一种农作物根茎木质纤维组分的原位同步量化方法

1.本发明涉及分析检测领域，尤其涉及一种农作物根茎木质纤维组分的原位同步量化方法。


背景技术：

2.植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和木质素等木质纤维组分构成，其组成和相对比例取决于细胞的特定功能及其发育阶段。纤维素聚集成规则结构的微纤丝并确定细胞壁的框架，致密细胞壁纤维间的间隙通过化学键和/或氢键填充有半纤维素和木质素分子，其化学组成比例与物理空间网络结构高度关联，蕴含着十分丰富的遗传信息密码，直接决定了农作物的特异农艺性状(茎的刚度和强度、作物对胁迫的抗性等)。同时，细胞壁中木质纤维组分的物理化学性质在空间和时间上具有异质性，这种异质性甚至也发生在单个细胞壁上。因此，原位获取细胞壁木质纤维组分信息对于辅助验证和解析作物种质资源形成规律、新基因挖掘与功能解析、产量品质和抗性等重要性状形成的分子机制具有重要意义。
3.目前，在育种领域，植物微观表型往往借助免疫标记和组织学染色原位揭示木质纤维组分分布，但仅仅能做到原位定性获得特定化学组成在组织细胞尺度上的定位信息，从而揭示基因的表达部位和效果。免疫标记是通过特异性标记基因表达蛋白在细胞上的分布来定性揭示基因的表达部位，但该方法只能定性显示基因表达的效果而无法量化细胞壁组成的差异和变化。组织学染色是通过使用特定的染料吸附在细胞壁的某个成分上来定性观察成分的分布，该技术所分析的成分受染色剂限制，且因吸附作用容易受到其它成分的干扰而造成量化分析困难。因此，以上方法难以用于农作物不同组织中细胞壁木质纤维组分分布的原位同步量化分析。
4.近年来，基于共聚焦拉曼显微成像在木材细胞壁组成如木质素和纤维素分布的可视化表征方面已有相关研究报道。如wang c,yang j,wen j,et al.structure and distribution changes of eucalyptus hemicelluloses during hydrothermal and alkaline pretreatments[j].international journal of biological macromolecules,2019,133:514-521.—表征了桉树中细胞壁不同形态区域半纤维素的分布差异；jin k,liu x,wang k,et al.imaging the dynamic deposition of cell wall polymer in xylem and phloem in populus
×
euramericana[j].planta,2018,248(4):849-858.—表征了杨木新木质部和韧皮部中木质素和碳水化合物的化学分布变异。中国专利cn 102435594 a公布了一种基于共聚焦拉曼显微成像测定植物细胞壁木质化程度的方法，该方法在原位状态下获得细胞壁内木质素的拉曼光谱成像图，根据拉曼信号强度确定细胞壁内木质素分布，从而定性描述细胞壁不同形态区域木质化程度。
[0005]
然而，上述相关论文和专利的研究对象主要为木材组织细胞，研究论文仅仅可视化表征了木材样本同一谱图上化学组成的分布，或选取特定部位拉曼光谱进行比较分析等，专利也仅能分析木质素，实现同一张图谱上木质化程度表征，而无法实现木质纤维多组分的原位同步量化分析。实现不同图谱之间原位量化比较的难点在于样品平整度、聚焦差
