1.本发明涉及生物工程技术和食品品质评价技术领域，特别是涉及一种基于抑菌活性的蜂王浆品质评价方法。
背景技术：2.蜂王浆(royal jelly)又名蜂皇浆、王浆，是由工蜂发达的下咽头腺和上颚腺等腺体共同分泌的乳白色或淡黄色浆状物。蜂王浆的ph值为 3.6～4.2，含有60～70％的水，11～23％的糖类，9～18％的蛋白质，4～8％的酯类，以及微量的维生素和矿物质等成份。具有抗衰老、抗菌、抗疲劳、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病和抗突变作用等多种生理功能。
3.《蜂王浆》国家标准gb 9697-2008中，根据水分和10-羟基-2-癸烯酸 (10-hda)的含量，将蜂王浆分为优等品和合格品，即优等品水分含量≤ 67.5(g/100g)，10-hda含量≥1.8g/100g；合格品水分含量≤69.0(g/100g)， 10-hda含量≥1.4g/100g。然而，在实际应用中，人们发现仅以这两个指标评价蜂王浆品质有失偏颇。比如：水分含量很容易被人为控制，而 10-hda性质较为稳定，即使在不适宜的贮存条件下存放也几乎没有变化。实际上，人们发现新鲜蜂王浆的生理活性远高于贮存后的蜂王浆，且贮存时间越久，生理活性越差。这充分说明，蜂王浆极易变质，其品质易受贮存条件的影响，若贮存条件不当，则蜂王浆的物理性状、化学组成和生理功效均会发生显著变化。现行的国标无法有效评价蜂王浆品质，急需一种简单易推广的蜂王浆品质评价方法。
4.为了有效地评价蜂王浆的品质，从而建立蜂王浆的分级和定价标准，以及销售、流通、消费各环节的贮藏方法，科研人员进行了大量实验，试图找到一些有价值的蜂王浆品质评价指标，考虑到蜂王浆的“新鲜度”和其品质密切相关，科研人员筛选了多种潜在的蜂王浆“新鲜度”评价指标，试图结合“新鲜度”指标和国标理化指标共同评价蜂王浆的品质。已报道的“新鲜度”指标包括酶类物质(超氧化物歧化酶、葡萄糖氧化酶)、色度、糠氨酸、糠醛、游离氨基酸、57ku蛋白和atp及其降解产物等，然而受各种因素的制约，目前仍没有一种蜂王浆“新鲜度”评价指标被世界公认。
5.蜂王浆的品质与其物理性状、化学组成和生理功效密切相关，很难找到单独的评价指标，同时，目前尚未有基于抑菌活性评价蜂王浆品质的报道。
技术实现要素：6.本发明的目的是提供一种基于抑菌活性的蜂王浆品质评价方法，以解决上述现有技术存在的问题，该方法在原理上兼顾了水分、10-hda和新鲜度对蜂王浆品质的影响，且具有操作简单和评价直观的特点，易于推广应用，为蜂王浆的品质检测技术奠定重要基础。
7.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
8.本发明提供一种评价蜂王浆品质的方法，通过测定蜂王浆的抑菌活性来评价其品质。
9.进一步地，先将待测蜂王浆稀释至10％体积浓度，之后采用滤纸片法测定稀释后
的蜂王浆对指示菌的抑菌活性，根据抑菌圈直径判断待测蜂王浆的品质等级。
10.进一步地，所述指示菌为海洋沉积物芽孢杆菌co29，其分类命名为cytobacillus oceanisediminis，保藏编号为cgmcc no.22874，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏中心，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏日期为2021年7月13日。
11.进一步地，所述待测蜂王浆的品质等级包括合格品和不合格品两个等级；
12.若所述抑菌圈直径大于或等于7.2mm，则待测蜂王浆为合格品；若所述抑菌圈直径小于7.2mm，则待测蜂王浆为不合格品。
13.进一步地，所述滤纸片法测定过程为：滤纸片浸透稀释后的蜂王浆之后，将其置于指示菌平板中，37℃恒温培养18-20h，再测量指示菌的抑菌圈直径，以此评价蜂王浆的品质等级。
14.本发明还提供一种菌株在评价蜂王浆品质中的应用，包括以下步骤：
15.(1)菌株的培养：将菌株加入液体培养基中培养，待其生长进入对数期，取菌液涂布于固体培养基平板，即得指示菌平板；
16.(2)先将滤纸片浸透稀释至10％体积浓度的待测蜂王浆，之后将其置于指示菌平板中，37℃恒温培养18-20h，再测量指示菌的抑菌圈直径，根据结果判断待测蜂王浆的品质等级；
17.所述菌株为海洋沉积物芽孢杆菌co29，其分类命名为cytobacillusoceanisediminis，保藏编号为cgmcc no.22874，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏中心，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2021年7月13日。
