1.1.2主要试剂、1.1.3主要设备均同实施例1。
[0044]
1.2方法
[0045]
其中，1.2.1人γδt细胞的培养及鉴定、1.2.2人γδt细胞的纯度分析、1.2.3 不同
剂量辐射人γδt细胞进行分组均同实施例1。
[0046]
1.2.4hepg2细胞的培养hepg2细胞置于含10％胎牛血清的mem培养基中，37℃、5％co2环境下的细胞培养箱中培养，使用倒置显微镜观察细胞形态及生长情况，取对数生长期细胞进行实验。
[0047]
1.2.5乳酸脱氢酶释放法(ldhrm法)检测人γδt细胞对肝癌hepg2细胞的杀伤活性以辐射后继续培养24h、48h的人γδt细胞作为效应细胞，以处于对数生长期hepg2细胞作为靶细胞，按照20:1比例于37℃、5％co2环境下的细胞培养箱中共孵育6h，置于1500r/min下离心10min，收集各组上清液，在全自动生化分析仪上于340nm波长下检测光密度值(d)。每组设置3个复孔，以单独效应细胞和靶细胞作为对照组，计算各组杀伤活性。计算公式为：杀伤活性＝[(d
实验组-d
效应细胞自然释放组-d
靶细胞自然释放组
)/(d
靶细胞最大释放组-d
靶细胞自然释放组
)]
ꢀ×
100％。
[0048]
1.3统计学分析
[0049]
实验数据采用表示，采用spss 16.0软件进行单因素方差分析，以p《0.05 为差异有统计学意义。
[0050]
2人γδt细胞对肝癌hepg2细胞的杀伤效应结果
[0051]
按照效靶比20:1比例共孵育6h后，辐射后培养24h的2gy剂量组、4gy 剂量组人γδt细胞的杀伤活性分别为45.33％
±
3.22％、42.42％
±
3.54％，显著高于 0gy未辐射对照组的34.73％
±
3.69％(分别p《0.01、p《0.05)。辐射后培养48h 的2gy剂量组、4gy剂量组人γδt细胞的杀伤活性分别为47.33％
±
3.81％、 43.85％
±
3.39％，显著高于0gy未辐射对照组的36.53％
±
4.15％(分别p《0.01、 p《0.05)，见图4。
[0052]
实施例3：不同剂量电离辐射对人γδt细胞穿孔素、颗粒酶b及cd107a 的表达实验
[0053]
1.1实验材料
[0054]
1.1.1实验细胞、1.1.2主要试剂、1.1.3主要设备均同实施例1。
[0055]
1.2方法
[0056]
其中，1.2.1人γδt细胞的培养及鉴定、1.2.2人γδt细胞的纯度分析、1.2.3 不同剂量辐射人γδt细胞进行分组均同实施例1。
[0057]
1.2.4流式细胞术检测人γδt细胞胞内抗原穿孔素、颗粒酶b的表达取辐射后继续培养48h的各组人γδt细胞，离心弃去上清，经pbs洗涤2次，调整细胞浓度为1
×
107/ml。取各组细胞悬液100μl，加入fitc标记的抗人γδtcr单抗、percp-cy5.5标记的抗人cd3单抗各20μl，室温下避光孵育20min，然后加入固定和破膜试剂继续孵育15min，再加入pe标记的抗人穿孔素单抗，避光孵育20min后用pbs洗涤，再以400μl pbs重悬细胞，上机检测人γδt细胞穿孔素的表达。与检测穿孔素步骤相同，在加入固定和破膜试剂继续孵育15min 后，加入pe标记的抗人颗粒酶b单抗，避光孵育20min后用pbs洗涤，再以 400μl pbs重悬细胞，上机检测人γδt细胞颗粒酶b的表达。
[0058]
1.2.5流式细胞术检测人γδt细胞表面抗原cd107a的表达取辐射后继续培养48h的各组人γδt细胞，离心弃去上清，经pbs洗涤2次，调整细胞浓度为1
×
107/ml。取各组细胞悬液100μl，加入fitc标记的抗人γδtcr单抗、 percp-cy5.5标记的抗人cd3单抗、apc标记的抗人cd107a单抗各20μl，于室温条件下避光孵育20min，经pbs洗涤后重悬细胞，上机检测cd107a的表达。
[0059]
1.3统计学分析
[0060]
实验数据采用表示，采用spss 16.0软件进行单因素方差分析，以p《0.05 为差异有统计学意义。
[0061]
2人γδt细胞胞内穿孔素、颗粒酶b及细胞表面cd107a的表达结果
[0062]
