1.本发明涉及乳制品生产技术领域，具体涉及一种牛奶坏包的反接种分析方法。
背景技术：2.目前乳制品行业uht乳占据液态奶超70％市场份额，但uht乳在货架期内经常发生一些质量缺陷，如蛋白水解、脂肪上浮、风味劣化等，对消费者健康和企业品牌造成严重的不良影响。其中微生物导致的坏包是行业中的痛点，如果不及时排查出问题有可能导致连续几个批次产品均出现质量问题。所以如何实现快速分析、确定导致坏包的菌种尤为重要。微生物菌种鉴定手段对微生物操作人员的专业要求较高，同时需要相关的鉴定设备，导致很多企业无法做到独立完成菌种鉴定。企业通常先用平板检测方式判断产品是单一菌污染还是多菌种污染。在确定为单一菌污染的情况下，将不同类型的菌反接种至正常乳制品产品中制成反接种样品，将反接种样品与坏包产品进行对比，从而确定是否与造成产品坏包的菌一致。
3.通常是将菌接种至牛奶包装袋中。对比过程中需要分析反接种样品的ph值和凝固状态，在检测过程中需要将反接种样品打开进行检测和观察，为避免外来菌来的污染，微生物样品开袋检测过后只能做废弃物处理，不能继续培养，导致需要准备的反接种样品大，对反接种用菌用量增大，多次操作带来外来污染的可能性也增大。
技术实现要素：4.本发明的目的在于：针对现有牛奶坏包分析方法反接种样品需求量大，效率低的问题，提供一种用于牛奶坏包分析的反接种分析方法。通过向牛奶中加入石蕊，在石蕊显色作为背景下，能够对牛奶的产气、产酸和胨化状态进行实时观测，能够综合考量产气、产酸和胨化状态来判断菌的种类。整个过程样品用量少，操作简单，用时短，提升了检测效率。
5.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
6.一种牛奶坏包的反接种分析方法，包括如下步骤，
7.s1，取与坏包牛奶相同基质的正常牛奶，置于容器中，加入石蕊；进行灭菌处理；得到石蕊牛奶样品；
8.s2，向步骤s1得到的石蕊牛奶样品中，接种待确认菌，将容器密闭，进行培养；
9.s3，观察产气情况、产酸情况和胨化情况；当石蕊牛奶样品的产气情况、产酸情况和胨化情况与坏包样品一致时，判断该坏包牛奶产生的原因由该待确认菌引起。
10.坏包牛奶分析时，其主要目的是为了快速的确定是哪种菌引起的坏包，从而继续针对该菌进行分析排查来源。当坏包牛奶中分离的菌为单一菌时，将该菌反接种至正常牛奶中以确定是否由该菌引起的坏包。当坏包牛奶中分离的菌为多个菌时，需将多个菌分别反接种至正常牛奶中以分别确定是否由其中一个菌引起的坏包。通常采用的将分离后的待确认菌接种至牛奶包装后，只能通过观察是否已胀包判断是否产气，而且胀包所需时间较长；在判断是否产酸时，需取样进行ph值的测量，导致取样后的样品无法继续培养，导致了
实验样品用量增大；在判断是否胨化时，同样的需要打开包装才能观察，而且由于样品为白色，坏包时间较短时不易观察。通过制备石蕊牛奶样品置于密闭容器中，仅需要将待确认菌分别反接种，通过观察的方式，就能判断石蕊牛奶样品的产气、产酸和胨化情况。尤其胨化状态，在石蕊变色的情况下，以石蕊作为背景色胨化现象更易呈现出来，较未加石蕊的样品胨化表现得更为明显和提前。仅通过观察的方式，不必对石蕊牛奶样品造成损失，减少了实验所需要的样品量；而且能够持续的更快的观察到石蕊牛奶的变化，进而判断是否与坏包牛奶一致。减少了坏包分析的时间。
11.作为本发明的优选方案，所述产气情况判断时，坏包牛奶的产气情况通过观察是否胀包判断；石蕊牛奶样品的产气情况通过观察是否有气泡产生判断。
12.作为本发明的优选方案，所述产酸情况判断时，坏包牛奶的产酸情况通过取样测量ph值判断；石蕊牛奶样品的产酸情况通过观察样品的颜色变化判断。
13.作为本发明的优选方案，所述胨化情况判断时，坏包牛奶的胨化情况通过检测酪蛋白含量是否降低判断；石蕊牛奶样品的胨化情况中，通过观察样品状态判断。坏包牛奶的胨化情况不易观察，需要通过检测酪蛋白含量是否降低判断。
