一种用作光动力抗菌剂的季铵化卟啉衍生物及其制备方法和应用

1.本发明涉及材料技术领域，具体涉及一种医用抗菌材料，尤其涉及光动力抗 菌剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.卟啉是由一个由四个吡咯型残基组成的被取代的芳香族大环组成，由四个甲 基基团连接，卟啉核总共拥有22个π电子，其中18个π电子在大周期内离域。由 于它们的芳香族性质，卟啉通常参与介索位置的亲电取代反应。卟啉是获得美国 食品与药品监督管理局(fda)的批准的一种光敏药物。目前卟啉在催化剂、半导 体、电子材料、超导材料、抗癌药物、核磁共振影像增强剂、非线性光学材料及 dna-结合或断裂试剂等领域都有着广泛的应用。卟啉因其化学和光稳定性高、 易合成和修饰、治疗窗口高效产生ros，成为一种理想光敏剂(ps)，部分已经进 入临床应用于光动力学治疗癌症。
3.光动力抗菌疗法的基本原理是光和光敏剂(ps，photosensitizers)通过电子转 移(ⅰ型反应)或能量转移(ⅱ型反应)来产生活性氧(ros)，这些活性氧会与许多细菌 内部组件作用产生氧化损伤而导致细菌死亡。目前这种联合光、光敏剂和氧的独 特疾病治疗方法的应用领域已经从最初的肿瘤延伸到老年性黄斑变性和微生物 感染。特别是在治疗微生物感染类疾病中，光动力疗法具有抗菌谱广、靶向选择 性强的优势，同时可以对光敏剂进行结构修饰增加光敏剂对微生物的亲和力。
4.很多不同化学结构的光敏剂已经应用于微生物的光动力灭活，其中包括卟啉 类、酞菁类、吩噻嗪类等。特别是卟啉类化合物，具有良好的光谱特性、高的单 线态氧产率和较好的生物相容性，是作为抗菌光敏剂的理想候选药物
13.。将细胞 外壁破膜剂乙二胺四乙酸、阳离子多肽多粘菌素b、聚合物、纳米颗粒、生物分 子等与光敏剂相结合，能够显著提高光敏剂对微生物的亲和力，特别是最近发现 带有阳离子电荷的光敏剂能够显著的灭活微生物。
5.当前光敏抗菌化合物存在化学稳定性差、不溶于水等问题，而季铵盐本身也 由于细胞毒性大的缺陷，此外，大多数ps材料利用复杂的合成物来将ps与聚 合物共价连接，采用不可伸缩的封装方法，和/或合并ps或支架，其实际使用有 限。在现有的接触型和释放型杀菌策略中，更多利用表面装饰等的技术，往往无 法产生具有足够稳定性和实用性的材料。


技术实现要素：

6.本发明创造性地通过对四苯基卟啉进行季铵化修饰得到季铵化卟啉衍生物， 使制得的光动力抗菌剂季铵化卟啉衍生物可达到双重抗菌性能，本发明提供的新 型抗菌抗炎修复膜具有“光洁净”功能，能够激活机体自我修复功能，期望能够 达到渗透止血-深度保水-抗菌抗炎-光照自净-智能修复等功能。解决此问题的方 法之一是采用抗细菌粘附－
杀菌(抗－杀)结合策略，即创建具有双重抗菌功能 的表面，既能防止细菌附着又能杀死细菌。
7.本发明首先提供了一种用作光动力抗菌剂的季铵化卟啉衍生物，结构式如下 所示：
[0008][0009]
本发明进一步提供了所述的季铵化卟啉衍生物的制备方法，其包括：
[0010]
将tmp-oh与卤素取代的己烷通过亲核取代反应得到tmpo(ch2)6x，再将 所述tmpo(ch2)6x与n-甲基二乙醇胺发生季铵化反应，即得；
[0011]
其中，所述卤素选自f、cl、br或i中的任一种；所述卤素取代的己烷优选 为1,6-二氯己烷、1,6-二溴己烷、1,6-二氟己烷或1,6-二碘己烷，更优选为1,6-二 溴己烷。
[0012]
在根据本发明的一个实施方案中，所述tmp-oh是通过包括下述步骤的方 法制备得到的：
[0013]
以三氯甲烷为溶剂，边搅拌边加入吡咯、均三甲基苯甲醛、对羟基苯甲醛和 三氟化硼乙醚，其中，均三甲基苯甲醛:对羟基苯甲醛:吡咯的摩尔比为3:1.2:4； 常温下搅拌1小时，然后加入四氯苯醌(tcq)，65℃下搅拌回流1小时；反应 结束后冷却至室温，分离纯化，即得tmp-oh；
[0014]
优选地，所述分离纯化是通过包括下述步骤的方法实现的：蒸除溶剂，以二 氯甲烷溶解后抽滤，再经过硅胶柱层析分离纯化，即得。
[0015]
在根据本发明的一个实施方案中，所述tmpo(ch2)6x是通过包括下述步骤 的方法制备得到的：
[0016]
将tmp-oh以丙酮溶解后加入naoh进行磁力搅拌，反应4～8小时后加入 卤素取代的己烷，然后以油浴65℃反应，tlc监测反应，20小时后停止反应， 分离纯化即得；
[0017]
优选地，所述分离纯化是通过包括下述步骤的方法实现的：
