1.本发明涉及医药领域，特别涉及一种层状双氢氧化物@泊洛沙姆188纳米杂化物的制备方法及应用。
背景技术：2.层状双氢氧化物(ldhs)，属于典型的二维纳米材料，基于其固有的理化特性包括结构可调性，生物相容性，ph敏感性等，目前在纳米诊疗平台中表现出很大的潜力，包括药物和基因递送，光热和化学动力学治疗，磁共振成像诊断等。然而，ldh作为递送载体需要解决的问题之一还在于裸载药ldhs容易发生团聚，稳定分散性较差，在生理环境中容易被带负电的大分子吸附发生聚集，进而导致不良的递送行为，这限制了其临床应用。因此，选择可以增加体内循环时间并具有良好生物相容性的包覆层进行表面修饰改性势在必行。
3.在现有的研究中，一些聚合物电解质比如低分子量肝素、牛血清白蛋白、高分子嵌段聚合物、壳聚糖，脂质体和peg化透明质酸等作为ldhs胶体稳定剂，可以减少因聚集而产生的毒性。目前聚合物电解质作为ldhs胶体稳定剂的制备过程中，由于制备方法的使用不当，造成药物插入层间少而较多地吸附在表面，从而导致载药ldhs在生理介质中发生突释，降低了其药物利用度。
4.因此，通过合理的结构设计及制备方法解决载药ldhs的稳定分散和突释问题具有重要的意义。
技术实现要素：5.为克服现有技术存在的不足，本发明的目的在于通过剥层-重构的方法制备一种具有良好分散稳定性、药物缓释能力及细胞摄入效果的一种层状双氢氧化物@泊洛沙姆188纳米杂化物的制备方法及应用，改善药物释放效果，提高药物利用度。
6.一种层状双氢氧化物@泊洛沙姆188纳米杂化物的制备方法，包括，
7.将二价金属可溶性盐和三价金属可溶性盐溶于脱co2去离子水中，得到混合盐溶液；
8.将naoh溶液在n2氛围下，以500-600rpm的转速进行磁力搅拌，并将所述混合盐溶液缓慢滴加至正在搅拌的naoh溶液中，滴加完毕后调节ph值为 9～10，继续常温搅拌0.5～2h后，以4000-5000r/min的速度离心，并去除上清液，用水重悬沉淀物，循环多次以将沉淀物水洗至中性；
9.用水将沉淀物重悬后倒入晶化釜中，并将晶化釜置于90℃～120℃的烘箱中晶化10～14h后，于-15～-25℃下冷冻至少8h，然后真空干燥至少72h，得到层状双氢氧化物粉末；
10.将层状双氢氧化物粉末溶入甲酰胺中得到层状双氢氧化物悬浮液，并将层状双氢氧化物悬浮液超声6-8h，以进行剥层；
11.向剥层后的层状双氢氧化物悬浮液中加入溶有抗肿瘤药物的naoh溶液，超声0.5h
～2h后，加入泊洛沙姆188胶束溶液，继续超声0.5h～2h后，充入氮气密封，静置后，离心水洗沉淀物以除去甲酰胺，并用水重悬后，在室温下静置老化得到层状双氢氧化物@泊洛沙姆188纳米杂化物溶液。
12.进一步的，上述制备方法，其中，所述二价金属可溶性盐为为硝酸镁、氯化镁和硝酸锰中的一种或多种的组合。
13.进一步的，上述制备方法，其中，所述三价金属可溶性盐为硝酸铝、氯化铝、硝酸钆和硝酸铕中的一种或多种的组合。
14.进一步的，上述制备方法，其中，所述二价金属可溶性盐和所述三价金属可溶性盐的金属离子摩尔比为2:1～3:1。
15.进一步的，上述制备方法，其中，所述抗肿瘤药物为阴离子型药物。
16.进一步的，上述制备方法，其中，溶有抗肿瘤药物的naoh溶液中，所述抗肿瘤药物的含量为2.5-9mg/ml。
17.进一步的，上述制备方法，其中，所述层状双氢氧化物悬浮液的浓度为 0.1-0.25g/ml。
18.进一步的，上述制备方法，其中，所述泊洛沙姆188胶束溶液的浓度为 0.8-8mg/ml。
19.进一步的，上述制备方法，其中，泊洛沙姆188胶束溶液与溶有抗肿瘤药物的naoh溶液中总的水分的体积与所述甲酰胺的体积之比为1:1。