异或仪器状态差异导致不同条件下采集的图谱信号强度可比性差。不同条件下拉曼图谱可比性差制约了共聚焦拉曼显微成像在分子遗传育种和作物改良研究中的应用，这是因为作物育种改良研究中需要解析不同基因和性状形成的调控机理，往往涉及不同作物不同组织部位的比较研究。同时，农作物茎秆相较于木本植物结构疏松柔软，甚至呈现中空(如水稻和小麦茎秆)，主要由表皮、厚壁组织、维管组织和薄壁组织等具有明显区别的组织组成，细胞尺寸差异大，从几微米到几十微米不等。上述物理结构的差异，使得共聚焦拉曼显微技术用于农作物茎秆微尺度表征时对样品制备和图谱获取及处理都提出了更大的挑战。
[0006]
因此，发明一种基于共聚焦拉曼显微成像的农作物根茎木质纤维组分原位同步量化方法，可以推动共聚焦拉曼显微技术在作物育种研究中的应用，将有助于作物育种领域产生新的发现。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的是提供一种农作物根茎木质纤维组分的原位同步量化方法，该方法可以同步生成木质纤维组分分布的高清空间图像，并提供可分析的定量数据，以支持同一样品不同组织和不同样品同一组织木质纤维组分含量的统计学显著差异分析。
[0008]
本发明提供的农作物根茎木质纤维组分的原位同步量化方法主要包括样品制备、原始拉曼光谱图像获取、原始拉曼光谱图像处理和木质纤维组分原位同步量化的步骤。
[0009]
下面将详细展开说明：
[0010]
(一)样品制备与原始拉曼光谱图像获取
[0011]
所述样品制备包括农作物根茎样本切割及固定、包埋切片、去离子水浸泡和d2o中超声处理。采用共聚焦拉曼显微镜获取所述原始拉曼光谱图像。
[0012]
具体包括：
[0013]
(1)将采集到的农作物样本切割，其厚度不超过5mm，随后置于福尔马林-乙酸-乙醇(formalin-acetic-alcohol，faa)固定剂中，固定24h以上；
[0014]
(2)固定后的样品采用聚乙二醇1500或聚乙二醇2000包埋切片，切片厚度为18-32μm；
[0015]
(3)去离子水浸泡30-60min，期间换水2-3次，随后置于d2o中，超声5-15秒；
[0016]
(4)将切割薄片使用载玻片和盖玻片固定后置于共聚焦拉曼显微镜下，获得作物原始拉曼光谱图像。
[0017]
其中，步骤(1)中所述农作物样本在新鲜状态下切割并固定。
[0018]
步骤(2)中所述聚乙二醇分子量的选用根据农作物不同生长时期不同部位组织硬度决定，如生长后期豆科作物根茎选用聚乙二醇2000，禾本科选用聚乙二醇1500。
[0019]
步骤(2)中切片厚度根据不同农作物不同部位组织结构密度决定，所述切割厚度禾本科作物优选为28-32μm，豆科优选为18-26μm。
[0020]
步骤(3)中所述去离子水浸泡时长，禾本科切片浸泡时长40-60min，豆科切片浸泡时长30-50min。d2o中超声处理时间以细胞壁结构清晰为标准决定。
[0021]
步骤(4)中所述载玻片和盖玻片固定时使用d2o封片，并用指甲油密封盖玻片四周。
[0022]
步骤(4)中所述获取作物原始拉曼光谱图像的仪器采集参数主要包括使用波长为
532nm线性偏振激光，激光功率25mw，光谱分辨率为4cm-1
，扫描次数为2-4次，每次积分时间为1000-2000ms。
[0023]
步骤(4)中所述获取作物原始拉曼光谱图像的物镜选用可以选择50x、100x物镜进行清晰成像，并根据物镜选用设置扫描步长分别为1μm、0.5μm。
[0024]
(二)原始拉曼光谱图像处理
[0025]
所述原始拉曼光谱图像处理包括波段截取及预处理、细胞壁区域拉曼光谱提取和背景信号去除。
[0026]
具体包括：
[0027]
(1)对原始拉曼图谱进行波段截取，平滑降噪，基线校正；
[0028]
(2)提取细胞壁区域拉曼光谱；
[0029]
(3)去除细胞壁区域拉曼光谱中背景信号。