[0018]
蒸除溶剂后，用甲醇溶解抽滤，滤渣用二氯甲烷溶出；然后，将二氯甲烷层 收集后旋干过柱，上样后先以石油醚冲柱，除去没反应的1，6-二溴己烷之后， 换用二氯甲烷/石油醚＝1：3作展开剂，收集得到中间体tmp(ch2)6x。
[0019]
在根据本发明的一个实施方案中，所述季铵化反应是通过包括下述步骤的方 法实现的：
[0020]
将所述tmp(ch2)6x溶解于dmf中，将其缓慢滴加到n-甲基二乙醇胺中， 油浴温度设置为80℃，冷凝回流，20小时后收集反应混合物，分离纯化即得季 铵化卟啉衍生物；
[0021]
优选地，所述分离纯化是通过包括下述步骤的方法实现的：
[0022]
蒸除溶剂dmf，加入蒸馏水复溶，然后以乙酸乙酯萃取，直至水层无色， 收集乙酸
乙酯层，旋干，得到产物，以乙酸乙酯洗涤产物，收集固体物，所述固 体物再以甲醇溶解后旋干，旋干后再加入甲醇抽滤，收集滤液，旋干后即得到季 铵化卟啉衍生物。
[0023]
本发明的另一方面提供了一种静电纺丝纳米纤维膜的制备方法，，包括：
[0024]
1)称取将聚己内酯颗粒和胶原蛋白溶于六氟异丙醇，于室温下磁力搅拌均 匀，待完全溶解后，密闭磁力搅拌均匀并静置一段时间得到均相溶液；
[0025]
2)将如权利要求1所述的季铵化卟啉衍生物加入pcl/col质量比为60:40， 浓度为6％的溶液中，超声搅拌溶解后制备出pcl/col/季铵盐纺丝溶液；以质 量分数计，所述季铵化卟啉衍生物占溶液的质量百分比为0.02-0.5％；
[0026]
3)将所述纺丝溶液加入到静电纺丝装置中，纺丝参数设定为电压16kv， 流速0.0016mm/s，接收距离18cm；环境温度28
±
3℃，相对湿度40
±ꢀ
10％。将pcl/col/季铵盐复合纳米纤维膜在室温下真空干燥三天，即得；
[0027]
优选地，所述静电纺丝装置的注射器固定在微量注射泵的主泵上，高压电源 正极接在注射器金属针头上作为喷丝口，负极接在圆柱形接收铝箔纸上并与接地 线相连，纤维收集到铝箔上形成纤维膜；更优选地，所述喷丝口的针头为22g。
[0028]
本发明的再一方面提供了一种纳米纤维膜，含有上述的季铵化卟啉衍生物。
[0029]
本发明进一步提供了上述的季铵化卟啉衍生物在制备抗菌试剂或抗菌材料 中的应用；或所述纳米纤维膜在制备抗菌材料中的应用。
[0030]
在根据本发明的一个实施方案中，所述抗菌材料为用于创伤愈合、瘢痕修复 或组织工程的敷料。
[0031]
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
[0032]
本发明提供的季铵化卟啉在光学治疗窗口下能够高效产生ros，能够在相 对低浓度和低光功率条件下能够杀死多种微生物细胞。利用静电纺丝技术将其加 入纺丝原料中制备的功能性聚合物纳米纤维，同时具有生物相容性好、细胞毒性 小等优势，能够作为优质的抗菌敷料使用，实现了光控杀菌并能促进伤口愈合。
附图说明
[0033]
图1：tmpoh、tmpo(ch2)6br、的红外光谱；
[0034]
图2：tmpoh、tmpo(ch2)6br、的1hnmr谱图；
[0035]
图3为2-2tmp-o-(ch2)6br的核磁共振氢图谱；
[0036]
图4为2-2tmp-o-(ch2)6br的质谱图谱；
[0037]
图5为2-5季铵化卟啉的核磁共振氢图谱；
[0038]
图6为2-5季铵化卟啉的质谱图谱；
[0039]
图7为四苯基卟啉、2-2tmp-o-(ch2)6br和2-5季铵化卟啉的质谱对比图谱；
[0040]
图8为四苯基卟啉、2-2tmp-o-(ch2)6br和2-5季铵化卟啉的红外光谱对比 图谱；
[0041]
图9a为pcl+col膜扫描电镜以及直径分布图；图9b所示为含药膜的红外图谱及共有特征峰；
[0042]
图10为药物浓度0.02％纳米纤维膜扫描电镜以及直径分布图；
[0043]
图11为药物浓度0.05％纳米纤维膜扫描电镜以及直径分布图；
[0044]
图12为药物浓度0.1％纳米纤维膜扫描电镜以及直径分布图；
[0045]
图13为利用cck8测试纳米纤维膜的细胞毒性的结果图；
[0046]
图14为纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌的抑菌率的结果图；
[0047]
图15为纳米纤维膜对大肠杆菌的抑菌率的结果图；
[0048]
图16为接触角测试结果图；
[0049]