流式细胞术检测显示，辐射后培养48h的2gy剂量组、4gy剂量组人γδt 细胞胞内穿孔素、颗粒酶b表达均显著高于0gy未辐射对照组，2gy组人γδt 细胞表面cd107a表达显著高于未辐射对照组，见表1、图5。
[0063]
表1不同剂量电离辐射48h后人γδt细胞穿孔素、颗粒酶b及cd107a的表达
[0064][0065][0066]
注：与0gy未辐射对照组相比较，*p《0.05，**p《0.01。
技术特征：1.一种促进人γδt细胞体外增殖与增强其细胞毒活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）无菌采集健康人外周血20 ml，抗凝处理后，密度梯度离心获取外周血单个核细胞，经磷酸盐缓冲液洗涤后加入至gt551 h3无血清培养基中，形成初始细胞密度为1
×
10
6 /ml的细胞溶液，置于37
°
c、5%co2环境下的细胞培养箱中培养，隔日补充完全培养基；（2）将步骤（1）中的人γδt细胞培养10天后，收集少量细胞经磷酸盐缓冲液洗涤后，与fitc标记的抗人γδtcr单抗在室温下避光孵育15 min，再次使用磷酸盐缓冲液洗涤后经检测收集扩增效率达80%以上的人γδt细胞，经磷酸盐缓冲液洗涤2遍后悬浮于含0.5%牛血清白蛋白、2 mmol/l 乙二胺四乙酸的磷酸盐缓冲液中，采用抗人γδtcr单抗包被的磁珠阳性分选人γδt细胞；（3）取步骤（2）中分选纯化后的人γδt细胞，将分选纯化后的人γδt细胞按1
×
10
7 /ml的细胞密度转移至6孔细胞培养板中，每孔3 ml，采用直线加速器治疗机，于室温条件下以6 mv x线分别给予0.08 gy进行辐射，机架ga为270
°
，源皮距ssd =500 cm，辐射野10 cm
ꢀ×
10 cm，剂量率为0.08 gy/min，输出量为2 gy/min，培养皿前覆盖1.5 cm等效填充物，结束后置于37
°
c、5%co2环境下的细胞培养箱内继续培养48 h，即获得体外增殖2倍以上的人γδt细胞；（4）取步骤（2）中分选纯化后的人γδt细胞，将分选纯化后的人γδt细胞按1
×
10
7 /ml的细胞密度转移至6孔细胞培养板中，每孔3 ml，采用直线加速器治疗机，于室温条件下以6 mv x线分别给予2 gy进行辐射，采用垂直辐射，机架ga为180
°
，源皮距ssd =100 cm，辐射野15 cm
ꢀ×
15 cm，剂量率为200 gy/min，培养皿底部垫1.5 cm等效填充物；结束后置于37
°
c、5%co2环境下的细胞培养箱内继续培养48 h，即获得体外对肝癌hepg2细胞的杀伤活性为45%以上的人γδt细胞；经流式细胞术检测该人γδt细胞胞内抗原穿孔素、颗粒酶b表达，表面抗原溶酶体相关膜蛋白-1表达均显著提高。2.根据权利要求l所述的促进人γδt细胞体外增殖与增强其细胞毒活性的方法，其特征在于gt551 h3无血清培养基中需补加重组人白细胞介素-2、异戊烯焦磷酸溶液，其中重组人白细胞介素-2的浓度为2 μg/ml、异戊烯焦磷酸的浓度为100 iu/ml。3.根据权利要求l所述的促进人γδt细胞体外增殖与增强其细胞毒活性的方法，其特征在于人γδt细胞的增殖能力采用台盼兰染色法进行检测，人γδt细胞对肝癌hepg2细胞的杀伤活性采用乳酸脱氢酶释放法检测。
技术总结本发明属于医药技术领域，公开了促进人γδT细胞体外增殖与增强其细胞毒活性的方法。单次0.08 Gy电离辐射能够显著促进体外人γδT细胞增殖能力，获得体外增殖2倍以上的人γδT细胞；单次2 Gy电离辐射能够显著增强人γδT细胞对肝癌HepG2细胞的肿瘤杀伤活性，获得体外对肝癌HepG2细胞的杀伤活性为45%以上的人γδT细胞，其机制与电离辐射促进人γδT细胞穿孔素、颗粒酶B及溶酶体相关膜蛋白-1的表达相关。本发明发现了低剂量电离辐射对γδT细胞新的医药用途，可为进一步研究电离辐射应用于肿瘤免疫治疗的可能性及合适剂量提供依据及参考。及参考。及参考。
技术研发人员：王路路 冯守信 周忠海 陈玲 杨阳 马文青 赵海泉
受保护的技术使用者：徐州医科大学
技术研发日：2022.05.17
技术公布日：2022/11/1