[0030]
其中，步骤(1)中所述波段截取的范围为4000-400cm-1
，平滑降噪使用9点或11点savitzky-golay(s-g)平滑算法，基线校正采用凹式rubberband校正方法，迭代次数为10次，基线校正点数为64点。
[0031]
步骤(2)中所述提取细胞壁区域拉曼光谱使用细胞壁木质纤维组分特征峰峰面积积分图像结合修正otsu算法实现。
[0032]
进一步地，所述积分图像中峰面积积分范围为2805-3042cm-1
；获取所述积分图像后将其灰度化。
[0033]
在本发明的一些实施例中，先获取细胞壁木质纤维组分特征峰峰面积积分图像，并将其灰度化为[0，255]。
[0034]
进一步地，所述修正otsu算法的原理如下：
[0035]
σ2(t)＝(ω0+α0)(μ
0-μ
t
)2+ω1(μ
1-μ
t
)2ꢀꢀ
(1)
[0036]
其中，通过阈值t将像素分为细胞壁区域(roi)和非细胞壁区域(nroi)两类，σ2(t)代表roi和nroi的类间方差，ω0和ω1分别为像素点归属于两类的概率，α0为修正因子(6-7之间)，μ0和μ1分别为两类的灰度均值，μ
t
为整体拉曼灰色图像的均值。
[0037]
步骤(3)中所述背景信号去除采用光谱差减法扣除背景信号，即差谱＝混合信号光谱-参比光谱
×
差减因子，其中，所述参比光谱为非细胞壁区域的平均光谱，所述差减因子是通过混合信号光谱参考峰强度与参比光谱参考峰强度的比值确定。
[0038]
进一步地，所述参考峰的优选结果为561
±
5cm-1
。
[0039]
相较于从细胞壁光谱中随机选择一定数量的光谱作为代表性光谱进行量化分析，本发明使用细胞壁木质纤维组分特征波段的峰面积积分结合修正otsu算法，实现了细胞壁区域光谱完整、高效和准确地提取，使量化的结果更加客观可靠。
[0040]
(三)木质纤维组分原位同步量化
[0041]
所述木质纤维组分原位同步量化包括：将处理后的拉曼光谱图像根据特征波段进行强度归一化，根据归一化后相对拉曼强度单峰成像生成农作物组织中多种木质纤维组分分布的拉曼图像，再生成可以用于统计分析的量化数据。
[0042]
具体包括：
[0043]
(1)对处理后的拉曼光谱图像根据特征波段进行强度归一化；
[0044]
(2)根据归一化后相对拉曼强度单峰成像同步生成农作物组织多种木质纤维组分
分布的拉曼图像；
[0045]
(3)根据细胞壁木质纤维组分特征波段相对拉曼强度，生成可以用于统计分析的的量化数据。
[0046]
其中，步骤(1)中所述强度归一化是根据细胞壁木质纤维组分拉曼信号中的一个特征波段进行强度归一化，特别是2943
±
5cm-1
波段，该波段基本包括所有木质纤维组分ch伸缩振动。
[0047]
步骤(2)中生成的多种木质纤维组分分布的拉曼图像包括但不仅限于纤维素(2895cm-1
，ch伸缩振动)、半纤维素(1471cm-1
，木聚糖中的oh和ch2伸缩振动)和木质素(1600cm-1
，芳香族骨架伸缩振动)分布图像，此外还可以找到能够代表木质纤维组分中任意精细结构组分的特征波段(如松柏醇/醛(1633cm-1
)，对羟基肉桂酸(1173cm-1
)等)，即可通过本方法生成其含量分布图像。
[0048]
步骤(3)中生成的细胞壁木质纤维组分含量在统计上能够有效比较的量化数据同样包括但不仅限于纤维素(2895cm-1
，ch伸缩振动)、半纤维素(1471cm-1
，木聚糖中的oh和ch2伸缩振动)和木质素(1600cm-1
，芳香族骨架伸缩振动)，此外还可以找到能够代表木质纤维组分中任意精细结构组分的特征波段(如松柏醇/醛(1633cm-1
)，对羟基肉桂酸(1173cm-1