图17为不同浓度纳米纤维膜的溶血率测试结果图；
[0050]
图18为含不同浓度药物纳米纤维膜的tga以及dsc测定，其中a为含不 同浓度药物纳米纤维膜的tga测定结果图谱；b为含不同浓度药物纳米纤维膜 的dsc测定结果图谱。。
具体实施方式
[0051]
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图 及具体实施例进行详细描述。
[0052]
实施例1：的制备
[0053]
(1)tmp-oh的实验室制备：
[0054]
在实验装置中加入适量三氯甲烷，边搅拌边依次加入吡咯，均三甲基苯甲醛， 对羟基苯甲醛和三氟化硼乙醚，其中，均三甲基苯甲醛:对羟基苯甲醛:吡咯加入 量为3:1.2:4。常温下搅拌1小时，然后加入四氯苯醌(tcq)，65℃下搅拌回流 1小时。反应结束后冷却至室温，蒸除溶剂，用二氯甲烷溶解后抽滤，经过两次 硅胶柱层析分离纯化得到tmp-oh；
[0055]
(2)tmp(ch2)6br的实验室制备：
[0056]
将上述得到的tmp-oh用丙酮溶解后加入naoh进行磁力搅拌，反应4～8 小时后加入1，6-二溴己烷，此时改为油浴65℃反应，tlc监测反应，20小时 后停止反应。蒸除溶剂后，用甲醇溶解抽滤，滤渣用二氯甲烷溶出。将二氯甲烷 层收集后旋干过柱，上样后先用石油醚冲柱，除去没反应的1，6-二溴己烷之后， 换用二氯甲烷/石油醚＝1：3作展开剂，收集紫色产物tmp(ch2)6br；
[0057]
(3)的实验室制备：
[0058]
将上述得到的中间体tmp(ch2)6br溶解于少量dmf中缓慢滴加到n-甲基 二乙醇胺中，油浴温度设置为80℃，冷凝回流，tlc监测反应进程。20小时时 收集反应。蒸除溶剂dmf，加入少量蒸馏水，用乙酸乙酯萃取多次，直至水层 无色，收集乙酸乙酯层旋干，加入少量乙酸乙酯洗涤产物，收集固体(固体用甲 醇溶解后旋干)(重复2次)，旋干后加入甲醇抽滤，收集滤液，旋干得到目标产 物
[0059]
实施例2：的制备
[0060]
(1)tmp-oh的中试制备：
[0061]
在2l的圆底烧瓶中加入1000ml三氯甲烷，用一次性注射器(移液枪)依 次加入1388μl吡咯，2213.6μl均三甲基苯甲醛，0.8188g对羟基苯甲醛和864 μl三氟化硼乙醚，常温下搅拌1小时，然后加入3688mg四氯苯醌(tcq)，65℃ 下搅拌回流1小时。反应结束后冷却至室温，蒸除溶剂。用二氯甲烷溶解后抽滤， 经过两次硅胶柱层析分离得到tmp-oh；
[0062]
tmp(ch2)6br的中试制备：
[0063]
将上述得到的卟啉tmp-oh(300mg,0.40mmol)用丙酮10ml溶解后加入 naoh(0.2934g,0.007mol)进行磁力搅拌，反应4～8小时后加入1，6-二溴己烷 1ml，此时改为油浴65℃反应，tlc监测反应，20小时后停止反应。蒸除溶剂 后，用甲醇溶解抽滤，滤渣用二氯甲烷溶出。收集二氯甲烷层旋干过柱，上样后 先用石油醚冲柱，除去没反应的1,6-二溴己烷，之后换用二氯甲烷/石油醚＝1：3 作展开剂，收集紫色产物tmp(ch2)6br；
[0064]
的中试制备：
[0065]
将tmpo(ch2)6br(0.1g，0.11mmol)的dmf(1ml)滴加1mln-甲基二乙 醇胺中，温度设置为80℃下加热回流，反应20小时后收集反应。蒸除溶剂dmf， 加入少量蒸馏水，用乙酸乙酯萃取多次，直至水层无色，收集乙酸乙酯层旋干， 加入少量乙酸乙酯洗涤产物，收集固体(固体用甲醇溶解后旋干)(重复2次)， 旋干后加入甲醇抽滤，收集滤液，旋干得到目标产物。
[0066]
实施例3季铵化卟啉衍生物的检测验证
[0067]
(1)红外光谱分析
[0068]
首先，以tmp-oh为基础与1,6-二溴己烷通过亲核取代反应引入长链烷基 取代羟基中的h合成tmpo(ch2)6br，进而与叔胺反应生成卟啉季铵盐。如图1 所示，tmp-oh中3390cm-1可以归属为nh的伸缩振动峰，3310cm-1可以归属 为-oh伸缩振动峰，2919cm-1为-ch3伸缩振动峰，2855cm-1为-ch2伸缩振动峰。 tmpo(ch2)6br图谱中1242cm-1可以归属为芳香醚键ν
c-o
的伸缩振动峰，卟啉季 铵盐图谱中也出现芳香醚键ν
c-o
的伸缩振动峰，图1中1043cm-1可以归属为伯 醇羟基的伸缩振动峰。
[0069]
(2)1h nmr光谱分析
[0070]
