用于联合疗法的病毒载体的制作方法

用于联合疗法的病毒载体
1.相关申请的引用
2.本技术主张2020年1月10日提交的美国临时专利申请62/959,256和2020年1月17日提交的美国临时专利申请62/962,306的优先权，该临时专利申请的整体内容通过引用并入本文。
3.本技术还通过引用并入2018年12月12日提交的美国临时专利申请号62/778,646和2019年12月11日提交的国际专利申请号pct/us2019/065718，该国际专利申请主张2018年12月12日提交的美国临时专利申请号62/778,646的优先权。


背景技术：

4.肌营养不良症(md)是一组疾病，引起进行性虚弱和肌肉质量的缺失。在肌营养不良症中，异常基因(突变型基因)不产生形成健康肌肉所需的功能性野生型蛋白质。
5.肌营养不良症对于受累患者的生命质量具有严重的衰弱影响。duchenne型肌营养不良症(dmd)是最具破坏性的肌肉疾病之一，每5,000名新生男性中就有1人受其影响。它是被了解最深的肌营养不良症，由编码肌营养不良相关蛋白复合物(dapc)成员的基因中的突变引起。这些md由膜脆性引起，而膜脆性与由dapc所致的肌纤维膜-细胞骨架系带缺失有关。
6.具体而言，dmd由dmd基因中的突变引起，该突变导致dmd mrna的减少和肌营养不良蛋白(dystrophin)或功能性肌营养不良蛋白的缺失，肌营养不良蛋白是一种427kda肌纤维膜蛋白，与肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(dapc)缔合(hoffman等人，cell 51(6)：919-928，1987)。dapc由肌肉肌纤维膜处的多种蛋白质构成，这些蛋白质经由肌营养不良蛋白(一种肌动蛋白结合蛋白)和α-肌营养不良聚糖(一种层粘连蛋白结合蛋白)在细胞外基质(ecm)与细胞骨架之间形成结构联系。这些结构联系发挥作用以在收缩过程中稳定肌肉细胞膜，并且保护肌肉细胞膜免于收缩所致的损伤。
7.作为dmd突变结果的肌营养不良蛋白缺失扰乱肌营养不良蛋白糖蛋白复合物，导致肌膜脆性增加。包括钙流入肌浆、蛋白酶和促炎细胞因子的激活以及线粒体功能障碍在内的一连串事件导致进行性肌肉变性。此外，神经元型一氧化氮合酶(nnos)的位移造成组织缺血、氧化应激增加和修复失败。疾病进展的特征在于肌肉坏死、纤维化和脂肪组织替换的增加，以及后续肌肉活检中出现的更大程度的纤维尺寸变化。
8.积累的证据表明，细胞内ca
2+
(ca
2+i
)的异常升高是一种重要的早期致病事件，其在dmd中启动疾病进展并使之持续。肌/内质网ca
2+
atpase(serca)泵的正常功能导致＞70％的ca
2+
从细胞溶质去除和适当的肌肉收缩。因此，serca活性的降低已被视为dmd中ca
2+i
过载和肌肉功能障碍的主要原因。
9.目前，dmd无法治愈。标准治疗包括给药皮质类固醇(诸如强的松(prednisone)或地夫可特(deflazacort))以稳定肌肉强度和功能，延长独立行走时间，以及延迟脊柱侧凸和心肌病；双膦酸盐；以及地诺单抗(denosumab)和重组甲状旁腺激素。
10.随着基因疗法的出现，关于dmd治疗的研究和临床试验聚焦于基因替换或其他旨
在至少部分地恢复肌营养不良蛋白功能的基因疗法。这些疗法包括提供肌营养不良蛋白基因的功能性拷贝，诸如肌营养不良蛋白微小基因；或通过外显子跳跃和无义突变抑制来修复缺陷性肌营养不良蛋白基因产物。
11.但是，由于肌营养不良蛋白突变引起的广泛效应，对于治疗与原发性肌营养不良蛋白突变相关的其他继发性症状存在需求。
12.举例而言，肌营养不良蛋白的缺失导致肌营养不良蛋白相关蛋白复合物(dapc)的缺失，继而导致通过nnos产生一氧化氮(no)和hdac2的异常n-亚硝基化。这种经异常地n-亚硝基化的hdac2从染色质解离，并释放对特异性微rna(microrna)级联的抑制，继而导致一系列下游事件，诸如纤维化和增加的氧化应激。
13.特别地，关于纤维化，随着肌营养不良蛋白缺失，膜脆性导致肌膜撕裂和钙流入，触发钙激活的蛋白酶和节段性纤维坏死(straub等人，curr.opin.neurol.10(2)：168-175，1997)。这种不受控制的肌肉变性和再生循环最终耗尽了肌肉干细胞群(sacco等人，cell 143(7)：1059-1071，2010；wallace等人，annu rev physiol71：37-57，2009)，导致进行性肌无力、肌内膜炎症和纤维化瘢痕。
14.没有肌营养不良蛋白或微小肌营养不良蛋白来稳定膜，dmdd将表现出不受控制的组织损伤和修复循环，并最终通过结缔组织增生来用纤维化瘢痕组织替代缺失的肌肉纤维。
15.在诊断为dmd的最早年龄(例如，4至5岁之间)取得的肌肉活检显示突出的结缔组织增生。肌肉纤维化以多种方式产生危害。其减少肌内营养物质通过结缔组织屏障的正常转运，减少血流并剥夺肌肉的血管源性营养成分，并在通过肢体挛缩在功能上导致早期丧失行走能力。随着时间推移，由于肌肉的明显纤维化，治疗挑战性成倍增加。这可以通过比较连续时间点的结缔组织增生而在肌肉活检中观察到。该过程继续加剧，导致无法行走并加速失控，尤其在依赖轮椅的患者中。
16.因此，纤维化浸润在dmd中意义重大，并且是任何潜在疗法的显著障碍。就此而言，单独的基因替换疗法往往受到纤维化的严重程度的阻碍，而这种严重程度已经存在于非常小的患有dmd的儿童中。
17.纤维化的特征在于ecm基质蛋白(包括胶原和弹性蛋白)的过量沉积。ecm蛋白主要从细胞因子诸如tgf产生，该细胞因子由被激活的成纤维细胞响应于应激和炎症而释放。尽管dmd的主要病理特征是肌纤维变性和坏死，但纤维化作为病理结果具有同等的影响。在dmd患者中，纤维化组织的过量产生限制肌肉再生并促进肌无力。
18.在一项研究中，初始dmd肌肉活检中纤维化的存在与10年随访时的不佳运动结果高度相关(desguerre等人，j neuropathol exp neurol 68(7)：762-767，2009)。这些结果指出，纤维化是dmd肌肉功能障碍的主要贡献者，并强调了对于发展减少纤维化组织的疗法的需求。
19.已经在mdx小鼠中测试的大多数抗纤维化疗法通过抑制tgf通路来发挥作用以阻断纤维化细胞因子信号传导。
20.微rna(mirna)是约22个核苷酸的单链rna，其通过与mrna的3’utr内的碱基配对来在转录后水平上介导基因沉默，抑制转录或促使mrna降解。在mirna的5’末端处的7bp种子序列靶向该mirna；通过所靶向的序列以及其二级结果提供额外识别。mirna在肌肉疾病病
理学中扮演重要角色并且表现出独特地依赖于所讨论的肌肉肌营养不良蛋白类型的表达谱(eisenberg等人，proc natl acad sci u.s.a.104(43)：17016-17021，2007)。越来越多的证据表明，mirna牵涉入多个器官(包括心、肝、肾和肺)的纤维化过程中(jiang等人，proc natl acad sci u.s.a.104(43)：17016-17021，2007)。
21.最近，mir-29的下调被证明促进心肌纤维化(cacchiarelli等人，cell metab 12(4)：341-351，2010)。减少的mir-29表达在遗传学上与人dmd患者肌肉关联(eisenberg等人，proc natl acad sci u.s.a.104(43)：17016-17021，2007)。
22.mir-29家族由三个从两种双顺反子mirna簇表达的家族成员组成。mir-29a与mir-29b(mir-29b-1)共表达；mir-29c与mir-29b的第二拷贝(mir-29b-2)共表达。mir-29家族共享保守的种子序列，并且mir-29a和mir-29b各自与mir-29c仅相差一个碱基。此外，将mir-29质粒(mir-29a和mir-29b-1的簇)电穿孔到mdx小鼠肌肉中，降低了cm组分、胶原和弹性蛋白的表达水平，并且在处理后25天内导致肌肉区段中胶原沉积的强烈下降(cacchiarelli等人，cell metab 12(4)：341-351，2010)。
23.腺相关病毒(aav)是复制缺陷型细小病毒，其单链dna基因组的长度为约4.7kb，包括145个核苷酸的反向末端重复序列(itr)。
24.aav具备独特的特征，使得其非常适合作为用于将外来dna递送至细胞的载体，举例而言，在基因疗法中。培养物中细胞的aav感染不会导致细胞病变，而人和其他动物中的天然感染是沉默且无症状的。此外，aav感染多种哺乳动物细胞，从而有可能在体内靶向多种不同的组织。此外，aav转导缓慢分裂和不分裂的细胞，并且可作为转录活性核外体(染色体外元件)而基本上在那些细胞的寿命内持续存在。aav前病毒基因组作为质粒中的经克隆的dna具有感染性，这使得构建重组基因组可行。此外，因为引导aav复制、基因组衣壳化和整合的信号包含在aav基因组的itr内，该基因组的一些或全部的内部大约4.3kb(编码复制和功能性衣壳蛋白，rep-cap)可替换为外来dna，诸如含有启动子的基因匣、目的dna和聚腺苷酰化信号。rep和cap蛋白质可以反式提供。aav的另一显著特征是它是极其稳定和强健的病毒。它很容易承受用来使腺病毒失活的条件(56℃至65℃，持续数小时)，使得aav的冷藏不那么关键。aav甚至可以经冻干。最后，aav感染的细胞对重复感染没有抗性。
25.多项研究已经证明了肌肉内的长期(》1.5年)重组aav介导的蛋白质表达。参见clark等人，hum gene ther 8：659-669(1997)；kessler等人，proc nat.acad sc.u.s.a.93：14082-14087(1996)；和xiao等人，j virol 70：8098-8108(1996)。也参见chao等人，mol ther 2：619-623(2000)和chao等人，mol ther 4：217-222(2001)。此外，因为肌肉高度血管化，重组aav转导已经导致在肌肉注射后在全身循环中出现转基因产物，如herzog等人，proc natl acad sci u.s.a.94：5804-5809(1997)和murphy等人，proc natl acad sci u.s.a.94：13921-13926(1997)中所述。此外，lewis等人，j virol 76：8769-8775(2002)证明，骨骼肌纤维具备正确抗体糖基化、折叠和分泌所必需的细胞因子，表明肌肉能够稳定地表达所分泌的蛋白质治疗剂。
26.尽管使用aav载体的基因疗法已经为该领域带来了大量投资，但商业化仍存在巨大挑战。重组病毒载体生产被认为是复杂的，其中放大生产被视为的主要技术挑战，也是商业化的一大障碍。
27.具体地，取决于治疗面积，所报告的基于aav的病毒载体的临床剂量范围在每患者
10
11
至10
14
基因组颗粒(载体基因组；vg)。因此，从更广泛的基因疗法发展角度来看，目前的放大方法无法提供所述数量的剂量以允许进行后期(例如，ii/iii期)试验，因此阻碍了基因疗法产品的发展。这得到以下事实的支持：大多数临床研究规模非常小，对《100名患者(在一些情况下，《10)进行，使用粘附细胞转染过程，而该过程生成非常少量的产物。当将后期开发所需的指定量的病毒与目前生产能力(例如，来自单个10层细胞工厂的5
×
10
11
vg)比较时，真正令人担忧的是，这一方法将无法达到后期和市场对于极端孤儿疾病的材料需求，这些疾病具有高剂量和小患者队列，更不用说更“标准”的基因疗法适应症了。
28.如clement和grieger在最近的综述文章(molecular therapy-methods&clinical development(2016)3，16002；doi：10.1038/mtm.2016.2)中所指出的：“aav在临床环境中的使用强调了亟需能够生成非常大量的高纯raav颗粒的生产和纯化系统。的fda批准的典型研究性新药包括广泛的毒理学、安全性、剂量和生物分布评估的临床前研究，其中载体要求通常达到1e15至1e16载体基因组范围。尽管在技术上可行，但在使用现有生产系统时，制造如此数量的产品仍然是一项令人难以置信的工作。”29.这一问题对于期望进行全身性(而非局部)递送的aav载体而言尤为急迫。在最近的文章中，adamson-small等人(molecular therapy-methods&clinical development(2016)3，16031；doi：10.1038/mtm.2016.31)指出，“目前在载体生产和纯化中的局限性已经阻碍了临床候选载体的广泛实施，特别是当考虑全身性给药时。这一点在治疗先天性遗传疾病诸如肌营养不良症时尤其适用，此时可能需要全身基因转移，通常需要高aav剂量的全身给药。”事实上，先前在针对肌营养不良症的临床试验中对raav的研究已经通过肌肉注射递送载体，这一般是由于缺乏大规模制造以生成支持全身性给药所需的量的能力。在产生联合疗法所需的足够数量的高质量aav载体方面，两种aav载体在联合疗法中的全身性递送甚至更具挑战性。
30.因此，在罹患dmd和其他肌营养不良症的患者中的功能改善既需要基因恢复，也需要减少与大量继发性级联诸如纤维化有关的症状。替代性地或此外，肌营养不良症可能受益于同步地靶向不同致病通路的治疗。对于减少此类继发性级联症状(例如，纤维化)的方法存在需求，该方法可以与基因恢复方法配对以进行对dmd和其他肌营养不良症的更有效治疗。此类联合疗法还必须克服产生足够数量的基因疗法载体以将两种治疗剂成分递送至靶标组织的显著临床和商业化挑战，特别是在基因疗法载体的全身性递送情况下。


技术实现要素：

31.本文所述的发明提供一种用于基因疗法的病毒载体，其包含同步地编码第一多肽或第一rna(“第一转录和/或表达单元或匣(cassette)”)和从与第一转录和/或表达匣相关的所谓“多组分匣”表达的第二多肽或第二rna(“第二转录和/或表达单元或匣”)的多核苷酸序列，其提供对第一和第二多肽和/或rna各自的表达的分开且独立的控制，并且在不同的转录和/或表达单元或匣之间具有最低限度的或没有转录干扰。因此，本发明的病毒载体有时称为“多组分载体”。在某些实施方案中，两种转录和/或表达单元或匣各自处于其自己的独立控制元件或启动子的控制下。在某些实施方案中，两种独立的控制元件或启动子在相反方向上操作，诸如各自朝着(与背离相反)其最接近的末端重复序列序列(诸如aav载体中的itr序列)转录。
32.如本文所用，“第一”和“第二”转录匣或单元是相对术语，其中两种转录匣中的任一个可称为第一或第二转录匣。因此，在一种特定情况下描述的“第一转录匣”不必与在不同情况下描述的另一“第一转录匣”相同或等效。
33.本发明部分地基于以下令人惊奇的发现：一个或多个编码序列可插入某些位置内，诸如插入定位在目的基因(goi)的控制元件或启动子与最接近的itr之间的所谓“多组分匣”(见下文)内，同时该功能性蛋白质(诸如肌营养不良蛋白微小基因或微小基因产物)和一个或多个编码序列两者可在被感染的靶标细胞(例如，肌肉细胞)内表达，而且与仅包含功能性蛋白质(诸如肌营养不良蛋白微小基因产物)或仅包含该一个或多个编码序列的类似载体构造体相比，不显著减少表达。在某些实施方案中，与将相同编码序列插入病毒载体的其他部分内诸如插入goi异的源内含子或3
’‑
utr内相比，该一个或多个编码序列从多组分匣的表达得以极大增加。
34.如本文所用，“转录和/或表达单元或匣”最少包括控制元件、编码序列和转录终止序列。各转录和/或表达单元或匣中的编码序列可独立地编码任何蛋白质、多肽、mrna、非编码rna(诸如shrna、mirna、sirna或其前体)、反义序列、基因编辑酶的向导序列或mirna抑制剂等。编码序列可操作地链接至控制元件并出于该控制元件的控制下，该控制元件包括启动子且任选地包括一个或多个增强子或其他控制元件，以用于通过rna聚合酶(包括pol ii或pol iii)启动或影响转录，使得无论编码序列如何编码都可以被转录。编码序列还可操作地链接至下游转录终止序列(诸如t6转录终止序列)，使得转录可以按期望终止。
35.如本文所用，具有在相反/相异/多个方向上操作的两个或更多个转录单元和/或匣的构造体称为“多组分构造体”。
36.具体地，本发明的具有此类排列的两个或更多个转录和/或表达单元或匣的病毒载体(诸如基于aav的病毒载体或基于慢病毒的病毒载体)或病毒质粒载体主链中的多组分构造体称为“多组分载体”。
37.举例而言，本发明的载体可同步地编码从第一转录匣表达的第一治疗剂(例如，蛋白质)和从不同的匣表达的第二治疗剂(例如，rna)。
38.应理解，第一和第二(不同)表达单元和/或匣的表述是相对的，因此两种goi中的任一种可从任意表达单元和/或匣表达。举例而言，在一个实施方案中，微小肌营养不良蛋白编码序列可以从第一或第二(不同)表达匣表达。在另一实施方案中，shrna、sirna、mirna等中的任一者也可以从第一或第二(不同)表达匣表达。此外，两种表达单元/匣均可用来表达本文所述的蛋白质或非蛋白质产物(诸如mirna或其前体)。
39.换言之，第一或第二rna中的任一者或两者可以是不产生蛋白质或多肽的非编码rna。此类非编码rna可以是微rna(mir)、shrna(短发夹圈rna)、pirna、snorna、snrna、exrna、scarna、长ncrna诸如xist和hotair、反义rna或其前体，优选具有治疗价值，例如，那些与疾病诸如癌症、自闭症、阿兹海默症、软骨毛发发育不全、听力丧失和prader-willi综合征，特别是各种类型的肌营养不良症(md)(包括dmd/bmd)相关的。
40.此类非编码rna也可以是crispr/cas9蛋白的单或多向导rna，或crispr/cas12a(先前称为cpf1)蛋白的crispr rna(crrna)。
41.再者，两种转录单元/匣可用来表达产物(蛋白质、肽、rna等)，这些产物可以是生物学无关的或在生物功能方面有某种程度的关联。举例而言，所编码/表达的产物中的一者
可替换疾病或病症中缺陷性基因产物的功能，而另一种所编码/表达的产物可作用于分开的生物学通路，并且因此两种产物被顶并导致所期望的加和性或协同性生物或治疗效应。在治疗肌营养不良症的情境找那个，举例而言，所编码/表达的产物中的一者可以是肌营养不良蛋白的功能性版本(诸如μdys)，其补充缺失的肌营养不良蛋白功能；而另一种所编码/表达的产物可拮抗与肌营养不良蛋白功能缺失相关的副效应诸如纤维化。
42.因此，在一方面，本发明提供一种重组蛋白载体，其包含：a)第一转录匣，用于在可操作地链接的第一控制元件的控制下表达第一目标基因(第一goi)；b)第二转录匣，用于在可操作地链接的第二控制元件的控制下表达第二目标基因(第二goi)；其中所述第一转录匣和所述第二转录匣在序列上不重叠，并且其中所述第一控制元件和所述第二控制元件分别在彼此背离的方向上转录第一goi和第二goi。
43.换言之，第一转录匣和第二转录匣独立地处于其自己的转录控制元件/启动子的控制下，该转录控制元件/启动子引导在相反/不同方向上的转录，优选各自朝着最接近的末端重复序列序列(例如，aav的itr)。
44.在某些实施方案中，第一目的基因编码在疾病或病症中具有缺陷的野生型或正常基因(例如，经密码子优化的野生型或正常基因)，并且其中第二目的基因编码靶向所述在疾病或病症中具有缺陷的基因产物的拮抗剂。
45.在某些实施方案中，第一目的基因编码crispr/cas酶(例如，cas9、cas12a、cas13a-13d)，并且其中所述第二目的基因编码各自对于靶标序列具有特异性的一种或多种向导rna(例如，对于cas9，sgrna；或对于cas12a，crrna)。
46.在某些实施方案中，第一目的基因和第二目的基因编码在有益于治疗疾病或病症的不同通路中发挥功能的产物。
47.在某些实施方案中，在重组病毒载体中，a)第一goi包含异源内含子序列，其增强下游蛋白质编码序列、该蛋白质编码序列下游的3
’‑
utr编码区域、和聚腺苷酰化(polya)信号序列(例如，aataaa)的表达；b)第二goi包含一个或多个编码序列，其独立地编码：蛋白质、多肽、rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列、基因编辑酶的向导序列、微rna(mirna)和/或mirna抑制剂；并且c)任选地，一个或多个额外编码序列插入到第一goi的医院内含子序列中和/或3
’‑
utr编码区域中，其中所述一个或多个额外编码序列独立地编码：蛋白质、多肽、rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列、基因编辑酶的向导序列、微rna(mirna)和/或mirna抑制剂。
48.在特定实施方案中，本发明提供一种重组病毒载体，其包含：a)多核苷酸，其编码目的功能性基因或蛋白质(goi)，诸如有效治疗肌营养不良症者，其中所述多核苷酸包含3
’‑
utr编码区域且紧邻异源内含子序列的3’，该异源内含子序列增强由该多核苷酸编码的功能性蛋白质的表达；b)第一控制元件(例如，肌肉特异性控制元件)，其可操作地链接至该多核苷酸并驱动该多核苷酸的表达；和c)一个或多个编码序列：(1)插入在第一控制元件与最接近的病毒末端序列(例如，aav中的itr)之间并且可操作地链接至第二控制元件，和(2)任选地进一步插入在内含子序列中或3
’‑
utr编码区域中；其中所述一个或多个编码序列独立地编码：蛋白质、多肽、rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列、基因编辑酶的向导序列(诸如对于crispr/cas9，单向导rna(sarna)；或对于crispr/cas12a，acrrna)、微rna(mirna)和/或mirna抑制剂。
49.在某些实施方案中，重组病毒载体是重组aav(腺相关病毒)载体或重组慢病毒载体。
50.在特定实施方案中，本发明提供一种重组aav(raav)载体，其包含：a)多核苷酸，其编码功能性蛋白质，诸如有效治疗肌营养不良症者，其中所述多核苷酸包含3
’‑
utr编码区域且紧邻异源内含子序列的3’，该异源内含子序列增强由该多核苷酸编码的功能性蛋白质的表达；b)肌肉特异性控制元件，其可操作地链接至该多核苷酸并驱动该多核苷酸的表达；和c)一个或多个编码序列，其插入在肌肉特异性控制元件与最接近的aav itr之间并且可操作地链接至第二控制元件，和(2)任选地进一步插入在内含子序列中或3
’‑
utr编码区域中；其中所述一个或多个编码序列独立地编码：rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列、微rna(mirna)和/或mirna抑制剂。
51.在特定实施方案中，本文所述的发明提供一种病毒载体，诸如重组aav(raav)载体，其包含：a)肌营养不良蛋白小基因或微小基因，其编码功能性微小肌营养不良蛋白(例如，microd5)，其中所述肌营养不良蛋白小基因或微小基因包含3
’‑
utr编码区域且紧邻异源内含子序列的3’，该异源内含子序列增强肌营养不良蛋白小基因或微小基因的表达；b)肌肉特异性控制元件，其可操作地链接至该多核苷酸并驱动肌营养不良蛋白小基因或微小基因的表达；和c)一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)编码序列，其插入在肌肉特异性控制元件与最接近的aav itr之间并且可操作地链接至第二控制元件，和(2)任选地进一步插入在内含子序列中或3
’‑
utr编码区域中；其中所述一个或多个编码序列独立地编码：rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列、微rna(mirna)和/或mirna抑制剂。
52.在某些实施方案中，第二控制元件是启动子或启动子的一部分，其转录该一个或多个编码序列。举例而言，第二控制元件是pol ii启动子，其转录插入在第一控制元件与最接近的病毒末端序列之间的该一个或多个编码序列，任选地在与由第一控制元件启动的转录相反的方向上转录。在其他实施方案中，第二控制元件是pol iii启动子。在其他实施方案中，第一和第二控制元件两者是相同的启动子。在其他实施方案中，第一和第二控制元件是不同的启动子。
53.在某些实施方案中，功能性肌营养不良蛋白质是microd5，并且/或肌肉特异性控制元件/启动子是ck启动子。
54.在某些实施方案中，该一个或多个编码序列插入在转录匣内，该转录匣不编码或表达功能性蛋白质。在某些实施方案中，该一个或多个编码序列进一步插入在3
’‑
utr编码区域内，或在转录匣的聚腺苷酰化(polya)信号序列(例如，aataaa)之后，该转录匣不编码或表达功能性蛋白质。
55.在某些实施方案中，功能性goi的表达基本上不受该一个或多个编码序列的存在的影响(例如，当与不具有所述一个或多个编码序列的其他相同对照构造体相比时)。
56.在某些实施方案中，第一goi是野生型或正常serpina1编码序列(例如，经密码子优化的serpina1编码序列)，并且其中第二goi编码靶向serpina1的突变型等位基因的rnai剂(例如，sirna、shrna或mirna)。
57.在某些实施方案中，serpina1的突变型等位基因是pittsburg等位基因、b(alhambra)等位基因、m(malton)等位基因、s等位基因、m(heerlen)等位基因、m(mineral springs)等位基因、m(procida)等位基因、m(nichinan)等位基因、i等位基因、p(lowell)等
位基因、无效(granite falls)等位基因、无效(bellingham)等位基因、无效(mattawa)等位基因、无效(procida)等位基因、无效(hong kong 1)等位基因、无效(bolton)等位基因、pittsburgh等位基因、v(munich)等位基因、z(augsburg)等位基因、w(bethesda)等位基因、无效(devon)等位基因、无效(ludwigshafen)等位基因、z(wrexham)等位基因、无效(hong kong 2)等位基因、无效(riedenburg)等位基因、kalsheker-poller等位基因、p(duarte)等位基因、无效(west)等位基因、s(iiyama)等位基因或z(bristol)等位基因。
58.在某些实施方案中，第一goi为具有不同于突变体serpina1的5
’‑
utr和/或3
’‑
utr的serpina1的经密码子优化的野生型或正常编码序列；并且其中rnai剂靶向与serpina1的突变型而非经密码子优化的野生型等位基因特异性地相关的5
’‑
utr靶标序列、3
’‑
utr靶标序列和/或编码序列。
59.在某些实施方案中，第一控制元件和/或第二控制元件包含肝特异性启动子和/或增强子(诸如apoe增强子)或α1-抗肌营养不良蛋白启动子。
60.在某些实施方案中，第一goi为重复序列扩张疾患(rfd)中缺陷基因的野生型或正常编码序列(例如，red中缺陷基因的经密码子优化的野生型或正常编码序列)，并且其中第二goi编码rnai剂(例如，sirna、shrna或mirna)，该rnai剂靶向red中的缺陷基因的突变型等位基因。
61.在某些实施方案中，red为具有(超过52个)cag三核苷酸重复序列的突变型atxn3基因所致的脊髓小脑共济失调3(sca3)，并且其中rnai剂靶向与atxn3的突变型而非野生型等位基因特异性地相关的snp。
62.在某些实施方案中，red为具有(超过52个)cag三核苷酸重复序列的突变型atxn3基因所致的脊髓小脑共济失调3(sca3)，其中第一goi为具有不同于突变体atxn3的5
’‑
utr和/或3
’‑
utr的atxn3的经密码子优化的野生型或正常编码序列；并且其中rnai剂靶向与atxn3的突变型而非经密码子优化的野生型等位基因特异性地相关的5
’‑
utr靶标序列、3
’‑
utr靶标序列和/或编码序列。
63.在某些实施方案中，第一控制元件和/或第二控制元件包含神经元特异性启动子和/或增强子(诸如突触蛋白启动子)或天然atxn3启动子或普遍存在的启动子。
64.在某些实施方案中，red分别为sca1、2、3、6、7、8、10、12或17，并且其中rnai剂靶向分别与ataxin-1、ataxin-2、ataxin-3、cacna1、ataxin-7、sca8、sca10、ppp2r2b或tbp的突变型而非野生型等位基因特异性地相关的snp。
65.在某些实施方案中，red分别为sca1、2、3、6、7、8、10、12或17，其中第一goi分别为分别具有不同于突变型ataxin-1、ataxin-2、ataxin-3、cacna1、ataxin-7、sca8、sca10、ppp2r2b或tbp的5
’‑
utr和/或3
’‑
utr的ataxin-1、ataxin-2、ataxin-3、cacna1、ataxin-7、sca8、sca10、ppp2r2b或tbp的经密码子优化的野生型或正常编码序列；并且其中rnai剂靶向分别与ataxin-1、ataxin-2、ataxin-3、cacna1、ataxin-7、sca8、sca10、ppp2r2b或tbp的突变型而非经密码子优化的野生型等位基因特异性地相关的5
’‑
utr靶标序列、3
’‑
utr靶标序列和/或编码序列。
66.在某些实施方案中，red为具有(超过50个)ctg三核苷酸重复序列的突变型dmpk基因所致的肌强直性营养不良1型(dm1)，并且其中rnai剂靶向与dmpk的突变型而非野生型等位基因特异性地相关的snp。
67.在某些实施方案中，red为具有(超过50个)ctg三核苷酸重复序列的突变型dmpk基因所致的肌强直性营养不良1型((dm1)，其中第一goi为具有不同于突变体dmpk的5
’‑
utr和/或1
’‑
utr的dmpk的经密码子优化的野生型或正常编码序列；并且其中rnai剂靶向与dmpk的突变型而非经密码子优化的野生型等位基因特异性地相关的5
’‑
utr靶标序列、3
’‑
utr靶标序列和/或编码序列。
68.在某些实施方案中，第一控制元件和/或第二控制元件包含肌肉特异性启动子和/或增强子(诸如ck8启动子)或天然dmpk启动子或普遍存在的启动子。
69.在某些实施方案中，第一goi编码野生型或密码子优化的mbnl1基因，并且其中第二goi编码rnai剂(例如，sirna、shrna或mirna)，rnai剂靶向在肌强直性营养不良1型(dm1)中由于具有超过50个ctg三核苷酸重复序列而具有缺陷的dmpk基因的突变型等位基因。
70.在某些实施方案中，red为具有(超过55个)cgg三核苷酸重复序列的突变型fmr1基因所致的脆性x染色体综合征(fxs)，并且其中rnai剂靶向与fmr1的突变型而非野生型等位基因特异性地相关的snp。
71.在某些实施方案中，red为具有(超过55个)cgg三核苷酸重复序列的突变型fmr1基因所致的脆性x染色体综合征(fxs)，其中第一goi为具有不同于突变体fmr1的5
’‑
utr和/或3
’‑
utr的fmr1的经密码子优化的野生型或正常编码序列；并且其中rnai剂靶向与fmr1的突变型而非经密码子优化的野生型等位基因特异性地相关的5
’‑
utr靶标序列、3
’‑
utr靶标序列和/或编码序列。
72.在某些实施方案中，第一控制元件和/或第二控制元件包含神经元特异性启动子和/或增强子(诸如突触蛋白启动子)或天然fmr1启动子。
73.在某些实施方案中，第一goi在多特异性启动子(诸如ck8启动子)的控制下编码功能性肌营养不良蛋白质。
74.在某些相关实施方案中，在重组aav(raav)载体中：a)多核苷酸是肌营养不良蛋白微小基因，其编码功能性5-血影蛋白样重复序列肌营养不良蛋白质(例如，microd5；如us10,479,821中所述，其通过引用并入本文)；和/或b)肌肉特异性控制元件是ck启动子，其可操作地链接至肌营养不良蛋白微小基因并驱动肌营养不良蛋白微小基因的表达。
75.在某些实施方案中，第二goi编码一个或多个编码序列，该编码序列包含外显子跳跃反义序列，该反义序列诱导缺陷性肌营养不良蛋白的外显子诸如肌营养不良蛋白的外显子45至55或肌营养不良蛋白的外显子44、45、51和/或53的跳跃。
76.在某些实施方案中，微rna是mir-1、mir-133a、mir-29c、mir-30c和/或mir-206。举例而言，微rna可以是mir-29c，任选地具有经修饰的侧翼主链序列，该侧翼主链序列增强经设计用于靶标序列的mir-29c的向导链的加工性。在某些实施方案中，经修饰的侧翼主链序列来自或基于mir-30、mir-101、mir-155或mir-451。