14.作为本发明的优选方案，全脂牛奶的胨化表现为脂肪上浮、产品组织状态为絮状但不结块，脱脂牛奶的胨化表现为产品变澄清。在发现牛奶坏包时，先记录坏包牛奶的产气、产酸和胨化状态。此时坏包牛奶已经被菌污染一定时间。在进行石蕊牛奶样品反接种时，存在接种时间差的问题。故石蕊牛奶的观察结果是和在先记录的坏包牛奶的产气、产酸和胨化状态进行对比。
15.作为本发明的优选方案，当胨化使凝固的酪蛋白被水解时，试管上层为澄清液体。底部可能留有未被完全水解的酪蛋白。
16.作为本发明的优选方案，还包括空白牛奶样品的反接种；步骤如下，
17.a1，取与坏包牛奶相同基质的正常牛奶，置于容器中；进行灭菌处理；得到空白牛奶样品；
18.a2，向步骤a1得到的空白牛奶样品中，接种待确认菌，将容器密闭，进行培养；
19.a3，观察产气情况、产酸情况和胨化情况；当空白样品的产气情况、产酸情况和胨化情况与坏包样品一致时，停止观察石蕊牛奶样品。
20.为更准确的排除接种时间差带来的影响，在石蕊牛奶反接种的同时，做空白牛奶样品的反接种，能够更好的观察对比产气情况。当空白牛奶样品与在先记录的坏包牛奶的状态基本一致时，才停止观察石蕊牛奶；往往石蕊牛奶样品的状态更先表现出来被观察到，故能够争取更多的时间。
21.作为本发明的优选方案，步骤s2中的待确认菌是从坏包产品中通过微生物实验分离得到的。反接种的待确认菌是从坏包产品中通过微生物实验分离的，而不是已知菌。该反接种分析主要是为了判断待确认菌是否与造成牛奶坏包的菌是否一致，不在于判断具体的菌的类型。在判断一致的基础上，再进一步根据该菌的特性和来源解决污染源问题。
22.作为本发明的优选方案，同时进行多个待确认菌的反接种分析。
23.作为本发明的优选方案，步骤s2之前，对坏包牛奶进行微生物检测，确定多个可能的待确认菌；将多个待确认菌分别置于步骤s1得到的石蕊牛奶样品中。
24.作为本发明的优选方案，所述石蕊牛奶样品中，石蕊的浓度为2～3g/l。
25.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
26.1、本发明的牛奶坏包的反接种分析方法，通过将待确认菌反接种至石蕊牛奶样品中，能够直接的通过观察的方式判断样品的产气、产酸和胨化情况。且当石蕊变色时，在有色背景下样品的胨化状态能够更早和更明显的呈现出来，缩短了判定时间。同时通过观察的方式，避免了对样品进行取样检测导致的样品需求量大的问题，减少了工作量。
27.2、本发明的牛奶坏包的反接种分析方法，待确认菌为从坏包牛奶中分离的菌。在判断前先用平板判断产品是否为单一菌污染或者多种菌污染，为判断分析缩小了范围。对石蕊牛奶分别反接种不同的待确认菌，能够同时实现多个菌的判断比较，缩短了判断时间。
28.3、本发明的牛奶坏包的反接种分析方法，为更准确的排除接种时间差带来的影响，在石蕊牛奶反接种的同时，做空白牛奶样品的反接种，能够更好的观察对比产气情况。
附图说明
29.图1是实施例1中的石蕊牛奶样品反接种并培养2天时的状态照片。
30.图2是实施例1中的石蕊牛奶样品反接种并培养6天时的状态照片。
31.图3是实施例1中的石蕊牛奶样品反接种并培养8天时的状态照片。
32.图4是实施例1中的石蕊牛奶样品反接种并培养14天时的状态照片。
33.图5是实施例1中的石蕊牛奶样品反接种并培养14天时的状态另一视角的照片。
34.图6是试验例1中脱石蕊脱脂牛奶样品反接种不同菌培养1天时的状态照片。
35.图7是试验例1中脱石蕊脱脂牛奶样品反接种不同菌培养6天时的状态照片。
36.图8是试验例1中脱石蕊脱脂牛奶样品反接种不同菌培养6天时的状态另一视角的照片。
37.图9是试验例2中脱石蕊全脂牛奶样品反接种不同菌培养1天时的状态照片。
