用于快速检测zen毒素的比色适配体传感器及检测方法
技术领域
1.本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种用于快速检测zen 毒素的基于适配体和金纳米颗粒的新型比色适配体传感器及其检测方法。
背景技术：2.玉米赤霉烯酮(zen)，又名f-2毒素，是一种主要由镰刀菌、黄色镰刀菌等真菌产生的次级代谢产物，广泛分布于玉米、小麦、大麦、高粱、黑麦、和其他谷物当中。以往的研究表明，玉米赤霉烯酮会破坏人类和动物的免疫系统、神经系统和生殖系统，从而对粮食安全和人类健康造成严重威胁。许多国家和组织规定了农产品中zen的最大残留限量，例如我国规定小麦、玉米及其粉末制品最大残留量≤60ug/kg，玉米原料和加工产品的饲料最大残留量≤500ug/kg，仔猪、母猪混合饲料最大残留量≤100ug/kg，欧盟规定谷物和产品最大残留量≤75ug/kg，法国规定谷物、菜籽油最大残留量≤200ug/kg，奥地利规定小麦最大残留量≤60ug/kg等。因此，建立准确检测各类食品中zen的有效方法对保障公众健康至关重要。
3.目前常规的玉米赤霉烯酮的检测方法有很多种主要有通过 gc-ms方法鉴别在粮食生产中使用的玉米赤霉烯醇和由镰刀菌属污染造成的玉米赤霉烯酮污染。lc-ms/ms方法可以检测数百种霉菌毒素的含量和相关结构。虽然这些方法具有较高的灵敏度和准确度，但它们大多需要繁琐的样品前处理、精密的仪器和熟练的专业人员。采用免疫吸附测定法也是检测真菌毒素简单、快速的有效方法，包括酶联免疫吸附、电化学免疫分析、荧光免疫分析、基于微芯片的实验、基于电迁移的实验和表面等离子共振免疫测定的实验，然而，这些免疫分析严重依赖于抗体的利用。而通过动物免疫制备抗体通常是耗时、昂贵和敏感的。此外，试剂盒在储存和运输过程中容易失活，不易保存。
4.核酸适配体(aptamer)是一段具有高亲和力、能与靶标分子特异性结合的单链寡核苷酸(ssdna或ssrna)序列。具有体外合成简单、不需要动物、靶标范围广、亲和力和特异性高、易于保存和修饰、成本低、稳定性高以及可重复使用等特点，被认为是最具潜力的抗体替代品。由于适配体独特的性质，因此可与多种技术结合，广泛应用于靶向治疗、疾病检测、食品安全检测和生物医学。以适配体为识别元件，所开发的生物传感器具有更高的灵敏度和特异性，检测时间短，可在现场检测等优点，因此越来越受到研究者的亲睐。目前在检测真菌毒素方面，已经开发了一系列基于适配体的生物传感器，主要用于检测赭曲霉毒素a和黄曲霉毒素b1。但基于适体生物传感器的快速检测zen的研究很少。近年来，基于适配体的比色传感方法因其简单、低成本、高灵敏度和不需要复杂仪器就能特异检测而成为检测各种靶分子的替代方法，在这种检测方法中，适配体(单链dna或rna寡核苷酸)因其能够选择性地结合靶标分子而被用作识别元件，这有助于提高传感器的特异性。在比色传感器中，金纳米颗粒(aunps)因其高度的颜色对应性和可控的形状被广泛用作比色指示剂。分散的 aunp溶液呈酒红色。然而，aunps的聚集增加了颗粒的尺寸，导致溶液显著变化为紫色或蓝色。此外，aunps已与其他纳米材料(例如，还原的氧化石墨烯)结合使用或与适配子结合，以改善传感器的性能或提高检测灵敏度。
技术实现要素：5.针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种用于快速检测zen毒素的比色适配体传感器及检测方法。
6.为实现以上目的，本发明采用如下技术方案：
7.用于快速检测zen毒素的比色适配体传感器，包括玉米赤霉烯酮核酸适配体和纳米金。
8.优选的，所述玉米赤霉烯酮核酸适配体为浓度为5umol/l的玉米赤霉烯酮核酸适配体溶液。