四苯基卟啉衍生物(tmpoh)及溴代烷烃(tmpo(ch2)6br)的1hnmr分 析测试选用溶剂为d-chloroform，季铵盐的1h nmr分析测试选用氘代dmso， 在bruker 600的仪器上测试。以tmpoh为代表分析结果如图2所示，通过核磁 共振氢谱对其进行表征，表征结果显示tmpoh、tmpo(ch2)6br、 三者共有的8.80ppm、8.70ppm、8.68ppm、7.25ppm、7.01ppm处的苯环和吡咯 环中的c-h键以及2.62ppm、1.84ppm处的苯环的-ch3。溴代烷取代后的 tmpo(ch2)6br中出现了4.24ppm、3.49ppm中-och
2-、-ch2br的c-h键。季铵 盐谱图中出现的3.20ppm归属为-n-ch3的c-h键，以及新出现的3.94ppm、 3.58ppm归属为-n-(ch2)
2-中的c-h键，4.28ppm归属为
‑‑
oh键。
[0071]
实施例4合成步骤
[0072]
1)2-1tmp(oh)的合成
[0073][0074]
反应过程如上述反应式所示：
[0075]
在2l的圆底烧瓶中加入1000ml三氯甲烷，用一次性注射器(移液枪)加 入1388μl吡咯，2213.6(553.4)μl均三甲基苯甲醛，0.8188g(0.2049g)对 羟基苯甲醛和864μl三氟化硼乙醚，常温下搅拌1h(溶液变为黄色，后续变为 橙红)，然后加入3688mg四氯苯醌(tcq)，72℃下搅拌回流1h。
[0076]
反应结束后冷却至室温，旋转蒸发仪上旋干。
[0077]
2)tmp(oh)粗品的后处理：
[0078]
选用最粗的柱子，二氯甲烷装柱，二氯甲烷为洗脱剂，柱长15cm，上样量 为8-9g左右，第一个紫色色带为tmp，之后是黄绿色色带，接着是第二个紫色 tmp(oh)，收集第一色带，但此次黄色色带也被冲洗下来，并且第二个紫色色 带也有少量与第一混合，将第一色带和两者混合收集点板，发现第一个紫色点后 有一荧光紫色点，将其旋干后用二氯甲烷洗涤，抽滤出大量黄色固体。
[0079]
用ea:pe＝1：5点板可以分开
[0080]
pe装柱，柱长12cm，在柱子上可以清楚看到两个紫色色带，前面较浅的是 少量的tmp，第二个紫色色带是tmp(oh)的点。
[0081]
优化后的后处理方式为：
[0082]
柱长6cm左右，用二氯甲烷装柱，溶解样品，作展开剂，收集第二条紫色 色带，旋干，旋干后用二氯甲烷、甲醇、ea:pe＝1：5洗涤，收集滤液，旋干， 用ea:pe＝1：5作展开剂，溶解样品，柱长10cm，进行柱层析分离，收集紫色 色带，用ea:pe＝1：8进行点板观察得纯品。
[0083]
3)2-2tmp-o-(ch2)6br的合成
[0084][0085]
反应过程：
[0086]
卟啉tmp-oh(300mg,0.40mmol)用丙酮10ml溶解后加入naoh(0.2934g, 0.007mol)进行磁力搅拌，反应4h-8h后加入1，6-二溴己烷1ml，此时改为油浴 65℃反应，tlc监测反应，二氯甲烷：石油醚＝1：2点板观察，20h后停止反应。
[0087]
后处理：
[0088]
蒸除溶剂后，用甲醇溶解抽滤，滤渣用二氯甲烷溶出，滤液和滤渣全部收集， 用二氯甲烷：pe＝1：3点板观察，甲醇层中有少量产物(弃)
[0089]
二氯甲烷层旋干过柱，二氯甲烷：石油醚＝1：3装柱，柱长12cm，二氯甲 烷：石油醚＝1：3作展开剂、溶解样品，上样后先用石油醚冲柱，除去没反应的 1，6-二溴己烷。
[0090]
色带分布情况：
[0091]
产物带前有一浅紫杂质带(弃)，产物带后有一紫色色带(杂质)，接着是少 量反应物色带，最后是黑色杂质色带，产物色带前后杂质带离产物带很近，产物 带前浅紫色带冲下后换用二氯甲烷：pe＝1：2作展开剂，收集产物点板。
[0092]
核磁共振氢谱如图3所示，质谱结果如图4所示。核磁共振氢谱分析如下：
[0093]1h nmr(600mhz,cdcl3)δ8.79(d,j＝4.6hz,2h),8.65(d,j＝4.6hz,2h), 8.61(s,4h),8.08(d,j＝8.5hz,2h),7.24(dd,j＝8.6,3.0hz,8h),4.24(t,j＝6.3 hz,2h),3.49(t,j＝6.8hz,2h),2.61(d,j＝4.2hz,9h),1.84(d,j＝4.4hz,18h), 1.53(s,6h),1.25(s,2h),-2.56(s,2h).