)等)，即可通过本方法生成其在统计上能够有效比较的量化数据。
[0049]
其中，步骤(2)和(3)中细胞壁木质纤维组分分布的拉曼图像和导出的定量数据并不代表绝对含量值，但在统计上能够有效比较。
[0050]
相较于直接使用原始拉曼强度量化比较，本发明使用木质纤维组分特征波段强度归一化后的相对拉曼强度进行原位量化，可以消除焦平面变化对拉曼信号造成的影响，使量化数据更加准确。
[0051]
本发明的有益效果如下：
[0052]
本发明提供了一种农作物根茎木质纤维组分的原位同步量化方法，该方法可以同时生成多种木质纤维组分分布的高清空间图像，并提供可分析的定量数据，实现多组分原位同步量化分析。获取的多种木质纤维组分分布图像和定量数据可以支持同一样品不同组织和不同样品同一组织木质纤维组分含量的统计学显著差异分析，有助于作物育种研究中解析不同基因和性状形成的调控机理。本发明的方法具有分析细胞壁中更多精细结构组分的潜力，有助于作物细胞壁组分研究领域产生更多新的发现，在作物育种领域具有广阔的应用前景。与组织染色方法相比，本发明方法属于无标记分析技术(不需要染色剂、免疫标记等)，具有很高的化学特异性，避免了化学试剂与木质纤维组分反应活性差异对测定的影响，为原位量化提供准确的信息。
附图说明
[0053]
图1是两种水稻维管束组织木质纤维组分的含量分布拉曼图像和相对强度统计量化结果。(a-c)：il349水稻纤维素(a)、半纤维素(b)和木质素(c)含量分布拉曼图像；(d-f)：ko-bc1水稻纤维素(d)、半纤维素(e)和木质素(f)含量分布拉曼图像；(g-i)：两种水稻维管束组织纤维素(g)、半纤维素(h)和木质素(i)含量显著性差异分析。除*p《0.05和**p《0.01差异显著外，其余均无显著差异。缩略词：px，原生木质部；mx，后生木质部；ph，韧皮部；bs，束状厚壁组织。标尺：10μm。
[0054]
图2是两种水稻维管束组织木质纤维中精细结构组分的含量分布拉曼图像和相对强度统计量化结果。(a、b)：il349水稻松柏醇/醛(a)和对羟基肉桂酸(b)含量分布拉曼图像；(c、d)：ko-bc1水稻松柏醇/醛(c)和对羟基肉桂酸(d)含量分布拉曼图像；(e、f)：两种水稻维管束组织松柏醇/醛(e)和对羟基肉桂酸(f)含量显著性差异分析。除*p《0.05和**p《0.01差异显著外，其余均无显著差异。缩略词：px，原生木质部；mx，后生木质部；ph，韧皮部；bs，束状厚壁组织；caa，松柏醇/醛；hca，对羟基肉桂酸。标尺：10μm。
[0055]
图3是大豆根木质部导管与木射线细胞木质纤维组分的含量分布拉曼图像和相对强度统计量化结果。(a-c)：木质部导管纤维素(a)、半纤维素(b)和木质素(c)含量分布拉曼图像；(d-f)：木射线细胞纤维素(d)、半纤维素(e)和木质素(f)含量分布拉曼图像；(g-i)：根木质部导管与木射线细胞纤维素(g)、半纤维素(h)和木质素(i)含量显著性差异分析。除*p《0.05和**p《0.01差异显著外，其余均无显著差异。缩略词：v，木质部导管；r，木射线细胞。标尺：10μm。
具体实施方式
[0056]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0057]
本发明实施例中所用的水稻(禾本科模式物种)由中国农业大学生物学院2020年5月提供，分别为导入系il349水稻(il349)和从il349中分离出的水稻brittle culm1(bc1)基因突变体水稻(ko-bc1)，均在室外水田环境中生长。测试所用样品取自两种水稻茎秆倒数第二节间中间部位。
[0058]