77.在某些实施方案中，与微rna在宿主细胞中的内源性表达相比，微rna在宿主细胞中的表达上调至少约1.5至100倍(例如，约2至80倍、约1.5至10倍、约15至70倍、约50至70倍，约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或约80倍)。
78.在某些实施方案中，rnai序列为针对肌脂蛋白(sarcolipin)的shrna(shsln)。
79.在某些实施方案中，该一个或多个编码序列编码一个或多个相同或不同的针对肌脂蛋白的shrna(shsln)。
80.在某些实施方案中，shrna使肌脂蛋白mrna和/或肌脂蛋白蛋白质表达减少至少约50％。
81.在某些实施方案中，goi是crispr/cas9，并且向导序列是sgrna；或其中goi是crispr/cas12a，并且向导序列是crrna。
82.在某些实施方案中，rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列、crispr/cas9 sgrna、crispr/cas12a crrna和/或微rna拮抗一种或多种靶标基因的功能，该一种或多种靶标基因诸如炎症基因、nf-κb信号传导通路的活化剂(例如，tnf-α、il-1、il-1β、il-6、nf-κb(rank)的受体活化剂和toll样受体(tlr)的活化剂)、nf-κb、由nf-κb诱导的下游炎性细胞因子、组蛋白脱乙酰酶(例如，hdac2)、tgf-β、结缔组织生长因子(ctgf)、ollagens、弹性蛋白、细胞外基质的结构性组分、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)、肌肉生长抑制素、磷酸二酯酶-5(ped-5)或ace、vegf诱骗受体1型(vegfr-1或flt-1)和造血前列腺素d合成酶(hpgds)。
83.在某些实施方案中，异源内含子序列是seq id no：1。
84.在某些实施方案中，载体是血清型aav1、aav2、aav4、aav5、aav6、aav7、aavrh74、aav8、aav9、aav10、aav 11、aav 12或aav 13的重组aav载体。
85.在某些实施方案中，在载体例如重组aav(raav)载体中：a)该多核苷酸编码功能性fukutin(fktn)蛋白质；且/或b)该一个或多个编码序列编码外显子跳跃反义序列，该反义序列恢复fukuyama先天性肌营养不良症(fcmd)患者中的缺陷性fktn基因中的正确外显子10剪接。
86.在某些实施方案中，在载体例如重组aav(raav)载体中：a)该多核苷酸编码功能性lama2蛋白质；且/或b)该一个或多个编码序列编码外显子跳跃反义序列，该反义序列恢复merosin缺陷型先天性肌营养不良症1a型(mdc1a)患者中的缺陷性lama2基因中的c端g结构域(外显子45至65)，尤其是g4和g5的表达。
87.在某些实施方案中，在载体例如重组aav(raav)载体中：a)该多核苷酸编码功能性dmpk蛋白质或clcn1基因；且/或b)rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列或微rna(mirna)靶向缺陷性dmpk基因中的突变型转录本的经扩张的重复序列，或编码导致dm1患者的clcn1基因中的外显子7a跳跃的外显子跳跃反义序列。
88.在某些实施方案中，在载体例如重组aav(raav)载体中：a)该多核苷酸编码功能性dysf蛋白质；且/或b)该一个或多个编码序列编码外显子跳跃反义序列，该反义序列导致dysferlin肌病(lgmd2b或mm)患者中缺陷性dysf基因中的外显子32的跳跃。
89.在某些实施方案中，在载体例如重组aav(raav)载体中：a)该多核苷酸编码功能性sgcg蛋白质；且/或b)该一个或多个编码序列编码外显子跳跃反义序列，该反义序列导致lgmd2c患者中缺陷性lgmd2c基因(例如，具有δ-521t sgcg突变的基因)中的外显子4至7的跳跃。
90.在某些实施方案中，一个或多个编码序列进一步插入在内含子序列中。
91.在某些实施方案中，功能性蛋白质的表达不受所述一个或多个编码序列插入的负面影响。
92.在某些实施方案中，载体是血清型aav1、aav2、aav4、aav5、aav6、aav7、aavrh74、aav8、aav9、aav10、aav 11、aav 12或aav 13的载体。在某些实施方案中，载体是已知血清型的衍生物。在某些实施方案中，衍生物可表现出所期望的组织特异性或趋性、所期望的免疫
原性特征(例如，不经历受试患者免疫系统的攻击)或其他所期望的关于用于多种适应症的药物组合物或基因疗法的特性。
93.在某些实施方案中，第一控制元件(或多组分匣中的启动子)是启动子或启动子的一部分，其以组织特性的放射转录一个或多个编码goi序列。在某些实施方案中，组织特异性控制元件是肌肉特异性控制元件。
94.在某些实施方案中，肌肉特异性控制元件是人骨骼肌动蛋白基因元件、心肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子mef、肌肉肌酐激酶(mck)、截短的mck(tmck)、肌球蛋白重链(mhc)、c5-12、鼠肌酐激酶增强子元件、骨骼快速收缩肌钙蛋白c基因元件、慢速收缩心肌肌钙蛋白c基因元件、慢速收缩肌钙蛋白i基因元件、低氧诱导核因子、类固醇诱导元件或糖皮质激素应答元件(gre)。
95.在某些实施方案中，肌肉特异性控制元件包含wo2017/181015(通过引用并入本文)的seq id no：10或seq id no：11的核苷酸序列。
96.本发明的另一方面提供一种组合物，其包含本发明的任何载体，例如，重组病毒(aav)载体。
97.在某些实施方案中，该组合物是药物组合物，进一步包括治疗上相容的载体、稀释剂或赋形剂。
98.在某些实施方案中，治疗上可接受的载体、稀释剂或赋形剂是无菌水溶液，其包含10mm l-组氨酸ph 6.0、150mm氯化钠和1mm氯化镁。
99.在某些实施方案中，该组合物的剂型为约10ml的水溶液，具有至少1.6
×
10
13
个载体基因组。
100.在某些实施方案中，该组合物具有至少2
×
10
12
个载体基因组每毫升的效力。
101.本发明的另一方面提供一种生产受试组合物的方法，包括在细胞内生产载体例如重组aav载体，以及裂解该细胞以获得该载体。
102.在某些实施方案中，载体是aav1、aav2、aav4、aav5、aav6、aav7、aavrh74、aav8、aav9、aav10、aav 11、aav 12或aav 13载体。
103.本发明的另一方面提供一种治疗有此需要的个体的肌营养不良症或抗肌萎缩蛋白病(dystrophinopathy)的方法，该方法包括向个体给药治疗有效量的本发明的任一重组载体例如重组aav载体或本发明的任一组合物。
104.在某些实施方案中，肌营养不良症是duchenne肌营养不良症或becker肌营养不良症。
105.在某些实施方案中，肌营养不良症是duchenne肌营养不良症、becker肌营养不良症、fukuyama先天性肌营养不良症(fcmd)、dysferlin肌病、肌强直性营养不良和merosin缺陷型先天性肌营养不良症1a型、面肩胛肱型肌营养不良症(fshd)、先天性肌营养不良症(cmd)或肌带型肌营养不良症(lgmdr5或lgmd2c)。
106.本发明的另一方面提供一种治疗有此需要的个体的α-1抗胰蛋白酶缺乏症(aatd)的方法，该方法包括向所述个体给药治疗有效量的本发明的重组病毒载体(例如，重组aav载体)或包含该重组病毒载体的组合物。
107.本发明的另一方面提供一种治疗有此需要的个体的脊髓小脑共济失调3(sca3)的方法，该方法包括向所述个体给药治疗有效量的本发明的重组病毒载体(例如，重组aav载
体)或包含该重组病毒载体的组合物。
108.本发明的另一方面提供一种治疗有此需要的个体的肌强直性营养不良1型(dm1)的方法，该方法包括向所述个体给药治疗有效量的本发明的重组病毒载体(例如，重组aav载体)或包含该重组病毒载体的组合物。
109.本发明的另一方面提供一种治疗有此需要的个体的脆性x染色体综合征(fxs)的方法，该方法包括向所述个体给药治疗有效量的本发明的重组病毒载体(例如，重组aav载体)或包含该重组病毒载体的组合物。
110.在某些实施方案中，重组载体例如重组aav载体或组合物通过肌肉注射、静脉注射、肠胃外给药或全身性给药来给药。
111.本发明的另一方面提供一种试剂盒，其用于预防或治疗个体的疾病诸如dmd或相关/有关疾病，该试剂盒包括：一种或多种载体，例如，本文所述的重组aav载体，或本文所述的组合物；使用说明书(手写的、印刷的、电子/光存储介质或在线的)；和/或包装。在某些实施方案中，试剂盒还包括用于治疗疾病(例如，dmd)的已知治疗性组合物，以用于联合疗法。
112.应理解，本文所述的任何一种实施方案，包括仅在实施例或权利要求中描述的，可以与本发明的任何一种或多种其他实施方案组合，除非该组合被明确否认或是不适宜的。
附图说明
113.图1显示了示意图(不按比例)，其显示受试重组病毒(例如，慢病毒或aav)载体的代表性和非限制性实施方案，该载体包含各自在分开的转录控制元件控制下以不同取向/方向且彼此背离地从分开的转录匣表达的第一目的基因(goi)和第二goi，其中转录匣在序列上不重叠。此类构造体可用来表达任何两种或更多种goi，其产物可以共操作(优选协同性地)以实现所期望的生物学结果。举例而言，goi中的一者可编码如下所述的小肌营养不良蛋白、微小肌营养不良蛋白或肌营养不良蛋白微小基因(例如，下述5-血影蛋白样重复序列microd5肌营养不良蛋白质，或功能性dmd基因的版本(小肌营养不良蛋白或附图中标记为“μdys”))，且另一goi可编码一个或多个额外编码序列，该一个或多个额外编码序列可以是蛋白质、多肽或非蛋白质编码rna(ncrna)诸如shrna中的一种。rnai、mirna等的编码基因可以插入在载体中“转录物”在该处启动的任何地方，例如，在goi中的一者的启动子(附图中标记为示例性肌肉特异性启动子ck8)与最接近的itr序列之间的区域内；在goi之前的内含子内；在3
’‑
utr区域内；或在polya信号序列后。额外ncrna(例如，shrna)编码序列可以是相同的或不同的。本发明的这些所谓“多组分/独立的”转录物从其相应的自己的独立启动子转录，并且在下文中进一步详述。
114.图2显示编码mir-29c的多种重组病毒(例如，aav)载体在人ips源性心肌细胞中的相对mir-29c表达水平变化(以相对于仅表达μdys的对照载体的倍数计)，该载体作为病毒载体的唯一编码序列(“单组分”构造体)，或作为2019年12月11日提交的pct/us2019/065718中所述的融合构造体(“融合”构造体)的一部分，或作为本公开的多组分构造体(“多组分”构造体)的一部分。
115.图3显示多种编码mir-29c的重组aav载体在分化的c2c12肌管或原代小鼠心肌细胞中的mir-29c相对表达水平，该载体作为作为病毒载体的唯一编码序列(“单组分”构造体)或作为本公开的多组分构造体(“多组分”构造体)的一部分。
116.图4显示经由本公开的多个shsln-μdys多组分构造体造成的小鼠sln荧光素酶构造体水平的约90％敲低，经由归一化至海肾构造体活性的萤火虫活性所测量。作为比较，也显示了使用单组分构造体获得的结果。最后两个样品是用于商用msln敲低的阴性和阳性shrna构造体。
117.图5显示多种编码shsln的重组aav载体在分化的c2c12肌管或小鼠心肌细胞中的sisln相对表达水平(经处理的来自所转录的shsln的sirna产物)，该载体作为作为病毒载体的唯一编码序列(“单组分”)或作为本公开的多组分构造体(“多组分”)的一部分。
118.图6显示由编码shhsln的几种受试多组分构造体在人ips源性心肌细胞中造成的高达约90至95％的人sln mrna敲低。
119.图7显示由编码shmsln的几种受试单组分和多组分构造体在原代小鼠心肌细胞中造成的高达约90％的小鼠sln mrna敲低。
120.图8显示几种hum-shsln-μdys多组分构造体在人ips源性心肌细胞中的归一化的μdys mrna水平。
121.图9是变性琼脂糖凝胶的图像，表明具有mir-29c或shsln编码序列的单组分、融合和多组分构造体中的很大程度上完整的aav基因组。
122.图10显示全部三种aav9衣壳蛋白vp1至vp3的比率在基于aav9的单组分、融合和多组分载体中保持相同。
123.图11显示在aav9载体中使用本发明的mir-29c-μdys多组分构造体，左腓肠肌中的mir-29c上调高达6倍(上图)，膈膜中的mir-29c上调高达5.8倍(下左图)，且左心室中的mir-29c上调高达7.5倍(下右图)。
124.图12显示在由单组分或多组分载体感染的小鼠中，mir-29c的血浆水平升高。
125.图13显示，使用上调mir-29c的多组分aav9载体，左腓肠肌中rna(左图)和蛋白质(右图)水平的μdys表达没有减少。
126.图14显示，经由aav9介导的表达测得，相对于仅μdys的aav9，shsln-μdys多组分在膈膜中具有高达75％msln mrna下调(上图)，在左心房(下左图)中具有高达95％msln mrna下调，且在左腓肠肌(下右图)中具有高达80％msln mrna下调。
127.图15显示经由aav9的shmsln-μdys多组分构造体在膈膜中实现的类似水平的μdys rna/蛋白质表达。在心房中也获得了类似结果(数据未显示)。
128.图16显示经由aav9的shmsln-μdys多组分构造体在舌中实现的类似水平的μdys蛋白质表达和msln mrna敲低。
129.图17显示，aav9的mir-29c单组分和mir-29c-μdys多组分构造体降低血清ck水平。mir-29c与μdys共表达可引起血清ck水平的进一步降低。
130.图18显示aav9的shmsln单组分和多组分构造体实现的血清ck水平。
131.图19显示，aav9的mir-29c单组分和mir-29c-μdys多组分构造体降低血清timp1水平。
132.图20显示，aav9的几种mir-29c-μdys多组分载体或aav9的shmsln-μdys多组分多组分载体在腓肠肌中造成的mir-29c或shsln载体的生物分布在很大程度上类似。
133.图21显示，mir-29c-μdys和shmsln-μdys多组分构造体与μdys单组分构造体相比，在肝脏中的aav9载体滴度通常较低。
134.图22显示，在表达mir-29c的多组分载体感染的动物中，血浆alt水平具有可比性，表明肝损伤不可能是在某些被感染的动物中观察到的较低肝脏滴度的原因。
135.图23显示，基于本发明的多组分构造体对两种纤维化标志物基因的效应，多组分构造体在膈膜中获得了比单独的μdys构造体增加的获益。
具体实施方式
136.在没有平行方法来治疗多种继发性级联症状诸如纤维化和细胞内ca
2+
的异常升高的情况下，不可能完全实现外显子跳跃、终止密码子通读或基因替换疗法的益处。在没有减少此类继发性级联事件(包括肌肉纤维化)的方法的情况下，甚至小分子或蛋白质替换策略也可能失败。举例而言，先前在具有使用aav小肌营养不良蛋白治疗现有纤维化的老年mdx小鼠中进行的研究表明，不会实现完全功能恢复(human molecular genetics 22：4929-4937，2013)。也已知dmd心肌病的进展伴随着心室壁的瘢痕化和纤维化。
137.本发明部分地涉及治疗患者的基因疗法，该方法不仅通过提供替代的功能性肌营养不良蛋白小基因来补偿肌营养不良蛋白及其功能的缺陷，而且直接使用形同基因疗法载体中的一个或多个额外编码序列靶向一种或多个继发性级联基因，从而在一个紧凑载体中实现用于全身性递送的联合疗法。
138.事实上，本发明特别是重组aav(raav)载体不限于治疗dmd。本发明适用于治疗其中基因具有缺陷的其他肌营养不良症。举例而言，本发明的重组aav(raav)载体可提供功能性蛋白质和/或一个或多个编码序列(诸如非编码rna，例如，rnai序列、反义rna、mirna)以治疗肌营养不良症，其中该功能性蛋白质提供肌营养不良症中缺陷性基因产物的野生型替代物，或提供对治疗肌营养不良症有效的非野生型替代物(例如，5-血影蛋白样microd5肌营养不良蛋白微小基因产物)。
139.再者，本发明特别是重组aav(raav)载体不限于治疗肌营养不良症。它可以用来表达至少两种目的基因(goi1和goi2)，这两种基因各自似乎能够承受独立的转录控制而不考虑其他转录级联存在或不存在，并且goi的表达水平似乎高于先前在2019年12月11日提交的pct/us2019/065718中描述的融合构造体，有时出乎意料地高得多。
140.因此，在一方面，本发明提供一种重组蛋白载体，例如，重组慢病毒或aav(raav)载体，其包含：a)第一转录匣，用于在可操作地链接的第一控制元件的控制下表达第一目标基因(第一goi)；b)第二转录匣，用于在可操作地链接的第二控制元件的控制下表达第二目标基因(第二goi)；其中所述第一转录匣和所述第二转录匣在序列上不重叠(但转录控制元件诸如启动子和/或增强子除外)，并且其中所述第一控制元件和所述第二控制元件分别在彼此背离的方向上转录第一goi和第二goi。
141.如本文所用，各goi编码至少一种基因产物。基因产物可以是蛋白质或肽，以及可能不会最终转录为蛋白质或多肽的功能性rna，诸如rnai剂(例如，shrna、sirna、mirna)、调节性rna或反义序列等。初始转录的rna基因产物可进一步经细胞内加工以得到功能性形式。
142.此外，各goi可编码超过一种基因产物。举例而言，在任何转录匣中，蛋白质编码序列可含有内含子和/或utr区域(诸如3’utr区域)。某些非编码rna基因产物的编码序列可以插入到或包埋在一个转录匣内，诸如内含子或3’utr区域内。当初始rna产物从转录匣转录
时，成熟mrna编码蛋白质产物，以及一种或多种非编码rna基因产物将在细胞内rna处理后获得。
143.在某些实施方案中，额外goi(例如，第三goi)可存在于相同病毒载体上，例如，在第一与第二转录匣之间，或(完全或部分地)与第一和第二转录匣重叠。此类额外goi可以可操作地连接至第一和第二转录匣的转录控制元件，或在其自己的转录控制元件的控制下。
144.如本文所用，“在相反方向上且彼此背离”意为第一和第二转录匣中的模板链(由rna聚合酶用作转录模板)位于双链载体dna的不同链上(即，第一转录匣的模板链在一条链上，而第二转录匣的模板链在另一/互补链上)。再者，从第一转录匣的启动子转录引导rna聚合酶移动进一步背离(而非朝着)第二转录匣的启动子，反之亦然。
145.在某些实施方案中，两个非重叠转录匣彼此分隔0、1、5、10、20、50、100、150或200个核苷酸。
146.在某些实施方案中，两个非重叠转录匣彼此分隔约20至30个核苷酸。
147.在某些实施方案中，隔离序列(例如，ctcf结合位点)插入在不同转录匣的启动子之间，从而最小化相邻启动子的相互作用且/或增强各转录单元的靶标特异性表达。在脊椎动物中，隔离序列的增强子阻断活性与ccctc结合因子(ctcf)的结合位点相关。ctcf是普遍地表达的核蛋白/进化保守的转录因子，具有11锌指dna结合结构域。它识别长且多样的核苷酸序列，且牵涉到基因调节的多个方面中。
148.本发明的病毒载体的一个优势是受试载体的设计和构造以及其递送至靶标细胞或组织，为定制和/或优化以符合特定生物学需求提供更多机会。这部分地由于以下事实，多种所编码的goi的表达可以在多种水平独立且分开地控制。
149.举例而言，载体中的各goi可携带其自己的转录控制元件，诸如分开的启动子和增强子。在某些实施方案中，不同转录匣的启动子和/或增强子可以是相同的。在某些其他方案中，不同转录匣的启动子和/或增强子可以是不同的。在后一种情况下，取决于载体所处的组织和细胞，可以仅活化一个启动子/增强子，或可以将不同的启动子/增强子活化到不同的程度。具体而言，在某些实施方案中，一个启动子/增强子可以是组织特异性的，而另一启动子/增强子可以是普遍存在的。在某些实施方案中，一个启动子/增强子可以是诱导型的，而另一启动子/增强子可以是组成型的或不同的诱导型的。
150.组织特异性启动子和诱导型启动子的示例是本领域中已知的，包括下文所述的任一者。
151.在某些实施方案中，对于aav病毒载体，基于天然或经工程改造的病毒衣壳蛋白选择aav趋性，以便优先靶向所选择的/期望的组织或器官中的任何goi表达。
152.在某些实施方案中，可以将本发明的病毒载体局部地(与全身地相反)递送至选定器官、组织或细胞类型，以最大程度地将有限数量的病毒载体递送至所期望的靶标位点且/或避免不期望的副效应。
153.受试载体的另一不同优势是，可以考虑任何给定生物系统中任何生物反馈环的存在。举例而言，在某些情况下，调节一种靶标基因的活性可以抵消给定系统中现有生物反馈环的平衡，并且可以导致不期望的副效应或为进一步干预提供另一个机会。第二goi(其水平可能比先前可实现的高得多)在独立的表达控制下的存在，提供独特的机会以抗衡不期望的副效应，或提供加和性(如果不是协同性的)治疗选项。
154.部分地由于本文中讨论的众多优势，本发明的多组分载体可用于多种应用中。
155.如下文更详细地描述，在某些遗传疾患中，内源性基因变为缺陷性的或失能的，使得该基因的正常功能缺失并且需要被替换或补充。同时，缺陷性/失能基因编码突变型蛋白质，该蛋白质自身是缺陷性的或失能的或者以其他方式促使引起病理状态。在此类情况下，简单地补充缺失的野生型基因正常功能可能是不充分的。反之，去除或至少减少突变型蛋白质的有害效应可能也是必要的。
156.因此，在某些实施方案中，第一目的基因可编码在疾病或病症中具有缺陷的野生型(wt)或正常基因(例如，经密码子优化的野生型或正常基因)，并且其中所述第二目的基因可以编码靶向所述在疾病或病症中具有缺陷的基因的(突变型)产物的拮抗剂。
157.举例而言，在某些实施方案中，第一goi是野生型或正常serpina1编码序列(例如，经密码子优化的serpina1编码序列)，并且其中第二goi编码靶向serpina1的突变型等位基因的rnai剂(例如，sirna、shrna或mirna)。
158.在某些实施方案中，serpina1的突变型等位基因是pittsburg等位基因、b(alhambra)等位基因、m(malton)等位基因、s等位基因、m(heerlen)等位基因、m(mineral springs)等位基因、m(procida)等位基因、m(nichinan)等位基因、i等位基因、p(lowell)等位基因、无效(granite falls)等位基因、无效(bellingham)等位基因、无效(mattawa)等位基因、无效(procida)等位基因、无效(hong kong 1)等位基因、无效(bolton)等位基因、pittsburgh等位基因、v(munich)等位基因、z(augsburg)等位基因、w(bethesda)等位基因、无效(devon)等位基因、无效(ludwigshafen)等位基因、z(wrexham)等位基因、无效(hong kong 2)等位基因、无效(riedenburg)等位基因、kalsheker-poller等位基因、p(duarte)等位基因、无效(west)等位基因、s(iiyama)等位基因或z(bristol)等位基因。
159.在某些实施方案中，第一goi为具有不同于突变体serpina1的5
’‑
utr和/或3
’‑
utr的serpina1的经密码子优化的野生型或正常编码序列；并且其中rnai剂靶向与serpina1的突变型而非经密码子优化的野生型等位基因特异性地相关的5
’‑
utr靶标序列、3
’‑
utr靶标序列和/或编码序列。
160.在某些实施方案中，第一控制元件和/或第二控制元件包含肝特异性启动子和/或增强子(诸如apoe增强子)或α1-抗肌营养不良蛋白启动子。
161.在某些实施方案中，第一goi为重复序列扩张疾患(red)中缺陷基因的野生型或正常编码序列(例如，red中缺陷基因的经密码子优化的野生型或正常编码序列)，并且其中第二goi编码rnai剂(例如，sirna、shrna或mirna)，该rnai剂靶向red中的缺陷基因的突变型等位基因。
162.在某些实施方案中，red为具有(超过52个)cag三核苷酸重复序列的突变型atxn3基因所致的脊髓小脑共济失调3(sca3)，并且其中rnai剂靶向与atxn3的突变型而非野生型等位基因特异性地相关的snp。
163.在某些实施方案中，red为具有(超过52个)cag三核苷酸重复序列的突变型atxn3基因所致的脊髓小脑共济失调3(sca3)，其中第一goi为具有不同于突变体atxn3的5
’‑
utr和/或3
’‑
utr的atxn3的经密码子优化的野生型或正常编码序列；并且其中rnai剂靶向与atxn3的突变型而非经密码子优化的野生型等位基因特异性地相关的5
’‑
utr靶标序列、3
’‑
utr靶标序列和/或编码序列。
164.在某些实施方案中，第一控制元件和/或第二控制元件包含神经元特异性启动子和/或增强子(诸如突触蛋白启动子)或天然atxn3启动子。
165.在某些实施方案中，red分别为sca1、2、3、6、7、8、10、12或17，并且其中rnai剂靶向分别与ataxin-1、ataxin-2、ataxin-3、cacna1、ataxin-7、sca8、sca10、ppp2r2b或tbp的突变型而非野生型等位基因特异性地相关的snp。
166.在某些实施方案中，red分别为sca1、2、3、6、7、8、10、12或17，其中第一goi分别为分别具有不同于突变型ataxin-1、ataxin-2、ataxin-3、cacna1、ataxin-7、sca8、sca10、ppp2r2b或tbp的5
’‑
utr和/或3
’‑
utr的ataxin-1、ataxin-2、ataxin-3、cacna1、ataxin-7、sca8、sca10、ppp2r2b或tbp的经密码子优化的野生型或正常编码序列；并且其中rnai剂靶向分别与ataxin-1、ataxin-2、ataxin-3、cacna1、ataxin-7、sca8、sca10、ppp2r2b或tbp的突变型而非经密码子优化的野生型等位基因特异性地相关的5
’‑
utr靶标序列、3
’‑
utr靶标序列和/或编码序列。
167.在某些实施方案中，red为具有(超过50个)ctg三核苷酸重复序列的突变型dmpk基因所致的肌强直性营养不良1型(dm1)，并且其中rnai剂靶向与dmpk的突变型而非野生型等位基因特异性地相关的snp。
168.在某些实施方案中，red为具有(超过50个)ctg三核苷酸重复序列的突变型dmpk基因所致的肌强直性营养不良1型((dm1)，其中第一goi为具有不同于突变体dmpk的5
’‑
utr和/或1
’‑
utr的dmpk的经密码子优化的野生型或正常编码序列；并且其中rnai剂靶向与dmpk的突变型而非经密码子优化的野生型等位基因特异性地相关的5
’‑
utr靶标序列、3
’‑
utr靶标序列和/或编码序列。
169.在某些实施方案中，第一控制元件和/或第二控制元件包含肌肉特异性启动子和/或增强子(诸如ck8启动子)或天然dmpk启动子或普遍存在的启动子。
170.在某些实施方案中，第一goi编码野生型或密码子优化的mbnl1基因，并且其中第二goi编码rnai剂(例如，sirna、shrna或mirna)，rnai剂靶向在肌强直性营养不良1型(dm1)中由于具有超过50个ctg三核苷酸重复序列而具有缺陷的dmpk基因的突变型等位基因。
171.在某些实施方案中，red为具有(超过55个)cgg三核苷酸重复序列的突变型fmr1基因所致的脆性x染色体综合征(fxs)，并且其中rnai剂靶向与fmr1的突变型而非野生型等位基因特异性地相关的snp。
172.在某些实施方案中，red为具有(超过55个)cgg三核苷酸重复序列的突变型fmr1基因所致的脆性x染色体综合征(fxs)，其中第一goi为具有不同于突变体fmr1的5
’‑
utr和/或3
’‑
utr的fmr1的经密码子优化的野生型或正常编码序列；并且其中rnai剂靶向与fmr1的突变型而非经密码子优化的野生型等位基因特异性地相关的5
’‑
utr靶标序列、3
’‑
utr靶标序列和/或编码序列。
173.在某些实施方案中，第一控制元件和/或第二控制元件包含神经元特异性启动子和/或增强子(诸如突触蛋白启动子)或天然fmr1启动子。
174.在某些实施方案中，第一goi在多特异性启动子(诸如ck8启动子)的控制下编码功能性肌营养不良蛋白质。
175.也如下文中更详细地描述，在某些遗传性疾患中，有效治疗可能通过使用仅一种载体同步地靶向两种基因而得到增强，尤其是当第一目的基因和第二目的基因编码以不同
通路发挥作用的产物时，而仍有该疾病或病症的该治疗的两种益处。
176.在又一实施方案中，本发明的载体可用来将crispr/cas系统递送至靶标细胞以进行基因编辑，或任何基于crispr/cas的用途。具体而言，goi中的一者可编码cas酶，诸如cas9、cas12a、cas13a-13d。同时，另一goi可编码一种或多种匹配所编码的cas酶的向导rna，诸如对于cas9为sgrna，或对于cas12a为crrna。
177.上述可使用受试载体完成的所选实施方案中的各者已经进一步描述并在下文中例示。
178.举例而言，本发明的特定多组分载体包含：a)第一goi包含异源内含子序列，其增强下游蛋白质编码序列、该蛋白质编码序列下游的3
’‑
utr编码区域、和聚腺苷酰化(polya)信号序列(例如，aataaa)的表达；b)第二goi包含一个或多个编码序列，其独立地编码：蛋白质、多肽、rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列、基因编辑酶的向导序列、微rna(mirna)和/或mirna抑制剂；并且c)任选地，一个或多个额外编码序列插入到第一goi的医院内含子序列中和/或3
’‑
utr编码区域中，其中所述一个或多个额外编码序列独立地编码：蛋白质、多肽、rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列、基因编辑酶的向导序列、微rna(mirna)和/或mirna抑制剂。
179.在某些实施方案中，第一goi和/或第二goi的表达基本上不受彼此的存在的影响。
180.在相关实施方案中，本发明的另一特定多组分载体可用作病毒载体以同步地递送/表达基于酶的基因编辑系统的两个或更多个该组分，诸如可在靶标基因组位点/靶标基因组序列处创建dna双链断裂(dsb)的靶标序列特异性(经工程改造的)核酸酶，和匹配(野生型或所期望的)靶标基因组序列的供体或模板序列。该系统使得可能使用靶标细胞内的内源性同源重组(hr)过程来编辑掉缺陷性/不期望的靶标基因组序列，并将其替换为野生型或在所期望靶标基因组位置处的其他所期望序列。
181.在某些实施方案中，重组病毒载体是重组aav(腺相关病毒)载体。
182.举例而言，靶标序列特异性(经工程改造的)核酸酶可包括巨核酸酶(诸如laglidadg家族中的那些)机器变体，其识别独特的靶标基因组序列；锌指核酸酶(zfn)；转录活化因子氧效应子核酸酶(talen)；和crispr/cas基因编辑酶。
183.在crispr/cas的情况下，举例而言，受试载体可同步地递送(不是供体序列的或除递送供体序列之外还递送)具有所期望序列的一个或多个基因编辑向导序列以靶向一个或多个靶标序列，和可以由病毒载体编码为goi的相容编辑酶。该病毒递送系统可用来将细胞、组织或生物体中不期望的序列取代为所期望的序列。rtspr/cas酶系统的一个示例是crispr/cas9或crispr/cas12a(以前称为cpf1)，并且需要一个或多个向导序列(例如，单向导rna或sgrna，对于cas9；或crrna，对于cas12a)以引导至靶标细胞。cas9包括野生型cas9及其功能性变体。几种cas9变体是与小肌营养不良蛋白基因大约相同的尺寸，并且可以是由本发明的病毒载体编码的功能性goi。cas12a甚至比cas9小，并且也可以编码为goi。在某些实施方案中，由病毒构造体编码的cas基因可以具有或不具有utr和/或内含子元件。