[0094]
δ8.79ppm、8.65ppm、8.61ppm归属为吡咯环β位的c-h键；δ8.08ppm、 δ7.24ppm归属为苯环上的c-h键，δ4.24ppm峰归属为氧α-位c上的氢的化学 位移；在δ3.49ppm处的峰归属为brα-位碳上的氢的化学位移，δ2.61ppm、δ1.84 ppm峰归属为苯环上甲基氢的化学位移；δ1.53ppm归属为
ꢀ‑
och2ch2ch2ch2ch2ch2br中ch2的化学位移；δ1.25ppm归属为
ꢀ‑
och2ch2ch2ch2ch2ch2br中的ch2的化学位移；-2.56ppm归属于-nh的化学 位移。
[0095]
4)2-5季铵化卟啉
[0096][0097]
反应过程：
[0098]
将tmpo(ch2)6br(0.13mmol，120mg)溶解于1.5mldmf中缓慢滴加到 n-甲基二乙醇胺(2ml)中，油浴温度设置为80℃，冷凝回流，tlc监测反应进 程。
[0099]
16h时用二氯甲烷以及乙酸乙酯作展开剂点板观察，原点处有一紫色点，紫 色点前有少量杂质，以及未完全的反应物。20h时收集反应。
[0100]
后处理：
[0101]
蒸除溶剂dmf，加入少量蒸馏水，用乙酸乙酯萃取多次，直至水层无色， 收集乙酸乙酯层旋干，加入少量乙酸乙酯洗涤产物，收集固体(固体用甲醇溶解 后旋干)(重复2次)，旋干后加入甲醇抽滤，收集滤液，旋干，用乙酸乙酯和甲 醇分别作展开剂点板。
[0102]
2-5季铵化卟啉的1hnmr结果图谱和质谱图谱分别如图5、图6所示。
[0103]1h nmr(600mhz,dmso)δ8.83(s,2h),8.61(d,j＝29.6hz,6h),8.10(s, 2h),7.31(d,j＝16.1hz,8h),4.24(s,3h),3.91(s,30h),3.50(t,j＝23.4hz,20h), 3.20(d,j＝27.1hz,8h),2.53(s,9h),2.26(s,3h),1.92(d,j＝13.9hz,3h),1.85(s, 3h),1.76(s,18h),1.65(s,2h),1.47(s,2h),-2.64(s,2h).
[0104]
δ8.83ppm、、8.61ppm归属为吡咯环β位的c-h键；δ8.10ppm、δ7.31ppm归 属为苯环上的c-h键，δ4.24ppm峰归属为氧α-位c上的氢的化学位移；在δ 3.20ppm处的峰归属为brα-位碳上的氢的化学位移，δ2.53ppm、δ1.76ppm峰归 属为苯环上甲基氢的化学位移；δ1.53ppm归属为-och2ch2ch2ch2ch2ch2br中 ch2的化学位移；δ1.25ppm归属为-och2ch2ch2ch2ch2ch2br中的ch2的化学 位移；-2.56ppm归属于-nh的化学位移。
[0105]
图7为四苯基卟啉、2-2tmp-o-(ch2)6br和2-5季铵化卟啉的质谱对比图谱。
[0106]
图8为四苯基卟啉、2-2tmp-o-(ch2)6br和2-5季铵化卟啉的红外光谱对比 图谱；分析如下：
[0107]
首先，以tmp-oh为基础与1,6-二溴己烷通过亲核取代反应引入长链烷基 取代羟基中的h合成tmpo(ch2)6br，进而与叔胺反应生成卟啉季铵盐。tmp-oh 中3390cm-1
可以归属为nh的伸缩振动峰，3310cm-1
可以归属为-oh伸缩振动峰， 2919cm-1
为-ch3伸缩振动峰，2855cm-1
为-ch2伸缩振动峰。tmpo(ch2)6br图谱 中1242cm-1
可以归属为芳香醚键ν
c-o
的伸缩振动峰，卟啉季铵盐图谱中也出现 芳香醚键ν
c-o
的伸缩振动峰，图8中1043cm-1
可以归属为伯醇羟基的伸缩振动 峰。
[0108]
实施例5静电纺丝纳米复合膜制备
[0109]
配制pcl/col质量比为60:40，质量分数为6％的pcl/col溶液。
[0110]
称取一定量的聚己内酯颗粒和胶原蛋白溶于六氟异丙醇，室温下磁力搅拌均 匀，待完全溶解后，密闭磁力搅拌均匀并静置一段时间成均相溶液。将季铵化卟 啉按照一定质
量分数(0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％)，占溶液中固体含量的 百分含量)加入pcl/col质量比为60:40，浓度为6％的溶液中，超声搅拌溶解 后制备出pcl/col/季铵盐纺丝溶液。
[0111]
将纺丝液加入注射器中，注射器固定在微量注射泵的主泵上，高压电源正极 接在注射器金属针头上(针头为22g)作为喷丝口，负极接在圆柱形接收铝箔纸上 并与接地线相连，纤维收集到铝箔上形成纤维膜。纺丝参数设定为电压16kv， 流速0.0016mm/s，接收距离18cm；环境温度28
±
3℃，相对湿度40
±
10％。 将pcl/col/季铵盐复合纳米纤维膜在室温下真空干燥三天，以除去残留溶剂。
[0112]
图9a所示为pcl+col以及不同浓度含药膜扫描电镜以及直径分布图。
[0113]
图9b所示为含药膜的红外图谱及共有特征峰，其中，3300cm-1
处峰为o-h、 n-h特征峰，2940和2860cm-1
处的峰可分别归属于亚甲基不对称和对称伸缩振 动，1720cm-1
处是c＝o的伸缩振动吸收峰，1650cm-1
可以归属为羟基的弯曲振 动峰，1240cm-1
和1180cm-1
处的峰分别为c-c和c-o的伸缩振动吸收峰。