9.优选的，所述金纳米粒子为溶液，金纳米粒子溶液制备方法为：将体积比为100:1的超纯水和质量分数为1％的氯金酸溶液搅拌加热到沸腾，加入质量分数为1％的柠檬酸钠溶液，所述柠檬酸钠溶液与超纯水体积比为2.5:100，持续搅拌，待溶液颜色不再变化时，停止加热继续搅拌10min，冷却至室温，冷藏备用。
10.进一步地，用于快速检测zen毒素的比色适配体传感器进行 zen检测方法为：纳米金溶液和玉米赤霉烯酮核酸适配体溶液室温下反应，后加入不同浓度的玉米赤霉烯酮毒素标准样品孵育，再加入氯化钠溶液，室温孵育，以吸光值为纵坐标、玉米赤霉烯酮浓度为横坐标，建立标准曲线；将待测产品进行处理，提取得到含有zen的溶液，将所得溶液加入纳米金溶液和zen核酸适配体经过孵育的溶液中，进一步孵育后加入氯化钠溶液继续孵育，检测吸光值，代入标准曲线中，计算得到产品中zen的含量。
11.优选的，所述氯化钠溶液浓度为2mol/l。
12.优选的，纳米金溶液、玉米赤霉烯酮核酸适配体溶液和氯化钠溶液体积比为100:10:10。
13.优选的，纳米金溶液和玉米赤霉烯酮核酸适配体溶液室温下反应时间为5min。
14.优选的，加入不同浓度的玉米赤霉烯酮毒素标准样品孵育5min。
15.优选的，加入氯化钠溶液后室温孵育5min。
16.进一步地，在微孔板中分别加入100ulaunps溶液，再分别加入10ul浓度为5umol/l的zen核酸适配体溶液，室温下孵育5min，然后加入10ul提取得到含有zen的溶液，室温孵育5min后加入 10ul浓度为2mol/l的氯化钠溶液室温孵育5min后，用多模式读板仪检测吸光值。
17.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
18.本发明构建了一种简单、快速、可视化、无标记的比色生物传感器，以核酸适配体为识别原件，纳米金为指示剂，通过添加一定量的氯化钠，观察金纳米粒子的颜色变化，灵敏的检测zen。本发明比色适配体传感器对zen的检测过程只需要15min即可完成，并且很容易的检测出粮食中的zen，不需要昂贵的仪器，不需要修改适配体，成本低，为粮食中zen的现场检测提供新的途径。
附图说明
19.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
20.图1为本发明检测原理图；
21.图2为纳米金溶液紫外可见光吸收光谱图；
22.图3为纳米金溶液透射电镜图，其中a标尺为100nm，b标尺为5nm；
23.图4(a)不同浓度nacl环境下aunps的紫外光谱图；4(b)不同浓度的nacl下aunps在a650nm处的值；
24.图5为不同适配体浓度下的吸光值；
25.图6为纳米金溶液与适配体不同反应时间下的吸光值；
26.图7为不同浓度zen与a650的线性关系；其中，a为随着zen 浓度的增加导致aunps溶液在a650nm处的吸光值变化，b为zen 在5-300ng/ml浓度范围内，a650nm的吸光值与zen浓度呈的线性关系；
27.图8为不同干扰物下测定的吸光值图；
具体实施方式
28.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
29.实施例1
30.主要材料：
31.玉米赤霉烯酮核酸适配体(5'-gat ggg gaa agg gtc ccc
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ctg ggt tgg agc atc gga ca-3')：生工生物工程(上海)股份有限公司合成玉米赤霉烯酮标准品(zen)；