18.本发明公开了以下技术效果：
19.本发明通过筛选革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、酵母菌和丝状真菌等9种菌株，发现海洋沉积物芽孢杆菌对蜂王浆高度敏感、易于培养、生长迅速且无毒无害，可作为蜂王浆抑菌的指示菌株评价蜂王浆的抑菌活性，进一步确定采用浓度为10％的蜂王浆水溶液作为待测样品可提高实验重复性，减小误差，之后经蜂王浆不同贮存条件的抑菌活性实验及不同产地或蜜源蜂王浆抑菌活性变化实验结果，明确待测蜂王浆合格品的抑菌圈标准为大于或等于7.2mm，由此提供一种基于抑菌活性评价蜂王浆品质的新方法。
20.本发明通过测定蜂王浆的抑菌活性来评价其品质，在原理上兼顾了水分、10-hda和新鲜度对蜂王浆品质的影响，且具有操作简单和评价直观的特点，易于推广应用，为蜂王浆的品质检测技术奠定重要基础。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为蜂王浆对各试验菌的抑制结果；
23.图2为不同贮存条件下蜂王浆的抑菌作用；a：-18℃，b：4℃，c： 25℃，d：常温不避光，e：37℃；
24.图3为不同蜂王浆样品4℃下避光贮存60d后的抑菌作用。
具体实施方式
25.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
26.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
27.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
28.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
29.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
30.实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的试剂如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂。
31.以下实施例中所用海洋沉积物芽孢杆菌为发明人前期申请专利(cn113621541a)公开的海洋沉积物芽孢杆菌co29，其分类命名为 cytobacillus oceanisediminis，保藏编号为cgmcc no.22874，该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏中心，其地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，保藏日期为2021年7月13日；其余菌株为普通市售得到。
32.抑菌是蜂王浆重要的生理活性之一，也是最容易测定的生理活性指标。已报道的蜂王浆的抑菌活性物质有10-hda、多种蛋白质和多肽类等。 10-hda是蜂王浆国标中的品质区分指标，但无法反映蜂王浆的新鲜程度；水分含量也是蜂王浆国标中的品质区分指标，蜂王浆中的水分含量贮存时间延长而增加，它决定了单位重量蜂王浆所含的抑菌物质的质量；蛋白质和多肽类抑菌活性物质的含量变化可在某种程度上反映蜂王浆的新鲜度。因此抑菌活性是兼顾了10-hda、水分含量、蛋白质和多肽类抑菌活性物质的综合性蜂王浆品质评价指标。由此，发明人开展基于抑菌活性评价蜂王浆品质的研究。
33.实施例1
34.指示菌的筛选
35.抑菌实验的关键在于指示菌的筛选，良好的指示菌应该对蜂王浆高度敏感、易于培养、生长迅速且无毒无害。为此，我们选择了如下菌株进行抑菌试验，旨在找出适宜的蜂王浆抑菌的指示菌株。革兰氏阳性细菌：海洋沉积物芽孢杆菌(cytobacillus oceanisediminiss)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、小牛葡萄球菌(staphylococcus vitulinus)；革兰氏阴性细菌：大肠杆菌(escherichia coli)、皮特不动杆菌(acinetobacter pittii)、吲哚黄杆菌(chryseobacterium indologenes)；酵母菌：解脂耶
氏酵母(yarrowialipolytica)；丝状真菌：黑曲霉(aspergillus niger)、米曲霉(aspergillusoryzae)。
36.培养基：
37.细菌：牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g/l、蛋白胨10g/l、氯化钠5g/l、 ph自然。若配制固体培养基加入2％琼脂。在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