38.图10是试验例2中脱石蕊全脂牛奶样品反接种不同菌培养6天时的状态照片。
39.图11是试验例2中脱石蕊全脂牛奶样品反接种不同菌培养6天时的状态另一视角的照片。
40.图12是试验例3中全脂牛奶样品(不含石蕊)反接种不同菌培养3天时的状态照片。
41.图13是试验例3中全脂牛奶样品(不含石蕊)反接种不同菌培养8天时的状态照片。
42.图14是试验例3中全脂牛奶样品(不含石蕊)反接种不同菌培养11天时的状态照片。
具体实施方式
43.下面结合附图，对本发明作详细的说明。
44.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
45.实施例1
46.不同菌的反接种现象实验
47.某批次产品出现坏包现象，牛奶产品表现为ph下降，蛋白结块水乳分离。经微生物实验从坏包牛奶中分离出菌1和菌2。按照如下方式进行菌1和菌2的反接种实验，将菌1和菌
2反接种至石蕊牛奶样品中，并同时做空白实验。
48.s1，称取石蕊0.2克置于烧瓶中，加入坏包牛奶相同基质的正常牛奶100 毫升，加热溶解后按10毫升分装于试管中，于115℃灭菌10分钟。冷却后得到石蕊牛奶样品备用。
49.s2，向步骤s1得到的石蕊牛奶样品中，接种待确认菌，将容器密闭，进行培养；将上述菌1和菌2用接种环分别接种至反接种石蕊牛奶样品试管中，塞上试管塞于36℃恒温培养。每个菌接种1管，同时做空白管一起培养。
50.s3，观察产气情况、产酸情况和胨化情况；当石蕊牛奶样品的产气情况、产酸情况和胨化情况与坏包样品一致时，判断该坏包牛奶产生的原因由该待确认菌引起。如果产品状态和反接种培养物的反应结果相同(比如产酸、结块凝固、水乳分离等)，可判定是该菌导致的产品坏包。
51.图1、图2、图3和图4分别为培养2天、6天、8天、14天的状态照片；图5为14天时状态的另一视角的照片。图1-图5中，试管从左至右分别为空白、菌1和菌2。
52.从图中可以看出，菌2培养2天后开始变为粉红色，表示菌2产酸，直至培养6天后持续产酸至酪蛋白凝固，继续培养至8天后出现分层，表示该菌能产生蛋白酶，使凝固的酪蛋白水解为胨，形成透明液体。而菌1未出现产酸变粉、酪蛋白凝固、酪蛋白胨化等现象。对比产品状态为ph降低，蛋白结块水乳分离，从而判断是菌2带来的产品变化。经进一步对菌1和菌2的分析，表明菌1为蛾微杆菌，菌2为树微杆菌。
53.实施例2
54.某批次产品出现坏包，产品表现为脂肪上浮。ph无明显下降，未胀包。微生物检出以下两种菌，以a、b表示。将两种菌反接种至石蕊牛奶样品中，同时将两种菌反接种至正常牛奶样品中，观察表现并记录。当反接种的正常牛奶表现与产品坏包时表现一致时，停止对石蕊牛奶样品的观察。
55.菌编号是否产气是否产酸是否胨化a是是否b否否是
56.以上现象说明是b带来的产品变化，a有可能是检测过程中污染，应该重点研究b的特性和来源解决污染源。
57.实施例3
58.某批次产品出现坏包，产品表现为ph降低，产品凝固，未胀包。微生物检出以下两种菌，以c、d表示。将两种菌反接种至石蕊牛奶样品中，同时将两种菌反接种至正常牛奶样品中，观察表现并记录。当反接种的正常牛奶表现与产品坏包时表现一致时，停止对石蕊牛奶样品的观察。
59.菌编号是否产气是否产酸是否胨化c否是否d否否否
60.由于c菌观察石蕊变色判断为产酸，从而判断是c带来的该产品的变化，应该重点研究c的特性和来源解决污染源。
61.试验例1
62.不同菌在石蕊脱脂牛奶中的变化
63.在实施例1的基础上，采用实施例的反接种方式，将不同的菌进行接种观察样品的状态并做空白样品对比。