32.黄曲霉毒素b1标准品(afb1)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)、 t-2毒素：青岛普瑞帮生物工程公司；
33.氯金酸(haucl4)：国药集团化学试剂有限公司、zen酶联免疫试剂盒:上海快灵生物科技有限公司；
34.玉米粒：超市购买；
35.柠檬酸钠、重铬酸钾、乙腈、氯化钠、上海麦克林生化科技有限公司；
36.实验所使用水均为超纯水(电阻率为18.2mω.cm)。实验中有机溶剂均为色谱纯，其他实验材料为分析纯。
37.主要设备：
38.victor nivo多模式读板仪：珀金埃尔默企业管理(上海)有限公司；
39.紫外分光光度计：翰艺仪器(上海)有限公司；
40.jem-2100f透射电镜：日本电子株式会社；
41.kq-500de超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；
42.vortex-genie 2漩涡振荡器：美国scientific industries公司；
43.dfy-500高速粉碎机：浙江省永康市金穗机械制造厂；
44.th2-82t水浴恒温振荡器：常州荣华仪器有限公司；
45.用于快速检测zen毒素的比色适配体传感器，包括玉米赤霉烯酮核酸适配体和纳米金。本发明中玉米赤霉烯酮核酸适配体为现有技术，本领域技术人员可以通过市购等方式得到。
46.所述玉米赤霉烯酮核酸适配体为浓度为5umol/l的玉米赤霉烯酮核酸适配体溶液。
47.所述纳米金(aunps)溶液制备如下：
48.利用柠檬酸钠还原法制备aunps溶液具体步骤：将100ml的超纯水和1.00ml1％氯金酸溶液加入预先经过铬酸洗液浸泡的250ml 的烧杯中，搅拌加热到沸腾，加入2.5ml 1％的柠檬酸钠溶液快速搅拌10min，持续搅拌观察到溶液颜色由浅黄色变为黑色，再由黑色变为紫红色，最后由紫红色变为酒红色，且溶液呈透明。待溶液颜色不再变化时，停止加热继续搅拌10min，冷却至室温并分装，转移至4℃保存备用。利用紫外分光光度法对所制备的纳米金溶液进行特征峰和吸光值测定及质量评估，以及透射电镜对所制备的纳米金颗粒进行观察。
49.制备的aunps溶液呈酒红色，颜色分布均匀，无沉淀。扫描 300-700nm紫外可见吸收光谱和透射电镜对aunps颗粒的大小，形状和均匀性进行表征，由图2和图3可以看到制备的纳米金溶液在 520nm处有单一的吸收峰，没有杂峰出现。通过透射电镜说明制备的纳米金溶液比较均一且成分散状，而且制备出来的aunps粒径大小较为一致，均为15nm，成均匀分散的球形。
50.纳米金粒子在凝聚和分散状态下展现不同的颜色，合成的纳米金溶液处于分散状态呈现红色，当加入高浓度盐溶液后由于纳米金粒子发生聚集呈现蓝色。当样品溶液中不存在zen毒素时，zen核酸适配体可以通过静电作用吸附在aunps表面上，防止aunps聚集，使 aunps在高浓度盐溶液下保持稳定的分散状态，从而呈现红色；当溶液中存在靶标zen时，zen与核酸适配体特异性结合，此时处在盐离子环境中的纳米金颗粒因没有核酸适配体的保护而发生聚沉，并伴随着红色到蓝色颜色的变化。zen量越多，聚沉现象越明显，颜色变化越明显，吸光度值变化越大，因此可以根据不同条件下样品溶液颜色变化以及吸光度值来判断纳米金的状态，实现对玉米样品中 zen的定性和定量检测。
51.氯化钠浓度优化：
52.在微孔板中分加入100ul的aunps溶液，在分别加入10ul不同浓度的(0mol/l、0.5mol/l、1mol/l、1.5mol/l、2mol/l、2.5mol/l、 3mol/l)的氯化钠溶液混合，室温反应5min后用肉眼观察纳米金的颜色变化。用多模式读板仪测定aunps的吸光值，判断聚集程度，进而选择效果最佳的nacl溶液浓度。