本发明实施例中所用的豆科作物青6号大豆品种根系于2020年10月从中国农业大学曲周试验站采集，测试所用样品取自根系地下6-10cm区间，根段测试样品厚度为5mm左右。
[0059]
实施例1
[0060]
水稻茎秆维管束组织纤维素、半纤维素和木质素含量差异原位同步量化研究
[0061]
样品制备：将采集到的水稻茎秆倒数第二节间从中间部位切割，其厚度不超过5mm，随后置于福尔马林-乙酸-乙醇(formalin-acetic-alcohol，faa)固定剂中，固定24h以上；固定后的样品采用聚乙二醇1500包埋；使用滑走式切片机切取厚度约为30μm的横截面切片置于去离子水中，浸泡40-60min，期间换水2-3次；洗净后的切片转移至装有重水的离心管中，超声15秒左右；滴加0.1ml左右重水于载玻片上，然后将离心管中薄片转移至载玻片重水中并展平后盖上盖玻片；用滤纸吸除多余重水，并用指甲油密封，室温静置待指甲油凝固后进行拉曼图谱获取。
[0062]
图谱获取：使用共聚焦拉曼显微光谱仪(senterra
ꢀⅱ
，bruker，germany)获取水稻茎秆切片维管束组织拉曼显微图像，配备50倍的显微镜物镜(数值孔径(na)＝0.65，zeiss，德国)和532nm线性偏振激光，激光功率25mw，扫描次数为3，每次1000ms的曝光时间，每个像素光谱在4cm-1
的光谱分辨率下获得，扫描步长为1μm。
[0063]
图谱处理：首先，截取4000-400cm-1
波段范围光谱，采用凹式rubberband校正方法
基线校正，迭代次数为10次，基线校正点数为64点，使用11点savitzky-golay(s-g)平滑算法降噪；其次，使用细胞壁木质纤维组分特征峰峰面积积分图像结合修正otsu算法进行细胞壁区域拉曼光谱提取，其中峰面积积分范围为2805-3042cm-1
，修正因子α0＝6.5；最后采用光谱差减法扣除背景信号，以非细胞壁区域的平均光谱作为参比光谱，以561cm-1
为参考峰。
[0064]
维管束组织中纤维素、半纤维素和木质素含量原位同步量化：对细胞壁光谱进行2943cm-1
波段强度归一化，根据归一化后相对拉曼强度进行单峰成像同步生成纤维素(2895cm-1
，ch伸缩振动)、半纤维素(1471cm-1
，木聚糖中的oh和ch2伸缩振动)和木质素(1600cm-1
，芳香族骨架伸缩振动)含量分布拉曼图像，如图1中的a-f所示。随机选取三个维管束区域作为平行，进一步生成纤维素、半纤维素和木质素含量在统计上能够有效比较的量化数据，如图1中的g-i所示。
[0065]
两种水稻茎秆维管束组织纤维素、半纤维素和木质素含量分布拉曼图像显示(图1中的a-c,d-f)，半纤维素含量分布无明显差别，纤维素和木质素含量分布对比最明显的部位是维管束中的束状厚壁组织细胞(bs)，接下来是原生木质部(px)和次生木质部(mx)，最后是韧皮部(ph)。统计学量化结果显示，与il349水稻茎秆维管束组织相比，bc1突变体(ko-bc1)纤维素含量(图1中的g)降低了约12.0％，半纤维素含量没有显著差异(图1中的h)，木质素(图1中的i)含量上升了约18.1％。
[0066]
实施例2
[0067]
水稻茎秆维管束组织松柏醇/醛和对羟基肉桂酸含量差异原位同步量化研究
[0068]
样品制备、图谱获取和图谱处理与实施例1相同。
[0069]
维管束组织中松柏醇/醛和对羟基肉桂酸含量原位同步量化：对细胞壁光谱进行2943cm-1
波段强度归一化，根据相对拉曼强度进行单峰成像同步生成松柏醇/醛(caa，1633cm-1
)，对羟基肉桂酸(hca，1173cm-1