64.将大肠埃希氏菌、蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯菌、蛾微杆菌、树状微杆菌反接种至石蕊牛奶样品中，其中牛奶为脱脂牛奶。图6和图7中从左向右依次为空白、大肠埃希氏菌、蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯菌、蛾微杆菌、树状微杆菌。
65.图6为培养1天时状态的照片，可以看出大肠埃希氏菌产酸使培养物变粉色；蜡样芽孢杆菌管培养物颜色未发生变化，但是上层开始变澄清；肺炎克雷伯菌管产酸产气明显。图7为以上菌株反接种至石蕊脱脂牛奶培养基后的培养6 天时状态的照片，图8是培养6天时状态另一角度的照片。
66.下表对应不同时间不同的菌能观察到的变化，
67.表1不同菌在不同时间的观察到的变化
[0068][0069][0070]
将上述接种样品呈现的状态与坏包牛奶样品的状态进行比较，当产气、产酸、胨化状态基本一致时，判断为该菌引起的坏包污染。
[0071]
需要说明的是，该分析方法的目的在于确定牛奶中分离的菌是造成牛奶坏包的菌。在实际应用时，可不采用已知菌，而直接从坏包牛奶中分离菌种，将该菌反接种至石蕊牛奶样品中与坏包牛奶进行比对即可。
[0072]
由上述的观察结果可知，其他可通过观察石蕊牛奶培养物现象同步验证的分离菌株的生化特性有，
[0073]
培养物为蓝紫色：该菌不发酵乳糖，使培养基保持原色。
[0074]
培养物变为粉红色：该菌发酵乳糖产酸。
[0075]
培养物凝固：酪蛋白的等电点ph为4.8，当该菌持续产酸使ph降低至4.8 时，从而使牛乳中的酪蛋白凝固。
[0076]
培养物变为蓝色：说明乳糖未发酵，该菌分解含氮物质，生成胺及氨，培养基变碱，指示剂变为蓝色。
[0077]
培养物为白色：说明石蕊被还原。
[0078]
培养基上层变清：该菌产酸脂肪酶或者蛋白酶。
[0079]
试验例2
[0080]
不同菌在石蕊全脂牛奶中的变化
[0081]
在实施例1的基础上，采用实施例的反接种方式，将不同的菌进行接种观察样品的状态并做空白样品对比。
[0082]
将大肠埃希氏菌、蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯菌、蛾微杆菌、树状微杆菌反接种至石蕊牛奶样品中，其中牛奶为全脂牛奶。图8和图9中从左向右依次为空白、大肠埃希氏菌、蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯菌、蛾微杆菌、树状微杆菌。图9为培养1天时的状态照片。图10为培养6天时的状态照片。图11为培养6天时状态另一角度的照片。
[0083]
试验例3
[0084]
不同菌在空白牛奶样品(不加石蕊)的变化
[0085]
将蜡样芽孢杆菌、肺炎克雷伯菌、蛾微杆菌、树状微杆菌反接种至全脂牛奶样品中。
[0086]
图12为培养3天时的状态照片；图13为培养8天时的状态照片；图14为培养11天时的状态照片。其中，蜡样芽胞杆菌在第8天时不能观察到胨化现象，直到第11天时表现出明显的胨化。而在图10和图11中，添加了石蕊的石蕊牛奶样品在接种蜡样芽胞杆菌的第6天就能明显的观察到胨化现象。
[0087]
在石蕊牛奶反接种的同时，做空白牛奶样品的反接种，能够更好的观察对比产气、胨化情况，石蕊牛奶样品的状态更先表现出来被观察到，故能够争取更多的时间。
[0088]
对比例1
[0089]
1.反接种培养基准备：正常牛奶产品。
[0090]
2.接种培养：使用电烙铁开封正常牛奶产品，将待测菌株接种至牛奶里，每株菌同步接种5-10个平行样品，然后使用高温蜡油对牛奶包装进行封口。同样操作接种5-10个空白样品，以排除操作过程的污染。接种完后于36℃恒温培养。5株菌需要30-60个样品。以试验例中的菌为例说明各菌在判断时存在的问题。
[0091]
若菌为大肠埃希氏菌时，开封测ph
‑‑‑