53.合适的氯化钠浓度，能降低背景的干扰值，提高检测的灵敏度。但aunps对氯化钠溶液特别敏感，在一定浓度的氯化钠溶液中能发生凝聚，颜色由酒红色转变为蓝色，也就是说氯化钠浓度的大小直接影响aunps的凝聚程度。如图4a可以看出随着氯化钠的加入aunps 在a650nm处出现了峰值，并且随着氯化钠浓度的增加该处的吸光值也在增加，反之在a520nm处的峰值逐渐减低。因此本发明选择 a650nm处的吸光值来衡量aunps的聚集程度，从图4b可知aunps 在0～1mol/l浓度的氯化钠溶液中几乎不凝聚,肉眼看不出差别,仍保持稳定的红色，但是当氯化钠浓度在1.5-3mol/launps溶液开始出现团聚，随着氯化钠浓度的增加，a650nm处的吸光值不断增加，当氯化钠浓度达到2mol/l时，a650nm的吸光值趋与稳定，为了避免过量氯化钠的影响根据紫外图谱和颜色的变化最终选择2mol/l为最佳氯化钠浓度。
54.核酸适配体浓度优化：
55.在微孔板中分别加入100ul的aunps溶液，在分别加入10ul 不同浓度的(0umol/l、1umol/l、3umol/l、4umol/l、5umol/l、7 umol/l、9umol/l)zen核酸适配体溶液，室温下孵育5min向其反应溶液中加入10ul浓度为2mol/l的氯化钠溶液室温下反应5min 用肉眼观察颜色变化并用多模式读板仪测定吸光值，选择核酸适配体的最佳浓度。实验中设置3组平行对照。
56.适配体在一定程度上可以保护aunps在高盐条件下团聚，但也不是适配体的量越多越好。若吸附aunps的适配体量过多，将导致 aunps在高盐浓度溶液中不团聚变色，使整个体系中颜色变化受到影响，还会增加成本；核酸适配体量少起不到保护作用。所以探究核酸适配体的最佳浓度对整个发明至关重要。结果如图5所示当适配体浓度为0-4umol/l时aunps处于团聚状态适配体不能阻止盐诱导aunps聚集，当适配体浓度为5umol/l时aunps变为红色，说明核酸适配体对aunps盐诱导保护效果较好，相应的在a650nm处吸光值出现增大趋势，且在核酸适配体浓度在5umol/l以后a650nm的吸光值趋于平稳，说明适配体结合aunps已经饱和。
57.aunps与适配体孵育时间优化：
58.为了使核酸适配体与aunps充分结合，对aunps与适配体孵育时间进行了优化。在微孔板中分别加入100ul的aunps溶液，在分别加入10ul浓度为5umol/l的zen核酸适配体，室温下孵育5min 加入10ul浓度为30ng/ml的zen毒素标准品，室温孵育5min后加入10ul浓度为2mol/l的氯化钠溶液分别孵育0min、5min、10 min、15min、20min、25min、30min.后用多模式读板仪测定吸光值，实验中设置3组平行对照。
59.如图6所示当反应时间为5min时a650nm处的吸光值最大，当反应时间小于5min体系反应还未完成，反应体系的颜色仍然保持红色。随着反应体系时间的增加，a650nm处的吸光值下降，反应体系的颜色也逐渐处于降解状态，反应体系的颜色也逐渐变浅，所以选择最佳的孵育时间为5min。
60.线性关系：
61.用于快速检测zen毒素的比色适配体传感器进行zen检测方法为：在微孔板中分别加入100ulaunps溶液，然后分加入10ul浓度为5umol/l的zen核酸适配体溶液室温孵育5min后加入10ul 不同浓度(0ng/ml、5ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml、 200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml的zen 毒素标准样品孵育5min，后加入10ul 2mol/l的氯化钠溶液，室温孵育5min，实验中设置3组平行对照，以吸光值为纵坐标zen浓度为横坐标，建立标准曲线。