[0114]
图10为药物浓度0.02％纳米纤维膜扫描电镜以及直径分布图；
[0115]
图11为药物浓度0.05％纳米纤维膜扫描电镜以及直径分布图；
[0116]
图12为药物浓度0.1％纳米纤维膜扫描电镜以及直径分布图。
[0117]
根据以上实验结果，选用浓度6％、pcl:col＝60:40的纺丝液，加入不同 含量的季铵化卟啉，制备pcl/col/季铵化卟啉纳米纤维膜。图9-12分别为 pcl+col以及含药0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％的纤维膜sem照片。 观察纺丝膜表面纤维结构，可以看出季铵化卟啉的加入量在0.5％以内纤维形貌 较好。随着季铵化卟啉含量的增加，开始出现很多细小纤维，这是由于季铵盐的 加入增大了纺丝液的导电性，纺丝液滴在电场中受到的电场力增大，对其不断拉 伸的结果，并且造成纺丝过程不稳定。
[0118]
并且同一条件下，pcl+col膜纤维直径为81.6nm、含药0.02％的膜纤维直 径为139.2nm，含药0.05％的膜纤维直径在140.2nm，含药0.1％的膜纤维直径在 278.7nm，含药0.2％的膜纤维直径在376.8nm，含药0.5％的膜纤维直径在458.0nm， 由此可见，纤维直径也逐渐增大。
[0119]
实施例6含不同浓度药物纳米纤维膜的tga以及dsc测定
[0120]
利用热重量分析法(tga)和同步热分析仪仪器测定，将样品(～7.5mg)置于 铂盘样品架中加热，加热速度为20-500℃，10℃/min，冷却速度为20℃/min。采 用铝密封锅作为样品架。
[0121]
热分解性能采用热分析法测试，在温度程序控制下物质会发生各种转变和反 应，物质的质量或能量随温度或时间变化关系。
[0122]
测定结果如图18所示，dsc曲线显示在59.6℃有一个吸热峰，此处是纳米 纤维膜出现与结晶相熔融温度相关的吸热峰，在87.2℃时也出现了吸热现象，此 处与胶原样品完全变性的最高温度相一致，在407.04℃出现的较宽峰则为pcl 结构因分解破坏出现强吸热现象。tga曲线显示胶原第一阶段失重3.35％，出 现在30-140℃，是由水分蒸发所致，第二阶段失重出现在230-500℃，失重 77.02％，是由pcl和胶原大分子链的热分解所致，并且在开始出现失重时， pcl+col膜重量先降低，所以与pcl+col膜相比，含药膜热稳定性更好。
[0123]
实施例7ros检测
[0124]
以1,3-二苯异苯并呋喃(dpbf)作为化学传感探针，测量了含有不同浓度的季 铵化卟啉纳米纤维膜在光照射下产生的ros量。该检测机制是基于所生成的1o2在光照射下可以在410nm处不可逆地猝灭dpbf的吸光度。含dpbf(14μgml-1
) 和含不同浓度季铵盐的纳米纤维膜(1.0
×
1.0cm2)的甲醇溶液用(660nm， 3.2mwcm-2
)的灯连续照明不同时间(0-80min)。随后，通过紫外-可见光谱仪记录 溶液410nm处的吸光度值。同时以黑暗条件下的含纳米纤维膜的dpbf溶液作 为对照。
[0125]
纯dpbf和dpbf/pcl+col空白膜在连续照射80min后，在410nm处的吸 光度没有变化，表明1o2的生成量可以忽略不计。然而，在掺杂季铵化卟啉的纳 米纤维膜中，随着光照射时间的延长，dpbf在410nm处的吸附量逐渐下降。此 外，光照过程中季铵化卟啉浓度为0.5％的膜dpbf的吸光度下降最大。
[0126]
光照季铵化卟啉药物溶液，其吸光度虽有上升但峰形不变所以药物经过长时 间光照射药物没有发生改变。
[0127]
实施例8细胞毒性试验
[0128]
l929细胞毒性(无毒性)
[0129]
采用cck-8检测法评价细胞毒性。
[0130]
季铵化卟啉配制溶液
[0131]
季铵化卟啉用甲醇溶解后配置成10mg/ml的溶液，稀释100倍测吸光度。
[0132]
l929小鼠成纤维细胞(dmem)中培养，其中添加10vol％胎牛血清(fbs)和 1vol％青霉素-链霉素溶液。加入0.25％胰蛋白酶-edta溶液从培养皿中消化细胞， 并在新鲜培养基中重悬，用于后续实验。将纳米纤维膜(1.0
×
1.0cm2)轻轻地放置 在24孔板底部，然后把每孔5
×
104细胞密度的培养基(10μl)中的细胞接种于膜 上孵育2h后加入500μl培养基，在5％二氧化碳的潮湿气氛中孵育24小时，把 24孔板从培养箱中拿出放置3h。采用无样品的平行实验作为对照。放置3h后， 取出培养基，加入500μl(培养基：cck-8＝1：10)溶液，孵育2h。2h后吸取 上清液200μl于96孔板中，使用酶标仪测量450nm处的od值。结果以相对于 对照组获得的od值的。
[0133]
光照条件：
[0134]
l929小鼠成纤维细胞(dmem)中培养，其中添加10vol％胎牛血清(fbs)和 1vol％青霉素-链霉素溶液。加入0.25％胰蛋白酶-edta溶液从培养皿中消化细胞， 并在新鲜培养基中重悬，用于后续实验。将纳米纤维膜(1.0
×
1.0cm2)轻轻地放置 在24孔板底部，然后把每孔5
×
104细胞密度的培养基(10μl)中的细胞接种于膜 上孵育2h后加入500μl培养基，5％二氧化碳的潮湿气氛中孵育24小时后，把 24孔板从培养箱中取出光照3h(9mw/cm2)。采用无样品的平行实验作为对照。 光照后，吸出培养基，加入500μl(培养基：cck-8＝1：10)溶液，孵育2h。2h 后吸取上清液200μl于96孔板中，使用酶标仪测量450nm处的od值。结果以 相对于对照组获得的od值的。