产酸，需要大量样品。
[0092]
若菌为蜡样芽孢杆菌时，无法判断是否产蛋白酶。
[0093]
若菌为肺炎克雷伯菌时，开封测ph
‑‑‑
产酸，需要大量样品。
[0094]
若菌为蛾微杆菌时，因为牛奶不会有明显的变化，所以需要再次将反接种样品再次划线至培养基上培养，以判定是否接菌成功。
[0095]
若菌为树微杆菌时，开封测ph
‑‑‑
产酸。不能观察到胨化现象。
[0096]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：1.一种牛奶坏包的反接种分析方法，其特征在于，包括如下步骤，s1，取与坏包牛奶相同基质的正常牛奶，置于容器中，加入石蕊；进行灭菌处理；得到石蕊牛奶样品；s2，向步骤s1得到的石蕊牛奶样品中，接种待确认菌，将容器密闭，进行培养；s3，观察产气情况、产酸情况和胨化情况；当石蕊牛奶样品的产气情况、产酸情况和胨化情况与坏包样品一致时，判断该坏包牛奶产生的原因由该待确认菌引起。2.根据权利要求1所述的牛奶坏包的反接种分析方法，其特征在于，所述产气情况判断时，坏包牛奶的产气情况通过观察是否胀包判断；石蕊牛奶样品的产气情况通过观察是否有气泡产生判断。3.根据权利要求1所述的牛奶坏包的反接种分析方法，其特征在于，所述产酸情况判断时，坏包牛奶的产酸情况通过取样测量ph值判断；石蕊牛奶样品的产酸情况通过观察样品的颜色变化判断。4.根据权利要求1所述的牛奶坏包的反接种分析方法，其特征在于，所述胨化情况判断时，通过检测酪蛋白含量是否降低判断；石蕊牛奶样品的胨化情况中，通过观察样品状态判断。5.根据权利要求4所述的牛奶坏包的反接种分析方法，其特征在于，全脂牛奶的胨化表现为脂肪上浮、产品组织状态为絮状但不结块，脱脂牛奶的胨化表现为产品变澄清。6.根据权利要求4所述的牛奶坏包的反接种分析方法，其特征在于，当胨化使凝固的酪蛋白被水解时，试管上层为澄清液体。7.根据权利要求1所述的牛奶坏包的反接种分析方法，其特征在于，还包括空白牛奶样品的反接种；步骤如下，a1，取与坏包牛奶相同基质的正常牛奶，置于容器中；进行灭菌处理；得到空白牛奶样品；a2，向步骤a1得到的空白牛奶样品中，接种待确认菌，将容器密闭，进行培养；a3，观察产气情况、产酸情况和胨化情况；当空白样品的产气情况、产酸情况和胨化情况与坏包样品一致时，停止观察石蕊牛奶样品。8.根据权利要求1-7任一所述的牛奶坏包的反接种分析方法，其特征在于，步骤s2中的待确认菌是从坏包产品中通过微生物实验分离得到的。9.根据权利要求1-7任一所述的牛奶坏包的反接种分析方法，其特征在于，同时进行多个待确认菌的反接种分析。10.根据权利要求1-7任一所述的牛奶坏包的反接种分析方法，其特征在于，步骤s2之前，对坏包牛奶进行微生物检测，确定多个可能的待确认菌；将多个待确认菌分别置于步骤s1得到的石蕊牛奶样品中。
技术总结本发明涉及乳制品生产技术领域，具体涉及一种牛奶坏包的反接种分析方法，包括如下步骤，S1，取与坏包牛奶相同基质的正常牛奶，置于容器中，加入石蕊；进行灭菌处理；得到石蕊牛奶样品；S2，向步骤S1得到的石蕊牛奶样品中，接种待确认菌，将容器密闭，进行培养；S3，观察产气情况、产酸情况和胨化情况；当石蕊牛奶样品的产气情况、产酸情况和胨化情况与坏包样品一致时，判断该坏包牛奶产生的原因由该待确认菌引起。通过将待确认菌反接种至石蕊牛奶样品中，能够直接的通过观察的方式判断样品的产气、产酸和胨化情况。在有色背景下样品的胨化状态能够更早和更明显的呈现出来，缩短了判定时间。同时避免了样品需求量大的问题，减少了工作量。量。量。
技术研发人员：骆敏 马静 宋艳梅 夏忠悦 范光彩 谭莲英 周欢 黄漫蓉 钱成林
受保护的技术使用者：新希望乳业股份有限公司
技术研发日：2022.07.19
技术公布日：2022/11/1