62.如图7a所示随着zen浓度的增加导致aunps溶液在a650nm 处的吸光值不断上升，但是当zen浓度达到300ng/ml之后随着zen 的浓度增加aunps在a650nm处的吸光值不断下降，根据图7b所示zen在5-300ng/ml浓度范围内，a650nm的吸光值与zen浓度呈良好的线性关系，线性方程为y＝0.0003x+0.5128，相关系数 r＝0.9989，在优化条件下对空白对照进行了9次测定，确定该方法的检测限为5ng/ml。
63.将本发明方法与已报道的现有检测方法进行比较(表1)，本发明具有快速、成本低、直观可视、检出限低、线性范围宽等优点，且不需要昂贵的仪器，不需要修改适配体。
64.表1用于测定玉米赤霉烯酮的检测方法的比较
[0065][0066]
特异性检测：
[0067]
为了验证本发明方法是否可以特异性识别zen，进行特异性检测。
[0068]
在微孔板中分别加入100ulaunps溶液，在分别加入10ul浓度为5umol/l的zen核酸适配体溶液，室温下孵育5min，然后分别加入10ul浓度为30ng/ml的don、zen、t-2、afb1毒素标准品室温孵育5min后加入10ul浓度为2mol/l的氯化钠溶液室温孵育5min后，肉眼观察颜色变化并用多模式读板仪检测吸光值。实验中设置3组平行对照。
[0069]
如图8所示在最优的条件下分别检验zen和其他毒素，仅有加入zen的体系溶液由红色变成蓝色，其在a650nm处的吸光值显著高于其他毒素，表明本发明检测方法特异性良好。
[0070]
玉米样品检测验证
[0071]
将玉米粒粉碎，过80目的筛，取20g于锥形瓶中加入100ml 提取液(乙腈:水＝90:10)溶液，在45℃水浴恒温振荡器上振荡1h。先用定性滤纸过滤，再用0.45um微孔滤膜过滤，转移至棕色容量瓶保存。在玉米提取液中分别加入不同浓度的zen(10.0、50.0、100 ng/ml)标准溶液，得到含有zen的溶液，然后在微孔板中分别加入 100ulaunps溶液，再分别加入10ul浓度为5umol/l的zen核酸适配体溶液，室温下孵育5min，然后加入10ul提取得到含有zen 的溶液，室温孵育5min后加入10ul浓度为2mol/l的氯化钠溶液室温孵育5min后，用多模式读板仪检测吸光值。并进行加标回收，计算回收率，结果如表2所示，可见本发明方法测定实际样品的回收率为81.3％-96.4％，相对标准偏差为(rsd)1.0％-5.7％，结果表明，本发明基于适配体的比色法对实际食品样品中zen水平的快速特异性检测是可行的。
[0072]
表2实际样品中zen的加标回收率(n＝5)
[0073]
[0074]
可见，本发明以zen核酸适配体为识别元件，金纳米粒子(aunps) 为指示剂构建的一种简单、快速、可视化、无标记的比色适配体传感器，能够实现对粮食中玉米赤霉烯酮的可视化检测。本发明传感器可直接将zen适配体与aunps溶液结合，然后加入靶标zen和高浓度的盐溶液，即可检测，无需对其进行修饰，操作方便，且能用肉眼观察aunps溶液的颜色变化。本发明传感器的最低检测限为5ng/ml，其线性范围为5-300ng/ml，所得zen标准曲线方程为 y＝0.0003x+0.5128(r＝0.9989)。通过特异性试验证明此方法可特异检测zen，并用该方法对玉米样品进行测定，回收率为81.3％-96.4％，整个检测过程只需要15min即可完成，本发明方法可应用于实际样品的检测。