20.本发明还提供了一种层状双氢氧化物@泊洛沙姆188纳米杂化物的应用，应用于药物递送。
21.本发明利用电中性的聚合物胶束泊洛沙姆188来提高ldhs胶体的稳定性。泊洛沙姆188是一类由聚氧乙烯与聚氧丙烯醚共聚而成的三嵌段共聚物，属于两亲性聚合物胶束，具有良好的生物相容性(无毒、无抗原性、无刺激性、无致敏性、化学性质稳定、不溶血)与水相分散性，并且还具有修复细胞膜的作用，作为药用辅料能够促进药物的吸收。此外，其在水中还能够自组装形成纳米胶束，可以有效降低载体材料被网状内皮系统清除的风险，提升载药体系的体内稳定性。
22.本发明具有以下优点：
23.一是将泊洛沙姆188与层状双氢氧化物进行复合，解决了层状双氢氧化物在高离子强度生理流体中容易发生聚集的问题，使载药纳米杂化产物能够稳定分散在生理介质中；
24.二是采用剥层重构法获得了粒度分布均匀的纳米级杂化颗粒，并且使产物具有良好的释药能力。
25.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
26.图1为实施例1中层状双氢氧化物的xrd图；
27.图2为实施例1中ldhs-mtx@泊洛沙姆188纳米杂化物的tem图；
28.图3为实施例2中ldhs-5fu@泊洛沙姆188纳米杂化物的tem图；
29.图4为实施例3中ldhs-mtx@泊洛沙姆188纳米杂化物的体外释放曲线；
30.图5为实施例4中ldhs-5fu@泊洛沙姆188纳米杂化物的体外释放曲线；
31.图6为实施例5中ldhs-fitc@泊洛沙姆188纳米杂化物的细胞摄取图。
具体实施方式
32.为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。实施例中给出了本发明的若干实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
33.实施例1
34.本发明实施例1提供了一种层状双氢氧化物@泊洛沙姆188纳米杂化物的制备方法，主要包括两个步骤：制备层状双氢氧化物；基于层状双氢氧化物制备层状双氢氧化物@泊洛沙姆188纳米杂化物。
35.其中，制备层状双氢氧化物具体包括如下步骤：
36.(1)分别称取1.5112g(5.89mmol)六水硝酸镁和0.7891g(2.1mmol)九水硝酸铝溶于20ml脱co2去离子水中，得到混合盐溶液；
37.(2)将0.7g(0.0175mol)naoh溶于100ml水中，在n2氛围下，以600rpm 进行磁力搅拌，然后将混合盐溶液缓慢滴加至正在搅拌的碱液中，滴加完毕后调节混合液ph值为9.5，继续常温搅拌1h后，将溶液以4500r/min的速度离心 10min，去除上清液，用水重悬沉淀物，循环4次使沉淀物水洗至接近中性；
38.(3)用水将沉淀物重悬定容至75ml后倒入晶化釜中，然后置于烘箱内，在 100℃下晶化12h，再将晶化后的溶液于-20℃冷冻8h以上，然后放入冷阱温度为
ꢀ‑
60℃的真空干燥机中干燥72h，得到层状双氢氧化物粉末。
39.本实施例层状双氢氧化物的晶型特征如图1所示，(003)、(006)和(009)晶面的特征衍射峰分别出现在11.4
°
、22.9
°
和34.5
°
附近，各衍射角之间的度数具有较好的倍数关系，表明产物拥有较为规则的层状结构。
40.其中，制备层状双氢氧化物@泊洛沙姆188(ldhs-mtx@泊洛沙姆188)纳米杂化物，步骤如下：