184.在某些实施方案中，goi是crispr/cas9，并且向导序列是sgrna(单向导rna)；或其中goi是crispr/cas12a，且向导序列是crrna。
185.在某些实施方案中，重组病毒载体是重组aav(腺相关病毒)载体。
186.在某些实施方案中，重组病毒载体是慢病毒载体。
187.因此，在相关方面，本发明提供重组慢病毒载体以用于间接体内或体内基因疗法。在间接体内基因疗法中，使用受试病毒载体转染所培养的宿主细胞以表达目标基因，然后移植到身体内。体内基因疗法是将遗传物质插入所靶向的组织内的直接方法，并且转导发生在患者自己的细胞内。
188.在某些实施方案中，本发明的慢病毒载体包含：a)编码功能性基因和蛋白质(goi)的多核苷酸，其对于治疗需要治疗的患者/受试者/个体的肌营养不良症而言有效，其中所述多核苷酸包含3
’‑
utr编码区域，并且紧邻增强由该多核苷酸编码的功能性蛋白质的表达的异源性内含子序列的3’，其中相对应的野生型功能性蛋白在肌营养不良症中是缺陷性的，或其中功能性蛋白质(尽管不是野生型的)对于治疗肌营养不良症而言仍是有效的；b)第一控制元件(肌肉特异性控制元件)，可操作地连接至该多核苷酸并驱动其表达；和c)一个或多个编码序列(1)插入第一控制元件与最接近的病毒末端序列(例如，aav的itr)之间并且可操作地连接至第二控制元件，和(2)任选地进一步插入在表达匣的内含子序列中或3
’‑
utr编码区域中或其他处；其中所述一个或多个编码序列独立地编码：rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列、微rna(mirna)和/或mirna抑制剂。
189.如本文所用且取决于语境，术语“融合”可具有不同的意义，包括融合蛋白、融合rna转录物，其中可存在超过一个所编码的序列(诸如goi的编码序列和一种或多种rnai剂的编码序列等，其插入到/包埋在goi的3-utr区域中或内含子区域中)；以及融合构造体，其中病毒载体含有goi的编码序列和一种或多种rnai剂等。
190.再一次，如本文所用且取决于语境，术语“多组分”(例如，如“多组分构造体”或“多组分(病毒)载体”等)是指以下事实，病毒构造体/载体中存在至少两个转录匣或单元，使得一者(在第一控制元件或第一启动子控制下)负责第一转录匣/单元中一个(第一)goi(蛋白质、多肽、rna等)的转录，而另一(第二)goi(在第二控制元件或第二启动子控制下)负责除第一goi之外的另一所编码序列诸如ncrna或另一蛋白质编码序列的转录，其中两个转录匣在很大程度上分开地且彼此独立地操作。第二转录匣/单元可定位在第一goi的第一转录单元的启动子与最接近的病毒载体末端序列(诸如最接近的aav载体的itr)之间。在某些实施方案中，第二转录单元在与第一转录单元的转录方向相比的相反方向上且彼此背离地转录。
191.在某些实施方案中，第二控制元件是启动子或启动子的一部分，其转录该一个或多个编码序列。举例而言，第二控制元件是pol ii启动子，其转录插入在第一控制元件与最接近的病毒末端序列之间的该一个或多个编码序列，在与由第一控制元件启动的转录相反的方向上转录。在其他实施方案中，第二控制元件是pol iii启动子。在其他实施方案中，第一和第二控制元件两者是相同的启动子。在其他实施方案中，第一和第二控制元件是不同的启动子。
192.在某些实施方案中，一种goi的表达由于另一goi的存在而上调或下调(例如，当与不具有另一goi的其他相同对照构造体)。
193.在某些实施方案中，一种goi的表达基本上不受另一goi的存在的影响。
194.举例而言，在某些实施方案中，隔离序列(例如，ctcf结合位点)插入在不同转录匣的启动子之间，从而最小化相邻启动子的相互作用且/或增强各转录单元的靶标特异性表达。
195.肌营养不良症的治疗
196.在某些实施方案中，本发明的多组分载体可用来治疗肌营养不良症，其中一种goi编码肌营养不良症中的缺陷性基因。
197.如本文所用，“肌营养不良症(md)”包括一组以由于异常基因或基因突变所致的进行性肌无力和肌肉质量缺失为特征的一组疾病，该异常基因或基因突变干扰形成健康肌肉所需的野生型蛋白质产生。md包括duchenne肌营养不良症(dmd)；becker肌营养不良症(bmd)；先天性肌营养不良症(cmd)，特别是具有鉴定的基因突变，诸如下文所述的，包括fukuyama先天性肌营养不良症(fcmd)和merosin缺陷型先天性肌营养不良症1a型(mdc1a)；dysferlin肌病(lgmd2b和miyoshi肌病)；肌强直性营养不良；肢带型肌营养不良症(lgmd)诸如lgmd2c；和面肩胛肱型肌营养不良症(fshd)。
198.如本文所用，“患者”、“受试者”和“个体”可互换使用以包括在受试方法中待治疗、诊断和/或自其获得生物样品的哺乳动物(例如，人)。典型地，个体受到或可能将受到dmd和本文所述其他相关疾病的影响，并且在一些实施方案中，dmd和相关心肌病和肌营养不良性心肌病的影响。在特定实施方案中，个体是人类儿童或青少年(例如，不超过18岁、15岁、12岁、10岁、8岁、5岁、3岁、1岁、6个月、3个月、1个月等)。在特定实施方案中，儿童或青少年是男性。在另一特定实施方案中，个体是成年人类(例如，≥18岁)，诸如成年男性。
199.全长肌营养不良蛋白基因是2.6mb且编码79个外显子。11.5-kb编码序列翻译为427-kd蛋白质。肌营养不良蛋白可分为四个主要结构域，包括n-端结构域、棒结构域、富半胱氨酸结构域和c端结构域。棒结构域可进一步分为24个血影蛋白样重复序列和四个铰链。
200.功能性“肌营养不良蛋白微小基因”或“肌营养不良蛋白基因”具有小于24个血影蛋白样重复序列和一个或多个与基因疗法递送载体(腺病毒和慢病毒)相容的铰链区域，并且已经在us7001761、us6869777、us8501920、us7892824、us10479821和us10166272(全部通过引用并入本文)中描述。
201.在一种实施方案中，肌营养不良症是dmd或bmd，并且在重组aav(raav)载体中：a)多核苷酸是肌营养不良蛋白微小基因，其编码功能性5-血影蛋白样重复序列肌营养不良蛋白质(诸如microd5；如us10,479,821中所述的肌营养不良蛋白质，其通过引用并入本文)；和/或b)肌肉特异性控制元件是ck启动子，其可操作地链接至肌营养不良蛋白微小基因并驱动肌营养不良蛋白微小基因的表达。
202.如本文所用，“microd5”、“由sgt-001编码的微小肌营养不良蛋白微小基因”或短“sgt-001”，是指特定经工程改造的5次重复小肌营养不良蛋白质，其含有，从n端到c端，人全长肌营养不良蛋白质的n端肌动蛋白结合结构域，铰链区域1(h1)，血影蛋白样重复序列r1、r16、r17、r23和r24，铰链区域4(h4)，和c端肌营养不良蛋白聚糖结合结构域。这一5次重复小肌营养不良蛋白的蛋白质序列和相关肌营养不良蛋白微小基因在us10,479,821&wo2016/115543(通过引用并入本文)中描述。
203.在某些实施方案中，编码功能性肌营养不良蛋白质的肌营养不良蛋白微小基因不同于microd5，举例而言，在特定血影蛋白样重复序列和/或血影蛋白样重复序列数量方面(例如，包含最少4、5或6个人肌营养不良蛋白的血影蛋白样重复序列，优选包括1、2或3个最n端和/或c端重复序列)。人肌营养不良蛋白的一个或多个血影蛋白样重复序列也可以由来自utrophin或血影蛋白样重复序列取代。在某些实施方案中，肌营养不良蛋白微小基因小
于aav病毒载体的5kb封装限值，优选不超过4.9kb、4.8kb、4.6kb、4.5kb、4.4kb、4.3kb、4.2kb、4.1kb或4kb。
204.在某些实施方案中，肌营养不良蛋白微小基因编码小肌营养不良蛋白质，该蛋白质与microd5具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，更典型至少90％、91％、92％、93％或94％，且甚至更典型至少95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，其中该蛋白质保留小肌营养不良蛋白活性。
205.在某些实施方案中，小肌营养不良蛋白由核苷酸序列编码，该核苷酸序列与编码microd小肌营养不良蛋白的多核苷酸序列具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％或89％，更典型至少90％、91％、92％、93％或94％，且甚至更典型至少95％、96％、97％、98％或99％序列一致性。该多核苷酸任选地针对在哺乳动物诸如人体内表达进行密码子优化。
206.在某些实施方案中，该核苷酸序列在严格条件下与编码microd5小肌营养不良蛋白的核酸或其组分杂交，并且编码功能性小肌营养不良蛋白质。
207.术语“严格”用来指本领域中一般理解为严格的条件。杂交严格性主要由温度、离子强度和变性剂诸如甲酰胺的浓度决定。杂交和洗涤的严格条件的示例是0.015m氯化钠、0.0015m柠檬酸钠，在65至68℃；或0.015m氯化钠、0.0015m柠檬酸钠和50％甲酰胺，在42℃。见sambrook等人，molecular cloning：a laboratory manual，2nd ed.，cold spring harbor laboratory，(cold spring harbor，n.y.1989)。
208.也可使用更严格的条件(诸如更高温度、更低离子强度、更高甲酰胺或其他变性剂)，但将会影响杂交率。在其中涉及去氧寡核苷酸杂交的情况下，额外的示例性严格杂交条件包括在6
×
ssc 0.05％焦磷酸钠中在37℃(对于14碱基寡核苷酸)、48℃(对于17碱基寡核苷酸)、55℃(对于20碱基寡核苷酸)和60℃(对于23碱基寡核苷酸)。
209.其他剂可包括在杂交和洗涤缓冲液中，用于减少非特异性和/或背景杂交的目的。示例是0.1％牛血清白蛋白、0.1％聚乙烯基吡咯烷酮、0.1％焦磷酸钠、0.1％十二烷基硫酸钠、nadods04、(sds)、聚蔗糖、denhardt溶液、声震处理的鲑鱼精子dna(或其他非互补dna)和硫酸葡聚糖，但也可使用其他合适的剂。这些添加剂的浓度和类似可变，而实质上不影响杂交条件的严格性。杂交实验往往在ph 6.8至7.4完成，但在典型的例子强度条件下，杂交率几乎不依赖于ph。见anderson等人，nucleic acid hybridisation；a practical approach，ch.4，trl press limited(oxford，england)。本领域技术人员可调节杂交条件，以便适应这些变量并允许不同序列相关性的dna形成杂交物。
210.额外肌营养不良蛋白微小基因序列可见于，举例而言，us2017/0368198(通过引用并入本文)，和wo2017/181015(通过引用并入本文)的seq id no：7。
211.在某些实施方案中，编码任何肌营养不良蛋白微小基因诸如microd5的核苷酸序列可以是任何基于所公开的蛋白质序列的核苷酸序列。优选地，核苷酸序列针对在人体内表达进行了密码子优化。
212.小肌营养不良蛋白质向在肌肉收缩期间向肌膜提供稳定性，例如，小肌营养不良蛋白在肌肉收缩期间用作冲击吸收物。
213.在某些实施方案中，该一个或多个编码序列中的至少一者靶向dmd中的二级级联基因中的一个。
214.举例而言，在某些实施方案中，该一个或多个编码序列中的至少一个编码微rna诸如mir-1、mir-133a、mir-29特别是mir29c、mir-30c和/或mir-206。举例而言，mir-29c直接减少结缔组织的三种主要组分(例如，胶原1、胶原3和纤连蛋白)以减少纤维化。任选地，在某些实施方案中，所述微rna，诸如mir-1、mir-133a、mir-29特别是mir29c、mir-30c和/或mir-206，具有经修饰的侧翼主链，该侧翼主链增强对经设计为用于靶标序列的向导链的处理。在某些实施方案中，经修饰的侧翼主链序列可来自或基于mir-30、mir-101、mir-155或mir-451。
215.如本文所用，“纤维化”是指当损伤时，组织(包括骨骼肌、心肌、肝脏、肺、肾和前列腺)中的细胞外基质(ecm)组分的过量或不受调节的沉积和异常修复过程。所沉积的ecm组分包括纤连蛋白和胶原，例如，胶原1、胶原2或胶原3。
216.如本文所用，“mir-29”是指mir-29a、mir-29b或mir-29c中的一者。在某些实施方案中，mir-29是指mir-29c。
217.尽管不欲受缚于任何特定理论，但据信，所表达的mir29(诸如mir-29a、mir-29b或mir-29c)结合至胶原和纤连蛋白基因的3’utr以下调这些靶标基因的表达。
218.在另一实施方案中，该一个或多个编码序列中的至少一者编码rnai序列，诸如肌脂蛋白的shrna(shsln)。该一个或多个编码序列可编码相同或不同的针对肌脂蛋白的shrna(shsln)。在某些实施方案中，shrna使肌脂蛋白mrna和/或肌脂蛋白蛋白质表达减少至少约50％。
219.如本文所用“asarcolipin(sln)”、“sarcolipin蛋白”、“sln蛋白”、“sarcolipin多肽”和“sln多肽”可互换使用，以包括sln基因的表达产物，诸如天然人sln蛋白，其具有氨基酸序列(mgintrelflnftivlitvilmwllvrsygy)(seq id no：5)和登录号np_003054.1。该术语优选是指人sln。该术语也可用来指变体sln蛋白，其与seq id no：5相异1个氨基酸、2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸、5个氨基酸、6个氨基酸、7个氨基酸或8个氨基酸，任选地该差异在残基2至5、10、14、17、20和30内，优选在2至5和30内。该术语也可用来指变体sln蛋白，其在残基6至29处与seq id no：5相同，或在残基6至29中相差最多1、2或3个保守取代，诸如l
→
i和/或i
→
v。任选地，变体sln具有g30q取代。该变体展示出天然sln蛋白的功能活性，其可以包括：sln的磷酸化、去磷酸化、亚硝基化和/或泛素化；或结合至erca和/或减少通过例如来自atp水解的ca
2+
运输的去偶联而由serca运送到肌内质网的钙输入率，或其在能量代谢和重量增益调节中的角色。
220.如本文所用，“sln基因”、“sln多核苷酸”和“sln核酸”可互换使用，以包括天然的人sln编码核酸序列，例如，天然的人sln基因(refseq登录号：nm_003063.2)，一种具有sln cdna可自其转录的序列的核酸；和/或前述者的等位基因变异体和同源物，诸如编码本文所述的任何变体sln的多核苷酸。该术语涵盖双链dna、单链dna和rna。
221.在另一实施方案中，受试载体的一个或多个额外编码序列可以靶向与一种肌营养不良蛋白基因缺失所致的继发性级联事件相关的任何其他基因，诸如炎症基因、nf-κb信号传导通路的活化剂(例如，tnf-α、il-1、il-1β、il-6、nf-κb(rank)的受体活化剂和toll样受体(tlr)的活化剂)、nf-κb、由nf-κb诱导的下游炎性细胞因子、组蛋白脱乙酰酶(例如，hdac2)、tgf-β、结缔组织生长因子(ctgf)、ollagens、弹性蛋白、细胞外基质的结构性组分、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)、肌肉生长抑制素、磷酸二酯酶-5(ped-5)或ace、vegf诱骗受
体1型(vegfr-1或flt-1)和造血前列腺素d合成酶(hpgds)。该一个或多个额外编码序列可以是rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列和/或拮抗上述靶标基因的功能的微rna。
222.受试重组载体的设计可同步地靶向一种或多种(例如，1、2、3、4、5种)此类继发性级联基因或通路，诸如sln、微rna等。
223.举例而言，在某些实施方案中，受试载体的编码序列中的一者可以是rnai序列(sirna、shrna、mirna)或旨在下调sln表达的反义序列，因此，至少部分地通过增加通过serca对钙的摄取来缓解肌营养不良肌肉中细胞内ca
2+
的异常升高的继发性缺陷。
224.在某些替代性实施方案中，代替靶向继发性级联剂量中的一者或除此之外，该一个或多个编码序列中的至少一个可以是外显子跳跃反义序列，其诱导缺陷型内源性肌营养不良蛋白的外显子的跳跃，诸如肌营养不良蛋白的外显子45至55中的任一者或肌营养不良蛋白的外显子44、45、51和/或53，因此进一步增强肌营养不良蛋白微小基因(例如，microd5)的治疗效应。
225.如本文所用，“外显子跳跃”或“外显子切换”反义寡核苷酸(aon)是一种rnase-h抗性类型的反义序列，并发挥作用以调节前体mrna剪接并校正该前体mrna中的剪接缺陷。在反义序列介导的外显子跳跃疗法中，aon往往用来阻断特异性剪接信号并诱导某些外显子的特异性跳跃。这导致对突变的转录阅读框的校正，使得它能被翻译为内部缺失的但部分功能化的蛋白质。
226.在特定方面，本发明提供一种重组aav(raav)载体，其编码肌营养不良蛋白微小基因编码序列(诸如microd5/sgt-001)和一种或多种额外序列两者，该一种或多种额外序列用于靶向牵涉入肌营养不良蛋白功能缺失导致的继发性级联中的基因。此类构造体包含肌营养不良蛋白微小基因和一个或多个额外编码序列两者，该额外编码序列插入到肌营养不良蛋白微小基因的第一控制元件或启动子与最接近的病毒末端序列(例如，aav中的itr)之间并且可操作地连接至第二控制元件，并且(2)任选地进一步插入到肌营养不良蛋白微小基因的5’端异源性内含子内或肌营养不良蛋白微小基因的3
’‑
utr区域内。
227.具体而言，在一方面，本发明提供一种重组aav(raav)载体，其包含：a)肌营养不良蛋白微小基因，其编码功能性微小肌营养不良蛋白，其中所述肌营养不良蛋白微小基因包含3
’‑
utr编码区域且紧邻异源内含子序列的3’，该异源内含子序列增强肌营养不良蛋白微小基因的表达；b)肌肉特异性控制元件，其可操作地链接至该多核苷酸并驱动肌营养不良蛋白微小基因的表达；和c)一个或多个(例如，1、2、3、4或5个)编码序列，其插入在肌肉特异性控制元件与最接近的aav itr序列之间并且可操作地链接至第二控制元件，和(2)任选地进一步插入在内含子序列中或3
’‑
utr编码区域中；其中所述一个或多个编码序列独立地编码：rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列、微rna(mirna)和/或mirna抑制剂。
228.举例而言，raav载体可包含表达mir-29(例如，mir-29c)的多核苷酸序列，诸如核苷酸序列，其包含mir-29c靶标向导链(accgatttcaaatggtgctaga，wo2017/181015的seq id no：3，通过引用并入本文)、mir-29c向导链(tctagcaccatttgaaatcggtta，wo2017/181015的seq id no：4，通过引用并入本文)以及天然mir-30主链和茎环(gtgaagccacagatg，wo2017/181015的seq id no：5，通过引用并入本文)。
229.包含mir-30主链中的mir-29c cdna的示例性多核苷酸序列在wo2017/181015(通过引用并入本文)的seq id no：2和图1中详述。
230.在某些实施方案中，微rna-29编码序列编码mir-29c。
231.在某些实施方案中，mir-29c任选地具有经修饰的侧翼主链序列，该侧翼主链序列增强经设计用于靶标序列的mir-29c的向导链的加工性。举例而言，经修饰的侧翼主链序列可来自或基于mir-30(mir-30e)、mir-101、mir-155或mir-451的侧翼主链序列。
232.在某些实施方案中，微rna是mir-1、mir-133a、mir-30c和/或mir-206。
233.在某些实施方案中，与微rna在宿主细胞中的内源性表达相比，所述微rna在所述宿主细胞中的表达上调至少约1.5至15倍(例如，约2至10倍、约1.4至2.8倍、约2至5倍、约5至10倍，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、70、14或约80倍)。
234.在某些实施方案中，本发明的载体编码反义序列或rnai序列(sirna、shrna、mirna等)，该序列拮抗肌脂蛋白的功能(sln)。在某些实施方案中，本发明的载体编码shrna，该shrna拮抗肌脂蛋白的功能(shsln)。示例性shsln序列包括2019年12月11日提交的pct/us2019/065718的图9和10中公开的(例如，图9中加下划线的序列和图10中的高亮序列)。额外的示例性shsln序列包括wo2018/136880(通过引用并入本文)中公开的seq id no：7至11。
235.本发明部分地涉及基因疗法载体，例如，慢病毒或aav，其表达一个或多个编码序列，诸如肌营养不良蛋白微小基因，以及使用该载体治疗疾病的方法，例如，将该载体递送至肌肉以减少和/或预防继发性剂量症状而不恢复肌营养不良蛋白功能。
236.在一种实施方案中，肌营养不良症是先天性肌营养不良症(cmd)，其与已知的基因缺陷有关，诸如fukutin基因或fkrp(fukutin相关蛋白)基因。因此，在某些实施方案中，先天性肌营养不良症是fukuyama先天性肌营养不良症(fcmd)。
237.先天性肌营养不良症(cmd)是一组肌营养不良症，其在出生时或接近出生时变得明显。在某些实施方案中，本发明的方法和raav可用来治疗cmd，尤其是cmd伴以下基因中已知基因缺陷：诸如肌联蛋白(cmd伴心肌病)；sepn1(cmd伴肌间线蛋白包涵体，或cmd伴(早期)脊柱强直)；整联蛋白-α7(cmd伴整联蛋白α7突变)；整联蛋白-α9(cmd伴关节超松弛(hyperlaxity))；网蛋白(cmd伴家族性连接性大疱性表皮松解症)；fukutin(fukuyama cmd或mddga4)；fukutin相关蛋白质(fkrp)(cmd伴肌肉肥大或mdc1c)；large(mdc1d)；dok7(cmd伴肌无力综合征)；核纤层蛋白a/c(cmd伴脊柱强直和核纤层蛋白a/c畸变)；sbp2(cmd板脊柱强直和含硒蛋白质缺乏)；胆碱激酶β(cmd伴线粒体结构异常)；层粘连蛋白α2(merosin缺陷型cmd或mdc1a)；pomgnt1(santavuori肌眼脑病)；colga1、col6a2或col6a3(ullrich cmd)；b3gnt1(walker-warburg综合征：mddga型)；pomt1(walker-warburg综合征：mddga1型)；pomt2(walker-warburg综合征：mddga2型)；ispd(mddga3、mddga4、mddgb5、mddga6和mddga7)；gtdc2(mddga8)；tmem5(mddga10)；b3galnt2(mddga11)或sgk196(mddga12)。
238.因此，本发明的慢病毒或raav载体可包含编码在cmd中有缺陷的任何野生型基因(诸如上文所列的那些)的多核苷酸，或其功能性等效物，以治疗有此需要的个体的cmd。该一个或多个额外编码序列可编码消除或修饰突变型cmd基因的rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列或微rna(mirna)，或由于野生型基因功能缺失所致的继发性级联基因。
239.举例而言，fukuyama先天性肌营养不良症(fcmd)是由于突变型fktn基因，并且该一个或多个额外编码序列可编码外显子跳跃反义寡核苷酸以恢复患者中缺陷性fktn基因中的正确外显子10剪接。
240.在另一示例中，先天性肌营养不良症是由65个外显子lama2基因中的突变引发的merosin缺陷型先天性肌营养不良症1a型(mdc1a)。
241.因此，本发明的慢病毒或raav载体可包含编码功能性lama2蛋白的多核苷酸。该一个或多个额外编码序列可编码外显子跳跃反义序列，导致恢复的c端g结构域(外显子45至64)的表达，尤其是lama2的g4和g5的表达，这些外显子对于介导与α-肌营养不良蛋白聚糖的相互反应而言最为重要。举例而言，可以跳过突变型lama2基因的外显子4以治疗mdc1a。
242.在一种实施方案中，肌营养不良症是肌强直性营养不良(dm)，诸如dm1或dm2。
243.因此，本发明的慢病毒或raav载体可包含多核苷酸，该多核苷酸编码在dm1中有缺陷的功能性肌营养不良肌强直蛋白激酶(dmpk)蛋白质，或功能性cchc型锌指、dm2中的核酸结合蛋白质基因(cnbp)蛋白质。该一个或多个额外编码序列可编码rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列或微rna(mirna)，其可用来靶向dmpk基因或cnbp基因中的突变型转录物的经扩张的重复序列，以用于rnase介导的降解。该一个或多个额外编码序列也可编码外显子跳跃反义序列，该反义序列在dm1患者的clcn1基因中导致外显子7a的跳跃。
244.在一种实施方案中，肌营养不良症是由肌营养不良蛋白(dysf)基因中的突变引起的dysferlin肌病，包括肢带型肌营养不良症2b型(lgmd2b)和miyoshi肌病(mm)。
245.因此，本发明的慢病毒或raav载体可包含编码在lgmd2b或mm中有缺陷的功能性dysf蛋白的多核苷酸。该一个或多个额外编码序列也可编码外显子跳跃反义序列，该反义序列在dysferlin肌病患者的缺陷性dysf基因中导致外显子32的跳跃。
246.在一种实施方案中，肌营养不良症是肢带型肌营养不良症(lgmd)，其由四种肌聚糖蛋白基因的任一者中的突变引起，该基因是α(lgmd2d)、β(lgmd2e)、γ(lgmd2c)和δ(lgmd2f)基因，特别是由sgcg基因编码的γ肌聚糖蛋白(lgmd2c)。
247.因此，本发明的慢病毒或raav载体可包含编码在ldmd中有缺陷的功能性肌聚糖蛋白质的多核苷酸，诸如在lgmd2c中有缺陷的sgcg基因。该一个或多个额外编码序列也可编码外显子跳跃反义序列，该反义序列在缺陷性lgmd2c基因(诸如具有δ-521t sgcg突变的基因)中导致外显子4至7的跳跃。
248.在一种实施方案中，肌营养不良症是由dux4基因中的突变引起的面肩胛肱型肌营养不良症(fshd)。
249.因此，该一个或多个额外编码序列可编码rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列或减少dux4或下游靶标诸如pitv1的表达的微rna(mirna)。
250.在某些实施方案中，该一个或多个额外编码序列编码外显子跳跃反义序列，该反义序列靶向dux4的3
’‑
utr以减少其表达。这是因为dux4编码序列完全定位在基因第一外显子中，且靶向mrna 3’utr中的元件的外显子跳跃可打断许可的聚腺苷酰化或干扰内含子1或2剪接，因此破坏功能性dux4 mrna。
251.面肩胛肱型肌营养不良症(fshd)是遗传性常染色体显性疾患，以许可的肌肉变性为临床特征。它是排在uchenne肌营养不良症(dmd)和肌强直性营养不良后面的第三大肌营养不良症。fshd的遗传学特征是4号染色体上一组大卫星重复序列的致病性收缩，导致双同源框蛋白4(dux4)基因的异常表达。
252.有两种类型的fshd：fshd1和fshd2。fshd1是最常见的形式，发生在全部fshd患者的超过95％中。遗传分析将fshd 1与染色体4上的大卫星d4z4重复序列的遗传收缩联系起
来。另一方面，fshd2具有正常数量的d4z4重复序列但反而包括在染色体18p(染色质修饰因子)上的smchd1基因中的杂合突变。患有fshd1和fshd2的患者共享类似的临床表现。
253.目前的药物疗法无法治愈fshd，而是聚焦在fshd症状的惯例上，包括肌肉生长抑制素抑制剂罗特西普(luspatercept)和抗炎生物制剂(atyr1940)。抗炎生物制剂的基础是抑制fshd患者的肌肉病理学中常见的炎症，以便减缓表型进展。因此，受试一个或多个编码序列可编码针对肌肉生长抑制素或抗炎通路基因的rnai试剂或反义rna剂。同时，rnai试剂诸如小干扰rna(sirna)和小发夹rna(shrna)、或微rna(mirna)、或反义寡核苷酸，可以用来敲低肌病性dux4基因及其下游分子(包括配对样同源异型结构域转录因子1(pitx1))的表达。事实上，体外研究已经证明，通过将反义寡核苷酸给药至fshd患者的原代骨骼肌细胞，以及通过使用aav载体将针对dux4的mirna递送至dux4小鼠模型，成功地抑制了dux4 mrna表达。此外，已经在体内全身性地证明了对pitx1表达的成功抑制。
254.在某些实施方案中，该一个或多个额外编码序列可编码相同的序列(例如，sirna、shrna、mirna或反义序列)，并因此该额外编码序列的拷贝数可经调节或微调以用于投药考量。
255.在某些实施方案中，该一个或多个额外编码序列可编码不同的序列，该靶向不同的靶标或靶向相同的靶标。举例而言，在某些实施方案中，一个额外编码序列是针对靶标的翻译序列，而另一额外编码序列是针对相同靶标的shrna。替代性地，两个额外编码序列都是shrna，但它们靶向相同靶标的不同区域。
256.在某些实施方案中，功能性蛋白质诸如肌营养不良蛋白微小基因产物的表达不受该一个或多个编码序列插入的负面影响。
257.在1990年代早期，已经发现，很多无内含子的转基因尽管在体外组织培养细胞中被完美地表达，但无法在体内(例如，在荷有该转基因的转基因小鼠中)表达相同的转基因)，而将某些异源内含子序列插入到启动子与转基因的(无内含子)编码序列之间极大地增强了体内转基因表达。
258.特定而言，palmiter等人(proc.natl.acad.sci.u.s.a.88：478-482，1991，通过引用并入本文)证明，几种插入在金属硫蛋白启动子与生长激素转基因之间的异源内含子改善了转基因表达，并且为位改善转基因表达提供了添加某些异源内含子作为一般策略。这些包括选自以下的异源内含子：rgh的天然第一内含子、大鼠胰岛素ii(rins-ii)基因的内含子a、hβg基因的内含子b和sv40小t内含子。
259.类似的发现由choi等人(mol.cell.biol.11(6)：3070-3074，1991，通过引用并入本文)证实，他们报导了在携带链接至氯霉素乙酰转移酶(cat)的细菌基因的人组蛋白h4启动子的转基因小鼠中，转录单元中230-bp异源杂交物内含子的存在极大增强了cat活性(与插入序列精确缺失的类似转基因相比，5至300倍)。这一杂交物内含子由腺病毒剪接供体和免疫球蛋白g剪接受体组成，在广泛的动物中组织范围内刺激表达。由于杂交物内含子刺激组织培养物中组织血纤维蛋白溶酶原活化因子和因子viii的表达，choi得出结论，在小鼠中所见的增强不可能是特定于cat的，相反，通常适用于转基因小鼠中任何cdna的表达。
260.因此，在某些实施方案中，受试慢病毒或raav载体中的异源内含子选自由以下所组成的组：rgh的天然第一内含子、大鼠胰岛素ii(rins-ii)基因的内含子a、hβg基因的内含子b、sv40小t内含子和choi的杂交物内含子。
261.在某些实施方案中，异源内含子序列是seq id no：1：
262.gtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag。
263.在某些实施方案中，除了插入多组分匣内(例如，在goi启动子与最接近的aav itr之间)以外，该一个或多个额外编码序列全部插入异源性内含子序列(seq id no：1)内，或全部插入3
’‑
utr区域内，或插入两个区域内。举例而言，微rna-29c编码序列可以插入如seq id no：2
264.gtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcttgtcgagacagatctcttacacaggctgaccgatttctcctggtgttcagagtctgtttttgtctagcaccatttgaaatcggttatgatgtagggggaagaagactcttgcgtttctgataggcacctattggtcttactgacatccactttgcctttctctccacag中的内含子编码序列内。