[0075]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
技术特征：1.用于快速检测zen毒素的比色适配体传感器，其特征在于，包括玉米赤霉烯酮核酸适配体和纳米金。2.根据权利要求1所述用于快速检测zen毒素的比色适配体传感器，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮核酸适配体为浓度为5umol/l的玉米赤霉烯酮核酸适配体溶液。3.根据权利要求1所述用于快速检测zen毒素的比色适配体传感器，其特征在于，所述金纳米粒子为溶液，金纳米粒子溶液制备方法为：将体积比为100:1的超纯水和质量分数1％的氯金酸溶液搅拌加热到沸腾，加入质量分数1％的柠檬酸钠溶液，所述柠檬酸钠溶液与超纯水体积比为2.5:100，持续搅拌，待溶液颜色不再变化时，停止加热继续搅拌后，冷却至室温，冷藏备用。4.根据权利要求1～3任一项所述用于快速检测zen毒素的比色适配体传感器，其特征在于，进行zen检测方法为：纳米金溶液和玉米赤霉烯酮核酸适配体溶液室温下反应，后加入不同浓度的玉米赤霉烯酮毒素标准样品孵育，再加入氯化钠溶液，室温孵育，以吸光值为纵坐标、玉米赤霉烯酮浓度为横坐标，建立标准曲线；将待测产品进行处理，提取得到含有zen的溶液，将所得溶液加入纳米金溶液和zen核酸适配体经过孵育的溶液中，进一步孵育后加入氯化钠溶液继续孵育，检测吸光值，代入标准曲线中，计算得到产品中zen的含量。5.根据权利要求4所述用于快速检测zen毒素的比色适配体传感器，其特征在于，所述氯化钠溶液浓度为2mol/l。6.根据权利要求4所述用于快速检测zen毒素的比色适配体传感器，其特征在于，纳米金溶液、玉米赤霉烯酮核酸适配体溶液和氯化钠溶液体积比为100:10:10。7.根据权利要求4所述用于快速检测zen毒素的比色适配体传感器，其特征在于，纳米金溶液和玉米赤霉烯酮核酸适配体溶液室温下反应时间为5min。8.根据权利要求4所述用于快速检测zen毒素的比色适配体传感器，其特征在于，加入不同浓度的玉米赤霉烯酮毒素标准样品孵育5min。9.根据权利要求4所述用于快速检测zen毒素的比色适配体传感器，其特征在于，加入氯化钠溶液后室温孵育5min。10.根据权利要求4所述用于快速检测zen毒素的比色适配体传感器，其特征在于，在微孔板中分别加入100ulaunps溶液，再分别加入10ul浓度为5umol/l的zen核酸适配体溶液，室温下孵育5min，然后加入10ul提取得到含有zen的溶液，室温孵育5min后加入10ul浓度为2mol/l的氯化钠溶液室温孵育5min后，用多模式读板仪检测吸光值。
技术总结本发明涉及检测技术领域，公开了一种用于快速检测ZEN毒素的比色适配体传感器，包括玉米赤霉烯酮核酸适配体和纳米金。所述比色适配体传感器进行ZEN检测方法为：纳米金溶液和玉米赤霉烯酮核酸适配体溶液室温下反应，后加入不同浓度的玉米赤霉烯酮毒素标准样品孵育，再加入氯化钠溶液，室温孵育，以吸光值为纵坐标、玉米赤霉烯酮浓度为横坐标，建立标准曲线。本发明构建了一种简单、快速、可视化、无标记的比色生物传感器，对ZEN的检测过程只需要15min即可完成，并且很容易的检测出粮食中的ZEN，成本低，为粮食中ZEN的现场检测提供新的途径。为粮食中ZEN的现场检测提供新的途径。为粮食中ZEN的现场检测提供新的途径。
技术研发人员：张丽媛 卢利丰 于润众
受保护的技术使用者：黑龙江八一农垦大学
技术研发日：2022.07.12
技术公布日：2022/11/1