41.将0.4g层状双氢氧化物粉末加入至20ml甲酰胺中，超声7h进行剥层，再加入10ml溶有50mg甲氨蝶呤(mtx)的naoh溶液(0.01mol/l)，超声1h，然后加入10ml浓度为2mg/ml的泊洛沙姆188胶束溶液，继续超声1h后，充入氮气密封，静置过夜，反复离心水洗沉淀物6次以除去甲酰胺，最后冷冻干燥得到ldhs-mtx@泊洛沙姆188纳米杂化物。
42.本实施例中使用的抗肿瘤药物为甲氨蝶呤，得到的层状双氢氧化物@泊洛沙姆188纳米杂化物为层状双氢氧化物@泊洛沙姆188载甲氨蝶呤(ldhs-mtx@泊洛沙姆188)纳米杂化物。所制备的ldhs-mtx@泊洛沙姆188纳米杂化物的tem 图如图2所示，产物的颗粒尺寸大部分不超过100nm，且分散均匀。
43.实施例2
44.本实施例中制备层状双氢氧化物的方法如第一实施例中的相同，不同的是，本实施例中，抗肿瘤药物采用五氟尿嘧啶(5fu)，得到的层状双氢氧化物@泊洛沙姆188载五氟尿
嘧啶(ldhs-5fu@泊洛沙姆188)纳米杂化物，其制备方法具体包括：
45.将0.4g层状双氢氧化物粉末加入至20ml甲酰胺中，超声7h进行剥层，再加入10ml溶有90mg五氟尿嘧啶的naoh溶液(0.01mol/l)，超声1h，然后加入 10ml浓度为2mg/ml的泊洛沙姆188胶束溶液，继续超声1h后，充入氮气密封，静置过夜，反复离心水洗沉淀物6次以除去甲酰胺，最后冷冻干燥得到 ldhs-5fu@泊洛沙姆188纳米杂化物。
46.所制备的ldhs-5fu@泊洛沙姆188纳米杂化物tem图如图3所示，产物的颗粒尺寸均在100nm以内，且分散较为均匀。
47.需要说明的是，在本发明的另一实施例中，制备层状双氢氧化物的步骤中，磁力搅拌的转速也可以为500rpm，将混合盐溶液缓慢滴加至正在搅拌的naoh 溶液中后，调节ph值为10，常温搅拌2h，晶化温度为120℃，晶化时间14h，其他条件与第一实施例中的相同，也可制备得到符合要求的纳米杂化物。
48.在本发明的又一实施例中，基于层状双氢氧化物制备层状双氢氧化物@泊洛沙姆188纳米杂化物的步骤中，泊洛沙姆188胶束溶液的浓度可以为8mg/ml，其他条件与第一实施例中的相同，也可制备得到符合要求的纳米杂化物。
49.实施例3
50.ldhs-mtx@泊洛沙姆188纳米杂化物的体外药物释放实验，包括如下步骤。
51.(1)分别配置ph＝4.6的醋酸钠缓冲溶液和ph＝7.4的磷酸二氢钾缓冲溶液，作为体外药物释放的模拟介质。
52.(2)量取1.0ml实施例1中冷冻干燥前的ldhs-mtx@泊洛沙姆188纳米杂化物，放进透析袋中，两端用细线封口，将透析袋放入含有20ml的缓冲液中，于恒温振荡器中振荡释放，保持速度为100r/min，温度为37
±
0.5℃。
53.(3)每隔0.25h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、 5h、5.5h、6h、7h、8h、10h、12h、24h取出3ml含药物的介质并补回3ml释放介质。定点取样后，将含有mtx的不同时间段的介质，通过紫外-可见分光光度计测定mtx的释放量，于265nm处测定紫外吸光度，按标准曲线计算相应药物浓度及释放百分比，绘制出累积释放曲线。
54.ldhs-mtx@泊洛沙姆188纳米杂化物在不同ph值模拟介质中的mtx释放行为如图4所示，载药体系在两种ph值环境中均具有良好的缓释效果，其中在ph＝7.4的介质中(模拟体内中性环境)，因层板结构稳定存在，mtx的释放非常缓慢，24h的累计释放率为40.4％，而在ph＝4.6的介质中(模拟肿瘤细胞溶酶体环境)，因带有碱性的层板逐渐被溶蚀，导致层板结构崩塌，从而使mtx 在24h时得到完全释放，实现载药体系在病灶区充分释药的目的。
55.实施例4