38.酵母菌：yepd培养基：酵母粉10g/l、葡萄糖20g/l、胰蛋白胨20g/l，用h2so4将ph调至6.0。若配制固体培养基加入2％琼脂。配制好的培养基在115℃蒸汽灭菌20min。
39.丝状真菌：pdb培养基：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、ph自然。若配制固体培养基，在pdb培养基中加入2％琼脂即为pda培养基。配制好的培养基在121℃下高压蒸汽灭菌20min。
40.指示菌平板制备：相应类型的液体培养基用于相应菌株的活化，而固体培养基用于指示菌平板制作。对于细菌和酵母菌，菌株活化后，培养至对数生长期，摇匀后吸取100μl菌液均匀涂布在在固体培养基平板表面；对于丝状真菌，菌株活化后，培养3d，取100μl(1
×
106个/ml)分生孢子悬液均匀涂布在在固体培养基平板表面。
41.滤纸片的制备：把实验室用的普通滤纸用打孔器打成6mm直径的圆片，装在试管中密封121℃下高压蒸汽灭菌20min。
42.抑菌实验：用无菌镊子夹起已灭菌的滤纸片放入90％的新鲜蜂王浆(a 样品)水溶液中浸透，夹出时在容器边缘停靠片刻，滤掉多余的溶液，把滤纸片放在指示菌平板中，用镊子稍用力按一下，使之与培养基充分紧贴；以灭菌水浸湿的滤纸片做空白对照；细菌在37℃下恒温培养18～20h，酵母在30℃下恒温培养24h，丝状真菌在30℃下恒温培养72h。观察并测量指示菌菌落周围抑菌圈的直径(每个蜂王浆样品做5个重复实验，去掉最高值和最低值后，取平均值即为测定值)，评价蜂王浆体外抗菌活性。结果见图1。
43.由图1可知，新鲜蜂王浆(a样品)对细菌有不同程度的抑制作用，对解脂耶氏酵母、米曲霉和黑曲霉无抑制作用。新鲜蜂王浆对革兰氏阳性菌的抑菌作用强于对革兰氏阴性菌的作用，各菌株对蜂王浆的敏感程度排序为：海洋沉积物芽孢杆菌＞枯草芽孢杆菌＞小牛葡萄球菌＞皮特不动杆菌＞大肠杆菌＞吲哚黄杆菌。考虑到海洋沉积物芽孢杆菌对蜂王浆的高度敏感性，以及该菌株易于培养、生长迅速、且无致病性或者其他毒害作用，因此选用该菌株作为指示菌评价蜂王浆的抑菌活性。
44.实施例2
45.蜂王浆稀释度的确定
46.由表1结果可知，滤纸片法检测蜂王浆抑菌活性时，当蜂王浆浓度较高(90％)时，因为蜂王浆粘度较大，会造成抑菌实验的误差较大。为了提高实验重复性，减小误差，我们探究了蜂王浆稀释度对不同细菌的抑菌活性。
47.几乎所有实验过程同实施例1，只是做抑菌实验时，用无菌镊子夹起已灭菌的滤纸片分别放入10％、30％、50％、70％和90％的新鲜蜂王浆水溶液(a样品)中浸透，进行后续滤纸片法抑菌实验。结果见表1。
48.表1蜂王浆对各试验菌的抑制作用
[0049][0050][0051]
注：附表中
“‑”
表示无抑菌作用。
[0052]
由表1可知，新鲜蜂王浆(a样品)随浓度的增大对各菌株的抑菌活性逐渐增强，90％浓度的蜂王浆水溶液对所试6种细菌的生长均有不同程度的抑制作用，而当蜂王浆浓度降至10％时，只对海洋沉积物芽孢杆菌的生长有抑制作用，而对其它菌株的生长无明显抑制作用。可见，海洋沉积物芽孢杆菌对蜂王浆中的抑菌物质高度敏感，即使只有10％浓度的新鲜蜂王浆仍有明显的抑制该菌株生长的作用。10％浓度的新鲜蜂王浆粘度显著降低，实验重复性大幅提高，证明该方法测定菌株抑菌活性完全可行。
[0053]
实施例3
[0054]
不同贮存条件下蜂王浆的抑菌活性变化
[0055]
一般认为，蜂王浆品质与其新鲜度高度相关，不适宜的贮存方式会造成蜂王浆品质的显著下降。为了探究蜂王浆新鲜度和其抑菌活性之间的关系，我们研究了蜂王浆(a样品)在-18℃、4℃、25℃、常温不避光和37℃温度下贮存7d、14d、21d、28d、35d、42d、60d时对海洋沉积物芽孢杆菌的抑菌效果。考虑到10％浓度的蜂王浆水溶液的抑菌活性较低，有可能随着蜂王浆贮存而抑菌活性进一步下降，而无法反映蜂王浆新鲜度的变化，因此本实验同时配制了不同浓度的蜂王浆水溶液进行抑菌研究。其它实验基本过程同实施例1，实验结果如图2中的a-e所示。
[0056]
由图2中的a-e可知，整体上看，新鲜蜂王浆样品(-18℃)的抑菌活性＞4℃贮存的样品＞25℃贮存的样品＞常温不避光贮存的样品＞37℃贮存的样品，各贮存温度下，样品浓度越大、抑菌活性越强。-18℃贮存的样品，无论浓度大小，在不同贮存时间的抑菌活性无显著变化。4℃贮存的样品，10％的浓度抑菌活性随贮存时间延长而降低，而其它浓度样品抑菌活性随贮存时间变化不大。这说明在60d内，4℃贮存的蜂王浆的抑菌活性有下降，但是并不明显，只有在10％浓度的蜂王浆中才能表现出来，这也说明了采用10％蜂王浆浓度研究抑菌活性的合理性，即显著提高方法评价的灵敏度。25℃贮存的样品、常温不避光贮存的样品、37℃贮存的样品，除 90％浓度样品外，在其它的浓度下，均表现出随贮存时间延长而抑菌活性下降的特点，可见蜂王浆的抑菌活性能够反映其新鲜度。