265.seq id no：2中的mir-29c序列是
266.atctcttacacaggctgaccgatttctcctggtgttcagagtctgtttttgtctagcaccatttgaaatcggttatgatgtaggggga(seq id no：3)。
267.在某些实施方案中，慢病毒或raav进一步包含位于该多核苷酸(诸如肌营养不良蛋白微小基因)和额外编码序列侧翼的两个慢病毒或aav ltr/itr序列。
268.在某些实施方案中，由本发明的慢病毒或raav载体的goi可以可操作地链接至肌肉特异性控制元件。举例而言，肌肉特异性控制元件可以是人骨骼肌动蛋白基因元件、心肌动蛋白基因元件、肌细胞特异性增强子结合因子mef、肌肉肌酐激酶(mck)、tmck(截短的mck)、肌球蛋白重链(mhc)、c5-12(合成启动子)、鼠肌酐激酶增强子元件、骨骼快速收缩肌钙蛋白c基因元件、慢速收缩心肌肌钙蛋白c基因元件、慢速收缩肌钙蛋白i基因元件、缺氧诱导核因子、类固醇诱导元件或糖皮质激素应答元件(gre)。
269.在某些实施方案中，肌肉特异性控制元件在异源内含子序列的5’，在肌营养不良蛋白微小基因的5’，包含3
’‑
utr区域(包括翻译终止密码子(诸如tag))、polya腺苷酰化信号(诸如aataaa)和mrna裂解位点(诸如ca)。
270.在某些实施方案中，肌肉特异性控制元件包含wo2017/181015的seq id no：10或seq id no：11的核苷酸序列。
271.wo2017/181015的seq id no：10：
[0272][0273]
wo2017/181015的seq id no：11：
[0274]
[0275]
在某些实施方案中，本发明的raav载体可以可操作地链接至肌肉特异性控制元件，该控制元件包含mck增强子核苷酸序列(见wo2017/181015的seq id no：10，通过引用并入本文)和/或mck启动子序列(见wo2017/181015的seq id no：11，通过引用并入本文)。
[0276]
在某些实施方案中，raav进一步包含启动子，该启动子可操作地链接至肌营养不良蛋白微小基因和额外编码序列并且能够驱动该肌营养不良蛋白微小基因和额外编码序列的转录。
[0277]
示例性启动子是cmv启动子。
[0278]
在某些实施方案中，raav进一步包含用于将poly-a序列插入所转录的mrna中的polya腺苷酰化序列。
[0279]
在某些实施方案中，本发明的raav载体是血清型aav1、aav2、aav4、aav5、aav6、aav7、aavrh.74、aav8、aav9、aav10、aav11、aav12或aav13的载体。
[0280]
本发明的另一方面提供一种生产病毒载体例如本发明的raav载体的方法，包括培养已经用任何病毒载体例如本发明的raav载体转染的细胞，以及从经转染的细胞的上清液回收该病毒例如raav颗粒。
[0281]
本发明的另一方面提供一种病毒颗粒，其包含本发明的任何病毒载体，例如，重组aav载体。
[0282]
本发明的另一方面提供生产功能性蛋白质以及一个或多个额外编码序列的方法，该功能性蛋白质在肌营养不良症中是缺陷性的或对于治疗肌营养不良症而言有效(诸如小肌营养不良蛋白质)，该方法包括用在宿主细胞内共表达本发明的功能性蛋白质(例如，小肌营养不良蛋白)和编码序列产物(例如，rnai、sirna、shrna、mirna、反义序列、微rna或其抑制剂)的受试重组aav载体感染该宿主细胞。
[0283]
本发明的另一方面提供治疗有此需要的个体的肌营养不良症(诸如dmd或bmd)或抗肌萎缩蛋白病的方法，该方法包括向个体给药治疗有效量的病毒载体例如本发明的重组aav载体或本发明的任一组合物。
[0284]
本发明考虑向被诊断为患有抗肌萎缩蛋白病或肌营养不良症优选在个体中观察到一种或多种继发性级联症状诸如纤维化之前，或在个体的肌肉力已经减少之前，或在个体的肌肉质量已经减少之前。
[0285]
本发明也考虑向罹患抗肌萎缩蛋白病或肌营养不良症(诸如dmd或bmd或任何其他md，特别是缺陷性肌营养不良蛋白相关肌营养不良症)的患者给药本发明的任何病毒载体，例如aav载体，该患者已经发展出一种或多种继发性级联症状诸如纤维化，以便阻止或减缓这些个体的进一步疾病进展。
[0286]
本发明的另一方面提供重组病毒载体，例如，aav载体，其包含多核苷酸序列和该一个或多个额外编码序列，该多核苷酸编码在肌营养不良症中有缺陷或对于治疗肌营养不良症有效的功能性蛋白质(例如，小肌营养不良蛋白)。
[0287]
在某些实施方案中，本发明提供包含核苷酸序列的raav，该核苷酸序列与编码功能性小肌营养不良蛋白质诸如microd5的核苷酸序列具有至少85％、90％、95％、97％或99％一致性。
[0288]
病毒载体(例如，raav载体)可包含肌肉特异性启动子诸如mck启动子、有效增强肌营养不良蛋白基因的表达的异源内含子序列、小肌营养不良蛋白基因的编码序列、polya腺
苷酰化信号序列、位于这些序列侧翼的itr/ltr重复序列。病毒载体(例如，raav载体)可以任选地进一步包含氨苄西林耐药性或质粒主链序列或pbr322起源或复制，以用于在细菌宿主中扩增。
[0289]
在一方面，本发明的重组aav载体是aav1、aav2、aav4、aav5、aav6、aav7、aavrh.74、aav8、aav9、aav10、aav 11、aav 12或aav 13。
[0290]
在本发明的任何方法中，raav载体可通过肌肉内注射或静脉内注射来给药。
[0291]
在本发明的任何方法中，病毒载体(例如，raav载体)或组合物全身性给药。举例而言，病毒载体(例如，raav载体)或组合物通过注射、输液或移植肠胃外给药。
[0292]
本发明的另一方面提供一种组合物，诸如药物组合物，其包含本发明的任何病毒载体，例如，raav载体。
[0293]
在某些实施方案中，组合物是药物组合物，其可以进一步包含治疗上相容的载体或赋形剂。
[0294]
在另一实施方案中，本发明提供组合物，该组合物包含任何病毒载体，例如，共表达受试功能性蛋白质(例如，小肌营养不良蛋白)和所述一个或多个编码序列的raav载体，用于治疗罹患抗肌萎缩蛋白病或肌营养不良症诸如dmd或becker肌营养不良症的患者。
[0295]
本发明的组合物(例如，药物组合物)可经配制用于肌肉注射或静脉注射。本发明的组合物也可经配制用于全身性给药，诸如通过注射、输液或植入进行肠胃外给药。此外，任何组合物经配制为用于向罹患抗肌萎缩蛋白病或肌营养不良症诸如dmd、becker肌营养不良症或任何其他肌营养不良蛋白相关肌营养不良症的患者给药。
[0296]
在又一实施方案中，本发明提供任何病毒载体，例如，本发明的共表达受试功能性蛋白质(例如，小肌营养不良蛋白)和所述一个或多个编码序列的raav载体用于制备药物的用途，该药物用于治疗罹患抗肌萎缩蛋白病或肌营养不良症诸如dmd、becker肌营养不良症或任何其他肌营养不良蛋白相关肌营养不良症的患者。
[0297]
本发明考虑任何病毒载体(例如，本发明的aav载体)用于制备药物的用途，该药物用于在个体中观察到一种或多种继发性级联症状诸如纤维化之前向被诊断为患有dmd的患者给药。
[0298]
本发明也考虑任何病毒载体，例如，本发明的aav载体用于制备药物的用途，该药物用于向罹患肌营养不良症的个体给药任何病毒载体，例如，本发明的raav，该患者已经发展出继发性级联症状诸如纤维化，以便阻止或延迟这些个体中的疾病进展。
[0299]
本发明也提供病毒载体(例如，本发明的共表达受试工鞥那些蛋白质诸如小肌营养不良蛋白和所述一个或多个额外编码序列的raav载体)用于制备药物的用途，该药物用于治疗肌营养不良症诸如dmd/bmd。
[0300]
在本发明的任何用途中，该药物可经配制用于肌肉注射。此外，任何药物可以经制备用于向罹患肌营养不良症诸如dmd或任何其他肌营养不良蛋白相关肌营养不良症的患者给药。
[0301]
本发明也提供基因疗法载体，例如，在肌营养不良症患者中共表达受试功能性蛋白质(例如，小肌营养不良蛋白)和所述一个或多个编码序列的raav载体。
[0302]
应理解，本文所述的本发明的任一实施方案可以与本发明的任何一种或多种额外实施方案组合，包括仅在实施例中描述或仅在上文或下文一个章节中描述或本发明的一个
方面中描述的那些实施方案。
[0303]
aav
[0304]
如本文所用，术语“aav”是腺相关病毒的标准缩写。腺相关病毒是一种单链dna细小病毒，其仅在通过共感染辅助病毒而提供某些功能的细胞内生长。存在至少十三种已经表征的aav血清型。aav的一般信息和总数可见于，举例而言，carter，1989，handbook of parvoviruses，vol.1，pp.169-228和berns，1990，virology，pp.1743-1764，raven press，(new york)(通过引用并入本文)。但是，完全预期这些相同的原则将适用于额外aav血清型，因为众所周知，多种血清型在结构上和功能上都是非常密切相关的，甚至在基因水平上也是。见，举例而言，blacklowe，1988，parvoviruses and human disease，j.r.pattison，ed.，pp.165-174；和rose，comprehensive virology 3：1-61(1974)。举例而言，全部aav血清型明显表现出非常相似的由同源rep基因介导的复制特性；并且全部承载三种相关衣壳蛋白诸如在aav2中表达的那些。相关性的程度进一步通过异源双倍体分析表明，该分析表明了沿着基因组长度的血清型之间的广泛交叉杂交以及类似的自退火节段在对应于“反向末端重复序列”(itr)处的存在。类似的感染性模式也表明，该复制在类似的调节性控制下在各血清型中发挥作用。
[0305]
如本文所用，“aav载体”是指包含一种或多种目的多核苷酸(或转基因)的载体，该多核苷酸侧翼具有aav末端重复序列(itr)。当此类aav载体存在于已经用编码并表达rep和cap基因产物的载体转染的细胞内时，可被复制并封装到感染性病毒颗粒内。
[0306]“aav病毒体”或“aav病毒颗粒”或“aav载体颗粒”是指由至少一种aav衣壳蛋白和经衣壳化的多核苷酸aav载体构成的病毒颗粒。如果颗粒包含异源多核苷酸(即，除野生型aav基因组以外的多核苷酸，诸如待被递送至哺乳动物细胞的转基因)，它典型称为“aav载体颗粒”或简称为“aav载体”。因此，aav载体颗粒的生产必定包括aav载体的生产，因为该载体包含在aav载体颗粒内。
[0307]
本发明的重组aav基因组包含本发明的核酸分子和位于核酸分子侧翼的一个或个种aav itr。
[0308]
存在多种血清型的aav，并且aav载体的基因组的核苷酸序列是已知的。举例而言，aav血清型2(aav2)基因组的核苷酸序列在srivastava等人，j virol 45：555-564(1983)中呈现，并由ruffing等人，j gen virol 75：3385-3392(1994)校正。两者均通过引用并入本文。作为其他示例，aav-1的完整基因组提供在enbank登录号nc_002077(通过引用并入本文)中；aav-3的完整基因组提供在genbank登录号nc_001829(通过引用并入本文)中；aav-4的完整基因组提供在genbank登录号nc_001829(通过引用并入本文)中；aav-5基因组提供在genbank登录号af085716(通过引用并入本文)中；aav-6的完整基因组提供在genbank登录号nc_001862(通过引用并入本文)中；aav-7和aav-8基因组的至少一部分分别提供在genbank登录号ax753246(通过引用并入本文)中；和ax753249(通过引用并入本文)中(关于aav-8，也见美国专利号7,282,199和7,790,449)；aav-9基因组提供在gao等人，j.virol 78：6381-6388(2004)中，该文献通过引用并入本文；aav-10基因组提供在mol.ther.13(1)：67-76(2006)中，该文献通过引用并入本文；并且aav-11基因组提供在virology 330(2)：375-383(2004)中，该文献通过引用并入本文。aavrh74血清型在rodino-klapac等人，j.trans.med.5：45(2007)中描述，该文献通过引用并入本文。
[0309]
raav基因组中的aav dna可以来自重组病毒针对其进行衍生的任何aav血清型，包括但不限于，aav血清型aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aav-8、aav-9、aav-10、aav-11、aav-12、aav-13、rh10、rh74和aav-2i8。
[0310]
假型raav的生产在，举例而言，wo 01/83692中公开，该专利通过引用以其整体并入本文。
[0311]
也考虑其他类型的raav变体，举例而言，具有衣壳突变的raav。见，举例而言，marsic等人，molecular therapy，22(11)：1900-1909(2014)。多种aav血清型的基因组的核苷酸序列是本领域中已知的。
[0312]
在某些实施方案中，为了促进骨骼肌特异性表达，可以使用aav1、aav6、aav8或aavrh.74。
[0313]
在某些实施方案中，受试aav载体的aav血清型是aav9。
[0314]
引导病毒dna复制(rep)、衣壳化/封装和宿主染色体整合的顺式作用序列包含在itr内。三种aav启动子(根据其相对映射定位，名为p5、p19和p40)驱动两种编码rep和cap基因的aav内部开放阅读框的表达。
[0315]
两种rep启动子(p5和p19)与差异剪接的单一aav内含子(例如，在aav2核苷酸2107和2227处)偶合，导致从rep基因产生四种rep蛋白(rep 78、rep 68、rep 52和rep 40)。rep蛋白具备多种酶促特性，这些特性最终负责复制病毒基因组。
[0316]
cap基因从p40启动子表达，并且其编码三种衣壳蛋白vp1、vp2和vp3。替代性剪接和非共识转录翻译起始位点负责三种相关衣壳蛋白的生产。
[0317]
单一共识聚腺苷酰化位点定位在aav基因组的映射位置95处。aav的生命周期和遗传性在muzyczka，current topics in microbiology and immunology 158：97-129(1992)中综述。
[0318]
本发明的dna质粒包含本发明的raav基因组。将dna质粒转燃至允许用aav辅助病毒(例如，腺病毒、el缺失的腺病毒或疱疹病毒)转染的细胞，以将raav基因组组装到感染性病毒颗粒内。生产raav颗粒的技术是本领域中的标准技术，在该技术中，aav基因组被封装，并且将rep和cap基因以及辅助病毒功能提供至细胞。raav的生产需要以下组分存在于单一细胞(本文中称为封装细胞)内：raav基因组、与raav基因组分开(即，不在该基因组内)的aav rep和cap基因、和辅助病毒功能。aav rep和cap基因可以来自重组病毒可自其衍生的任何aav血清型，并且可以来自不同于raav基因组itr的aav血清型，包括但不限于，aav血清型aav-1、aav-2、aav-3、aav-4、aav-5、aav-6、aav-7、aavrh.74、aav-8、aav-9、aav-10、aav-11、aav-12和aav-13。
[0319]
一种生成封装细胞的方法是创建稳定地表达用于aav颗粒生产的全部必要组分的细胞系。举例而言，将包含缺乏aav rep和cap基因的raav基因组的质粒(或多个质粒)、与raav基因组分开的aav rep和cap基因、和可选择的标志物诸如新霉素耐药性基因整合到细胞的基因组内。已经通过诸如gc拖尾(samulski等人，proc.natl.acad.sci.u.s.a.79：2077-2081，1982)、添加含有限制性核酸内切酶裂解位点的合成连接子(laughlin等人，gene 23：65-73，1983或通过平端连接(senapathy&carter，j.biol.chem.259：4661-4666，1984)的过程，将aav基因组引入细菌质粒中。然后，用辅助病毒诸如腺病毒感染该封装细胞系。这一方法的优势是细胞是可选择的，并且适用于raav的大规模生产。
ther.10(6)：1031-1039，1999；schenpp and clark，methods mol.med.69：427-443，2002；美国专利号6,566,118和wo 98/09657中公开的方法。
[0326]
aav病毒载体的趋性可部分地基于预期靶标器官或组织进行选择，goi待在该器官或组合中表达。下表给出所选aav血清型的趋性的汇总，指示用于给定器官转导的最佳血清型。
[0327]
组织最优血清型cnsaav1、aav2、aav4、aav5、aav8、aav9心aav1、aav8、aav9肾aav2肝aav7、aav8、aav9肺aav4、aav5、aav6、aav9胰腺aav8感光细胞aav2、aav5、aav8rpe(视网膜色素上皮细胞)aav1、aav2、aav4、aav5、aav8骨骼肌aav1、aav6、aav7、aav8、aav9
[0328]
举例而言，aavpo1从猪分离，并发现其在直接肌肉注射到小鼠体内后有效地转导肌肉。通常，它通常可用于肌肉基因疗法，因为它在进行外周输液后稳健地转导全部主要肌肉组织(包括心脏和膈膜)。
[0329]
在某些实施方案中，通过将衣壳与来自不同aav血清型的基因组混合进行假定型，从而进一步细分aav的趋性。举例而言，aav2/5指示含有封装在来自血清型5的衣壳中的血清型2基因组的病毒。假型病毒可具有改善的转导效率，以及改变趋性。
[0330]
举例而言，aav2/5靶向不被aav2/2有效转导的神经元，并且更广泛地分布在脑中，指示改善的转导效率。这些杂交病毒中有很多已经得到充分表征，并且相对于标准病毒，它们对于体内应用而言是优选的。
[0331]
在某些实施方案中，通过使用衍生自多种不同血清型的重组生成的杂交衣壳进一步细分趋性。一种常见示例是aav-dj，其含有衍生自八种血清型的杂家衣壳。aav-dj展示比任何野生型需清洗更高的体外转导效率，并且它跨宽范围的体内细胞类型展示非常高的感染性。突变型aav-dj8展示aav-dj的特性，但具有增强的脑摄取。
[0332]
另一种经工程改造的aav-php.b家族的aav在整个cns中有效地递送基因，并且可用于需要cns递送的基因疗法中。
[0333]
最近，davidsson等人(pnas 116(52)：27053-27062，2019)描述了所谓brave(条码理性(barcoded rational)aav载体进化)方法，该方法能进使用一轮体内筛选而对经工程改造的衣壳结构进行大规模的有效选择。使用brave方法和隐markov模型聚类，作者呈现了25种具有细分特性的合成衣壳变体，诸如在特定子类型的神经元中的逆行轴突运输，如针对内齿动物和人多巴胺能神经元所示。
[0334]
另一方面，herrmann等人(acs synth.biol.8(1)：194-206，2019)描述了用于繁育具有改善的性质(dna家族改组)的新颖载体的特别强力的技术，其通过同源驱动的dna重组生成嵌合衣壳。
[0335]
在某些实施方案中，受试病毒载体的衣壳经表面工程改造以用于所选的和细胞类
型特异性基因递送。举例而言，buchholz等人(trends biotechnol.33(12)：777-790，2015)公开，基于慢病毒或腺相关病毒的基因载体可以经工程改造，使得它们使用选择的细胞表面标志物而非其天然受体进行细胞进入。与表面标志物的结合通过展示在载体颗粒表面上的靶向配体介导，该靶向配体可以是肽、单链抗体或设计的锚蛋白重复序列蛋白质。示例包括将基因递送至专门化的内皮细胞或淋巴细胞、肿瘤细胞或神经系统的特定细胞的载体。
[0336]
额外编码序列
[0337]
对于肌营养不良症治疗，本发明的重组载体除了包含肌营养不良蛋白质的编码序列诸如microd5之外，也包含一个或多个额外编码序列用于靶向一种或多种与肌营养不良蛋白缺失相关或由其所致的继发性并发症/继发性级联中的基因。
[0338]
在某些实施方案中，本发明的载体编码外显子跳跃反义序列，该反义序列可校正特异性肌营养不良蛋白基因突变。
[0339]
举例而言，该外显子跳跃反义序列在个体中缺陷性肌营养不良蛋白基因的前体信使rna(pre-mrna)剪接期间诱导特定外显子的跳跃，导致阅读框的恢复和内部截短的蛋白质的部分产生，类似于becker肌营养不良症中所见的肌营养不良蛋白质表达。
[0340]
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列跳过或剪除框中断外显子(突变的外显子)和/或相邻外显子以恢复正确的转录阅读框，并且产生短但功能性的肌营养不良蛋白质。
[0341]
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列诱导单一外显子跳跃。在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列诱导多个外显子跳跃，诸如外显子45至55中的一个或过个或全部的跳跃(即，天然外显子44直接接合至外显子56)。举例而言，11种反义序列可一起使用以跳跃包括外显子45至55在内的全部11个外显子。10种aon的混合液用于mdx52小鼠模型(外显子52缺失)中以诱导外显子45至51和53至55的跳跃，因此恢复功能性肌营养不良蛋白表达。
[0342]
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列诱导肌营养不良蛋白pre-mrna中外显子51的跳跃。理论上，外显子51的成功跳跃可治疗全部dmd患者中的约14％。
[0343]
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列靶向肌营养不良蛋白因的外显子51中的外显子剪接增强子(ese)位点，因此引起外显子51的跳跃并产生截短但部分功能性的肌营养不良蛋白质。
[0344]
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列诱导外显子44、45和53中一者或多者的跳跃。
[0345]
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列靶向与casimersen(外显子45)、ns-065/ncnp-01或戈洛迪森(golodirsen)(外显子53)或者依特立生(eteplirsen)或exondys 51(外显子51)相同的靶标序列。
[0346]
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列靶向fukuyama先天性肌营养不良症(fcmd)患者的突变fcmd/fktn基因中的隐蔽剪接供体和/或受体位点，以恢复正确的外显子10剪接。
[0347]
fukuyama先天性肌营养不良症(fcmd)是一种罕见的常染色体隐性疾病，并且是日本儿童肌营养不良症的第二大流行形式。负责fcmd(fcmd，也称为fktn)的基因编码蛋白质fukutin，该蛋白质是一种推定的羰基转移酶并糖基化α-肌营养不良蛋白聚糖(一种肌营养不良蛋白相关糖蛋白复合物(dagc)的成员)。fcmd的发病机制由sine-vntr-alu(sva)逆转
录转座子到fukutin基因的3
’‑
未翻译区域(utr)中的祖先插入引起，导致外显子10中的新隐蔽剪接供体和sva插入位点中的新隐蔽剪接受体的活化，从而诱导该隐蔽供体与受体位点之间的异常mrna剪接。结果是fcmd的外显子10的提前截短。在fcmd患者细胞和模型小鼠体内，已经证明，三种靶向隐蔽剪接调节区域的vivo-pmo的混合液阻止致病性sva外显子入陷并恢复正常fktn蛋白质水平和α-肌营养不良蛋白聚糖的o-糖基化。
[0348]
在某些实施方案中，反义序列靶向病理扩张的3或4个核苷酸的重复序列，诸如dm1患者中dmpk基因的3
’‑
utr区域中的ctc三元组重复序列，或dm2患者中cnbp基因的第一内含子中的cctg重复序列。
[0349]
肌强直性营养不良(dm)是成年人中最常见的肌营养不良症形式。它是常染色体显性疾病，可以归类为肌强直性营养不良1型(dm1)和肌强直性营养不良2型(dm2)。dm1由肌营养不良蛋白肌强直蛋白激酶(dmpk)基因的3
’‑
utr区域中ctc三元组的病理扩张引起，而dm2由cchc型锌指、核酸结合蛋白质基因(cnbp)的第一内含子中cctg道的病理扩张引起。由转录的rna聚集体和扩张的重复序列引起的rna功能增益毒性导致异常剪接(剪接病)。毒性rna的聚集体打断替代性剪接调节因子诸如盲肌样(mbnl)蛋白质和cug结合蛋白1(cugbp1)的功能，通过隔绝并消耗核rna病灶内的前者并且增加后者在dm1中的表达和磷酸化。mbnl和cugbp1蛋白质功能的改变导致靶标基因的pre-mrna中的异常剪接，即胰岛素受体(insr)、肌肉氯化物通道(clcn1)、桥接整合因子-1(bin1)和肌营养不良蛋白(dmd)，它们分别与胰岛素抗性、肌强直、肌无力和营养不良肌过程(全部为肌强直性营养不良的典型症状)有关。
[0350]
因此，dmpk基因中扩张的cug重复序列隔绝mbnl1蛋白质并引起几种下游基因中的异常剪接，从而引起dm1表型。同时，反义寡核苷酸可用来靶向突变型转录物的此类扩张的重复序列以进行rnase介导的降解，从而恢复下游基因的剪接。2
’‑
o-甲氧基乙基间隙体(gapmer)aon已经用于通过突变型rna转录物中rnase h靶向扩张的cug的降解，导致突变型mrna转录物的减少和恢复的蛋白质表达。
[0351]
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列导致dm1患者中clcn1基因中外显子7a的跳跃。
[0352]
dm1也可以通过校正氯化物通道1(clcn1)的异常剪接而得以治疗，因为这一基因引起dm1患者中的肌强直。通过超声暴露将pmo(磷酸二酰胺吗啉代寡聚物)和鼓泡脂质体一起使用以增强pmo到dm1小鼠(hsalr)肌肉中的递送，在体内实现clcn1的外显子7a的跳跃，导致缓解的肌强直和骨骼肌中的clcn1蛋白质表达。
[0353]
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列靶向dysf基因的外显子17、32、35、36和/或42，优选外显子32和/或36，以在具有dysf突变的dysferlin肌病(例如，lgmd2b或mm)患者中的外显子跳跃。
[0354]
dysferlin肌病是涵盖性术语，其涵盖由dysferlin(dysf)基因中的突变引起的肌营养不良症。dysferlin基因编码修复肌膜损伤所需的肌纤维膜蛋白。它由钙依赖性c2脂质结合结构域和病毒跨膜结构域组成。存在两种常见的dysferlin肌病：肢带型肌营养不良症2b型(lgmd2b)和miyoshi肌病(mm)，两者具有临床上不同的表型和常染色体隐性遗传。lgmd2b的特征是近端肌无力，而mm的特征是远端肌无力。lgmd2b和mm的初始临床表型是不同的。然而，随着疾病进展，两种病症的临床表现重叠，变得更相似，且患者既经历近端肌无
力也经历远端肢肌无力。dysferlin缺陷性肌肉纤维在膜修复中具有缺陷。
[0355]
dysferlin肌病可使用反义寡核苷酸通过外显子跳跃得以治疗，部分地由于在仅具有10％野生型水平表达的截短突变型dysf蛋白的患者中观察到的轻度表型。具体而言，在复合杂合女性患者的lgmd2b情况下，患者携带一个无效等位基因和在内含子31中另一等位基因上的dysf分支点突变。外显子32的天然框内跳跃导致以野生型水平的约10％表达的截短dysferlin蛋白，这不足以部分地补偿该无效突变。患者表现出轻度症状，并且在70岁的年龄可走动。最近已经证明，患者细胞中的外显子32跳跃导致准dysferlin表达水平，这拯救被治疗细胞中的膜修复，该细胞承受低渗压力和肌纤维膜定位的体外激光损伤。
[0356]
在某些实施方案中，对于具有lama2突变的merosin缺陷型先天性肌营养不良症1a型(mdc1a)患者中的外显子跳跃，外显子跳跃反义序列靶向lama2基因的外显子4。在某些实施方案中，外显子跳跃导致c端g结构域(外显子45至64)，特别是g4和g5的表达恢复，这些外显子对于介导与α-肌营养不良蛋白的相互作用而言最为重要。
[0357]
merosin缺陷型先天性肌营养不良症1a型(mdc1a)由65个外显子lama2基因中的突变引起，该突变导致层粘连蛋白-α2链表达中的完全或部分缺陷。层粘连蛋白-α2链与beta1(β1)和gamma1(γ1)链一起，是称为层粘连蛋白-211或分区蛋白(merosin)的异源三聚体层粘连蛋白同种型的部分，其尤其在骨骼肌的基底膜(包括肌神经接合点和schwann细胞(外周神经))中表达。层粘连蛋白-α2与肌营养不良蛋白-肌营养不良蛋白聚糖复合物(dgc)相互作用，介导骨骼肌和外周神经中的细胞信号传导、粘附和组织完整性。尽管并非总是如此，但层粘连蛋白-α2的部分表达引起更轻度的mdc1a，而层粘连蛋白-α2的完全不存在引起重度mdc1a。c端g结构域(外显子45至64)，特别是g4和g5，对于介导与α-肌营养不良蛋白的相互作用而言最为重要。消除g4和g5的突变与甚至在部分截短的层粘连蛋白-α2表达存在下的严重的表型相关。
[0358]
已经探索了外显子跳跃用于治疗mdc1a，其中pmo介导的外显子4跳跃校正看开放阅读框，导致截短的层粘连蛋白-α2链的恢复且略微延长患者寿命。
[0359]
在某些实施方案中，外显子跳跃反义序列诱导lgmd2c/sgcg基因中最常见的δ-521t突变的外显子4至7的跳跃和阅读框的恢复，以生成内部截短的sgcg蛋白，用于治疗具有δ-521t sgcg突变的肢带型肌营养不良症2c型患者。在某些实施方案中，外显子跳跃导致内部截短的sgcg蛋白的表达恢复，保留野生型sgcg蛋白的细胞内、跨膜和极羧基端。
[0360]
肌营养不良蛋白相关蛋白(dap)是成人肌肉纤维的肌细胞膜中的复合物，其跨膜组分将细胞骨架连接至细胞外基质，并且对于保持肌细胞膜的完整性至关重要。dgc内的肌聚糖蛋白亚复合物由4个单程跨膜亚基构成：α-肌聚糖蛋白、β-肌聚糖蛋白、γ-肌聚糖蛋白和δ-肌聚糖蛋白。α-肌聚糖蛋白至δ-肌聚糖蛋白，即α(lgmd2d)、β(lgmd2e)、γ(lgmd2c)和δ(lgmd2f)，主要地(β)或排他性地(α、γ和δ)在横纹肌中表达。四种肌聚糖蛋白基因中任一者中的突变可导致其他肌聚糖蛋白质的继发性缺陷，可能是由于肌聚糖蛋白复合物的去稳定化，导致肌聚糖病，即，常染色体隐性肢带型肌营养不良症(lgmd)。α至δ基因中的致病突变引起肌细胞膜中肌营养不良蛋白相关蛋白质(dap)复合物内的中断。
[0361]
在人体内，γ肌聚糖蛋白(lgmd2c)是由sgcg基因编码的蛋白质。严重的儿童常染色体隐性肌营养不良症(scarmd)是一种进行性肌肉萎缩疾患，其与γ-肌聚糖蛋白基因的微卫星标志物隔离。γ-肌聚糖蛋白基因中的突变首次在北非的马格里布国家中描述，该国
中γ-肌聚糖病的发病率高于一般值。lgmd 2c患者中最常见的突变之一，δ-521t，是来自γ-肌聚糖蛋白基因的外显子6中核苷酸碱基521至525处一串5个胸腺嘧啶的胸腺嘧啶缺失。这一突变使得阅读框位移并导致γ-肌聚糖蛋白质的不存在以及β和δ-肌聚糖蛋白的继发性减少，因此引起严重的表型。突变既在马格里布人群中发生也在其他国家人群中发生。
[0362]
已经探索了外显子跳跃用于治疗具有δ-521t突变的lgmd2c，其中所得内部截短的sgcg蛋白质提供功能性和病理性益处以校正果蝇(drosophila)模型中、异源性细胞表达研究中和缺乏γ-肌聚糖蛋白的转基因小鼠中γ-肌聚糖蛋白的缺失。也生成人肌肉疾病的细胞模型以显示，可在编码突变型人γ-肌聚糖蛋白的rna中诱导多个外显子跳跃。
[0363]
在某些实施方案中，本发明的载体编码反义序列或rnai序列(sirna、shrna、mirna等)，该序列拮抗肌脂蛋白的功能(sln)。在某些实施方案中，本发明的载体编码shrna，该shrna拮抗肌脂蛋白的功能(shsln)。