56.ldhs-5fu@泊洛沙姆188纳米杂化物的体外药物释放实验，包括如下步骤。
57.(1)分别配置ph＝4.6的醋酸钠缓冲溶液和ph＝7.4的磷酸二氢钾缓冲溶液，作为体外药物释放的模拟介质。
58.(2)量取1.0ml实施例2中冷冻干燥前的ldhs-5fu@泊洛沙姆188纳米杂化物，放进透析袋中，两端用细线封口，将透析袋放入含有20ml的缓冲液中，于恒温振荡器中振荡释放，保持速度为100r/min，温度为37
±
0.5℃。
59.(3)每隔0.25h、0.5h、0.75h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、 5h、5.5h、6h、7h、8h、10h、12h、24h取出3ml含药物的介质并补回3ml释放介质。定点取样后，将含有5fu的
不同时间段的介质，通过紫外-可见分光光度计测定5fu的释放量，于265nm处测定紫外吸光度，按标准曲线计算相应药物浓度及释放百分比，绘制出累积释放曲线。
60.ldhs-5fu@泊洛沙姆188纳米杂化物在不同ph值模拟介质中的5fu释放行为如图5所示，载药体系在两种ph值环境中都具有良好的缓释效果，且因 5fu分子较小，更易扩散，在达到释放平衡时，虽然两种条件下的累计释放率均较高，但在ph＝4.6的酸性环境中，载药体系释放得更加充分。
61.实施例5
62.ldhs-fitc@泊洛沙姆188纳米杂化物的细胞摄取实验，包括如下步骤。
63.(1)将0.4g层状双氢氧化物粉末(实施例1所得)加入至20ml甲酰胺中，超声7h进行剥层，再加入10ml溶有9mg异硫氰酸荧光素(fitc)的naoh 溶液(0.01mol/l)，超声1h，然后加入10ml浓度为2mg/ml的泊洛沙姆188胶束溶液，继续超声1h后，充入氮气密封，静置过夜，反复离心水洗沉淀物6次以除去甲酰胺，得到ldhs-fitc@泊洛沙姆188纳米杂化物悬浮液。
64.(2)选取人骨肉瘤细胞(mg63细胞)作为实验细胞，将悬浮的mg63细胞接种于细胞培养板中，在5％co2培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，分别加入fitc含量为20μg/ml的游离fitc及ldhs-fitc@泊洛沙姆188纳米杂化物悬浮液1ml，培养24h，使用pbs(聚丁二酸丁二脂)清洗3次，清除孔中残留的fitc和纳米杂化物，用4％多聚甲醛避光固定20min，再次用pbs洗涤3 次，然后加入hoechst33342(5μg/ml)避光染核20min，用pbs清洗3次，将处理好的细胞放置于激光共聚焦显微镜下观察细胞形态和细胞摄取。
65.mg63细胞对游离fitc与ldhs-fitc@泊洛沙姆188纳米杂化物的摄取情况如图6所示，其中hoechst33342是一种染细胞核的染料，使细胞核显蓝色(细胞定位作用)，fitc是一种染细胞质的染料，使细胞质显绿色，通过对比可以发现，ldhs-fitc@泊洛沙姆188组的绿色荧光更亮，说明模拟药物的fitc与载体材料复合后，更容易被目标细胞摄取而进入细胞内，体现出层状双氢氧化物 @泊洛沙姆188纳米载药杂化物作为药物载体材料的作用。
66.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
67.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