)含量分布拉曼图像，如图2中的a-d所示。随机选取三个维管束区域作为平行，进一步生成松柏醇/醛(caa)和对羟基肉桂酸(hca)含量在统计上能够有效比较的量化数据，如图2中的e-f所示。
[0070]
两种水稻维管束组织松柏醇/醛(caa)和对羟基肉桂酸(hca)含量分布拉曼图像显示(图2中的a-b，c-d)，松柏醇/醛(caa)含量分布差异较小，羟基肉桂酸(hca)含量分布对比最明显的部位是是维管束中的束状厚壁组织细胞(bundle sclerenchyma，bs)，接下来是次生木质部((metaxylem，mx)，最后是原生木质部(protoxylem，px)和韧皮部(phloem，ph)。统计学量化结果显示，维管束中松柏醇/醛(caa)含量并无显著差异(图2中的e)，而羟基肉桂酸(hca)含量上升了约18.7％(图2中的f)。
[0071]
实施例3
[0072]
大豆根木质部导管与木射线细胞纤维素、半纤维素和木质素含量差异原位同步量化研究
[0073]
样品制备：将采集到的大豆根在地下6-10cm区间切割，其根段厚度不超过5mm，随后置于福尔马林-乙酸-乙醇(formalin-acetic-alcohol，faa)固定剂中，固定24h以上；固定后的样品采用聚乙二醇2000包埋；使用滑走式切片机切取厚度约为18μm的横截面切片置于去离子水中，浸泡30-50min，期间换水2-3次；洗净后的切片转移至装有重水的离心管中，超声15秒左右；滴加0.1ml左右重水于载玻片上，然后将离心管中薄片转移至载玻片重水中
并展平后盖上盖玻片；用滤纸吸除多余重水，并用指甲油密封，室温静置待指甲油凝固后进行拉曼图谱获取。
[0074]
图谱获取：使用共聚焦拉曼显微光谱仪(senterra
ꢀⅱ
，bruker，germany)获取水稻茎秆切片维管束组织拉曼显微图像，配备50倍的显微镜物镜(数值孔径(na)＝0.65，zeiss，德国)和532nm线性偏振激光，激光功率25mw，扫描次数为2，每次2000ms的曝光时间，每个像素光谱在4cm-1
的光谱分辨率下获得，扫描步长为1μm。
[0075]
图谱处理：首先，截取4000-400cm-1
波段范围光谱，采用凹式rubberband校正方法基线校正，迭代次数为10次，基线校正点数为64点，使用11点savitzky-golay(s-g)平滑算法降噪；其次，使用细胞壁木质纤维组分特征峰峰面积积分图像结合修正otsu算法进行细胞壁区域拉曼光谱提取，其中峰面积积分范围为2805-3042cm-1
，修正因子α0＝6.5；最后采用光谱差减法扣除背景信号，以非细胞壁区域的平均光谱作为参比光谱，以561cm-1
为参考峰。
[0076]
大豆根木质部导管与木射线细胞纤维素、半纤维素和木质素含量差异原位同步量化：对细胞壁光谱进行2943cm-1
波段强度归一化，根据相对拉曼强度进行单峰成像同步生成纤维素(2895cm-1
，ch伸缩振动)、半纤维素(1471cm-1
，木聚糖中的oh和ch2伸缩振动)和木质素(1600cm-1
，芳香族骨架伸缩振动)含量分布拉曼图像，如图3中的a-f所示。随机选取三个木质部导管和木射线细胞区域作为平行，进一步生成纤维素、半纤维素和木质素含量在统计上能够有效比较的量化数据，如图3中的g-i所示。
[0077]
大豆根木质部导管(v)与木射线细胞(r)纤维素、半纤维素和木质素含量分布拉曼图像显示(图3中的a-c,d-f)，木质素含量分布对比最明显(图3中的c、f)，纤维素(图3中的a、d)和半纤维素(图3中的b、e)含量分布水平接近。统计学量化结果显示，大豆根木质部导管与木射线细胞纤维素(图3中的g)和半纤维素(图3中的h)含量无显著差异，木质素(图3中的i)含量上升了约55.6％(木质部导管(v)相较于木射线细胞(r))。