[0364]
示例性shsln序列包括2019年12月11日提交的pct/us2019/065718的图9和10中公开的(例如，图9中加下划线的序列和图10中的高亮序列)。额外的示例性shsln序列包括wo2018/136880(通过引用并入本文)中公开的seq id no：7至11。
[0365]
进一步的shsln序列可以基于任何本领域公认的方法使用下文所示的人sln mrna续设计。
[0366][0367]
在某些实施方案中，本发明的载体编码反义序列或rnai序列(sirna、shrna、mirna等)，该序列拮抗一种或多种靶标基因诸如抗炎基因的功能。
[0368]
在动物模型和患有dmd的患者两者中，iκb激酶/核因子-κb(nf-κb)信号传导在免疫细胞和再生性肌纤维中持续升高。此外，dmd肌肉中的nf-κb的活化因子诸如tnf-α和il-1和il-6上调。因此，抑制nf-κb信号传导级联组分，诸如nf-κb本身、其上游活化因子和下游炎性细胞因子，与替换/修复缺陷性肌营养不良蛋白基因协同作用对于治疗受试患者而言是有益的。
[0369]
因此，在某些实施方案中，本发明的载体编码反义序列或rnai序列(sirna、shrna、mirna等)，该序列拮抗一种或多种炎性基因，诸如nf-κb、tnf-α、il-1(il-1β)、il-6、nf-κb(rank)的受体活化因子和toll样受体(tlr)。
[0370]
在某些实施方案中，本发明的载体编码反义序列或rnai序列(sirna、shrna、mirna等)，该序列拮抗组蛋白脱乙酰酶诸如hdac2的功能。在dmd中，肌纤维膜处肌营养不良蛋白的不存在使得一氧化氮合成酶(nnos)离开原位并下调，改变hdac2的s-亚硝基化及其染色质缔合。在对于no通路是缺陷性的肌营养不良缺陷型mdx小鼠中，hdac2的活性导致其得以特异性增加。相比之下，mdx动物中nnos表达的拯救减轻了肌营养不良表型。此外，脱乙酰酶抑制剂向营养不良肌纤维提供了强烈的形态功能益处。事实上，吉维司他(givinostat)，一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂，作为dmd的潜在疾病修饰治疗正在评估中。数据指示，在鼠和人肌营养不良细胞两者中，肌营养不良蛋白的存在与hdac2结合至特定亚组的mirna相关联(见下文)，而当肌营养不良蛋白拯救时，从这些启动子释放hdac2。
[0371]
在某些实施方案中，本发明的载体编码反义序列或rnai序列(sirna、shrna、mirna等)或微rna，其拮抗tgf-β或结缔组织生长因子(ctgf)的功能。肌营养不良症中升高的tgf-β水平通过阻断卫星细胞的活化来刺激纤维化并损害肌肉再生。已经在肌营养不良症的鼠模型中测试了抗纤维化剂，包括氯沙坦，一种血管紧张肽ii型1受体阻断剂，其减少tgf-β的表达。也已经证明，ht-100(常山酮(halofuginone))经由肌营养不良症中的tgf-β/smad3通路阻止纤维化。同时，fg-3019是一种完全人单克隆抗体，其干扰结缔组织生长因子(纤维化的发病机制中的中心媒介)的作用，已经在开放标签的2期试验中在患有特发性肺纤维化(ipf)的患者中评估。
[0372]
在某些实施方案中，本发明的载体编码微rna(mir)，诸如mir-1、mir-29c、mir-30c、mir-133和/或mir-206。duchenne病灶与野生型状况中的差异性hdac2亚硝基化状态解除对特定亚组的微rna基因表达的控制。通过鉴定的微rna控制的几个回路，诸如连接mir-1与g6pd酶和细胞氧化还原状态的回路，或mir-29与细胞外蛋白和纤维化过程的回路，解释了dmd的一些致病特征。在mdx中，肌肉特异性(myomir)mir-1和mir-133以及普遍存在的mir-29c和mir-30c下调，朝着经外显子跳跃治疗的动物中的野生型水平恢复。根据mdx模型，当经由外显子跳跃恢复肌营养不良蛋白合成时，mir-1、mir-133a、mir-29c、mir-30c和mir-206的水平增加，而mir-23a表达不变。
[0373]
在某些实施方案中，本发明的载体编码微rna抑制剂，该抑制剂抑制在dmd或其相关疾病上调的微rna功能。举例而言，炎性mir-223表达水平在mdx小鼠肌肉中上调，而在经外显子跳跃治疗的小鼠中下调。其降低与所观察到的肌肉炎性状态减轻相一致，由于通过外显子跳跃进行的肌营养不良蛋白拯救。
[0374]
mdx动物承受广泛性纤维化变性，并且已经证明，mir-29靶向牵涉入纤维化变性中的循环因子的mrna，诸如胶原、弹性蛋白和细胞外基质的结构性组分。在mdx小鼠中，mir-29表达极少，并且胶原(col1a1)和弹性蛋白(eln)的mrna上调。因此，mir-29c的表达部分地通过下调胶原和弹性蛋白表达以及与胶原和弹性蛋白表达相关的病理性细胞外基质修饰来减轻dmd患者中的纤维化变性。
[0375]
在某些实施方案中，本发明的载体编码反义序列或rnai序列(sirna、shrna、mirna等)，该序列拮抗g6pd(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)的功能。营养不良肌中的一个重要问题是其对氧化应激的敏感性和应答，这可能牵涉到疾病进展中。g6pd是戊糖磷酸通路中的胞浆酶，其通过维持nadph的水平而向细胞提供还原能量，继而确保还原的与氧化的谷胱甘肽之间的高比率(gsh/gssg)，gsh是保护细胞免于氧化性损伤的主要抗氧化剂分子。g6pd mrna在
mdx肌肉中下调。它在其3
’‑
utr区域中包含三个推定的用于mir-1家族的结合位点，且mir-1和mir-206能够压制g6pd表达。事实上，在g6pd与mir-1表达之间存在负相关。c2成肌细胞的体外分化显示，mir-1水平的增加与g6pd蛋白、mrna水平和gsh/gssg比率的降低相关。在其中mir-1下调的mdx小鼠中，以高于野生型肌肉中的水平检测到g6pd，而在其中mir-1拯救的经外显子跳跃治疗的mdx中，g6pd的量减少。注意，在mdx小鼠中，g6pd水平的增加伴随着gsh/gssg比率的降低。
[0376]
在某些实施方案中，本发明的载体编码反义序列或rnai序列(sirna、shrna、mirna等)，该序列拮抗肌生长抑制素的功能。肌生长抑制素是肌肉质量的负调节因子。内源性肌生长抑制素的抑制或阻断补偿在很多类型的肌营养不良症(包括dmd)中常见的严重肌萎缩。肌生长抑制素阻断抗体myo-029处于针对患有md和其他肌营养不良的成年个体的临床试验中。也已经执行了使用肌生长抑制素抑制剂诸如卵泡抑素和pf-06252616(nct02310764)和bms-986089的其他临床试验。
[0377]
在某些实施方案中，本发明的载体编码反义序列或rnai序列(sirna、shrna、mirna等)，该序列拮抗一种或多种磷酸二酯酶-5(ped-5)或ace、或vegf诱饵受体1型(vegfr-1或flt-1)的功能。肌营养不良蛋白的缺失导致神经元一氧化氮合成酶向微血管的移位和肌源性一氧化氮的减少，导致功能性肌肉缺血和进一步的肌肉损伤。因此，磷酸二酯酶-5或ace、或vegf诱饵受体1型(vegfr-1或flt-1)的几种抑制剂已经作为增加血液流向肌肉的策略的一部分进行测试，包括对磷酸二酯酶-5或ace的药学抑制。
[0378]
在某些实施方案中，本发明的载体编码反义序列或rnai序列(sirna、shrna、mirna等)，该序列拮抗造血前列腺素d合成酶(hpgds)的功能。前列腺素d2(pgd2)由多种炎性细胞产生，且造血pgd合成酶(hpgds)经显示在dmd患者的坏死肌肉中表达。hpgds抑制剂的给药降低了tetranor-pgdm(pgd2的尿代谢物)的尿排泄，并且抑制了dmd的mdx小鼠模型中的肌坏死。已经在临床试验中评估了tas-205(一种新颖的hpgds抑制剂)用于dmd治疗。
[0379]
rnai和反义设计
[0380]
在rna干扰(rnai)中，创建了短rna分子，这些分子是互补性的并且结合至内源性靶标mrna。该结合导致靶标mrna的功能性失活，包括靶标mrna的降解。
[0381]
rnai通路见于很多真核细胞中，包括植物和动物中，并且由酶切口酶(dicer)在细胞质中启动，该酶将长双链rna(dsrna)或小发夹rnas(shrna)分子裂解为约21个核苷酸sirna的短双链片段。然后，各sirna解缠绕为两个单链rna(ssrna)，即过客链(passenger strand)和向导链。过客链被降解，且向导链被并入rna诱导沉默复合物(risc)中。最充分研究的结果是转录后基因沉默，其在当向导链与mrna分子中的互补序列配对时发生并且诱导通过argonaute 2(ago2)(rtsc的催化性组分)进行的裂解。在一些生物体中，这一过程全身性扩散，但最初受限于sirna的摩尔浓度。
[0382]
除了sirna和shrna以外，对于rna干扰至关重要的另一种类型的小rna分子是微rna(mirna)。
[0383]
微rna是基因组编码的非编码rna，其帮助调节基因表达，特别是在发育期间。成熟mirna在结构上类似于sirna，但它们必须首先承受广泛的转录后修饰才能成熟。mirna从长得多的rna编码基因表达，作为称为pri-mirna的初级转录物，然后在细胞核中通过由rnase iii酶drosha和dsrna结合蛋白dgcr8组成的未处理复合物加工为70个核苷酸的茎环结构，
称为pre-mirna。当将这一pre-mirna运输至细胞溶质内时，其dsrna部分被切口酶结合并裂解以产生成熟mirna分子，其两条链可以分开为过客链和向导链。mirna向导链，如sirna向导链，可整合至相同的risc复合物中。
[0384]
因此，两种dsrna通路，mirna和sirna/shrna，两者都需要处理具有主链序列的前体分子(pri-mirna、pre-mirna和dsrna或shrna)，以便为mirna或sirna生成成熟的功能性向导链，并且两种通路最终在risc复合物处汇聚。
[0385]
在整合到risc中之后，sirna与其靶标mrna进行碱基配对并裂解它，从而阻止其被用作翻译模板。然而，不同于sirna，加载mirna的risc复合物扫描细胞质mrna的潜在互补性。mirna靶向mrna的3
’‑
utr区域，而不是破坏性切割(通过ago2)，在那里它们通常以不完全互补性结合，从而阻止核糖体进入翻译。
[0386]
sirna与mirna的区别之处在于，mirna，尤其是动物中的那些，通常具有与靶标的不完全配对并且抑制很多具有类似序列的不同mrna的翻译。相比之下，sirna通常进行性完美碱基配对并且仅在单一、特定靶标中诱导mrna裂解。
[0387]
历史上，sirna和shrna已经用于rnai应用中。sirna通常是双链rna分子，长度为20至25个核苷酸。sirna短暂地抑制靶标mrna，直到它们也在细胞内被降解。shrna的长度通常为约80个碱基对，其包括创建发夹结构的内部杂交区域。如先前所述，shrna在细胞内经处理以形成sirna，继而敲低基因表达。shrna的一个益处是它们可以被并入质粒载体内并整合到基因组dna中以进行长期或稳定的表达，并因此进行更长期的靶标mrna敲除。
[0388]
shrna设计是可商业获得的。举例而言，cellecta提供使用人类全基因组shrna文库或小鼠decipher shrna文库(其靶向约10,000个小鼠基因)的针对任何靶标基因(例如，全部19,276个蛋白质编码人类基因)的rnai筛选服务。thermofisher scientific提供来自ambion的silencer select sirna(经典的21聚体)，据制造商，其合并了sirna设计、脱靶效应预测算法和化学的最新改善。
[0389]
thermofisher scientific还提供pre-mir
tm
mirna前体分子，这些分子是小的、经化学修饰的双链rna分子，旨在模拟内源性成熟mirna。此类pre-mir mirna前体的使用使得能够通过mirna活性的上调进行mirna功能性分析，并且可用于mirna靶标位点鉴定和验证中，筛选调节靶标基因表达的mirna，以及筛选影响靶标基因(诸如sln)功能或细胞过程的mirna。
[0390]
thermofisher scientific进一步提供anti-mir
tm
mirna抑制剂，这些抑制剂是经化学修饰的单链核酸，旨在特异性地结合并抑制内源性微rna(mirna)分子。
[0391]
反义序列设计也可以从大量商业和公开来源诸如idt(integrated dna technologies)和genlink获得。设计考量可包括寡核苷酸长度、靶标mrna的二级/三级结构、靶标mrna上的蛋白质结合位点、靶标mrna或反义寡核苷酸中cg基序的存在、反义寡核苷酸中四元组的形成和增加或降低反义序列活性的基序的存在。
[0392]
外显子跳跃反义寡核苷酸设计是本领域中已知的。见，举例而言，camilla bernardini(ed.)，duchenne muscular dystrophy：methods and protocols，methods in molecular biology，vol.1687，doi 10.1007/978-1-4939-7374-3_10，第10章，shimo等人，由springer science+business media llc出版，2018)，其详细讨论有效外显子跳跃寡核苷酸的设计，考虑以下因素，诸如靶标位点的选择、寡核苷酸的长度、寡核苷酸化学特性和
与rna链相比的解链温度等。还讨论使用反义寡核苷酸的混合液来跳跃多个外显子。覆盖的特异性基因和肌营养不良症包括：dmd(duchenne肌营养不良症)、lama2(merosine缺陷性cmd)、dysf(dysferlin肌病)、fktn(fukuyama cmd)、dmpk(肌强直性营养不良)和sgcg(lgmd2c)。完整内容通过引用并入本文。
[0393]
举例而言，受影响肌病基因中的蛋白质/基因序列及其突变可以从ncbi和leiden肌营养不良症线上网页公开获得。用于有效外显子跳跃的潜在靶标位点可以通过使用人剪接发现者网站www.umd./hsf获得。靶标mrna的二级结构可使用例如mfod web服务器在albany.edu网站评估。寡核苷酸的长度正常情况下可以是8至30聚体。寡核苷酸gc含量计算可以在西北大学(northwestern university)服务器处的oligocalc网站获得。可是使用gggenome网站进行任何脱靶序列的搜索。寡核苷酸的解链温度可通过lna寡核苷酸预测工具或oligoanalyzer 3.1软件在sg.idtdna.com估计。
[0394]
增强的rnai(mir、sirna和shrna)向导链生成
[0395]
在某些实施方案中，编码序列编码rnai试剂，诸如mir、sirna或shrna。
[0396]
在某些实施方案中，对于mir和/或shrna/sirna设计，自其生成了成熟mir或成熟sirna的野生型主链序列可以经修饰以增强向导链生成并最小化/消除过客链产生。由于成熟mir/sirna/shrna的两条链(在裂解后)理论上可以并入risc复合物中并且变为rnai的向导，优势是选择性地增强所设计的向导链的效用并最小化risk复合物中的很大程度上互补的过客链的效用，以便减少或最小化例如脱靶效应(例如，由于当过客链加载在risc中时非预期靶标序列的裂解)。
[0397]
可用来实现这一目标(增强前导链生成并最小化/消除过客链产生)的一种方法是通过使用杂交构造体，其中包含所设计的向导链的所设计的成熟mir/sirna/shrna序列被包埋在其他mir序列的主链序列内，该其他mir序列有利于向导链的生成而不利于过客链的产生。
[0398]
这一原则在一些经修饰的mir-29c构造体和shsln构造体的设计中例示说明，但相同的原则可轻易地适应靶向任何其他序列的其他rnai试剂。
[0399]
对于下文例示说明的全部设计，适应的设计策略包括工程改造侧翼主链序列、环序列和过客链核苷酸序列，以便保持天然主链序列的2d和3d结构。在这一背景下，对于mirna/shrna设计，天然主链序列的2d/3d结构在很大程度上是指茎环与侧翼主链多核苷酸序列之间的距离、中心茎的结构、突起部的定位和/或尺寸、任何内部环的存在和定位以及茎内的误配等。用于基于所选择的mir-30e、mir-101和mir-451主链序列的mir-29c杂交构造体的某些示例性2d结构映射作为例示说明提供如下。
[0400]
a.具有mir-30主链序列的杂交物mir-29c(29c-m30e)
[0401]
fellmann等人(cell rep.5(6)：1704-1713，2013，通过引用并入本文)描述了通过将基干的保守元件b3’鉴定为优化加工所谓“shrnamir”(包埋在内源性微rna环境中的合成shrna)的关键所需，优化实验性mir-30主链的系统性方法。所得经优化的主链称为“mir-e”，强烈地增加了成熟shrna水平和敲低功效。这一方法可轻易地将现有mir和shrna试剂转化为mir-e，从而生成更有效的mir和shrna。
[0402]
应用这一技术，基于所期望的成熟mir-29c序列和fellmann等人中所述的经工程改造/优化的mir-30主链序列，生成了29c-m30e杂交序列。这一29c-m30e序列(关于其预计
的2d结构，见2019年12月11日提交的pct/us2019/065718的图29)已经并入下文实施例中使用的以下受试病毒载体中：μdys-29c-m30e-i2、ff1a-29c-m30e、u6-29c-m30e。29c-m30e的以下5
’→3’
序列是连续序列，经人工分开为不同的行，以例示说明该连续序列的不同节段。
[0403][0404][0405]
具体而言，在上述连续序列中，中间行代表过客链序列、加双下划线的环序列和成熟mir-29c向导序列。注意，过客和向导序列可彼此反向互补，并且可以蛇行回转且与中间环序列形成茎环结构。但应注意，完美的反向互补序列不是必要的。可存在内部突起部等，并因此在一些情况下，两条链不必彼此100％互补(见这一小节最后一个序列中的向导链和过客链)。最上行和最下行带包m30e侧翼主链序列，其经优化以确保向导序列的产生增强并最小化过客链的产生。
[0406]
在类似设计中，将靶向人sln的sirna包埋在mir-30e-hsln-c1中相同(与紧邻本段落的上一段和下一段的序列中的最上行和最下行以及加双下划线的环序列)的m30e主链序列中。但向导链与过客链是不同的。这一所谓c1-m30e序列已经并入下文实施例中使用的以下受试病毒载体中：c1-m30e-i2、c1-m30e-3utr和c1-m30e-pa。
[0407][0408]
将靶向人sln的类似设计的第二sirna包埋在mir-30e-hsln-c1中相同(与紧邻本段落的上一段和下一段的序列中的最上行和最下行以及加双下划线的环序列)的m30e主链序列中。但向导链与过客链是不同的。这一所谓c21-m30e序列已经并入下文实施例中使用的以下受试病毒载体中：c2-m30e-i2、e2-m30e-3utr和e2-m30e-pa。
[0409][0410]
使用天然mir-30主链序列的经修饰的mir-29c序列(“m30n”)也提供如下作为比较。注意，这种情况下的向导链在环序列的5’。这一m30n主链序列类似地增强向导链的产生，但程度小于所测试的实验系统中的m30e主链序列(资料未显示)。
[0411][0412]
b.具有mir-101主链序列的杂交物mir-29c(29c-101)
[0413]
使用mir-101主链序列的不同mir-29c杂交物(29c-101，关于其预计的2d结构，见2019年12月11日提交的pct/us2019/065718的图30)也使用本文中相同的命名法例示说明如下。这里，最上行和最下两行代表mir-101的主链序列，而第二行是具有过客链、环序列和向导链的成熟mir-29c。这一29c-101序列已经并入下文实施例中使用的以下受试病毒载体中：μdys-29c-101-i2、μdys-29c-3utr-101。
[0414][0415]
c.具有mir-155主链序列的杂交物mir-29c(29c-155)
[0416]
使用mir-155主链序列的不同mir-29c杂交物(29c-155)例示说明如下，使用本文中相同的命名约定。这里，最上行和最下行代表mir-155的侧翼主链序列，而第二行是具有向导链、环序列和过客链的成熟mir-29c。这一29c-155序列已经并入下文实施例中使用的以下受试病毒载体中：ef1a-29c-155。
[0417][0418]
也使用mir-155主链序列的mir-29c杂交物(29c-19nt)例示说明如下，使用本文中相同的命名约定。这里，最上行和最下行代表mir-155(与紧邻的上一个序列中相同)的侧翼主链序列，而第二行是具有向导链、环序列和过客链的成熟mir-29c。注意，这里的环序列是19nt，而非上一个序列中的17nt环。这一29c-19nt序列已经并入下文实施例中使用的以下受试病毒载体中：ff1a-29c-19nt、29c-19nt-μdys-pa、29c-19nt-μdys-3utr。
[0419][0420]
d.具有mir-155主链序列的杂交物shsln(shmsln-v2&c1/c2-m155)
[0421]
mir-155a主链序列中的shsln例示说明如下，使用本文中相同的命名约定。这里，最上行和最下行代表mir-155的侧翼主链序列，而第二行是具有向导链、环序列(19nt)和过客链的靶向小鼠sln的成熟shrna(shmsln)。这一shmsln-v2序列已经并入下文实施例中使用的以下受试病毒载体中：ef1a-msln、融合-v1、μdys-shmsln-v1。
[0422][0423]
mir-155a主链序列中的shsln例示说明如下，使用本文中相同的命名约定。这里，最上行和最下行代表mir-155的侧翼主链序列，而第二行是具有向导链、环序列(19nt)和过客链的靶向小鼠sln的另一成熟shrna(shmsln)。与上述类似/相关shmsln序列相比，附加二核苷酸碱基对tt:aa(或严格地说，sirna的3’末端处的uu)的存在已经与所产生的向导链sirna的效力增加相关联。这一shmsln-v2序列已经并入下文实施例中使用的以下受试病毒载体中：ef1a-msln-v2、融合-v2、μdys-shmsln-v2。
[0424][0425]
mir-155a主链序列中的另一shsln例示说明如下，使用本文中相同的命名约定。这
里，最上行和最下行代表mir-155的侧翼主链序列，而第二行是具有向导链、环序列(19nt)和过客链的靶向人sln的成熟shrna。这一c1-m155序列已经并入下文实施例中使用的以下受试病毒载体中：c1-m155-pa\c1-m155-i2\c1-m155-3utr。
[0426][0427]
mir-155a主链序列中的另一shsln例示说明如下，使用本文中相同的命名约定。这里，最上行和最下行代表mir-155的侧翼主链序列，而第二行是具有不同向导链、环序列(19nt)和过客链的靶向人sln的成熟shrna。这一c2-m155序列已经并入下文实施例中使用的以下受试病毒载体中：c2-m155-pa\e2-m155-i2\c2-m155-3utr。
[0428][0429]
e.具有mir-451主链序列的杂交物mir-29e(29c-451)
[0430]
使用mir-451主链序列的mir-29c杂交物(29c-451，关于其预计的2d结构，见2019年12月11日提交的pct/us2019/065718的图31)也使用本文中相同的命名法例示说明如下。这里，最上两行和最下两行代表mir-451的侧翼主链序列，而第三行是具有向导链、环序列和过客链的成熟mir-29c。
[0431][0432]
f.u6驱动的mir-29c和shsln
[0433]
下述实验章节也描述某些“单组分”病毒载体构造体的用途，该构造体仅表达mir-29c或仅表达shsln。此类单组分表达匣由强pol iii u6启动子驱动。此类序列不属于经修饰的mir-29c或经修饰的shsln序列，因为强u6启动子直接生成pre-mirna或shsln而没有任何侧翼核苷酸序列。但对于比较目的，这里也使用相同命名法列出了此类序列。
[0434]
由u6启动子驱动的mir-29c例示说明如下(u6-29c-v1)。这里，第二行是具有过客链、环序列和向导链的成熟mir-29c。这已经用于pgfp-u6-shaav-gfp载体中以生成“单组分”对照载体。下述连续序列的第一行中的核苷酸是u6启动子中转录起始位点后的前5个核苷酸，且t6转录终止序列在用于在下述连续序列的最后一行中克隆的序列之前。
[0435][0436]
由u6启动子驱动的shsln例示如下(u6-shmsln-v1)。这里，第2行是具有过客链、环序列和向导链的shsln。在实施例中，这已经用于u6-shmsln-v1载体中。
[0437][0438]
由u6启动子驱动的shsln例示如下(u6-msln-v4)。这里，第2行是具有过客链、环序列和向导链的shsln。在实施例中，这已经用于u6-msln-v4载体中。
[0439][0440]
g.多组分构造体
[0441]
下文描述了几种mir29c编码序列和靶向sln的shrna编码序列，如从受试病毒载体内的多组分表达匣所表达。
[0442]
通常，下述全部序列直接插入到u6启动子转录起始位点的下游，且tttttt延伸段是t6转录终止位点。对于全部下述设计，设计策略包括工程改造侧翼序列、环和过客链核苷酸序列以保持天然的主链2d和3d结构。对于mirna/shrna设计，2d/3d结构(很大程度上由茎环与侧翼核苷酸序列之间的距离、中心茎结构、突起部的定位和尺寸、内部环和茎中的误配定义)全部是重要的考虑因素。
[0443]
》多组分_29c_v1
[0444][0445]
由多组分表达匣中的u6启动子驱动的mir-29c。这里，从5’到3’，具有过客链、环序列(加双下划线)和向导链序列的成熟mir-29c描绘为紧邻t6转录终止位点的5’。
[0446]
》多组分_29c_v2
[0447][0448]
由多组分表达匣中的u6启动子驱动的mir-29c。这里，从5’到3’，具有过客链、环序列(加双下划线)和向导链序列的成熟mir-29c描绘为紧邻t6转录终止位点的5’。
[0449]
》多组分_29c_v3
[0450][0451]
由多组分表达匣中的u6启动子驱动的mir-29c。这里，从5’到3’，具有过客链、环序列(加双下划线)和向导链序列的成熟mir-29c描绘为紧邻t6转录终止位点的5’。
[0452]
》多组分_29c_v4
[0453][0454]
由多组分表达匣中的u6启动子驱动的mir-29c。这里，从5’到3’，具有过客链、环序列(加双下划线)和向导链序列的成熟mir-29c描绘为紧邻t6转录终止位点的5’。
[0455]
》多组分_29c_v5(mir-155 backbone-based design)
[0456][0457]
由多组分表达匣中的u6启动子驱动的mir-29c。这里，mir-29c使用mir-155主链序列，其中最上行和最下行序列代表mir-155的侧翼主链序列，而第二行序列，从5’到3’，包括具有向导链序列、环序列(加双下划线)和过客链序列的成熟mir-29c。
[0458]
》多组分_msln_shv1
[0459][0460]
由多组分表达匣中的u6启动子驱动的靶向msln的shrna。这里，从5’到3’，具有过客链、环序列(加双下划线)和向导链序列的成熟shmsln描绘为紧邻t6转录终止位点的5’。
[0461]
》多组分_msln_shv2
[0462][0463]
由多组分表达匣中的u6启动子驱动的靶向msln的shrna。这里，从5’到3’，具有过客链、环序列(加双下划线)和向导链序列的成熟shmsln描绘为紧邻t6转录终止位点的5’。
[0464]
》多组分_msln_shv3
[0465][0466]
由多组分表达匣中的u6启动子驱动的靶向msln的shrna。这里，从5’到3’，具有过客链、环序列(加双下划线)和向导链序列的成熟shmsln描绘为紧邻t6转录终止位点的5’。
[0467]
》多组分_msln_shv4
[0468][0469]
由多组分表达匣中的u6启动子驱动的靶向msln的shrna。这里，从5’到3’，具有过客链、环序列(加双下划线)和向导链序列的成熟shmsln描绘为紧邻t6转录终止位点的5’。
[0470]
以下序列应用于仅编码靶向人sln的shrna(shhsln)(即，不在多组分匣中)的单分子构造体中或编码多组分表达匣中的goi(例如，μdys编码序列)和靶向人sln的shrna两者的组合(“combo”)构造体中。见图6。
[0471]
》u6-hsln-c1-v1
[0472][0473]
由u6启动子驱动的靶向hsln的shrna。这里，从5’到3’，具有过客链、环序列(加双下划线)和向导链序列的成熟shhsln描绘为紧邻t6转录终止位点的5’。
[0474]
》u6-hsln-c1-v2
[0475][0476]
由u6启动子驱动的靶向hsln的shrna。这里，从5’到3’，具有过客链、环序列(加双下划线)和向导链序列的成熟shhsln描绘为紧邻t6转录终止位点的5’。
[0477]
》u6-hsln-c2-v1
[0478][0479]
由u6启动子驱动的靶向hsln的shrna。这里，从5’到3’，具有过客链、环序列(加双下划线)和向导链序列的成熟shhsln描绘为紧邻t6转录终止位点的5’。
[0480]
》u6-hsln-c2-v2
[0481][0482]
由u6启动子驱动的靶向hsln的shrna。这里，从5’到3’，具有过客链、环序列(加双下划线)和向导链序列的成熟shhsln描绘为紧邻t6转录终止位点的5’。
[0483]
》u6-hsln-c3-v1
[0484][0485]
由u6启动子驱动的靶向hsln的shrna。这里，从5’到3’，具有过客链、环序列(加双下划线)和向导链序列的成熟shhsln描绘为紧邻t6转录终止位点的5’。
[0486]
》u6-hsln-c3-v2
[0487][0488]
由u6启动子驱动的靶向hsln的shrna。这里，从5’到3’，具有过客链、环序列(加双下划线)和向导链序列的成熟shhsln描绘为紧邻t6转录终止位点的5’。
[0489]
本发明的病毒载体可用于基因疗法中以治疗多种遗传疾患，包括但不限于如上所述的各种肌营养不良症。可使用本发明的多组分载体治疗的额外遗传疾患在下文章节中进一步描述。
[0490]
a-1抗胰蛋白酶缺乏症(a1ad或aatd)治疗
[0491]
α-1抗胰蛋白酶缺乏症(a1ad或aatd)是一种由于serpina1(serpin肽酶抑制剂，分支a，成员1)基因中的突变所致的遗传疾患，其导致所生产的a1at蛋白质(serpin超家族蛋白酶抑制剂)不足。α-1抗胰蛋白酶缺乏症在全世界范围内发生，但流行率因人群而变。约1,500至3,500名具有欧洲血统的个体中有1人受到这一疾患的影响。它在亚裔人群中不常见。尽管其名称a1at为蛋白酶抑制剂，但其不仅抑制胰蛋白酶。它主要与弹性蛋白酶结合/复合，但也与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶和细菌蛋白酶结合/复合。它在肝脏中产生，并且正常地加入全身循环。其在血液中的参考范围0.9至2.3g/l之间，但其浓度在急性炎症时可以升高很多倍。
[0492]
a1at保护组织免受炎性细胞中的酶，尤其是中性粒细胞弹性蛋白酶的攻击。在成年人中，当血液中含有不足量的a1at或功能上有缺陷的a1at时(诸如在α-1抗胰蛋白酶缺乏症中)，中性粒细胞弹性蛋白酶过量游离以断裂弹性蛋白，降低非的弹性，这导致呼吸系统并发症诸如慢性阻塞性肺病(copd)。
[0493]
再者，缺陷性a1at可能无法离开肝脏(其起源地)，且反而在肝脏中堆积，导致成年人或儿童的肝硬化。举例而言，所谓z突变/等位基因引起a1at蛋白质在干细胞中聚合，阻止其分泌到血液中，并且聚集的突变型蛋白质具有毒性功能增益(另一方面，动物数据已经证明，仅减少突变蛋白质的水平具有有益效应，甚至在不存在野生型蛋白质上调的情况下)。