[0135]
黑暗条件：
[0136]
将纳米纤维膜(1.0
×
1.0cm2)轻轻地放置在24孔板底部，然后把每孔5
×
104细 胞密度的培养基(10μl)中的细胞接种于膜上孵育2h后加入500μl培养基，5％二 氧化碳的潮湿气氛中孵育24小时。采用无样品的平行实验作为对照。24h后， 吸出培养基，加入500μl(培养基：cck-8＝1：10)溶液，孵育2h。2h后吸取 上清液200μl于96孔板中，使用酶标仪测量
450nm处的od值。结果以相对于 对照组获得的od值的。
[0137]
结果如图13所示，黑暗条件下pcl+col空白膜与样品膜组的od值与对 照组相比都有所增加，说明胶原蛋白的加入有利于细胞生长、增殖。但随着季铵 化卟啉的浓度提高，细胞毒性有所增加。参考《gb/t 16886.5》中细胞毒性评价 等级，黑暗条件下，膜的细胞毒性等级均为0级，评价为合格。光照条件由于受 实验条件限制，3h光照时细胞在自然条件下培养。自然条件下培养时，给予光 照与不给予光照对比，季铵化卟啉含量从0.1％增加到0.5％时，细胞毒性均在75％ 以上，细胞毒性等级为1级，评价为合格。
[0138]
实施例9抗菌性实验
[0139]
以革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌作为代表菌株，检测表 面细菌的光动力灭活性。
[0140]
将金黄色葡萄球菌或大肠杆菌细胞接种到分离的琼脂平板上，并在37℃下 孵育过夜。用每个细菌的单个菌落，在37℃下接种30ml的培养基中12h，然后 离心去除上清液。然后，用酶标仪在600nm处检测细胞分散体的吸光度来测定 细菌浓度。在600nm处的光密度为1.0，相当于～109细胞ml-1
。将这些活性培 养物放在无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液中稀释，获得最终浓度为106个细胞 ml-1
。测试膜(1cm
×
1cm)经过灭菌后平铺在24孔板底部，取100μl(106个细胞 ml-1
)的细菌悬液中加在测试膜上，37℃黑暗条件下孵育5小时，再光照3h.随后 加入900μl无菌pbs，通过超声(3min)处理去除膜表面的细菌。然后，将每 个细菌悬液(金黄色葡萄球菌和大肠杆菌)的100μl镀于无菌lb琼脂培养板上， 然后在37℃下孵育过夜，得到可见菌落。计算每个平板上的菌落数，评估每个 样品上粘附的活菌总数。
[0141]
纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌的抑菌率结果如图14所示，黑暗条件下，含 有季铵化卟啉的纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用但抑菌效果不 明显。光照后，随着季铵化卟啉的含量增加抑菌率随之增加，其中季铵化卟啉含 量为0.5％的膜抑菌率为97.15％，杀菌效果明显。
[0142]
纳米纤维膜对大肠杆菌的抑菌率结果如图15所示，黑暗条件下，含有季铵 化卟啉的纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用但抑菌效果不明显。光 照后，随着季铵化卟啉的含量增加抑菌率随之增加，其中季铵化卟啉含量为0.5％ 的膜抑菌率为93.63％。
[0143]
大肠杆菌与金黄色葡萄球菌的结果对比表明，含季铵化卟啉的抗菌纳米纤维 膜对金黄色葡萄球菌更敏感，杀菌效果更显著。
[0144]
实施例10接触角测试
[0145]
采用接触角测量仪测定纤维膜的接触角,考察水油比和乳化剂对纤维表面亲 疏水性的影响。测量参数为：将纳米纤维膜平铺在载玻片上，用盖玻片压平后置 于载物台，设置每次水滴体积为1μl，截取水滴落纤维膜瞬间的接触角图像，如 图16所示。测试结果表明，pcl+col空白膜的水接触角角度为77.00
°
，而含 有0.5％的季铵化卟啉纳米纤维膜水接触角角度为85.38
°
。季铵化卟啉/胶原纳 米纤维膜与pcl+col空白膜相比，具有一定的疏水性，水接触角随着季铵化卟 啉的浓度增加角度也随之增加。
[0146]
实施例11溶血率测试：
[0147]
将电纺制备含不同浓度季铵化卟啉的纳米纤维膜剪成1cm
×
1cm的正方形， 经紫外灭菌后置于24孔培养板底部。balb/c小鼠眼球取血，将1ml血离心去除 上层血清以分离红细胞，洗涤两次，用30mlpbs(10mm，ph＝7.2-7.4)重悬稀 释，将1ml稀释后的红细胞加入
到24孔培养板的纳米敷料上，37c孵育1h， 收集各孔浸提液，1000rpm离心10min，分离上清液，用酶标仪测定上清在540 nm处的吸光度，以红细胞中添加0.1％triton x-100作为阳性对照(n＝4)，以红 细胞中添加0.1％pbs作为空白对照。
[0148][0149]
不同浓度纳米纤维膜的溶血率测试结果如图17所示。测试中阳性对照组液 体呈深红色，这因为蒸馏水的加入导致红细胞破裂，发生溶血现象，而测试样品 组和阴性对照组上清液均澄清、无色透明，离心管底部有未破裂的红细胞沉积， 未见溶血现象。
[0150]