[0078]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：
1.一种农作物根茎木质纤维组分的原位同步量化方法，其特征在于，包括样品制备、原始拉曼光谱图像获取、原始拉曼光谱图像处理和木质纤维组分原位同步量化的步骤；所述木质纤维组分原位同步量化包括：将处理后的拉曼光谱图像根据特征波段进行强度归一化，根据归一化后相对拉曼强度单峰成像生成农作物组织中多种木质纤维组分分布的拉曼图像，再生成可以用于统计分析的量化数据。2.根据权利要求1所述的农作物根茎木质纤维组分的原位同步量化方法，其特征在于，所述特征波段为2943
±
5cm-1
波段。3.根据权利要求1所述的农作物根茎木质纤维组分的原位同步量化方法，其特征在于，生成的所述农作物组织中多种木质纤维组分分布的拉曼图像包括但不限于纤维素、半纤维素和木质素的分布情况，还包括能够代表上述木质纤维素组分中任意精细结构组分的特征波段的分布情况。4.根据权利要求1-3任一项所述的农作物根茎木质纤维组分的原位同步量化方法，其特征在于，所述原始拉曼光谱图像处理包括波段截取及预处理、细胞壁区域拉曼光谱提取和背景信号去除。5.根据权利要求4所述的农作物根茎木质纤维组分的原位同步量化方法，其特征在于，所述波段截取的范围为4000-400cm-1
，所述预处理包括平滑降噪和基线校正。6.根据权利要求4所述的农作物根茎木质纤维组分的原位同步量化方法，其特征在于，所述细胞壁区域拉曼光谱提取通过使用细胞壁木质纤维组分特征峰峰面积积分图像结合修正otsu算法实现；优选地，所述积分图像中峰面积积分范围为2805-3042cm-1
；获取所述积分图像后将其灰度化。7.根据权利要求4所述的农作物根茎木质纤维组分的原位同步量化方法，其特征在于，所述背景信号去除采用光谱差减法，计算公式为：差谱＝混合信号光谱-参比光谱
×
差减因子，其中，所述参比光谱为非细胞壁区域的平均光谱，所述差减因子是通过混合信号光谱参考峰强度与参比光谱参考峰强度的比值确定。8.根据权利要求7所述的农作物根茎木质纤维组分的原位同步量化方法，其特征在于，所述参考峰为561
±
5cm-1
。9.根据权利要求1-3任一项所述的农作物根茎木质纤维组分的原位同步量化方法，其特征在于，所述样品制备包括农作物根茎样本切割及固定、包埋切片、去离子水浸泡和d2o中超声处理；优选地，所述包埋切片过程中，选用的聚乙二醇的分子量根据农作物不同生长时期不同部位组织硬度决定，切片厚度根据不同农作物不同部位组织结构密度决定，d2o中超声处理时间以细胞壁结构清晰为标准决定。10.根据权利要求9所述的农作物根茎木质纤维组分的原位同步量化方法，其特征在于，采用共聚焦拉曼显微镜获取所述原始拉曼光谱图像，测定过程中激光激发波长优选为532nm。

技术总结
本发明涉及分析检测领域，具体提供一种农作物根茎木质纤维组分的原位同步量化方法，所述方法包括样品制备、原始拉曼光谱图像获取、原始拉曼光谱图像处理和木质纤维组分原位同步量化的步骤；所述木质纤维组分原位同步量化包括：将处理后的拉曼光谱图像根据特征波段进行强度归一化，根据归一化后相对拉曼强度单峰成像生成农作物组织中多种木质纤维组分分布的拉曼图像，再生成可以用于统计分析的量化数据。本发明的方法基于共聚焦拉曼显微图谱，不产生化学污染物，无标记且具有很高的化学特异性，可原位同步获得农作物根茎多种细胞壁木质纤维组分的空间量化信息。纤维组分的空间量化信息。


技术研发人员：杨增玲 廖科科 黄圆萍 韩鲁佳 史卓林
受保护的技术使用者：中国农业大学
技术研发日：2022.07.11
技术公布日：2022/11/1