[0494]
因此，疾病a1ad可以表现为肺病和/或肝病，且底层基质可能涉及未阻断的中性粒细胞弹性蛋白酶和肝脏中的异常a1at堆积。它是常染色体共显性的，一个缺陷等位基因比两个缺陷等位基因更容易导致轻度疾病。肺病的症状包括气短、喘气或肺部感染风险增加。a1ad的并发症也可包括copd、肝硬化、新生儿黄疸或脂膜炎。
[0495]
a1at是一种成熟形式的单链糖蛋白，由394个氨基酸组成，并且表现出多种糖形式。成熟a1at蛋白质可以由serpina1基因的约1.2kb(1254nt)的多核苷酸编码，该基因已经
定位至人染色体14q32。已经鉴定了serpina1基因的超过75种突变，很多具有临床显著效应(见，silverman等人，alpha1-antitrypsin deficiency.new england journal of medicine 360(26)：2749-2757，2009(通过引用并入本文))。
[0496]
举例而言，严重缺乏症的最常见原因piz(即，z等位基因)是一种单碱基配对取代，该取代导致位置342处的谷氨酸到赖氨酸突变(e342k或glu342lys，见下表)。纯合zz表型与肺气肿和肝病的高风险相关联。同时，pis(即，s等位基因)由位置264处的谷氨酸到缬氨酸突变(e264v或glu264val，见下表)所引起。ss纯合没有肺气肿的风险，但s与z或者s与无效杂合子具有轻度增加的肺气肿风险。已经描述了其他较少见的形式，诸如与肝病和肺病两者的风险增加相关联的pim(malton)等位基因，并且其中的一些以本领域中使用的多种命名法子啊下表中列出。其他等位基因包括pittsburg等位基因(met358arg)，其发生在a1at活跃位点处并改变其功能以变为针对凝血酶和因子xi而非弹性蛋白酶的强力抑制剂，导致出血疾患。
[0497]
目前，肺病的治疗包括支气管扩张剂、吸入型类固醇，以及当发生感染时，抗生素。也可能建议a1at蛋白质的静脉输液或在严重疾病中的肺移植。在患有严重肝病的那些人中，肝移植可能是一个选项。也建议流感、肺炎球菌和肝炎的疫苗。
[0498]
因此，本发明的aav载体可用来治疗a1ad，其中本发明的多组分或融合载体可用来递送(1)第一治疗剂，其包含野生型serpina1的编码序列，和(2)第二治疗剂，其包含突变型serpina1的拮抗剂，使得缺陷性a1at蛋白质的表达得以减少或消除。
[0499]
举例而言，野生型serpina1基因可以是1257nt的多核苷酸序列(见下文)，并且可以使用肝脏特异性增强子和/或启动子中的任一者在肝脏中表达。
[0500]
[0501]
肝脏启动子(例如，肝脏特异性poe增强子和α1-抗胰蛋白酶启动子)可见于www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8845389，其驱动m-形式serpina1和任何针对引起aatd的serpina1变体形式的rnai剂的表达
[0502]
也可使用针对人类表达进行密码子优化的serpina1(见下文)。
[0503][0504][0505]
在某些实施方案中，拮抗剂编码rnai试剂(诸如sirna、mirna、shrna等)，该试剂靶向缺陷性a1at(但不靶向野生型a1at)的mrna。
[0506]
在某些实施方案中，sirna靶向定位可包括serpina1的3’utr、5’utr和/或编码区域，因为待从受试病毒载体表达的serpina1基因可具有天然经密码子优化的编码序列和优化的utr，该基因将会不同于天然serpina1基因，并因此不被针对突变体serpina1的sirna所靶向。一些靶向突变型serpina1的代表性shrna序列处于例示说明的目的提供于下。
[0507]
》serpina1-sirna-1(第二行代表过客链、环和向导链序列)：
[0508]
》serpina1-sirna-2(第二行代表过客链、环和向导链序列)
[0509][0510]
在某些实施方案中，缺陷性a1at含有b(alhambra)等位基因、m(malton)等位基因、
s等位基因、m(heerlen)等位基因、m(mineral springs)等位基因、m(procida)等位基因、m(nichinan)等位基因、i等位基因、p(lowell)等位基因、无效(granite falls)等位基因、无效(bellingham)等位基因、无效(mattawa)等位基因、无效(procida)等位基因、无效(hong kong 1)等位基因、无效(bolton)等位基因、pittsburgh等位基因、v(munich)等位基因、z(augsburg)等位基因、w(bethesda)等位基因、无效(devon)等位基因、无效(ludwigshafen)等位基因、z(wrexham)等位基因、无效(hong kong 2)等位基因、无效(riedenburg)等位基因、kalsheker-poller等位基因、p(duarte)等位基因、无效(west)等位基因、s(liyama)等位基因和z(bristol)等位基因。
[0511]
在某些实施方案中，缺陷性a1at含有pittsburg等位基因和/或下表中列出的突变中的一种或多种。
[0512]
在存在两种突变型等位基因的情况下，第二治疗剂可编码多种拮抗剂，该拮抗剂各自靶向至少一种该突变型等位基因(但不靶向由相同载体编码的野生型等位基因)的特定区域。举例而言，一种拮抗剂可以是靶向z等位基因突变的shrna或sirna或mirna，且另一种你拮抗剂可以是靶向s等位基因突变的shrna或sirna或mirna，等等。
[0513]
在某些实施方案中，受试载体可编码多种针对多种缺陷性aiat等位基因的拮抗剂，同时编码或不编码野生型等位基因。
[0514]
如本文所用，“野生型等位基因”是指一种变体，其具有正常(不是缺陷性的)水平的a1at抑制活性，包括m1a(残基213处的ala)、m1v(残基213处的val)、m2、m3等位基因等。(crystal，trends genetics 5：411-7，1989，通过引用并入)。
[0515][0516]
在某些实施方案中，本发明的病毒载体优先感染肝脏细胞和组织。举例而言，对具有aav8衣壳的重组aav2载体基因组(称为aav2/8)进行假分型增强了对于肝脏细胞的趋性。
[0517]
重复序列扩张疾患
[0518]
本发明的载体也可用于治疗某些由可在整个基因中发生的扩张的核苷酸重复序列所引起的所谓重复序列扩张疾患(red)。
[0519]
此类red的示例包括在5’utr区域内的三核苷酸重复序列，诸如脆性x染色体综合征(cgg重复序列)、fxtas(cgg重复序列)、脆性xe精神发育迟滞(gcc重复序列)和脊髓小脑共济失调12型(cag重复序列)；外显子中的三核苷酸重复序列，诸如脊髓小脑共济失调1型、2型、3型、6型、7型和17型(cag重复序列)，亨廷顿症(cag重复序列)，亨廷顿样症2(cag重复序列)，脊髓延髓肌萎缩症(cag重复序列)，齿状核红核苍白球路易体萎缩症(cag重复序列)，多发性骨骼发育不良(gac重复序列)，并指(趾)多指(趾)综合征(gcg重复序列)，手-足-生殖器综合征(gcg重复序列)，颅骨锁骨发育不良(gcg重复序列)，前脑无裂畸形(gcg重复序列)，眼咽肌营养不良症(gcg重复序列)，先天性中枢性通气不足症候群(gcg重复序列)，bpei综合征(gcg重复序列)，和x连锁精神发育迟滞(gcg重复序列)；内含子中的核苷酸重复序列，诸如friedreich共济失调(gaa重复序列)、肌强直性营养不良2型(cctg重复序列)、脊髓小脑共济失调10型(attct重复序列)、脊髓小脑共济失调31型(tggaa重复序列)、脊髓小脑共济失调36型(ggcctg重复序列)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ggggcc重复序列)；以及3’utr区域中的三核苷酸重复序列，诸如肌强直性营养不良1型(ctg重复序列)和脊髓小脑共济失调8型(ctg重复序列)。
[0520]
举例而言，脊髓小脑共济失调(sca)是一组遗传性共济失调，其特征是脑中与运动控制相关的部分(小脑)中且有时是脊髓中的退行性变化。存在多种那类型的sca，根据其鉴定顺序(见omim网站的sca1-45)，根据负责具体类型的sca的突变(改变)基因分类。体征和症状可按类型而变但都是类似的，并且可包括不协调行走(步态)、手眼协调性差和不能正常说话(构音障碍)。sca3，也称为machado-joseph病，是最常见类型的sca。sca 9至36型较少见且位未充分表征。
[0521]
所选择的sca(包括其在人类染色体上的基因座)、基因产物(包括所编码蛋白质的尺寸)以及潜在突变的类型总结在下表中。
[0522][0523]
sca以常染色体显性模式遗传。使用术语脊髓小脑的其他疾病可能具有常染色体隐性遗传(“scar”)。目前的治疗是支持性的，并且基于患有sca的人中存在的体征和症状(而非原因)。
[0524]
这些ed的一个共有特征是，它们全部涉及核苷酸重复序列，主要是三核苷酸重复序列，这是重复很多次的dna节段。尽管这些重复序列的存在并非不正常的并且不造成问题，但大于正常数量的重复序列可能干扰所影响的基因的功能，导致遗传病症。此类三核苷酸重复序列是不稳定的，并且当从父母传递给孩子时可能在长度上有所变化。数量增加的重复序列往往导致发病年龄更小和更严重的疾病。
[0525]
在常染色体显性病症中，每个细胞中疾病相关基因的突变拷贝足以引起该病症的体征或症状。因此，对此类red的成功治疗可能既需要替换缺陷基因也需要减少或消除缺陷基因或基因产物。
[0526]
作为具体示例，最常见的sca是sca3或machado-joseph病(mjd)，这是一种常染色体显性进行性神经系统疾患，原则上的特征是共济失调、痉挛状态和眼球运动异常。估计在全世界范围内，mjd影响每100,000人中的1至5人。mjd由编码染色体14q32上的ataxin-3基因(atxn3)中gln重复序列的杂合(cag)n三核苷酸重复序列扩张所引起。正常个体具有至多44个q重复序列，而mjd患者具有52至86个之间的q重复序列。alves等人(plos one 3(10)：e3341，doi.org/10.1371/journal.pone.0003341)证明，但核苷酸多态性(snp)存在于超过70％的患有machado-joseph病(mjd)的患者中，并且这一snp可用来选择性地使突变型ataxin-3等位基因失活，使用慢病毒载体介导的rnai(shrna)在体外和大鼠mjd模型在体内进行。该方法的选择性在体外通过突变型等位基因特异性shrna的共表达时保持野生型ataxin-3表达来证明，并且在体内通过野生型等位基因特异性shrna对于突变型ataxin-3基因表达的效应有限来证明。ataxin-3的等位基因特异性沉默显著降低与mjd相关的神经
病理学异常的严重性。因此，当本发明的载体可用来同步地递送缺陷性sca3等位基因的拮抗剂和不能被突变型等位基因特异性拮抗剂靶向的野生型sca3等位基因时，可使用类似的方法。
[0527]
当存在野生型等位基因与突变型等位基因之间的snp时，相同方法可用于任何其他red。
[0528]
因此，本发明的aav载体可用来治疗任何red诸如本文所述的哪项，其中本发明的多组分或融合载体可用来递送(1)第一治疗剂，其包含待治疗的red底层野生型基因的编码序列，和(2)第二治疗剂，其包含突变型red基因的拮抗剂，使得缺陷性red基因和/或蛋白质的表达得以减少或消除。
[0529]
在某些实施方案中，red分别是sca1、sca2、sca3、sca6、sca7、sca8、sca10、sca12或sca17，其中第一治疗剂分别包含野生型ataxin-1、ataxin-2、ataxin-3、cacna1、ataxin-7、sca8、sca10、ppp2r2b或tbp的编码序列，和(2)第二治疗剂包含分别对于ataxin-1、ataxin-2、ataxin-3、cacna1、ataxin-7、sca8、sca10、ppp2r2b或tbp的突变型等位基因具有特异性的拮抗剂。
[0530]
举例而言，野生型ataxin-3基因atxn3可以由1086nt多核苷酸序列(见下文)编码，且可以使用任何一种神经元特异性启动子诸如突触蛋白启动子在神经元中表达。
[0531][0532]
也可使用针对人表达进行密码子优化的atxn3(见下文)。
[0533]
[0534][0535]
在某些实施方案中，拮抗剂编码rnai试剂(诸如sirna、mirna、shrna等)，该试剂靶向缺陷性ataxin-1、ataxin-2、ataxin-3、cacna1、ataxin-7、sca8、sca10、ppp2r2b或tbp(但不靶向其野生型对应部分)的mrna。等位基因特异性可以基于snp。
[0536]
在某些实施方案中，sirna靶向定位可包括atxn3的cag重复序列、3’utr、5’utr和/或编码区域，因为待从受试病毒载体表达的atxn3基因可具有天然经密码子优化的编码序列和优化的utr，该基因将会不同于天然atxn3基因，并因此不被针对突变体atxn3的sirna所靶向。一些靶向突变型atxn3的代表性shrna序列处于例示说明的目的提供于下。
[0537]
》atxn3-sirna-1(第二行代表过客链、环和向导链序列)：
[0538]
》atxn3-sirna-2(第二行代表过客链、环和向导链序列)：
[0539]
》atxn3-sirna-30(mir-30主链)(第二行代表过客链、环和向导链序列)：
[0540][0541]
》atxn3-sirna-4(mir-30主链)(第二行代表过客链、环和向导链序列)：
[0542][0543]
atxn3和/或所编码的rnai剂(诸如shrna)可以从任何神经元选择性启动子诸如突触蛋白启动子(www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc4229583/)、或天然atxn3启动子、或u6启动子(尤其是对于shrna)表达。
[0544]
本发明的载体可治疗的另一red是肌强直性营养不良1型(dm1)，这是一种常染色体显性多系统遗传疾患，影响骨骼肌和平滑肌以及眼、心、内分泌系统和中枢神经系统。临床发现跨越了从轻度到重度的连续统一体，分为三种稍微重叠的表型：轻度、典型和先天性。目前，dm1无法治愈。治疗基于存在的体征和症状。
[0545]
与在znf9基因的内含子1中具有cctg核苷酸扩张的肌强直性营养不良2型或dm2(其少见且与更轻度症状相关联)相反，dm1由dmpk基因的非编码3
’‑
utr区域中的ctg三核苷酸重复序列的扩张引起。长度在5至34之间的ctg重复序列视为正常，35至49重复序列视为可突变正常，而超过50的重复序列视为彻头彻尾的异常。分子遗传学测试在几乎00％的受影响个体中检测到了致病变体。在全世界范围内，dm1估计在每8,000人中影响1人。
[0546]
据信，由dmpk基因(肌强直性营养不良蛋白激酶)作成的蛋白质在细胞内和细胞间的通讯和脉冲传输中扮演角色。这似乎对心脏、大脑和骨骼肌细胞的正确功能很重要。t超过正常数量的ctg重复序列导致产生更长且毒性的rna。这继而给细胞带来问题，主要是因为它捕获并禁用重要的蛋白质。这阻止肌肉和其他组织中的细胞正常运作，导致md1的症状和体征。因此，设计dm1治疗中的重要策略是从其rna网释放细胞蛋白质，特别是一种称为肌盲1或mbnl1的蛋白质，和/或增加mbnl1的表达。
[0547]
因此，在某些实施方案中，red是dm1，其中第一治疗剂包含野生型dmpk的编码序列(例如，具有正常数量的5至34个ctg重复序列，优选具有12个或更少的ctg重复序列，即正常或非-dm1细胞中所见的ctg重复序列的平均数量)，和(2)第二治疗剂包含对于dmpk的突变型等位基因(诸如那些具有超过50个ctg重复序列的)具有特异性的拮抗剂。
[0548]
举例而言，野生型dmpk基因可由1887nt(对于一些可用dmpk同种型中的一者，见下文)编码，并且可普遍地表达，或使用任何一种肌肉特异性启动子诸如ck8在肌肉中特异性地表达。
[0549][0550][0551]
源自dmpk的启动子可包括
[0552]
www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/9535904中的启动子。
[0553]
也可使用针对人类表达进行密码子优化的dmpk(见下文)。
[0554][0555]
在某些实施方案中，拮抗剂编码rnai时间(诸如sirna、mirna、shrna等)或靶向突变型dmpk等位基因的反义序列。拮抗剂可以对于编码突变型等位基因的ctg重复序列具有特异性，或对于编码mrna的突变型等位基因(诸如突变型等位基因中存在的snp)的另一区域具有特异性。
[0556]
在某些实施方案中，野生型等位基因的经密码子优化的版本可以从转录匣中的一者表达，且来自该经密码子优化的野生型等位基因的rna转录物对于rnai试剂不敏感。
[0557]
在某些实施方案中，sirna靶向定位可包括dmpk的ctg重复序列、3’utr、5’utr和/或编码区域，因为待从受试病毒载体表达的dmpk基因可具有天然经密码子优化的编码序列和优化的utr，该基因将会不同于天然dmpk基因，并因此不被针对突变体dmpk的sirna所靶
向。一些靶向突变型dmpk的代表性shrna序列处于例示说明的目的提供于下。
[0558]
》dm1-重复序列-shrna-1(第二行代表过客链、环和向导链序列)：
[0559][0560]
》dm1-重复序列-shrna-1(第二行代表过客链、环和向导链序列)：
[0561][0562]
在相关方面，不是编码野生型dmpk，而是野生型mbnl1基因(例如，1146-nt编码序列)可以经编码为第一治疗剂。
[0563]
举例而言，野生型mbnl1基因可由1146nt多核苷酸序列(对于一些可用mbnl1同种型中的一者，见下文)编码，并且可普遍地表达，或使用任何一种肌肉特异性启动子诸如ck8在肌肉中特异性地表达。
[0564][0565][0566]
源自mbnl1的启动子可包括
[0567]
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc5389549/genes中的启动子。
[0568]
也可使用针对人类表达进行密码子优化的mbnl1(见下文)。
[0569][0570]
本发明的载体可治疗的再一red是亨廷顿病(hd)，这是一种致命且目前无法治愈的常染色体显性神经退行性疾病，其特征是运动、认知和行为障碍，估计在美国影响1/10000的人。它由亨廷顿蛋白(htt)基因cag重复序列区域的毒性扩增引起，该基因通常编码3144个氨基酸的htt蛋白。由此产生的突变型亨廷顿基因(mhtt)在外显子1内具有超过36个cag重复序列，通过一种尚不清楚的机制赋予突变型蛋白以毒性。
[0571]
突变型亨廷顿蛋白具有多种有害的分子和细胞后果，包括纹状体神经元的bdnf神经营养支持丧失、轴突运输受损、囊泡再循环改变、线粒体功能障碍、自噬增加、蛋白质聚集和转录失调。然而，突变亨廷顿蛋白的单一异常效应不能解释神经元功能障碍和早期死亡。hd患者通常在40岁时出现不自主运动、认知功能障碍和行为改变。
[0572]
本发明的载体可用于以至少两种不同的方法治疗hd。在第一种方法中，可以使用本发明的载体去除第一治疗剂以提供正常或野生型htt基因，而可以同步地递送第二治疗剂以特异性靶向突变型htt基因产物。
[0573]
举例而言，通过rnai(sirna、shrna、mirna等)或aso的基因沉默可用以特异性地靶向突变型htt mrna。举例而言，这可以通过靶向突变型htt等位基因上的snp来实现。van bilsen等人(hum gene ther.19(7)：710-719，2008)使用小干扰rna(sirna)，通过特异性靶向位于致病突变下游数千个碱基的单核苷酸多态性(snp)，选择性地将杂合hd供体致病等位基因的内源性mrna减少约80％。内源性突变型htt蛋白的选择性抑制也被证明使用这一sirna。lombardi等人(exp neurol.217(2)：312-319，2009)将来自327名无关的欧洲白种人hd患者的dna在hd基因中的26个snp位点处进行基因分型，且发现超过86％的患者对于至少一个snp是杂合的。此外，靶向这些位点的等位基因特异性sirna使用高通量筛选方法轻易
地可鉴定，且使用这一方法鉴定的等位基因特异性sirna事实上显示对来自hd患者的成纤维细胞中的内源性突变型htt蛋白质的选择性抑制。pfister等人(curr biol.19(9)：774-8，2009)类似地发现，48％的所测试患者群体在单snp位点是杂合的；该snp的一种同种型与hd相关联。再者，对应于恰好三个snp位点的五种等位基因特异性sirna可用来治疗四分之三的美国和欧洲hd患者群体。
[0574]
在第二种方法中，不使用特异性地靶向突变型htt基因产物的第二治疗剂，第二治疗剂可同步地靶向突变型htt基因产物和野生基因产物两者以减少(但不消除)两者的表达。由于野生型亨廷顿蛋白在细胞内具有多种对于神经元功能而言很重要的生理活性，完全抑制突变型和野生型亨廷顿蛋白两者可能不是所期望的。因此，将野生型hdd同步表达为第一治疗剂可能进一步恢复野生型htt蛋白功能。由于数据显示突变型亨廷顿蛋白表达减少(甚至仅部分地减少)可能足以导致治疗益处，这一治疗方法可用于不符合进行htt表达的基于snp的突变型等位基因特异性敲低条件的患者。
[0575]
作为这些方法的替代品，可以将有益于治疗hd的修饰物表达为第一治疗剂，而不是表达野生型htt作为第一治疗剂。举例而言，goold等人(hum mol genet.28(4)：650-661，2019)证明，增加的fan1(fancd2和fanci相关核酸酶1)表达与延迟的hd发病年龄和减缓的hd进展显著相关联，表明fan1在扩张的htt cag重复序列的背景下具有保护性。fan1在人细胞中的过表达减少了外源性表达的突变型htt外显子1中的cag重复序列扩张，并且在源自患者的干细胞和分化的中型多棘神经元中，fan1敲低增加了cag重复序列扩张。稳定化效应依赖于fan1浓度和cag重复序列长度。
[0576]
有益于治疗hd的另一种修饰剂可以是msh3的拮抗剂，因为这一误配修复基因msh3的变体已经与hd以及dm1进展联系起来。见flower等人(brain 142(7)：1876-1886，2019)。可使用相同的策略来治疗dm1。
[0577]
本发明的载体可治疗的又一red是friedreich共济失调(frda)，这是最常见的遗传性共济失调。它是一种常染色体隐性遗传疾病，与脊髓中神经组织的变性有关，该变性引起共济失调。在美国，这一疾病估计影响1/50,000的个体。特别受影响的是通过与小脑的连接引导手臂和腿部肌肉运动所必需的感觉神经元。因此，患者行走困难，手臂和腿部感觉丧失，言语障碍随着时间推移而恶化。许多人还患有一种称为肥厚型心肌病的心脏病，这是frda患者最常见的死亡原因。目前，对于这一疾病不存在有效的治疗。
[0578]
frda由染色体9上的fxn基因中的突变引起，该突变产生称为frataxin的重要蛋白质。虽然frataxin的确切作用尚不清楚，但据信它有助于电子传递链中的铁硫蛋白合成，以生成atp，并通过提供适量的活性氧(ros)来调节线粒体中的铁转移，以维持正常过程。没有frataxin，线粒体中的能量下降，过量的铁产生额外的活性氧，导致进一步的细胞损伤。低frataxin水平导致线粒体电子传递和功能性乌头酸酶组装所需的铁硫簇的生物合成不足，以及整个细胞的铁代谢紊乱。
[0579]
在96％的病例中，突变的fxn基因在两个等位基因的内含子1中均具有90至1300个gaa三核苷酸重复序列扩增。这种扩展引起表观遗传变化和重复序列附近异染色质的形成。较短gaa重复序列的长度与发病年龄和疾病严重程度相关。异染色质的形成导致基因转录减少，frataxin-fdra患者的frataxin fdra表达水平较低，仅为健康个体正常水平的5-35％。甚至突变fxn基因的杂合携带者的frataxin水平也降低了50％；但这种减少不足以引
起症状。其余4％的病例与一个等位基因中的gaa扩增相关，另一个与点突变(错义、无义或内含子点突变)相关。
[0580]
因此，在某些实施方案中，red是frda，其中第一治疗剂包含野生型fxn基因的编码序列(例如，630个核苷酸的编码序列)，和(2)第二治疗剂包含对于具有gaa重复序列的fxn基因的突变型等位基因具有特异性的拮抗剂。
[0581]
在某些实施方案中，第二治疗剂包括rnai试剂，诸如对fxn基因的突变型等位基因具有特异性的sirna、hrna或mirna编码序列。等位基因特异性可以基于扩张的gaa重复序列或与突变型等位基因相关的snp。
[0582]
在某些实施方案中，本发明的载体可靶向神经元细胞内的表达，诸如脊髓外周神经元中的神经元，包括对于指导手臂和腿的肌肉运动至关重要的感觉神经元。载体可局部地递送至靶标神经元。
[0583]
在某些实施方案中，本发明的载体可靶向心脏、肌肉、前列腺和/或frda中经常受影响的其他系统中的表达。
[0584]
在某些实施方案中，本发明的载体可靶向普遍存在的表达。
[0585]
在某些实施方案中，本发明的载体使用fxn启动子、神经元特异性启动子(诸如突触蛋白启动子)、肌肉特异性启动子(诸如ck8)或普遍存在的启动子，以驱动第一和/或第二治疗剂的表达。
[0586]
本发明载体可治疗的又一red是脆性x综合征(fxs)，这是遗传性精神发育迟滞、智力残疾和孤独症的最常见原因，并且是遗传学上相关的21三体综合征后精神缺陷的第二常见原因。保守估计报告，脆性x染色体综合征影响1/2,500至1/4,000的男性和1/7,000至1/,000的女性。
[0587]
fxs以x连锁显性模式遗传。它典型是由于x染色体上脆性x精神发育迟滞1(fmr1)基因的5
’‑
utr区域内的cgg三元组重复序列的扩张。正常fmr1基因具有5至44个之间的cgg重复序列，最常见29或30个重复序列。当这一cgg重复序列扩张至55到超过200时，发生脆性x染色体综合征。当出现中间数量的重复序列时，称为存在预置换。在重复序列扩增大于200的个体中，cgg重复序列扩增和fmr1启动子存在甲基化，导致fmr1基因沉默和其产物缺失。一项研究发现，fmr1沉默是由fmr1 mrna介导的，因为fmr1 mrna包含转录的cgg重复序列，作为5’非翻译区域的一部分，与fmr1基因的互补cgg重复序列部分杂交，形成rna
·
dna双链。具有突变形式的fmr1基因的最终结果是产生的脆性x精神发育迟滞蛋白(fmrp)数量不足，该蛋白是神经元之间连接正常发育所必需的。这一疾病目前无法治愈。
[0588]
因此，在某些实施方案中，red是fxs，其中第一治疗剂包含野生型fmr1基因的编码序列(例如，1863个核苷酸的编码序列)，和(2)第二治疗剂包含对于具有ccg重复序列的fxs基因的突变型等位基因具有特异性的拮抗剂。
[0589]
举例而言，野生型fmr1基因可以由1899nt多核苷酸序列(见下文)编码，且可以使用任何一种神经元特异性启动子诸如突触蛋白启动子在神经元中表达。
[0590][0591][0592]
突触蛋白启动子可见于
[0593]
www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/pmc4229583/)。替代性地，天然fmr1启动子或u6启动子可用来驱动表达。
[0594]
也可使用针对人类表达进行密码子优化的fmr1(见下文)。
[0595][0596][0597]
在某些实施方案中，第二治疗剂包括rnai试剂，诸如对fmr1基因的突变型等位基因具有特异性的sirna、hrna或mirna编码序列。等位基因特异性可以基于扩张的ccg重复序列或与突变型等位基因相关的snp。
[0598]
在某些实施方案中，sirna靶向定位可包括fmr1的cgg重复序列、3’utr、5’utr和/或编码区域，因为待从受试病毒载体表达的fmr1基因可具有天然经密码子优化的编码序列和优化的utr，该基因将会不同于天然fmr1基因，并因此不被针对突变体fmr1的sirna所靶向。一些靶向突变型fmr1的代表性shrna序列处于例示说明的目的提供于下。
[0599]
》fmr1-sirna-1(第二行代表过客链、环和向导链序列)：
[0600]
》fmr1-sirna-2(第二行代表过客链、环和向导链序列)：
[0601][0602]
》fmr1-sirna-30(mir-30主链)(第二行代表过客链、环和向导链序列)：
[0603][0604]
在某些实施方案中，本发明的载体可靶向神经元细胞内的表达。载体可局部地递送至靶标神经元。
[0605]
在某些实施方案中，本发明的载体可靶向普遍存在的表达。
[0606]
在某些实施方案中，本发明的载体使用fmr1启动子、神经元特异性启动子(诸如突触蛋白启动子)或普遍存在的启动子，以驱动第一和/或第二治疗剂的表达。
[0607]
组合物和药物组合物
[0608]
在另一实施方案中，本发明设想包含本发明的raav的组合物。本发明的组合物包含raav和药学上可接受的载体。该组合物还可包含其他成分诸如稀释剂和佐剂。可接受的载体、稀释剂和赋形剂对于接纳者无毒且优选在所采用的剂量和浓度下是惰性的，并且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸；抗氧化剂诸如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如edta；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；和/或非离子性表面活性剂，诸如tween、pluronics或聚乙二醇(peg)。
[0609]
投药和给药
[0610]
待在本发明的方法中给药的raav的滴度将依据，举例而言，特定raav、给药模式、治疗目标、个体和所靶向的细胞类型而变，并且可通过本领域标准方法测定。raav的滴度可以在约1
×
106、约1
×
107、约1
×
108、约1
×
109、约1
×
10
10
、约1
×
10
11
、约1
×
10
12
、约1
×
10
13
至约1
×
10
14
或更多dnase耐药性颗粒(drp)每ml。剂量也可以以病毒基因组(vg)为单位来表达。
[0611]
本发明考虑用raav在体内或体外转导靶标细胞的方法。体内方法包括以下步骤：向有此需要的动物(包括人类)给药有效剂量或有效的多个剂量的包含本发明的raav的组合物。如果剂量在发展出疾患/疾病之前给药，则给药是预防性的。如果剂量在发展出疾患/疾病之后给药，则给药是治疗性的。在本发明的实施方案中，有效剂量是减轻(消除或减少)至少一个与被治疗的疾患/疾病相关的症状，其减缓或阻止进展到疾患/疾病状态，减缓或阻止疾患/疾病状态的进展，缩减疾病的程度，导致疾病的缓解(部分或总体)，和/或延长生存期。考虑使用本发明的方法来预防或治疗的疾病的示例是pmd或以髓磷脂产生、变性、再生或功能缺陷为特征的其他疾病。
[0612]
对于给药，有效量和治疗有效量(本文中也称为剂量)可以基于体外测定和/或动物模型研究的结果进行初始估计。举例而言，剂量可以在动物模型中配制以实现包括如在细胞培养物中测定的ic
50
在内的循环范围。该信息可用来更准确地测定在目的个体中有用的剂量。
[0613]
给药有效剂量的组合物可以通过本领域标准途径进行，包括但不限于，肌肉内、肠胃外、静脉内、口服、口含、鼻腔、肺、颅内、骨内、眼内、直肠或阴道途径。本发明的raav的aav组分(特别是aav itr和衣壳蛋白)的给药途径和血清型可以由本领域技术人员考虑被治疗的感染和/或疾病状态以及待表达一个或多个编码序列和/或小肌营养不良蛋白的靶标细胞/组织而选择和/或匹配。
[0614]
具体而言，本文所述的制剂可通过而不限于注射、输液、灌注、吸入、灌洗和/或摄食来给药。给药途径可以包括但不限于，静脉内、皮内、动脉内、腹膜内、病灶内、颅内、关节内、前列腺内、胸膜内、气管内、鼻内、玻璃体内、阴道内、直肠内、外用、肿瘤内、肌肉内、膀胱内、心包内、脐内、眼内、粘膜、口服、皮下和/或结膜下途径。
[0615]