根据数据结果显示，pcl+col空白膜的溶血率为0.343，随着季铵化卟啉 的增加，溶血率随之增加。pcl+col膜、含药0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％的纳米纤维膜溶血率均不超过5％，结果表明，这些膜应用到体内不会产生 溶血作用，具有良好的生物相容性，符合溶血率要求。
[0151]
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员 来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改 进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种用作光动力抗菌剂的季铵化卟啉衍生物，其特征在于，结构式如下所示：2.如权利要求1所述的季铵化卟啉衍生物的制备方法，其特征在于，包括：将tmp-oh与卤素取代的己烷通过亲核取代反应得到tmpo(ch2)6x，再将所述tmpo(ch2)6x与n-甲基二乙醇胺发生季铵化反应，即得；其中，所述卤素选自f、cl、br或i中的任一种；所述卤素取代的己烷优选为1,6-二氯己烷、1,6-二溴己烷、1,6-二氟己烷或1,6-二碘己烷，更优选为1,6-二溴己烷。3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述tmp-oh是通过包括下述步骤的方法制备得到的：以三氯甲烷为溶剂，边搅拌边加入吡咯、均三甲基苯甲醛、对羟基苯甲醛和三氟化硼乙醚，其中，均三甲基苯甲醛、对羟基苯甲醛和吡咯的摩尔比为3:1.2:4；常温下搅拌1小时，然后加入四氯苯醌(tcq)，65℃下搅拌回流1小时；反应结束后冷却至室温，分离纯化，即得tmp-oh；优选地，所述分离纯化是通过包括下述步骤的方法实现的：蒸除溶剂，以二氯甲烷溶解后抽滤，再经过硅胶柱层析分离纯化，即得。4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述tmpo(ch2)6x是通过包括下述步骤的方法制备得到的：将tmp-oh以丙酮溶解后加入naoh进行磁力搅拌，反应4～8小时后加入卤素取代的己烷，然后以油浴65℃反应，tlc监测反应，20小时后停止反应，分离纯化即得；优选地，所述分离纯化是通过包括下述步骤的方法实现的：蒸除溶剂后，用甲醇溶解抽滤，滤渣用二氯甲烷溶出；然后，将二氯甲烷层收集后旋干过柱，上样后先以石油醚冲柱，除去没反应的1，6-二溴己烷之后，换用二氯甲烷/石油醚＝1：3作展开剂，收集得到中间体tmp(ch2)6x。5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述季铵化反应是通过包括下述步骤的方法实现的：将所述tmp(ch2)6x溶解于dmf中，将其缓慢滴加到n-甲基二乙醇胺中，油浴温度设置为80℃，冷凝回流，20小时后收集反应混合物，分离纯化即得季铵化卟啉衍生物；优选地，所述分离纯化是通过包括下述步骤的方法实现的：蒸除溶剂dmf，加入蒸馏水复溶，然后以乙酸乙酯萃取，直至水层无色，收集乙酸乙酯层，旋干，得到产物，以乙酸乙酯洗涤产物，收集固体物，所述固体物再以甲醇溶解后旋干，旋干后再加入甲醇抽滤，收集滤液，旋干后即得到季铵化卟啉衍生物。6.一种静电纺丝纳米纤维膜的制备方法，其特征在于，包括：
1)称取将聚己内酯颗粒和胶原蛋白溶于六氟异丙醇，于室温下磁力搅拌均匀，待完全溶解后，密闭磁力搅拌均匀并静置一段时间得到均相溶液；2)将如权利要求1所述的季铵化卟啉衍生物加入pcl/col质量比为60:40，浓度为6％的溶液中，超声搅拌溶解后制备出pcl/col/季铵盐纺丝溶液；以质量分数计，所述季铵化卟啉衍生物占溶液的质量百分比为0.02-0.5％；3)将所述纺丝溶液加入到静电纺丝装置中，纺丝参数设定为电压16kv，流速0.0016mm/s，接收距离18cm；环境温度28
±
3℃，相对湿度40
±
10％，将pcl/col/季铵盐复合纳米纤维膜在室温下真空干燥三天，即得；优选地，所述静电纺丝装置的注射器固定在微量注射泵的主泵上，高压电源正极接在注射器金属针头上作为喷丝口，负极接在圆柱形接收铝箔纸上并与接地线相连，纤维收集到铝箔上形成纤维膜；更优选地，所述喷丝口的针头为22g。7.一种纳米纤维膜，其特征在于，含有如权利要求1所述的季铵化卟啉衍生物。8.如权利要求7所述的纳米纤维膜，其特征在于，是通过如权利要求6所述的制备方法制备得到的。9.如权利要求1所述的季铵化卟啉衍生物在制备抗菌试剂或抗菌材料中的应用；或如权利要求7或8所述的纳米纤维膜在制备抗菌材料中的应用。10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗菌材料为用于创伤愈合、瘢痕修复或组织工程的敷料。

技术总结
本发明提供一种用作光动力抗菌剂的季铵化卟啉衍生物及其制备方法和应用。本发明提供的季铵化卟啉衍生物具有双重抗菌性能，弥补单一硅凝胶抗菌抗炎效果弱、刺痛感强的缺陷，又能达到渗透止血-深度保水-抗菌抗炎-光照自净-智能修复等功能。智能修复等功能。智能修复等功能。


技术研发人员：张家婧 袁晓茜 班超 孙文昊 王晓涵 侯桂革
受保护的技术使用者：滨州医学院
技术研发日：2022.05.17
技术公布日：2022/11/1