[0057]
marconi等人(j.agric.food chem 2002,50,2825-2829)认为4℃贮存 10个月完全可以保留蜂王浆营养成分。吴黎明(蜂王浆新鲜度指标和评价方法研究，浙江大学，2008)
研究发现蜂王浆在4℃贮存3个月完全可以保留蜂王浆营养成分。wu等人(lwt-food science and technology2015,63,504-510)研究认为蜂王浆在4℃贮存2个月可以保持新鲜度。因此如果保守认为蜂王浆在4℃贮存2个月可以保持新鲜度，此时，10％浓度的蜂王浆溶液的抑菌圈直径为7.8
±
0.3mm，因此初步将抑菌圈直径大于 7.5mm定为合格品，而抑菌圈直径小于7.5mm定为不合格品。
[0058]
实施例4
[0059]
不同产地或蜜源蜂王浆在4℃下贮存60d内的抑菌活性变化
[0060]
蜂王浆的产地或蜜源均可能引起其成份的变化，导致其抑菌活性不同。为了使本发明具有普适性，我们随机选取了7种蜂王浆样品，样品信息见表2，研究了这些蜂王浆在4℃下贮存60d内的抑菌活性变化，结果见图3。
[0061]
表2蜂王浆样品信息
[0062][0063]
由图3可知，不同产地和蜜源蜂王浆，稀释为10％浓度的蜂王浆水溶液后，在4℃下避光贮存60d，样品抑菌圈最小为7.5mm，样品抑菌圈最大为8.1mm，可见不同样品的抑菌活性略有差别，考虑到测定时的标准差，以及样品的多样性，保守地修正实施例3中对合格品抑菌圈的定义，将抑菌圈直径大于或等于7.2mm定为合格品，而抑菌圈直径小于7.2mm定为不合格品。
[0064]
结合上述实施例判断，我们认为-18℃贮存60d、4℃贮存60d、25℃贮存21d、常温不避光贮存14d或者37℃贮存7d内均可认为是合格品；而其他贮存条件下会导致不合格品蜂王浆的出现，这些结果与目前公认的实践经验相吻合。
[0065]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
技术特征：1.一种评价蜂王浆品质的方法，其特征在于，通过测定蜂王浆的抑菌活性来评价其品质。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，先将待测蜂王浆稀释至10％体积浓度，之后采用滤纸片法测定稀释后的蜂王浆对指示菌的抑菌活性，根据抑菌圈直径判断待测蜂王浆的品质等级。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述指示菌为海洋沉积物芽孢杆菌，其保藏编号为cgmcc no.22874。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述待测蜂王浆的品质等级包括合格品和不合格品两个等级；若所述抑菌圈直径大于或等于7.2mm，则待测蜂王浆为合格品；若所述抑菌圈直径小于7.2mm，则待测蜂王浆为不合格品。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述滤纸片法测定过程为：滤纸片浸透稀释后的蜂王浆之后，将其置于指示菌平板中，37℃恒温培养18-20h，再测量指示菌的抑菌圈直径。6.一种菌株在评价蜂王浆品质中的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌株的培养：将菌株加入液体培养基中培养，待其生长进入对数期，取菌液涂布于固体培养基平板，即得指示菌平板；(2)先将滤纸片浸透稀释至10％体积浓度的待测蜂王浆，之后将其置于指示菌平板中，37℃恒温培养18-20h，再测量指示菌的抑菌圈直径，根据结果判断待测蜂王浆的品质等级；所述菌株为海洋沉积物芽孢杆菌，其保藏编号为cgmcc no.22874。
技术总结本发明公开了一种基于抑菌活性的蜂王浆品质评价方法，属于生物工程技术和食品品质评价技术领域。该方法通过测定蜂王浆的抑菌活性来评价其品质，具体地，先将待测蜂王浆稀释至10％体积浓度，之后采用滤纸片法测定稀释后的蜂王浆对指示菌的抑菌活性，根据抑菌圈直径判断待测蜂王浆的品质等级。本发明通过测定蜂王浆的抑菌活性来评价其品质，在原理上兼顾了水分、10-HDA和新鲜度对蜂王浆品质的影响，且具有操作简单和评价直观的特点，易于推广应用，为蜂王浆的品质检测技术奠定重要基础。为蜂王浆的品质检测技术奠定重要基础。为蜂王浆的品质检测技术奠定重要基础。
技术研发人员：赵勋能 张健 胡九菊 张津和
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：2022.05.18
技术公布日：2022/11/1