本发明提供有效剂量的raav和包括本发明的联合疗法的本发明的组合物的局部给药和全身性给药。例如，全身性给药是给药至循环系统内，从而影响整个身体。全身性给药包括场内给药诸如通过胃肠道吸收和通过注射、输液或移植进行的肠胃外给药。
[0616]
特定而言，本发明的raav的实际给药可以通过使用任何物理方法实施，该方法将raav重组载体运输至动物的靶标组织诸如骨骼肌内。根据本发明的给药包括但不限于，注射到肌肉内、血流内和/或直接注射到肝脏内。已经证明，将raav简单地重新悬浮在磷酸盐缓冲盐水中足以提供可用于肌肉组织表达的媒介物，并且对于可以与raav共同给药的载体或其他组分没有已知的限制(但在使用raav的正常模式下应避免使dna降解的组合物)。raav的衣壳蛋白可以经修饰，使得raav被靶向至特定目的靶标组织诸如肌肉。见，举例而言，wo 02/053703，其公开内容通过引用并入本文。
[0617]
药物组合物可制备为可注射制剂或外用制剂，以通过透皮转运递送至肌肉。先前已经研发了用于肌肉注射和透皮转运的大量制剂，并且可用于本发明的实践中。raav可以与任何药学上可接受的载体合用以易于给药和处理。
[0618]
待在本文公开的方法中给药的raav的剂量将依据，举例而言，特定raav、给药模式、治疗目标、个体和所靶向的细胞类型而变，并且可通过本领域标准方法测定。
[0619]
给药至特定手术者的实际剂量也可以由医师、兽医或研究者考虑到以下参数来决定：该参数诸如但不限于，物理和生理参数(包括体重)、病症严重程度、疾病类型、先前或并行治疗性干预措施、个体的特发病和/或给药途径。
[0620]
所给药的各raav的滴度可以在约每ml 1
×
106、约1
×
107、约1
×
108、约1
×
109、约1
×
10
10
、约1
×
10
11
、约1
×
10
12
、约1
×
10
13
、约1
×
10
14
至约1
×
10
15
或更多dnase耐药性颗粒(drp)。剂量也可以以病毒基因组(vg)为单位表达(即，分别为1
×
107vg、1
×
108vg、1
×
109vg、1
×
10
10
vg、1
×
10
11
vg、1
×
10
12
vg、1
×
10
13
vg、1
×
10
14
vg、1
×
10
15
vg)。剂量也可以以病毒基因组(vg)每千克(kg)体重表达(即，分别为1
×
10
10
vg/kg、1
×
10
11
vg/kg、1
×
10
12
vg/kg、1
×
10
13
vg/kg、1
×
10
14
vg/kg、1
×
10
15
vg/kg)。测定aav滴度的方法在clark等人，hum.gene ther.10：1031-1039，1999中描述。
[0621]
示例性剂量可以在约1
×
10
10
至约1
×
10
15
载体基因组(vg)/千克体重的范围内。在
一些实施方案中，剂量可包括1
×
10
10
vg/kg体重、1
×
10
11
vg/kg体重、1
×
10
12
vg/kg体重、1
×
10
13
vg/kg体重、1
×
10
14
vg/kg体重或1
×
10
15
vg/kg体重。剂量可包括1
×
10
10
vg/kg/天、1
×
10
11
vg/kg/天、1
×
10
12
vg/kg/天、1
×
10
13
vg/kg/天、1
×
10
14
vg/kg/天或1
×
10
15
vg/kg/天。剂量可以在0.1mg/kg/天至5mg/kg/天、或0.5mg/kg/天至1mg/kg/天、或0.1mg/kg/天至5μg/kg/天或0.5mg/kg/天至1μg/kg/天的范围内。在其他非限制性示例中，剂量可包括1μg/kg/天、5μg/kg/天、10μg/kg/天、50μg/kg/天、100μg/kg/天、200μg/kg/天、350μg/kg/天、500μg/kg/天、1mg/kg/天、5mg/kg/天、10mg/kg/天、50mg/kg/天、100mg/kg/天、200mg/kg/天、350mg/kg/天、500mg/kg/天或1000mg/kg/天。通过在治疗方案的进程(即，几天、几周、几个月等)期间给药单个或多个剂量，可实现治疗有效量。
[0622]
在一些实施方案中，该药物组合物的剂型为10ml的水溶液，具有至少1.6
×
10
13
个载体基因组。在一些实施方案中，该剂型具有至少2
×
10
12
个载体基因组每毫升的效力。在一些实施方案中，该剂型包含无菌水溶液，其包含10mm l-组氨酸ph 6.0、150mm氯化钠和1mm氯化镁。在一些实施方案中，药物组合物是10ml无菌水溶液的剂型，其包含10mm l-组氨酸ph 6.0、150mm氯化钠和1mm氯化镁；并且具有至少1.6
×
10
13
个载体基因组。
[0623]
在一些实施方案中，药物组合物可以是以下剂型：在10ml水溶液中包含介于1
×
10
10
与1
×
10
15
个之间的载体基因组；在10ml水溶液中包含介于1
×
10
11
与1
×
10
14
个之间的载体基因组；在10ml水溶液中包含介于1
×
10
12
与2
×
10
13
个之间的载体基因组；或在10ml水溶液中包含大于或等于约1.6
×
10
13
个载体基因组。在一些实施方案中，该水溶液是无菌水溶液，其包含约10mm l-组氨酸ph 6.0、150mm氯化钠和1mm氯化镁。在一些实施方案中，该剂型具有大于约t1
×
10
11
个载体基因组每毫升(vg/ml)、大于约1
×
10
12
vg/ml、大于约2
×
10
12
vg/ml、大于约3
×
10
12
vg/ml或大于约4
×
10
12
vg/ml的效力。
[0624]
在一些实施方案中，至少一个aav载体作为药物组合物的一部分提供。药物组合物可包含，举例而言，至少0.1％w/v的aav载体。在一些其他实施方案中，药物组合物可包含2％至75％之间的化合物(按所述药物组合物重量计)，或25％至60％之间的化合物(按所述药物组合物重量计)。
[0625]
在一些实施方案中，该剂型在试剂盒中。试剂盒可进一步包括该剂型的使用指南。
[0626]
处于肌肉注射的目的，可采用处于佐剂诸如芝麻油或花生油中或处于水性丙二醇中的溶液，以及无菌水溶液。如果需要，可以缓冲这种水溶液，并且首先使液体稀释剂与盐水或葡萄糖等渗。作为游离酸(dna含有酸性磷酸基团)或药学上可接受的盐的raav溶液可以在与表面活性剂(诸如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。raav的分散液也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备。在正常储存和使用条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。就此而言，所采用的无菌含水介质都可以通过本领域技术人员熟知的标准技术容易地获得。
[0627]
在一些实施方案中，对于注射，制剂可制成水溶液，例如缓冲液，包括但不限于汉克斯溶液、林格溶液和/或生理盐水。溶液可含有配制剂，诸如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。替代性地，制剂可以是冻干和/或粉末形式，以便在使用前与合适的载体对照物(例如，无菌无热原水)构建。
[0628]
本文公开的任何制剂可有利地包含任何其他药学上可接受的载体，该载体包含不会产生可能超过给药益处的显著不良、过敏或其他不良反应的载体，无论是用于研究、预防
和/或治疗。示例性药学上可接受的载体和制剂公开于remington’s pharmaceutical sciences，18th fd.，mack printing company，1990，针对其关于载体和制剂的教导，该文献通过引用并入本文。此外，制剂的制备可能符合美国食品和药物管理局生物标准和质量控制司和/或其他相关美国和外国监管机构要求的无菌性、热原性、一般安全性和纯度标准。
[0629]
示例性的、通常使用的药学上可接受的载体可包括但不限于，填充剂或填料、溶剂或助溶剂、分散介质、涂层、表面活性剂、抗氧化剂(例如抗坏血酸、蛋氨酸和维生素e)、防腐剂、等渗剂、吸收延迟剂、盐、稳定剂、缓冲剂、螯合剂(例如，edta)、凝胶、粘合剂、粘合剂、凝胶、粘合剂等，崩解剂和/或润滑剂。
[0630]
示例性缓冲剂可包括但不限于，柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、富马酸盐缓冲剂、葡萄糖酸盐缓冲剂、草酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂，磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂和/或三甲胺盐。
[0631]
示例性防腐剂可包括但不限于苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基本加上丙基、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎氯铵、氯化六甲铵、对羟基苯甲酸烷基酯(诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和/或3-戊醇。
[0632]
示例性等渗剂可包括多元糖醇，其包括但不限于三元或高级糖醇(例如，甘油、赤藓糖醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨醇和/或甘露醇)。
[0633]
示例性稳定剂可包括但不限于，有机糖、多羟基糖醇、聚乙二醇、含硫还原剂、氨基酸、低分子量多肽、蛋白质、免疫球蛋白、亲水聚合物和/或多糖。
[0634]
配制物也可以是积存注射制剂。在一些实施方案中，这种长效制剂可以通过但不限于植入(例如，皮下或肌肉内)或肌肉内注射施用。因此，举例而言，化合物可以用合适的聚合物和/或疏水材料(例如，在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂或微溶衍生物(例如，微溶盐)配制。
[0635]
此外，在多种实施方案中，aav载体可使用缓释系统(例如，包含aav载体的固体聚合物的半透性基质)递送。已经建立了各种缓释材料，并且为本领域普通技术人员所熟知。根据其化学性质，缓释胶囊可能在给药数周后释放载体，最多历经100天。
[0636]
适用于注射用途的药物载体、稀释剂或赋形剂包括用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌水溶液或分散液和无菌粉末。在所有情况下，形式必须是无菌的，并且必须是具有易注射性的流体。它必须在制造和储存条件下稳定，并且必须防止细菌和真菌等微生物的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其含有，举例而言，水、乙醇、多元醇(举例而言，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、其合适混合物和植物油。可以保持适当的流动性，举例而言，通过使用诸如卵磷脂的涂层、在分散体的情况下保持所需的粒径以及通过使用表面活性剂。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来防止微生物的作用，举例而言，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选包括等渗剂，举例而言，糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可通过使用延迟吸收的试剂来实现，举例而言，单硬脂酸铝和明胶。
[0637]
无菌注射溶液的制备方法是，根据需要将所需量的raav与上述各种其他成分一起加入适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌。通常，通过将灭菌活性成分加入无菌载体中来制备分散体，该载体包含基本分散介质和上述所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无
菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该技术产生活性成分粉末加上来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分。
[0638]
用raav转导也可以在体外完成。在一种实施方案中，从个体去除所需的靶标肌肉细胞，用raav转导并重新导入个体。替代性地，在这些细胞不会在个体中产生不适当的免疫应答的情况下，可以使用同源或异种肌肉细胞。
[0639]
适合将转导细胞转导和再导入个体的方法是本领域中已知的。在一种实施方案中，通过将raav与肌肉细胞结合，例如，在适当的培养基中，并使用常规技术(诸如southern印迹和/或pcr)或使用可选择的标志物来筛选含有目的dna的细胞，可以在体外转导细胞。然后可以将转导的细胞配制成药物组合物，并通过各种技术将该组合物引入个体，例如，通过肌肉内、静脉内、皮下和腹腔注射，或通过使用例如导管注射到平滑肌和心肌中。
[0640]
用本发明的raav转导细胞导致所述一个或多个额外编码序列和小肌营养不良蛋白的持续共表达。因此，本发明提供了向动物，优选向人给药/递送共同表达所述一个或多个额外编码序列和小肌营养不良蛋白的raav的方法。这些方法包括用本发明的一种或多种raav转导组织(包括但不限于，组织诸如肌肉，器官诸如肝脏和大脑，以及腺体诸如唾液腺)。可以用包含组织特异性控制元件的基因匣进行转导。举例而言，本发明的一种实施方案提供通过肌肉特异性控制元件引导来转导肌肉细胞和肌肉组织的方法，该控制元件包括但不限于，源自肌动蛋白和肌球蛋白家族的那些，诸如来自myod基因家族(见weintraub等人，science 251：761-766，1991)、肌细胞特异性增强子结合因子mef-2(cserjesi and olson，mol cell biol 11：4854-4862，1991)、源自人骨骼肌动蛋白基因的控制元件(muscat等人，mol cell biol 7：4089-4099，1987)、心肌动蛋白基因、肌肉肌酐激酶序列元件(johnson等人，mol cell biol 9：3393-3399，1989)和鼠肌酐激酶增强子(mck)元件；源自骨骼快速收缩肌钙蛋白c基因、慢速收缩心肌钙蛋白c基因和慢速收缩肌钙蛋白i基因的控制元件：缺氧诱导核因子(semenza等人，proc natl acad sci u.s.a.88：5680-5684，1991)；类固醇诱导元件和启动子，包括糖皮质激素应答元件(grf)(见mader and white，proc.natl.acad.sci.u.s.a.90：5603-5607，1993)；和其他控制元件。
[0641]
肌肉组织是体内dna传递的一个有吸引力的靶标，因为它不是一个重要的器官，很容易抵及。本发明考虑从转导的肌纤维持续共表达mirna和小肌营养不良蛋白。
[0642]
如本文所用，“肌肉细胞”或“肌肉组织”是指衍生自任何种类肌肉的细胞或细胞组(举例而言，例如来自消化道、膀胱、血管或心脏组织的骨骼肌和平滑肌)。此类肌肉细胞可以是分化的或未分化的，诸如成肌细胞、心肌细胞、肌管、心肌细胞和成心肌细胞。
[0643]
术语“转导”用来指在体内或体外经由本发明的复制缺陷型raav将该一个或多个额外编码序列和小肌营养不良蛋白的编码区域给药/递送至接纳细胞，导致该一个或多个额外编码序列和小肌营养不良蛋白被接纳细胞共表达。
[0644]
因此，本发明提供了向有需要的患者给药有效剂量(或多个剂量，基本上同步给药或间隔给药)的raav的方法，该raav编码所述一个或多个额外编码序列和小肌营养不良蛋白。
[0645]
aav产生
[0646]
编码aav载体的必要复制(rep)和结构性(cap)蛋白的基因已经从aav载体删除，以允许待递送的序列插入到剩余末端重复序列之间。因此，对于aav载体的生长，步进需要递
送辅助病毒，而且需要将编码rep和cap蛋白的基因递送到被感染细胞内。替代性地，编码rep和cap蛋白的基因需要存在于用于生产的细胞内。
[0647]
适用于本发明方法的aav载体可使用本领域公认的任何方法生产。在最近的综述中，penaud-budloo等人(molecular therapy：methods&clinical development vol.8，pages 166-180，2018)提供了对最常用于生产raav的上游方法进行了综述。其中描述的各方法通过引用并入本文。
[0648]
封装细胞系(hek293)的瞬时转染
[0649]
特定而言，在某些实施方案中，使用封装细胞系诸如hek293细胞的瞬时转染来生产aav载体。这是最成熟的aav生产方法，包括人胚胎hek293细胞的质粒转染。典型地，由载体质粒(含有目的基因，诸如编码肌营养不良蛋白微小基因和一个或多个额外编码序列两者的受试多核苷酸)和一种或多种辅助质粒，使用磷酸钙或聚乙烯亚胺(pei)(一种阳离子聚合物)对hek293细胞进行同步转染。
[0650]
辅助质粒允许表达四种rep蛋白，三种aav结构性蛋白vp1、vp2和vp3，aap，和腺病毒辅助功能e2a、e4和varna。raav复制所需的额外腺病毒e1a/e1b辅因子在hek293分泌细胞中表达。rep-cap和腺病毒辅助序列在两种分开的质粒上克隆或组合在一种质粒上，因此，用于转染的三质粒系统和双质粒系统两者都是可能的。三质粒方案使得cap基因具有多功能性，可以轻易地从一种血清型切换为另一种。
[0651]
质粒一般通过常规技术使用细菌起源和抗生素耐药基因在大肠杆菌中生产或通过微环技术生产。
[0652]
在粘附hek293细胞中的瞬时转染已经用于raav载体的大规模制造。最近，hek293细胞也已适应悬浮条件以使其长期在经济上可行。
[0653]
hek293系一般在以l-谷氨酰胺、5％至10％胎牛血清(fbs)和1％青霉素-链霉素补充的dmem中繁殖，但在无血清悬浮液f17、expi293和其他特定于制造的培养基中维持的悬浮hek293细胞除外。对于粘附细胞，fbs的百分比可在aav生产过程中减少，以便限制由动物来源组分造成的污染。
[0654]
通常，raav载体在质粒转染后48至72小时从细胞沉淀物和/或上清液中回收，取决于血清型。
[0655]
用重组杆状病毒感染昆虫细胞
[0656]
杆状病毒-sf9平台已经构建为在哺乳动物细胞内的gmp相容且可放大的替代性aav生产。它可以在粗制收获品中生成高达2
×
105个病毒基因组每细胞。
[0657]
当前方案涉及用两种重组杆状病毒感染sf9昆虫细胞，一种杆状病毒表达载体(bfv)允许进行rep78/52和cap的合成，而一种重组杆状病毒携带侧翼具有aav itr的目的基因。几种无血清培养基适应sf9细胞悬浮生长。
[0658]
考虑到以下这些安全性问题，双杆状病毒-sf9生产系统与其他生产平台相比具有很多优势：(1)使用无血清培养基；(2)尽管在sf细胞系中发现了外来病毒转录物，但大多数感染昆虫的病毒在哺乳动物细胞中不主动复制；和(3)在昆虫细胞中进行raav生产不需要除杆状病毒外的辅助病毒。
[0659]
在某些实施方案中，使用表达rep和cap蛋白的稳定的sf9昆虫细胞系，因此需要仅感染一种重组棒状病毒，从而以高产率进行感染性raav载体的生产。
[0660]
用rhsv载体感染哺乳动物细胞
[0661]
hsv是用于在允许细胞中进行aav复制的辅助病毒。因此，hsv既可作用辅助病毒也可用作穿梭病毒来递送支持aav基因组复制的必要aav功能并封装到生产细胞。
[0662]
基于用rhsv共感染的aav生产可有效地生成大量raav。除了总体产率高(高达1.5
×
105vg/细胞)外，该方法进一步在创建raav原液中具有优势，如该原液具有明显增加的质量，如通过改善的病毒效力所测量。
[0663]
在这一方法中，典型使用两种rhsv感染仓鼠bhk21细胞系或hek293和衍生物，一种rhsv携带由aav itr托架的目的基因(rhsv-aav)，且第二种具有所期望血清型的aav rep和cap orf(rhsvrepcap)。2至3天后，收集细胞和/或培养基，并历经多个纯化步骤纯化raav以去除细胞杂质、hsv源性污染物和未封装的aav dna。
[0664]
因此在一些实施方案中，hsv作为辅助病毒用于aav感染。在一些实施方案中，使用icp27缺失的hsv的非复制突变体实施aav生长。
[0665]
用于在哺乳动物细胞中生产重组aav病毒颗粒的某些方法已经在本领域中已知并历经过去十年改善。举例而言，美国专利申请公开号20070202587描述在哺乳动物细胞中的重组aav生产，该生产基于用两种或更多种复制缺陷性重组hsv载体对细胞的共感染。美国专利申请公开号20110229971和thomas等人(hum.gene ther.20(8)：861-870，2009)描述了使用1型重组hsv共感染悬浮适应的哺乳动物细胞的可放大的重组aav生产方法。adamson-small等人(hum.gene ther.methods 28(1)：1-14，2017)描述使用hsv系统在无血清悬浮液制造平台中的改良aav生产方法。
[0666]
哺乳动物稳定细胞系
[0667]
也可使用稳定低表达rep和cap基因的稳定哺乳动物分泌细胞有效地且可放大地生产raav载体。此类细胞可由野生型ad5辅助病毒(其在基因上稳定并且可以以高滴度轻易地生产)感染，以诱导rep和cap的高水平表达。感染性raav载体可在用野生型ad 5型感染这些封装细胞系时生成，并且通过质粒转染或在用重组ad/aav杂交病毒感染后提供raav基因组。
[0668]
替代性地，ad可由作为辅助病毒的hsv-1替代。
[0669]
合适的温度哺乳动物分泌细胞可包括hela源性分泌细胞系、a549细胞或hek293细胞。优选的hela细胞系是helas3细胞，一种悬浮适应的hela亚克隆。
[0670]
本文所述的方法可用来在无动物组分培养基中制造受试aav载体，优选以250-l规模，或2,000-l商业规模。
[0671]
实施例
[0672]
实施例1：来自多组分构造体的编码序列的体外表达
[0673]
本发明的多组分病毒载体不仅能够表达关注的功能性基因或蛋白质(goi)，而且能够表达某些rnai、反义序列、sgrna、mirna或其抑制剂的一个或多个编码序列。本发明的重组病毒载体的一种代表性、非限制性构象例示在图1中。举例而言，本发明的重组病毒载体可以是多组分aav载体，诸如aav9载体，其经设计为表达一种版本的功能性肌营养不良蛋白基因，诸如上文所述的任一种μdys基因。相同多组分载体也表达一个或多个额外编码序列，该一个或多个额外编码序列来自定位在goi启动子与最接近的itr序列之间的独立的/多组分转录单元(见图1)。换言之，该一个或多个额外编码序列中的至少一者从不同于goi
启动子(诸如肌肉特异性ck8启动子)的独立的/多组分启动子转录。多组分转录单元的转录方向可能与goi启动子相反。受试多组分载体的设计允许对goi转录单元和多组分转录单元进行独立且分开的控制，因此提供对分开的转录单元表达的更大灵活性和控制。
[0674]
在额外编码序列编码mirna诸如mir-29c的情况下，mir-29c编码序列的主链序列可经修饰，使得成熟mir-29c序列的围绕序列获自其他mirna，诸如mir-30、mir-101、mir-155或mir-451的围绕序列(见上文)。已经发现，将mir-29c的天然围绕序列替换为来自mir-30、mir-101、mir-155或mir-451的那些可以增强设计为靶向mir-29c靶标序列的mir-29c的一条链(例如，向导链)的产生(即，减少对于靶向mir-29c靶标序列而言没有用的其互补过客链的产生)。
[0675]
作为对照，在同一载体背景上生成数种所谓mir-29c“单组分”表达构造体。这些mir-29c单组分表达构造体不表达μdys基因，但可以代之以表达报告基因诸如egfp或gfp。
[0676]
举例而言，一种该单组分载体可表达插入到egfp编码序列上游的内含子序列中的mir-29c编码序列，其全部来自ef1a启动子。mir-29c编码序列的主链序列可通过mir-30、mir-101、mir-155或mir-451的主链序列修饰。
[0677]
另一种该单组分载体可表达shrna，诸如靶向/下调sln表达的shsln。shrna的表达可由可通过rna pol iii使用的u6启动子驱动，这生产短rna转录物的强转录。shrna编码序列可以插入u6转录匣中的内含子内，在gfp的编码序列之前。
[0678]
作为比较，如2019年12月11日提交的过继专利申请号pct/us2019/065718中所述的几种所谓“融合”载体也可包括在这一实验中。
[0679]
具体而言，几种代表性多组分、融合或单组分载体用来在体外转染人ips源性心肌细胞，并且测定了被感染心肌细胞中的mir-29c表达，且结果显示在图2中。
[0680]
具体而言，根据标准过程，将五种单组分构造体、五种融合构造体、三种多组分构造体和两种表达μdys的对照构造体经转染到人ips源性心肌细胞。成熟mir-29c水平经由taqman环圈qpcr测量。所测试的五种单组分构造体包括u6或ef1a驱动的mir-29c表达匣，该表达匣设计在mir-30(ef1a-29c-m30e和u6-29c-m30e)和mir-155(ef1a-29c-19nt和ef1a-29c-155)主链中。所测试的五种融合构造体包括mir-29c表达匣，该表达匣设计在mir-101(μdys-29c-101-i2&μdys-29c-3utr-101)、mir-30(μdys-29c-m30e-i2)和mir-155(29c-19nt-μdys-3utr&29c-19nt-μdys-pa)主链中，插入到内含子(i2)内、3’utr(3utr)内和相对于μdys表达匣的pa(pa)位点位置之后。三种多组分构造体(多组分-29c-v1、多组分-29c-v2和多组分-29c-v5)全部从由pol iii(u6)启动子驱动的多组分表达匣表达mir-29c。
[0681]
很明显，与其中使用类似构造体来仅表达μdys(并因此仅存在背景水平的内源性mir-29c表达)的对照相比，融合构造体通常在被感染的人ips源性心肌细胞中以2至11倍的系数过表达mir-29c。
[0682]
用来生成图2中的数据的特异性融合构造体包括：
[0683]
29c-19nt-μdys-3utr：mir-155主链中的经修饰的mir29c，插入μdys表达匣的3
’‑
utr区域内(在polya腺苷酰化信号序列前)。
[0684]
29c-19nt-μdys-pa：相同的经修饰的在mir-155主链中的mir29c编码序列，插入在μdys表达匣的polya腺苷酰化信号序列之后。
[0685]
μdys-29c-m30e-i2：经修饰的在mir-30e主链中的mir29c编码序列，插入在μdys表
达匣的内含子区域内。
[0686]
μdys-29c-101-i2：经修饰的在mir-101主链中的mir29c编码序列，插入在μdys表达匣的内含子区域内。
[0687]
μdys-29c-3utr-101：经修饰的在mir-101主链中的mir29c编码序列，插入在μdys表达匣的3
’‑
utr区域内。
[0688]
同时，与仅表达μdys的相同对照载体相比，表达mir-29c的单组分构造体通常在被感染的人ips源性心肌细胞中以6至73倍的系数过表达mir-29c。
[0689]
用来生成图2中的数据的特异性单组分构造体包括：
[0690]
ef1a-29c-m30e：mir-30e主链中的经修饰的mir29c编码序列，由ef1a启动子驱动。
[0691]
u6-29c-m30e：mir-30e主链中的经修饰的mir29c编码序列，由pol iii u6启动子驱动。
[0692]
u6-29c-v1：mir29c编码序列，由pol iii u6启动子驱动。
[0693]
ef1a-29c-19nt：mir-155主链中的经修饰的mir29c编码序列，由ff1a启动子驱动。
[0694]
ef1a-29c-155：mir-155主链中的另一个经修饰的mir29c编码序列，由ef1a启动子驱动。
[0695]
三种多组分构造体全部表达高至非常高水平的mir-29c转录物，其中v2构造体达到融合构造体μdys-29c-m30e-i2的最高水平，而v1和v5多组分构造体两者均达到单组分构造体的最高水平(50至70倍)。见图2。
[0696]
当在其他体外细胞系统中评价这些构造体时获得了指示从这些构造体(优先)生产mir-29c的类似趋势，该细胞系统包括mouly人健康原代成肌细胞、小鼠c2c12永生化成肌细胞系和小鼠成纤维细胞nih3t3细胞，全部没有来自相同载体的μdys表达的变化(数据未显示)。因此，将mir-29c表达匣插入受试多组分载体(其也含有μdys表达匣)内部引起μdys mrna生产的显著减少(如果有)。
[0697]
一些选定的在aav9病毒颗粒中的多组分重组病毒载体(多组分-29c-v1、多组分-29c-v2和多组分-29c-v5)也用来感染分化的c2c12肌管和原代小鼠心肌细胞，并且也在这些细胞中确认了mir-29c表达。见图3，其中结果表达为在针对仅表达μdys的对照进行归一化后的相对mir-29c表达。
[0698]
在这一实验中，相对于对照组，μdys生产似乎在很大程度上不受影响。此外，mir-29c过客链水平未显示增加的水平。
[0699]
同时，来自受试多组分构造体的shmsln表达和所得的在由此类多组分构造体转染的小鼠c2c12细胞中小鼠sln-萤火虫构造体水平的约90％下调显示在图4中。
[0700]
图4中使用的各种构造体描述如下。
[0701]
μdys：仅编码μdys(goi)的对照aav9载体。
[0702]
ef1a-msln：仅表达靶向小鼠sln(msln)的shrna的单组分构造体。shrna编码序列的转录由ef1a启动子驱动。
[0703]
ff1a-msln：仅表达靶向小鼠slnshrna的另一种单组分构造体。shrna编码序列的转录由ff1a启动子驱动。
[0704]
msln-shrna对照：靶向小鼠sln的商用阳性对照shrna。
[0705]
混杂：具有阳性对照shrna的混杂序列的商用阴性对照shrna。
[0706]
四种多组分构造体(多组分_v1至多组分_v4)描述如上。
[0707]
与实现约50％msln表达敲低的融合构造体(数据未显示)相比，受试多组分构造体在基于双重荧光素酶的测定法中一贯地实现》90％msln敲低，其中结果表达为来自萤火虫荧光素酶的rlu(相对荧光素酶单位)与来自海肾荧光素酶的rlu的比率。图4中的结果显示，与仅表达μdys但不表达针对msln的shrna的对照(μdys)相比(归一化比率为1.0)，全部四种所测试的表达靶向msln的shrna的多组分构造体(多组分-v1、多组分-v2、多组分-v3和多组分-v4)各自将msln表达敲低》90％。相比之下，在类似的基于双重荧光素酶的测定法中，ef1a-msln和ef1a-mslnv2融合构造体分别将msln敲低约50％至30％。msln-shrna阳性对照类似地敲低约80至90％msln表达，而混在对照无效应。见图4。
[0708]
图5显示多种编码shmsln的重组aav9载体在分化的c2c12肌管或小鼠原代心肌细胞中的sisln相对表达水平(经处理的来自所转录的shsln的sirna产物)，该载体作为病毒载体的唯一编码序列(“单组分”)或作为本公开的多组分构造体(“多组分”)的一部分。sirna产生经由定制taqman颈环qpcr系统进行定量。单组分和多组分构造体的相对sisln表达水平针对μdys对照组中的水平进行归一化，但由于对照组中sisln样rna产生几乎不存在或非常小，明显的高倍变化可能没有信息。尽管如此，很明显，在所测试的两种细胞类型中，单组分构造体表达与对照组相比高约1000倍水平的来自强u6 pol iii启动子的sisln。同时，所测试的多组分构造体达到与单组分构造体相比类似的高(如果不是更高)水平的sisln。
[0709]
全部多组分aav构造体均具有在很大程度上与仅表达μdys的单组分构造体具有可比性的aav产率。
[0710]