技术特征：1.一种层状双氢氧化物@泊洛沙姆188纳米杂化物的制备方法，其特征在于，包括，将二价金属可溶性盐和三价金属可溶性盐溶于脱co2去离子水中，得到混合盐溶液；将naoh溶液在n2氛围下，以500-600rpm的转速进行磁力搅拌，将所述混合盐溶液缓慢滴加至正在搅拌的naoh溶液中，滴加完毕后调节ph值为9～10，继续常温搅拌0.5～2h后，以4000-5000r/min的速度离心，并去除上清液，用水重悬沉淀物，循环多次以将沉淀物水洗至中性；用水将沉淀物重悬后倒入晶化釜中，并将晶化釜置于90℃～120℃的烘箱中晶化10～14h后，于-15～-25℃下冷冻至少8h，然后真空干燥至少72h，得到层状双氢氧化物粉末；将层状双氢氧化物粉末溶入甲酰胺中得到层状双氢氧化物悬浮液，并将层状双氢氧化物悬浮液超声6-8h，以进行剥层；向剥层后的层状双氢氧化物悬浮液中加入溶有抗肿瘤药物的naoh溶液，超声0.5h～2h后，加入泊洛沙姆188胶束溶液，继续超声0.5h～2h后，充入氮气密封，静置后，离心水洗沉淀物以除去甲酰胺，并用水重悬后，在室温下静置老化得到层状双氢氧化物@泊洛沙姆188纳米杂化物溶液。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述二价金属可溶性盐为为硝酸镁、氯化镁和硝酸锰中的一种或多种的组合。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述三价金属可溶性盐为硝酸铝、氯化铝、硝酸钆和硝酸铕中的一种或多种的组合。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述二价金属可溶性盐和所述三价金属可溶性盐的金属离子摩尔比为2:1～3:1。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗肿瘤药物为阴离子型药物。6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，溶有抗肿瘤药物的naoh溶液中，所述抗肿瘤药物的含量为2.5-9mg/ml。7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述层状双氢氧化物悬浮液的浓度为0.1-0.25g/ml。8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述泊洛沙姆188胶束溶液的浓度为0.8-8mg/ml。9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，泊洛沙姆188胶束溶液与溶有抗肿瘤药物的naoh溶液中总的水分的体积与所述甲酰胺的体积之比为1:1。10.一种层状双氢氧化物@泊洛沙姆188纳米杂化物的应用，其特征在于，应用于药物递送。
技术总结本发明公开了一种层状双氢氧化物@泊洛沙姆188纳米杂化物的制备方法及应用，该方法包括，将二价金属可溶性盐和三价金属可溶性盐溶解得到混合盐溶液；将混合盐溶液缓慢滴加至NaOH溶液中，滴加完毕后调节pH值为9～10，继续常温搅拌，离心去除上清液，用水重悬沉淀物水洗至中性；将沉淀物重悬后倒入晶化釜中，晶化后冷冻干燥得到层状双氢氧化物粉末；将层状双氢氧化物粉末溶入甲酰胺中得到层状双氢氧化物悬浮液，并进行剥层；向剥层后的层状双氢氧化物悬浮液中加入溶有抗肿瘤药物的NaOH溶液，并加入泊洛沙姆188胶束溶液，除去甲酰胺后，并用水重悬，并在室温下静置老化得到层状双氢氧化物@泊洛沙姆188纳米杂化物溶液。化物@泊洛沙姆188纳米杂化物溶液。化物@泊洛沙姆188纳米杂化物溶液。
技术研发人员：梁良 任锦 余敬谋
受保护的技术使用者：九江学院
技术研发日：2022.05.17
技术公布日：2022/11/1