也在人ips源性心肌细胞中测试大量表达靶向人sln的shrna的额外单组分和多组分构造体。这些包括靶向人sln的6种单组分构造体和6种多组分构造体。这些实验的结果总结在图6中。
[0711]
具体而言，在图6的实验中使用几种阴性对照(例如，多种μdys和gfp质粒)和阳性对照。阴性对照包括：两种表达单独的μdyse的构造体(μdys1和μdys2)，其对于sln mrna的表达水平无效应；在肌肉特异性启动子ck8下表达gfp的构造体(ck8-gfp)，其gfp也对于sln mrna表达无效应；和“总混杂(sigma scramble)”，即表达靶向hsln的shsln的混杂序列的构造体，其在意料之中地对于sln mrna表达无效应。阳性对照是“sigma shrna”，这是一种可从sigma商购的shrna质粒，其编码靶向hsln的shsln，将hsln mrna下调约80％。
[0712]
测试了六种单组分构造体，其各自表达一个版本的靶向hsln的shrna并且各自在强pol iii u6启动子的转录控制下，并且显示将hsln mrna表达下调约80至90％。
[0713]
跨本发明的6种单组分构造体和4种多组分构造体，也观察到了高达90至95％的hsln mrna表达下调。举例而言，combo-c1-v1构造体是一种多组分构造体，其共表达μdys和靶向hsln的shrna。当用这一构造体感染人ips源性心肌细胞时，高达90％的hsln mrna被敲低。对于三种其他combo构造体，即combo-c1-v2、combo-c2-v1和combo-c2-v2，观察到了相同结果。
[0714]
在原代小鼠心肌细胞中也获得了类似结果，其中施用本发明的表达靶向msln的shrna的单组分或多组分aav9构造体，得到高达90％的msln mrna表达敲低。见图7。
[0715]
尽管多组分构造体极大地影响hsln mrna表达，但它们对于来自相同载体的μdys
表达似乎不具有负面影响。如图8中所示，将靶向人sln的6种单组分构造体和6种多组分构造体转染到来源于人ips的心肌细胞。大多数多组分构造体显示于对照仅μdys构造体在很大程度上类似的(》50％)μdys mrna表达。
[0716]
对选定的单组分、融合和多组分构造体的变性琼脂糖凝胶分析也确认，这些mir-29c或shsln构造体的aav9基因组在很大程度上是完整的。见图9。此外，整个图9中的全部基于aav9的单组分、融合和多组分载体，全部三种aav9衣壳蛋白vp1至vp3的比率相同。见图10。
[0717]
这些结果表明，从个体多组分载体产生的aav9病毒载体，如融合载体，具有基因组完整性。
[0718]
实施例2：来自多组分构造体的编码序列的体内表达
[0719]
这一实验表明，受试多组分构造体如融合构造体可用来同步地表达μdys和一种或多个额外编码序列，该额外编码序列影响分开的通路(例如，sln的下调和/或mir-29c的上调)以实现比单分子更佳(如果不是协同性的)疗效。
[0720]
在这一组实验中，使用几种编码μdys基因以及第二编码序列(mir-29c和靶向小鼠sln的shmsln)的aav9的融合和多组分构造体。将这些融合和多组分构造体经由尾静脉以约5e13vg/kg(除了一个组，即u6-29c-v1以1e14vg/kg)的剂量注射到6周龄雄性mdx小鼠体内。然后，在注射后历经28天时间段监测μdys、mir-29c和sln mrna的表达。详细的实验设置总结如下：
[0721]
组类型名称动物数量mirμdysμdys4mirsolou6-29c-v14mir融合μdys-29c-m30e-i24mir融合μdys-29c-101-3utr4mir多组分多组分-29c-v13mir多组分多组分-29c-v22mir多组分多组分-29c-v54mir单组分-1e14u6-29c0v1(2
×
)2mir对照对照4shslnμdysμdys4shsln单组分u6-shmsln-v14shsln融合μdys-shmslnv24shsln多组分多组分-shmsln-v14shsln多组分多组分-shmsln-v22
[0722]
在mir-29c实验组中发现，两种所述测试的融合构造体，一种在m30e主链中并且插入到backbon μdys表达匣的内含子内，而一种在mir-101主链中并且插入到μdys表达匣的3
’‑
utr内，在左腓肠肌(见pct/us2019/065718的图20a)、膈膜(见pct/us2019/065718的图20b)和左心室(见pct/us2019/065718的图20c)中导致1.4至2.8倍的mir-29c上调。mir-29c-μdys融合aav9构造体以5e13vg/kg剂量给药。单组分u6启动子驱动的在aav9中的mir-29c构造体以5e13vg/kg剂量产生2至11倍的上调，且以1e14vg/kg剂量产生6至16倍的上调。
[0723]
同时，由融合aav9构造体所致的mir-29c上调并未在腓肠肌(见pct/us2019/065718的图21)、膈膜(数据未显示)和左心室(数据未显示)中导致μdys产生的减少在rna和蛋白质两种水平上，融合aav9构造体均显示与对照仅μdys aav9构造体类似的μdys表达。仅表达mir-29c的单组分构造体不产生μdys，因此显示不存在μdys水平。
[0724]
类似地，发现三种所测试的多组分构造体(多组分-29c-v1、多组分-29c-v2和多组分-29c-v5)导致左腓肠肌中的2至6倍mir-29c上调(图11上图)、膈膜中的高达5.8倍mir-29c上调(图11下左图)和左心室中的高达7.5倍mir-29c上调(图11下右图)。
[0725]
有趣的是，可以在血浆中检测到增加的mir-29c表达水平(图12)，表明mir-29c的血清/血浆水平可用作生物标志物来示踪mir-29c表达水平。
[0726]
由多组分aav9构造体所致的mir-29c上调也未在左腓肠肌(图13左图，对于rna；右图，对于蛋白质)、膈膜(数据未显示)和左心室(数据未显示)中导致μdys产生的减少。在rna和蛋白质两种水平上，多组分aav9构造体均显示与对照仅μdys aav9构造体类似的μdys表达。仅表达mir-29c的单组分构造体不产生μdys，因此显示可忽略的μdys水平。
[0727]
在shmsln实验组中，发现所测试的shmsln融合aav9构造体导致膈膜、左腓肠肌和心房中高达50％的msln mrna下调(见pct/us2019/065718的图22)以及舌中的下调(数据未显示)。类似地，由融合aav9构造体所致的在rna和蛋白质两种水平的msln mrna下调并未在腓肠肌(见pct/us2019/065718的图23)、膈膜(数据未显示)和左心室(数据未显示)中导致μdys产生的减少，与仅表达μdys的对照aav9相比。仅表达shmsln的单组分构造体不产生μdys，因此显示不存在dys水平。显示了膈膜结果。在舌和心房中的类似结果。
[0728]
类似地，发现两种所测试的shmsln多组分aav9构造体(多组分-shmsln-v1和多组分-shmsln-v2)导致膈膜中高达75％的msln mrna下调(图14上图)、左心房中高达95％的msln mrna下调(图14下左图)和左腓肠肌中高达80％的msln mrna下调(图14下右图)，以及舌中的下调(见图16)。在这些实验中独立地确认了sirna产生。
[0729]
由一种多组分aav9构造体所致的msln mrna下调也未导致膈膜中(图15左图，对于rna，右图，对于蛋白质)、舌中(图16左图)和心房中(数据未显示)在rna和蛋白质两种水平的μdys产生的减少，与仅表达μdys的对照aav9相比；但多组分-shmsln-v2构造体将左腓肠肌中的μdys表达减少60至70％。仅表达shmsln的单组分构造体不产生μdys，因此显示不存在dys水平。
[0730]
这些数据显示，受试多组分构造体可同步地既表达μdys基因又表达至少一种额外编码基因诸如mir-29c或针对sln的shrna，因此实现与仅表达一种编码序列诸如μdys的病毒载体相比更佳的治疗结果。
[0731]
实施例3：从多组分构造体在体内表达的编码序列具有生物活性
[0732]
本实验表明，从本发明的多组分构造体表达的编码序列具有生物活性。
[0733]
肌营养不良蛋白为肌肉细胞膜提供结构稳定性，并且增加的肌纤维膜渗透性导致肌酸激酶(ck)从肌肉纤维释放。因此，增加的肌酸激酶(ck)水平是肌肉损伤的标志。在dmd患者中，ck水平显著增肌，高于正常水平(例如，是自出生以来的正常水平的10至100倍)。同样，血清ck水平也被认为是mdx小鼠模型中肌肉健康的评量标准。
[0734]
本实验中的数据显示，aav9的mir-29c单组分(以1e14vg/kg的高剂量给药)和mir-29c-μdys多组分(以5f13vg/kg剂量给药)构造体两者均使mdx小鼠模型中的血清ck水平减
少，减少至与μdys对照相比类似的程度，因此表明在dmd中表达mir-29c的治疗性受益。
[0735]
具体而言，在实施例2的体内实验中，也测定了各组小鼠的血清ck水平。图17显示，单独表达μdys造成血清ck水平的显著下降。使用全部三种所测试的多组分构造体共表达μdys和mir-29c，也导致血清ck水平的类似的显著下降。有趣的是，单独表达mir-29c也导致血清ck水平的显著降低，尤其是当使用较高的病毒剂量(表达mir-29c的单组分构造体的剂量)时。
[0736]
在图18中，来自单组分构造体或多组分构造体的shmsln的表达似乎未减少血清ck水平。
[0737]
另一方面，金属蛋白酶组织抑制因子-1(timp-1)已被提议作为监测duchenne肌营养不良症(dmd)患者的疾病进展和/或治疗效果的血清生物标志物，因为dmd患者的timp-1血清水平显著高于健康对照组。类似地，timp1也是mdx小鼠模型中肌肉健康的血清标志物。
[0738]
因此，在实施例2的体内实验中，也测定了各组mdx小鼠的血清timp1水平。pct/us2019/065718的图25左图中显示，单独表达μdys造成血清timp1水平的显著下降。使用两种所测试的融合构造体共表达μdys和mir-29c，也导致血清timp1水平的类似的显著下降。同样，单独表达mir-29c未导致血清timp1水平的降低，甚至是当使用较高的病毒剂量(表达mir-29c的单组分构造体的剂量)时。
[0739]
同样，pct/us2019/065718的图25右图显示，单独表达μdys造成血清timp1水平的显著下降。使用所测试的融合构造体共表达μdys和针对msln的shrna，也导致血清timp1水平的类似的显著降低。同样，单独地表达针对msln的shrna并未导致血清timp1水平的降低。
[0740]
这里，从多组分构造体获得了类似的结果。在图19左图中，单独的μdys的表达造成血清timp1水平的显著下降。使用全部三种所测试的多组分构造体共表达μdys和mir-29c，也导致血清timp1水平的类似的显著下降。同样，单独表达mir-29c未导致血清timp1水平的降低，甚至是当使用较高的病毒剂量(表达mir-29c的单组分构造体的剂量)时。
[0741]
同样，在图19右图中，单独表达μdys造成血清timp1水平的显著降低。使用所测试的多组分构造体共表达μdys和针对msln的shrna，也导致血清timp1水平的类似的显著降低。同样，在单组分构造体中单独地表达针对msln的shrna并未导致血清timp1水平的降低。
[0742]
实施例4：与对照构造体相比，多组分构造体在腓肠肌中显示可比的生物分布
[0743]
在实施例2的体内实验中，多组分病毒载体的肝脏水平与仅表达μdys的单组分病毒载体的生物分布相比。发现所使用的大多数病毒载体在腓肠肌中的生物分布在很大程度上相似，无论该多组分构造体是否表达mir-29c或shmsln。见图20。然而，与μdys单组分构造体相比，一种编码shmsln的多组分载体似乎更低。
[0744]
实施例5：两种多组分构造体显示肝脏中的生物分布减少
[0745]
在实施例2的体内实验中，多组分病毒载体的肝脏水平与仅表达dys的单组分病毒载体的肝脏水平相比。发现所使用的大多数病毒载体的病毒滴度在肝脏中或多或少地较低，无论该多组分构造体是否表达mir-29c或shsln。见图21。唯一的例外似乎是表达mir-29c的div-29c-载体，其明显地具有与dys单组分构造体相同(如果不是更高)的病毒滴度。
[0746]
为了确定肝损伤是否是肝脏中滴度明显较低的原因，对多个由多组分载体感染的组评估血浆alt水平。图22中的结果显示，肝损伤不可能是肝脏中滴度较低的原因，因为在肝脏中滴度较低的两种多组分构造体，即div-29c-v1和div-29c-v2，两者具有与pbs对照可
比(如果不是更低)的血浆alt水平。
[0747]
实施例6：与μdys单一疗法相比，使用多组分构造体增强了疗效
[0748]
为了确定μdys与mir-29c的共表达是否导致更佳的疗效和/或更少的并发症诸如纤维化，在用实施例2中的多种多组分、单组分或对照构造体给药的小鼠中检查两种纤维化标记基因col3a1和fn1的表达水平。col3a1表达和fn1表达已经用作纤维化活性的标志物。
[0749]
在膈膜中，仅表达μdys或mir-29c的单组分aav9载体导致纤维化标记基因col3a1的表达下降约35-50％。较高剂量的单组分mir-29c构造体(以1e14vg/kg)将col3a1表达进一步减少至对照载体的约1/3(图23上左图)。多组分构造体中的一种，即div-29c-v1，将col3a1水平剧烈减少了超过90％，鉴于单独的μdys和mir-29c导致的减少水平，这是出乎意料的。其他多组分载体，即div-29c-v5，将col3a1表达减少至与mir-29c单组分构造体u6-29c-v1相同的程度。
[0750]
其他纤维化基因fn1的表达也减少，但程度较小。尽管单独的μdys构造体似乎显著减少膈膜中的fn1表达，mir-29c单组分构造体在5e13vg/kg的正常剂量下确实适度地将fn1表达减少约25％，并且在1e14vg/kg的高剂量下减少超过50％。两种多组分载体以介于正常与高滴度mir-29c之间的水平减少fn1表达。
[0751]
然而，在左腓肠肌中，μdys将col3a1的表达水平减少超过50％，但mir-29c以正常滴度明显地增加约50％且以高滴度增加100％。两种多组分载体将左腓肠肌中的col3a1表达减少至约恰好低于50％。
[0752]
对于左腓肠肌中的fn1表达，观察到了类似的结果。在该处，尽管μdys减少fn1表达且mir-29c增加fn1表达，但与单独的μdys相比，两种多组分载体出乎意料地将fn1表达减少至相同程度(如果不是更好)。
[0753]
但应注意，在这一年龄的mdx小鼠(即，10周)纤维化典型仅在膈膜中表现。从纤维化角度来看，腓肠肌很大程度上是“正常的”。
[0754]
这些结果显示，基于本发明的多组分构造体对这两种纤维化标志物基因的效应，多组分构造体在膈膜中获得了比单独的μdys构造体增加的获益，并且在左腓肠肌中也可能如此。
[0755]
实施例7：基于酶的基因编辑的递送：crispr/cas和sgrna/crrna
[0756]
受试病毒载体，例如，raav病毒载体，可用来将crispr/cas9或crispr/cas12a(或其他经工程改造或修饰的cas酶或其同源物)与一种或多种sgrna(对于cas9)或一种或多种crrna(对于cas12a)一起递送至靶标细胞，用于靶标细胞中靶标基因的同步敲低。靶标细胞趋性可部分地通过crispr/cas和grna/crrna编码序列驻留在其内的病毒颗粒的趋性进行控制。
[0757]
举例而言，对于与aav介导的递送，受试病毒载体中的goi可以是crispr/cas9或crispr/cas12a的编码序列。可分别加载到cas9或cas12a上的该一种或多种sgrna或crrna可以从多组分表达匣、内含子、3
’‑
utr和/或cas9/cas12a的表达匣中的其他处表达。
[0758]
在用受试病毒载体(例如，aav载体)感染靶标细胞后，cas蛋白和sgrna/crrna在靶标细胞内共表达以介导基因编辑。

技术特征：
1.一种重组病毒载体，其包含：a)第一转录匣，其用于在可操作地连接的第一控制元件的控制下表达第一目的基因(第一goi)；b)第二转录匣，其用于在可操作地连接的第二控制元件的控制下表达第二目的基因(第二goi)；其中，所述第一转录匣和所述第二转录匣在序列中不重叠，并且所述第一控制元件和所述第二控制元件分别在彼此背离的方向上转录所述第一goi和所述第二goi。2.根据权利要求1所述的重组病毒载体，其中，所述第一目的基因编码野生型或正常基因(例如，密码子优化的野生型或正常基因)，其在疾病或病症中是缺陷性的，并且其中，所述第二目的基因编码拮抗剂，所述拮抗剂靶向所述在疾病或病症中是缺陷性的基因的产物。3.根据权利要求1所述的重组病毒载体，其中，所述第一目的基因并编码crispr/cas酶(例如，cas9、cas12a、cas13a-13d)，并且其中，所述第二目的基因编码一种或多种各自对于靶标序列具有特异性的向导rna(例如，对于cas9，sgrna；或对于cas12a，crrna)。4.根据权利要求1所述的重组病毒载体，其中，所述第一目的基因和所述第二目的基因编码在有益于疾病或病症治疗的不同途径中起作用的产物。5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组病毒载体，其中：a)所述第一goi包含异源内含子序列，其增强下游蛋白质编码序列、所述蛋白质编码序列下游的3'-utr编码区域和聚腺苷酰化(polya)信号序列(例如，aataaa)的表达；b)所述第二goi包含一个或多个编码序列，所述一个或多个编码序列独立地编码：蛋白质、多肽、rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列、基因编辑酶的向导序列、微rna(mirna)和/或mirna抑制剂；并且c)任选地，一个或多个额外编码序列，其插入所述异源内含子序列中和/或所述第一goi的所述3'-utr编码区域中，其中，所述一个或多个额外编码序列独立地编码：蛋白质、多肽、rnai序列(sirna、shrna、mirna)、反义序列、基因编辑酶的向导序列、微rna(mirna)和/或mirna抑制剂。6.根据权利要求1至5中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述重组病毒载体是重组aav(腺相关病毒)载体。7.根据权利要求1至5中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述重组病毒载体是慢病毒载体。8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述第一goi和/或所述第二goi的表达在彼此存在的情况下基本上不受影响。9.根据权利要求1至8中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述第一goi是野生型或正常serpina1编码序列(例如，密码子优化的serpina1编码序列)，并且其中，所述第二goi编码靶向serpina1的突变型等位基因的rnai剂(例如，sirna、shrna或mirna)。10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述serpina1的突变型等位基因是pittsburg等位基因、b(alhambra)等位基因、m(malton)等位基因、s等位基因、m(heerlen)等位基因、m(mineral springs)等位基因、m(procida)等位基因、m(nichinan)等
位基因、i等位基因、p(lowell)等位基因、无效(null)(granite falls)等位基因、无效(bellingham)等位基因、无效(mattawa)等位基因、无效(procida)等位基因、无效(hong kong 1)等位基因、无效(bolton)等位基因、pittsburgh等位基因、v(munich)等位基因、z(augsburg)等位基因、w(bethesda)等位基因、无效(devon)等位基因、无效(ludwigshafen)等位基因、z(wrexham)等位基因、无效(hong kong2)等位基因、无效(riedenburg)等位基因、kalsheker-poller等位基因、p(duarte)等位基因、无效(west)等位基因、s(iiyama)等位基因或z(bristol)等位基因。11.根据权利要求9或10所述的重组病毒载体，其中，所述第一goi是serpina1的密码子优化的野生型或正常编码基因，其具有不同于突变型serpina1的5'-utr和/或3'-utr，并且其中所述rnai剂靶向5'-utr靶标序列、3'-utr靶标序列和/或与serpina1的突变型等位基因相关但不与所述密码子优化的野生型等位基因相关的编码序列靶标序列。12.根据权利要求9至11中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述第一控制元件和/或所述第二控制元件包含肝特异性启动子和/或增强子，诸如apoe增强子和α1-抗胰蛋白酶启动子。13.根据权利要求1至8中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述第一goi为重复序列扩张疾患(red)中缺陷基因的野生型或正常编码序列(例如，red中缺陷基因的经密码子优化的野生型或正常编码序列)，并且其中，所述第二goi编码rnai剂(例如，sirna、shrna或mirna)，该rnai剂靶向red中的缺陷基因的突变型等位基因。14.根据权利要求13所述的重组病毒载体，其中，所述red为具有(超过52个)cag三核苷酸重复序列的突变型atxn3基因所致的脊髓小脑共济失调3(sca3)，并且其中，所述rnai剂靶向与atxn3的突变型而非野生型等位基因特异性地相关的snp。15.根据权利要求13所述的重组病毒载体，其中，所述red为具有(超过52个)cag三核苷酸重复序列的突变型atxn3基因所致的脊髓小脑共济失调3(sca3)，其中，所述第一goi为具有不同于突变体atxn3的5'-utr和/或3'-utr的atxn3的经密码子优化的野生型或正常编码序列；并且其中，所述rnai剂靶向与atxn3的突变型而非经密码子优化的野生型等位基因特异性地相关的5'-utr靶标序列、3'-utr靶标序列和/或编码序列。16.根据权利要求14或15所述的重组病毒载体，其中，所述第一控制元件和/或所述第二控制元件包含神经元特异性启动子和/或增强子(诸如突触蛋白启动子)或天然atxn3启动子。17.根据权利要求13所述的重组病毒载体，其中，所述red分别为sca1、2、3、6、7、8、10、12或17，并且其中，所述rnai剂靶向分别与ataxin-1、ataxin-2、ataxin-3、cacna1、ataxin-7、sca8、sca10、ppp2r2b或tbp的突变型而非野生型等位基因特异性地相关的snp。18.根据权利要求13所述的重组病毒载体，其中，所述red分别为sca1、2、3、6、7、8、10、12或17，其中所述第一goi分别为分别具有不同于突变型ataxin-1、ataxin-2、ataxin-3、cacna1、ataxin-7、sca8、sca10、ppp2r2b或tbp的5'-utr和/或3'-utr的ataxin-1、ataxin-2、ataxin-3、cacna1、ataxin-7、sca8、sca10、ppp2r2b或tbp的经密码子优化的野生型或正常编码序列；并且其中，所述rnai剂靶向分别与ataxin-1、ataxin-2、ataxin-3、cacna1、ataxin-7、sca8、sca10、ppp2r2b或tbp的突变型而非经密码子优化的野生型等位基因特异性地相关的5'-utr靶标序列、3'-utr靶标序列和/或编码序列。
19.根据权利要求13所述的重组病毒载体，其中，所述red为具有(超过50个)ctg三核苷酸重复序列的突变型dmpk基因所致的肌强直性营养不良1型(dm1)，并且其中，所述rnai剂靶向与dmpk的突变型而非野生型等位基因特异性地相关的snp。20.根据权利要求13所述的重组病毒载体，其中，所述red为具有(超过50个)ctg三核苷酸重复序列的突变型dmpk基因所致的肌强直性营养不良1型((dm1)，其中，所述第一goi为具有不同于突变体dmpk的5'-utr和/或1'-utr的dmpk的经密码子优化的野生型或正常编码序列；并且其中，所述rnai剂靶向与dmpk的突变型而非经密码子优化的野生型等位基因特异性地相关的5'-utr靶标序列、3'-utr靶标序列和/或编码序列。21.根据权利要求19或20所述的重组病毒载体，其中，所述第一控制元件和/或所述第二控制元件包含肌肉特异性启动子和/或增强子(诸如dk8启动子)或天然dmpk启动子或普遍存在的启动子。22.根据权利要求1至8中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述第一goi编码野生型或密码子优化的mbnl1基因，并且其中，所述第二goi编码rnai剂(例如，sirna、shrna或mirna)，所述rnai剂靶向在肌强直性营养不良1型(dm1)中由于具有超过50个ctg三核苷酸重复序列而具有缺陷的dmpk基因的突变型等位基因。23.根据权利要求13所述的重组病毒载体，其中，所述red为具有(超过55个)cgg三核苷酸重复序列的突变型fmr1基因所致的脆性x染色体综合征(fxs)，并且其中，所述rnai剂靶向与fmr1的突变型而非野生型等位基因特异性地相关的snp。24.根据权利要求13所述的重组病毒载体，其中，所述red为具有(超过55个)cgg三核苷酸重复序列的突变型fmr1基因所致的脆性x染色体综合征(fxs)，其中，所述第一goi为具有不同于突变体fmr1的5'-utr和/或3'-utr的fmr1的经密码子优化的野生型或正常编码序列；并且其中，所述rnai剂靶向与fmr1的突变型而非经密码子优化的野生型等位基因特异性地相关的5'-utr靶标序列、3'-utr靶标序列和/或编码序列。25.根据权利要求23或24所述的重组病毒载体，其中，所述第一控制元件和/或所述第二控制元件包含神经元特异性启动子和/或增强子(诸如突触蛋白启动子)或天然fmr1启动子。26.根据权利要求1至8中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述第一goi在多特异性启动子(诸如ck8启动子)的控制下编码功能性肌营养不良蛋白质。27.根据权利要求26所述的重组病毒载体，其中，所述第二goi编码一个或多个编码序列，所述编码序列包含外显子跳跃反义序列，所述反义序列诱导缺陷性肌营养不良蛋白的外显子诸如肌营养不良蛋白的外显子45至55或肌营养不良蛋白的外显子44、45、51和/或53的跳跃。28.根据权利要求5至8中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述微rna是mir-1、mir-133a、mir-29c、mir-30c和/或mir-206。29.根据权利要求28所述的重组病毒载体，其中，所述微rna是mir-29c，任选地具有经修饰的侧翼主链序列，所述侧翼主链序列增强经设计用于靶标序列的mir-29c的向导链的加工性。30.根据权利要求29所述的重组病毒载体，其中，所述侧翼主链序列来自或基于mir-30、mir-101、mir-155或mir-451。
31.根据权利要求5至8中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述rnai序列是针对肌脂蛋白的shrna(shsln)。32.根据权利要求5至8中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述rnai序列(sirna、shrna、mirna)、所述反义序列、所述crispr/cas9sgrna、所述crispr/cas12a crrna和/或所述微rna拮抗一种或多种靶标基因的功能，所述一种或多种靶标基因诸如炎症基因、nf-κb信号传导通路的活化剂(例如，tnf-α、il-1、il-1β、il-6、nf-κb(rank)的受体活化剂和toll样受体(tlr)的活化剂)、nf-κb、由nf-κb诱导的下游炎性细胞因子、组蛋白脱乙酰酶(例如，hdac2)、tgf-β、结缔组织生长因子(ctgf)、ollagens、弹性蛋白、细胞外基质的结构性组分、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(g6pd)、肌肉生长抑制素、磷酸二酯酶-5(ped-5)或ace、vegf诱骗受体1型(vegfr-1或flt-1)和造血前列腺素d合成酶(hpgds)。33.根据权利要求5至8中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述异源性内含子序列是seq id no:1。34.根据权利要求1至33中任一项所述的重组病毒载体，其中，所述载体是血清型aav1、aav2、aav4、aav5、aav6、aav7、aavrh74、aav8、aav9、aav10、aav 11、aav 12或aav 13的重组aav载体。35.一种组合物，其包含根据权利要求1至34中任一项所述的重组病毒载体。36.根据权利要求35所述的组合物，其是药物组合物，进一步包括治疗上相容的载体、稀释剂或赋形剂。37.根据权利要求36所述的组合物，其中，所述治疗上可接受的载体、稀释剂或赋形剂是无菌水溶液，其包含10mm l-组氨酸ph 6.0、150mm氯化钠和1mm氯化镁。38.根据权利要求36或37所述的组合物，其剂型为约10ml的水溶液，具有至少1.6
×
10
13
个载体基因组。39.根据权利要求36至38中任一项所述的组合物，具有每毫升至少2
×
10
12
个载体基因组的效力。40.一种生产根据权利要求35至39中任一项所述的组合物的方法，包括在细胞内生产所述重组病毒载体(例如，所述重组aav载体)以及裂解所述细胞以获得所述载体。41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述载体是血清型aav1、aav2、aav4、aav5、aav6、aav7、aavrh74、aav8、aav9、aav10、aav11、aav 12或aav 13的重组aav载体。42.一种治疗有此需要的个体的α-1抗胰蛋白酶缺乏症(aatd)的方法，所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的根据权利要求9至12中任一项所述的重组病毒载体(例如，重组aav载体)或包含所述重组病毒载体的组合物。43.一种治疗有此需要的个体的脊髓小脑共济失调3(sca3)的方法，所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的根据权利要求14至16中任一项所述的重组病毒载体(例如，重组aav载体)或包含所述重组病毒载体的组合物。44.一种治疗有此需要的个体的肌强直性营养不良1型(dm1)的方法，所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的根据权利要求19至22中任一项所述的重组病毒载体(例如，重组aav载体)或包含所述重组病毒载体的组合物。45.一种治疗有此需要的个体的脆性x染色体综合征(fxs)的方法，所述方法包括向所述个体给药治疗有效量的根据权利要求23至25中任一项所述的重组病毒载体(例如，重组
aav载体)或包含所述重组病毒载体的组合物。46.根据权利要求42至45中任一项所述的方法，其中，所述重组aav载体或所述组合物通过肌肉注射、静脉注射、肠胃外给药或全身性给药来给药。

技术总结
本文所述的发明提供基因疗法载体，诸如共表达两种或更多种目的基因(GOI)的腺相关病毒(AAV)载体。本发明的载体可广泛地用于治疗多种遗传性疾患，诸如三核苷酸重复序列扩张疾患。患。


技术研发人员：F
受保护的技术使用者：坚固生物科技公司
技术研发日：2021.01.11
技术公布日：2022/11/1